Lactobacillus stimuluje odolnost k viru chřipky

Název:

Lactobacillus stimuluje odolnost k viru chřipky

Školitel:

Zuzana Lacková, Mgr. et Bc. Markéta Komínková, Mgr. Ondřej Zítka, Ph.D

Datum:

28. 3. 2014

Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.3.00/20.0148 Název projektu: Mezinárodní spolupráce v oblasti "in vivo" zobrazovacích technik

Rod Lactobacillus • Grampozitivní, fakultativně anaerobní či mikroaerofilní bakterie • Součást přirozené mikroflóry (zažívací trakt, vagína) • Využití v potravinářství (fermentované mléčné výrobky) • Využití v farmaceutickém průmyslu (probiotika, výroba vitamínů) • Účinky: – – – – – –

Posiluje imunitní systém Inhibuje střevní patogeny Snižuje hladinu cholesterolu v krvi Snižuje oxidační stres Zmírňuje příznaky chřipky Ochrana před virovými respiračními onemocněními

Glutathion • • • •

Tripeptid Antioxidační účinky Ochrana proti ROS, těžkým kovům, xenobiotikům Udržuje redoxní rovnováhu buněk

• Výskyt: – V eukaryotických systémech a gramnegativních bakteriích – U grampozitivních ?

G+ bakterie a glutathion • Glutathion obsahují jen některé G+ – Syntéza glutathion (Listeria monocytogenes , Listeria innocua , Clostridium perfringens, …

)

• Gopal, S.; Borovok, I.; Ofer, A.; Yanku, M.; Cohen, G.; Goebel, W.; Kreft, E.; Aharonowitz, Y., A multidomain fusion protein in Listeria monocytogenes catalyzes the two primary activities for glutathione biosynthesis. Journal of Bacteriology 2005, 187, 3839-3847.

– Import z média (Leuconostoc, Streptococcus, Enterococcus, …) • Pophaly, S. D.; Singh, R.; Kaushik, J. K.; Tomar, S. K., Current status and emerging role of glutathione in food grade lactic acid bacteria. Microbial Cell Factories 2012, 11.

Glutathion – syntéza a degradace


GSH GSH 1

γ-ECS - γ-glutamylcystein syntáza GSH-S - glutation syntáza

Glu – kyselina glutamová Cys – cystein Gyl – glycin


GSH GSH 1

GshR - glutation reduktáza GPo - glutation peroxidáza

H2O2

2H2O

GSH – redukovaný glutathion GSG – oxidovaný glutathion


GSH GSH 1

GshR - glutation reduktáza GPo - glutation peroxidáza

H2O2

2H2O

Základ antioxidačních vlastností glutathionu


GGT

GSH GSH 1

GGT - γ-glutamyl transpeptidáza

H2O2

2H2O


CydD

CydC

ATP

ADP GGT

GSH GSH 1

CydDC- fúzní proteiny

H2O2

2H2O

U prokaryot


CydD

CydC

ATP

ADP GGT

H2O2

2H2O

GshF- multidoménový protein

Některé G+

Lactobacillus rhamnosus • Při orálním podání působí proti respiračním virovým patogenům • Příznivě ovlivňuje léčbu respiračních onemocnění • Posiluje specifické imunitní funkce • Podporuje léčbu řady onemocnění

• Homology GshF • Import z média – Pophaly, S. D.; Singh, R.; Kaushik, J. K.; Tomar, S. K., Current status and emerging role of glutathione in food grade lactic acid bacteria. Microbial Cell Factories 2012, 11.

Cíl • Stanovení koncentrace glutathionu v L. rhamnosus a blokace syntézy glutathionu pomocí buthionin sulfoximinu (BSO) – HPLC-ED, ellmanovo činidlo

• Vliv extracelulárního glutathionu na růst L. rhamnosus – růstové křivky – stanovení glukózy, celkového obsah proteinů, LDH, laktát – stanovení antioxidační aktivity

Glutathion • Stanovení glutathinu pomocí Ellmanova činidla

SH-skupin (mmol.L-1)

3

2

1

0

0

5

10

15

20

25

Koncentrace BSO (mM)

30

50

Glutathion • Stanovení glutathinu pomocí Ellmanova činidla


3

2

Lactobacillus rhamnosus glutathion nesyntetizuje pomocí γ-glutamylcystein 1 syntázy 0

0

5

10

15

20

25

Koncentrace BSO (mM)

30

50


CydD

CydC

ATP

ADP GGT

GSH GSH 1

H2O2

2H2O


CydD

CydC

ATP

ADP GGT

GSH GSH 1

H2O2

2H2O

Glutathion

0,08

0,08

0,07

0,07

Bez BSO

0,06

Koncentrace GSH (μM)


• Stanovení glutathinu pomocí HPLC-ED

S BSO

0,05 0,04 0,03 0,02

0,01 0,00

Bez BSO S BSO

0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00

0

3 300 Koncentrace GSH (μM)

3000

0

3 300 Koncentrace GSSG (μM)

3000

Glutathion Plocha píku (µC)

• Stanovení glutathinu pomocí HPLC-ED 400

300

červen 2013

200

únor 2014

100

y = 0,6522x - 0,3207 R² = 0,9968

0 0

10

20

30

40

50

60

Koncentrace GSH (µM)

0,08

0,08

0,07

Bez BSO

0,06



Červen 2013 LOD < 0.03 µM Únor 2014 LOD < 0.3 µM

y = 6,485x + 1,2381 R² = 0,9973

S BSO

0,05 0,04 0,03 0,02

0,01 0,00

0,07

Bez BSO

S BSO

0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00

0

3 300 Koncentrace GSH (μM)

3000

0

3 300 Koncentrace GSSG (μM)

3000

Glutathion • Stanovení glutathinu pomocí Ellmanova činidla 5 Bez SBO

S SBO

4 3 2 1

0



5

Bez SBO

S SBO

4 3 2 1

0 0

3

300

3000

Koncentrace GSH (mM)

0

3

300

3000

Koncentrace GSSG (mM)


CydD

CydC

ATP

ADP GGT

GSH GSH 1

H2O2

2H2O


CydD

CydC

ATP

ADP GGT

GSH GSH 1

H2O2

2H2O


GGT

H2O2

2H2O

GshF- multidoménový protein


? GshF- multidoménový protein

GGT

H2O2

2H2O

Jak glutathion působí na L. rhamnosus?

Jak glutathion působí na L. rhamnosus?

1,4

1,4

1,2

1,2

Absorbance (AU)

Absorbance (AU)

• Růstové křivky

1 0,8 0,6 0,4

1 0,8 0,6 0,4

0,2

0,2

0

0 0

6

12

18

24

0

6

12

18

24

Čas (hodiny)

Čas (hodiny) Lbc. rhamnosus

GSH 1,3μM

GSH 2,6μM

Lbc. rhamnosus

GSSG 1,3μM

GSSG 2,6μM

GSH 5,2μM

GSH 10,4μM

GSH 20,8μM

GSSG 5,2μM

GSSG 10,4μM

GSSG 20,8μM

GSH 41,7μM

GSH 83,3μM

GSH 166,7μM

GSSG 41,7μM

GSSG 83,3μM

GSSG 166,7μM

GSH 333,3μM

GSSG 333,3μM

Jak glutathion působí na L. rhamnosus? • Metabolismus • Přídavek GSH a GSSG do média v koncentraci 0, 3, 300 a 3000 µM

GSSG

0 0

2

Log (koncentrace µM)

4

4 3

GSH

GSSG

2

1,2 1

Laktát (mol.L-1)

GSH

10

LDH (mkatl.L-1)

1

Proteiny (g.L-1)

Glukóza (mmol.L-1)

5

12

Tisíce

6

Tisíce

Tisíce

2

8 6

GSH

GSSG

4

0,8 0,6

2

0,2

0

0

0

2


4

0

2


4

GSSG

0,4

1

0

GSH

0

2


4

Jak glutathion působí na L. rhamnosus? 60

120

50

100

40

80

30

FRAP (%)

DPPH (%)

• Antioxidační aktivita

GSH GSSG

20

60

GSH GSSG

40

10

20

0

0

0

1

2

3


4

0

1

2

3

4


Závěr • L. rhamnosus neobsahuje γ-glutymylcystein syntázu • Pravděpodobně není schopen syntézy glutathionu

• L. rhamnosus neobsahuje fúzní proteiny • Není schopen importovat glutathion z média

• Glutathion urychluje metabolismus L. rhamnosus • Glutathion nemá negativní vliv na L. rhamnosus

Výhled do budoucna • Prostudování exprese genů zapojených do syntézy a transportu glutathionu do L. rhamnosus

• Podávání L. rhamnosus s přídavkem glutathionu myším infikovaným chřipkou – Sledování vlivu na příznaky a léčbu

• Aplikace na další virová onemocnění?

• Tato práce byla financována ze zdrojů NANOLABSYS CZ.1.07/2.3.00/20.0148

Literatura • • • •

• • •

• •

Meister, A.; Anderson, M. E., GLUTATHIONE. Annual Review of Biochemistry 1983, 52, 711-760. Knejzlik, Z.; Kas, J.; Ruml, T., Mechanism of xenobiotics entry into the organism and their detoxication. Chemicke Listy 2000, 94, 913-918. Pophaly, S. D.; Singh, R.; Kaushik, J. K.; Tomar, S. K., Current status and emerging role of glutathione in food grade lactic acid bacteria. Microbial Cell Factories 2012, 11. Kullisaar, T.; Songisepp, E.; Aunapuu, M.; Kilk, K.; Arend, A.; Mikelsaar, M.; Rehema, A.; Zilmer, M., Complete Glutathione System in Probiotic Lactobacillus fermentum ME-3. Applied Biochemistry and Microbiology 2010, 46, 481-486. Masip, L.; Veeravalli, K.; Georgioui, G., The many faces of glutathione in bacteria. Antioxidants & Redox Signaling 2006, 8, 753-762. Li, Y.; Hugenholtz, J.; Abee, T.; Molenaar, D., Glutathione protects Lactococcus lactis against oxidative stress. Applied and Environmental Microbiology 2003, 69, 5739-5745. Collins, M. D.; Phillips, B. A.; Zanoni, P., DEOXYRIBONUCLEIC-ACID HOMOLOGY STUDIES OF LACTOBACILLUS-CASEI, LACTOBACILLUS-PARACASEI SP-NOV, SUBSP PARACASEI AND SUBSP TOLERANS, AND LACTOBACILLUS-RHAMNOSUS SP-NOV, COMB-NOV. International Journal of Systematic Bacteriology 1989, 39, 105-108. Stiles, M. E.; Holzapfel, W. H., Lactic acid bacteria of foods and their current taxonomy. International Journal of Food Microbiology 1997, 36, 1-29. Gopal, S.; Borovok, I.; Ofer, A.; Yanku, M.; Cohen, G.; Goebel, W.; Kreft, E.; Aharonowitz, Y., A multidomain fusion protein in Listeria monocytogenes catalyzes the two primary activities for glutathione biosynthesis. Journal of Bacteriology 2005, 187, 3839-3847.

Děkuji za pozornost

Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.3.00/20.0148 Název projektu: Mezinárodní spolupráce v oblasti "in vivo" zobrazovacích technik

Lactobacillus stimuluje odolnost k viru chřipky

Recommend Documents