18
Bab III III.1
Metode Penelitian
Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah sentrifuga Beckman JA-14, pH meter digital Beckman, vortex, spektrofotometer Spectronik 20, kuvet plastik, SmartspecTM 3000 Bio-Rad, spektrofotometer Shimadzu UV, kuvet kuarsa 0,5 ml, inkubator, pengaduk magnet Fisher 110V, corong Buchner, kolom kromatografi, super
fraction collector SF-2120 Advantec, set alat SDS-PAGE, neraca analitis, freez dryer, pipet mikro ukuran 10 – 100 μL dan 100 - 100 μL (Eppendorf, Germany), sentrifuga dingin (Jouon MR 1822), set-up alat percobaan kinetika katalase IChO 2006 dan alat-alat gelas lainnya yang umum digunakan di laboratorium. Semua alat yang digunakan dipinjam dari gudang alat Laboratorium Biokimia Program Studi Kimia ITB. III.2
Bahan
III.2.1 Sampel Sampel yang digunakan pada penelitian ini yaitu kentang turunan ketiga dari varietas granola, ditanam di daerah Ciburial Lembang Jawa Barat dengan pemupukan organik dan digali beberapa saat sebelum digunakan. Gambar II.1 memperlihatkan sampel kentang yang digunakan. (a)
(b)
Gambar III-1 (a) Kentang baru digali (b) Kentang sudah dicuci bersih
19 III.2.2 Bahan Kimia Bahan-bahan kimia yang digunakan berderajat pro analisis kecuali yang disebutkan lain. Bahan yang digunakan adalah H2O2 (Merck), (NH4)2SO4 (Merck),
NaH2PO4.H2O
(Merck), Na2HPO4.7H2O (Merck), PMSF (Merck), Coomassie Brilliant Blue G-250 (Merck), C2H5OH (Merck), H3PO4 (Merck), Bovin Serum Albumin (Sigma), DEAEselulosa (Merck), membran selofan (Sigma), NaHCO3 (Merck), BaCl2 (Merck), NaCl (Merck), AgNO3 (Merck), Akrilamid (Merck), bis-akrilamid (Merck), basa tris-HCl (Merck), TEMED (Merck), APS (Merck), Metanol (Merck), Coomassie Blue R-250 (Merck), Asam asetat glacial (Merck), β-Merkaptoetanol (Merck), Gliserol (Merck), Brom fenol biru (Merck), Glisin (Merck), Aquabides, Aquades, Aqua DM.
III.3
Pembuatan Bahan
III.3.1 Pembuatan Buffer Fosfat 0,1M pH 7 Sebanyak 12,0 gram NaH2PO4.H2O dilarutkan dalam 1 liter aquabides menjadi larutan a. Kemudian 39,488 gram Na2HPO4.7H2O dilarutkan dalam 1,5 liter aquabides menjadi larutan b. pH meter dikalibrasi dengan larutan standar pH 4 dan larutan standar pH 7. Setelah konstan, 780 mL larutan a ditambahkan ke dalam 1220 ml larutan b sedikit demi sedikit sambil diaduk dengan pengaduk magnet kemudian suspensi diukur pHnya. Jika pH kurang dari 7 maka ditambahkan sedikit larutan b tetes demi tetes sampai pH 7. Jika pH lebih dari 7 ditambahkan sedikit larutan a tetes demi tetes sampai pH 7 (Colowick dan Kaplan, 1955. Dawson et al, 1969 dalam Sudarmadji dkk, 1984)
III.3.2 Pembuatan Larutan PMSF 0,1M Larutan PMSF ( Penil metil sulfuril flourida) 0,1 M dibuat dari 174,24 mg PMSF yang dilarutkan dalam pelarut 2- propanol anhidrid sehingga volume menjadi 10 mL.
III.3.3 Penyiapan membran selofan ( Kantong Dialisis ) Selofan dipotong kemudian dicuci dengan aquades sambil diremas-remas hingga permukaannya lentur kemudian direndam dalam larutan 2% NaHCO3 dan 1mM EDTA
20 pada suhu 80oC selama 20 menit untuk membunuh mikroba yang menempel. Setelah itu dicuci dengan aquades dan dipanaskan kembali dalam aquades sampai suhu kurang lebih 80oC, kemudian dikeluarkan dari larutan panas dan dibilas lagi dengan aquades dan selofan siap digunakan untuk kantong dialisis.
III.3.4 Pembuatan larutan standar Bovin Serum Albumin (BSA) Dalam penelitian ini, larutan standar stok BSA yang digunakan mempunyai konsentrasi 200 μg/ mL, dibuat dengan melarutkan 0,02 g kristal BSA dalam Buffer Fosfat 0,1M pH 7 menggunakan labu takar 100 mL. Konsentrasi standar BSA yang digunakan untuk penentuan konsentrasi protein adalah 5, 20, 40, 60, 80, dan 100 μg/ mL yang diencerkan dari larutan standar stok BSA yang telah dibuat.
III.3.5 Pembuatan Pereaksi Bradford Pereaksi Bradford yang digunakan dalam penelitian ini dibuat sendiri secara manual dari 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 yang dilarutkan dalam 50 mL etanol 95% kemudian ditambahkan sedikit demi sedikit 100mL H3PO4 85% kemudian larutan yang terjadi dimasukan ke dalam labu takar 1000mL dan ditambahkan aquades sampai tanda batas. Sebelum digunakan pereaksi warna ini disaring dengan kertas whatman no 1 (Bradford, 1976. Stoscheck, 1990)
III.3.6 Penyetimbangan DEAE – selulosa Kromatografi kolom penukar anion dalam penelitian ini menggunakan DEAE – Selulosa yang disiapkan dari 10 gram bubuk putih lembut DEAE – Selulosa yang dimasukan ke dalam gelas kimia berisi 250 ml aquades sedikit demi sedikit sambil diaduk dengan pengaduk magnet yang berkecepatan rendah supaya tidak berbuih. Setelah semua larut gelas kimia ditutup dengan alumunium foil kemudian di simpan di lemari es dan DEAEselulosa dibiarkan terendam selama 1 malam ( kurang lebih 12 jam ). Suspensi DEAEselulosa dicuci secara dekantasi dengan aquades kemudian dilarutkan kembali dalam buffer fosfat 0,1M pH 7 lalu didiamkan selama 10 menit setelah itu didekantasi berulang
21 sebanyak 3 kali dengan tujuan bubur DEAE – Selulosa mempunyai pH sama dengan pH buffer yang akan digunakan. Untuk menghilangkan udara, selanjutnya suspensi ini diaerasi menggunakan pompa hisap vakum.
III.3.7 Pembuatan Kolom Kolom kaca berukuran 50 x 2 cm dicuci bersih dan dibilas dengan buffer supaya bebas lemak. Glass woll yang telah bebas lemak (direndam semalam dengan aquades) ditempatkan di dasar kolom perlahan – lahan jangan sampai udara masuk untuk menghindari lolosnya partikel DEAE-selulosa. Kolom dipasang tegak lurus kemudian bubur DEAE-selulosa dimasukan dengan batang pengaduk kecil. Untuk mencapai keseimbangan kolom, matriks di elusi dengan buffer fosfat 0,1M pH 7 sebanyak 70 ml dan volume tetesan diatur dengan laju 0,32 ml per menit.
III.3.8 Penyiapan Gel Elektroforesis
Separating Gel untuk melakukan SDS-PAGE dibuat dengan mencampurkan 3334 μL suspensi akrilamid-bis akrilamid (39:1), 4110 μL ddH2O, 5000 μL larutan 1M tris-HCl pH 8,7, 70 μL larutan SDS 20%, 10 μL TEMED dan 70 μL larutan APS 10%. Suspensi digoyang kuat kemudian dituangkan kedalam gel sandwich kira-kira 1,5 cm dari bagian atas plate lalu ditambahkan aquades sampai ketinggian 1-5mm kemudian dibiarkan sampai terjadi polimerisasi (gel) kira-kira 30 menit. Saat menunggu polimerisasi,
stacking gel dibuat dengan mencampurkan 625 μL suspensi akrilamid-bis akrilamid (39:1), 3710 μL ddH2O, 625 μL larutan 1M tris-HCl pH 6,8, 25 μL larutan SDS 20%, 4 μL TEMED dan 25 μL larutan APS 10%. Suspensi digoyang kuat. Setelah polimerisasi
Separating Gel selesai, air yang berada di bagian atasnya dibuang dan suspensi stacking gel dituangkan diatas Separating Gel lalu disisipkan comb. Suspensi dibiarkan kembali kira-kira 30 menit untuk terjadinya polimerisasi (Hames, 1998)
22 III.3.9 Penyiapan Buffer Sampel SDS-PAGE Larutan stok 5xBuffer sampel dibuat dengan mencampurkan 12, 5 mL 1 M tris HCl pH 6,8, 20 mL Gliserol, 10 ml β-merkapto etanol 40 ml SDS 10 % dan 15 mg bromfenol biru
III.3.10 Pembuatan Larutan Running Buffer Larutan running Buffer dibuat dengan mencampurkan 10 gram SDS, 30,2 gr tris-HCl dan 144 gr glisin. Suspensi ditambahkan aquades dalam labu takar 1000 mL sampai tanda batas (Hames, 1998).
III.3.11 Pembuatan Larutan Staining Larutan staining dibuat dengan mencampurkan 400 ml metanol, 150 ml asam asetat glasial, 1 g coomassie blue R-250. Suspensi dilarutkan dengan aquades sampai volume 1 liter. Setelah itu larutan disaring menggunakan kertas saring dan corong biasa.
III.3.12 Pembuatan Larutan Destaining Larutan destaining dibuat dengan mencampurkan 100 ml metanol, 75 ml asam asetat glasial. Kemudian suspensi diencerkan dengan aquades sampai volume 1 liter.
III.4
Cara Kerja Penelitian
III.4.1 Isolasi Katalase dari kentang Diruang dingin (18oC), kentang segar yang baru digali dicuci bersih, dikupas, dipotongpotong dan ditimbang. Sebanyak 112,5 gram potongan kentang ditambah 90 mL buffer fosfat 0,1M pH 7 dan 0,9 mL larutan PMSF 0,1M diblender dengan kecepatan rendah selama 20 menit. Suspensi segera disaring dengan saringan kelapa dan filtrat ditampung dalam gelas kimia pada wadah berisi es. Ekstrak kentang berwarna kuning kecoklatan yang dihasilkan sebanyak 183 mL selanjutnya disentrifugasi selama 30 menit dengan kecepatan 20.000g. Supernatan (cairan bening berwarna coklat) yang dihasilkan
23 sebanyak 117 mL ditampung sebagai ekstrak kasar katalase (EKE) dan endapan berwarna putih kecoklat-coklatan (pelet) dibuang sebagai pengotor.
III.4.2 Optimasi reaksi enzimatis katalase dari kentang Karena pada penentuan aktivitas enzim dilakukan reaksi enzimatis, maka diperlukan optimasi reaksi enzimatis katalase dari kentang untuk menentukan konsentrasi substrat optimum. Optimasi dilakukan dengan mengukur serapan larutan hasil reaksi antara katalase dan substrat
(H2O2) dalam buffer fosfat pada panjang gelombang 240nm.
Penentuan konsentrasi substrat optimum dilakukan dengan cara membuat konsentrasi substrat bervariasi mulai dari 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45,dan 50mM dengan variabel lainnya dibuat tetap.
III.4.3 Penentuan Aktivitas Total Enzim Unit Aktivitas Katalase didefinisikan sebagai jumlah mmol H2O2 (substrat) yang bereaksi dengan 1 mL enzim katalase per menit. Aktivitas enzim ditentukan dari nilai selisih serapan larutan kontrol dan sampel (∆A) yang diukur pada panjang gelombang 240 nm (Aebi, 1984). Larutan kontrol adalah larutan hasil reaksi antara enzim yang dididihkan selama 5 menit dengan H2O2 30mM (substrat) dalam Buffer fosfat 50mM (pH 7). Larutan sampel adalah larutan hasil reaksi antara enzim dengan H2O2 30mM (substrat) dalam Buffer fosfat 50mM pH 7. Nilai selisih serapan tersebut diplotkan terhadap kurva kalibrasi penurunan nilai serapan H2O2 pada berbagai variasi konsentrasi yang diukur pada panjang gelombang 240 nm sehingga diperoleh harga penurunan konsentrasi substrat yang sebanding dengan nilai aktivitas katalase. Unit aktivitas katalase (unit/mL) dihitung dari penurunan konsentrasi substrat dibagi volume larutan enzim yang direaksikan. Aktivitas total (unit) dihitung dari unit aktivitas dikalikan volume larutan enzim yang diperoleh dari setiap tahapan pemurnian.
24 III.4.4 Penentuan Kandungan Protein Katalase adalah enzim berupa senyawa protein sehingga didalamnya terdapat kandungan protein tertentu. Penentuan konsentrasi protein dalam katalase dapat ditentukan dengan Metode Bradford (1976) menggunakan Bovine Serum Albumin (BSA) sebagai protein standar (Snyder, 1978 Beaumont et al, 1990). Untuk 100 μL volume sampel digunakan 5 mL pereaksi Bradford lalu divortex kemudian diinkubasi selama 5 menit. Larutan yang terjadi diukur serapannya pada panjang gelombang 595 nm (Bradford, 1976 dan Stoscheck, 1990). Dari data serapan (A595) yang diplotkan terhadap kurva standar BSA diperoleh konsentrasi protein yang terdapat dalam larutan enzim. Kandungan protein total dihitung dari konsentrasi protein dikalikan volume larutan enzim yang dihasilkan dari setiap tahapan pemurnian.
III.4.5 Fraksinasi amonium sulfat Sejumlah tertentu garam amonium sulfat (Lampiran A) yang telah dihaluskan ditambahkan sedikit demi sedikit kedalam 100 mL EKE sambil diaduk dengan pengaduk magnet pada kecepatan rendah. Setelah semua garam larut, suspensi disimpan selama 2 jam sambil terus diaduk untuk mencapai kesetimbangan endapan. Selanjutnya suspensi disentrifugasi 20.000g selama 30 menit. Supernatan berwarna coklat ditampung untuk difraksinasi lanjut, pelet berwarna coklat tua dilarutkan dalam Buffer fosfat 0,1M pH 7 dan disimpan sebagai fraksi 0-20%. Proses yang sama dilakukan terhadap supernatan untuk memperoleh fraksi 20-80% dan 80-100%. Selanjutnya untuk menghilangkan kadar garam dari larutan enzim, setiap fraksi didialisis menggunakan membran selofan dengan uji AgCl. Semua hasil fraksi dihitung aktivitas spesifik katalase berdasarkan uji aktivitas dan kandungan proteinnya.
III.4.6 Kromatografi Kolom Penukar Anion DEAE-Selulosa Sebanyak 3,5 mL larutan enzim fraksi 20-80% dimasukan kedalam kolom kromatografi penukar anion DEAE-selulosa yang sebelumnya telah dielusi dengan 70 mL Buffer fosfat untuk menyeimbangkan kolom. Laju elusi 0,32 mL/ menit dengan sistem elusi dilakukan
25 berdasarkan gradien konsentrasi NaCl 0,2M, NaCl 0,4 M dan NaCl 0,6M. Sebelumnya tabung penampung efluen diberi label nomor berurutan dan disusun dalam super fraction
collector SF-2120 Advantec alat diset dengan volume setiap tabung 3 mL . setelah itu cuplikan dimasukkan dengan pipet memutar sepanjang dinding kolom. Setelah semua meresap kedalam matriks, dibilas dengan Buffer sebanyak 4 kali masing-masing harus sampai meresap terlebih dahulu. Setiap tabung diuji serapan maksimumnya pada 280 nm untuk melihat kandungan proteinnya. Pada saat nilai A280 turun drastis eluen diganti dengan konsentrasi ion yang lebih besar. Kemudian setiap efluen yang memiliki nilai A280 tinggi dihitung aktivitas spesifik katalase berdasarkan uji aktivitas dan kandungan proteinnya. Selanjutnya untuk menghilangkan kadar garam dari larutan enzim, fraksi yang memiliki aktifitas spesifik tinggi (tabung ke-43 sampai 60) didialisis menggunakan membran selofan dengan uji AgNO3.
III.4.7 Pengujian Kemurnian Enzim dengan SDS-PAGE Larutan enzim murni dipekatkan dengan freeze drying dari volume 100 mL menjadi 50 μL kemudian ditambahkan 50 μL 5xBuffer sampel lalu dipanaskan selama 5 menit. Setelah itu suspensi disentrifugasi dalam sentrifuga dingin dengan kecepatan 11.500 rpm selama 2 menit. Cara kerja ini dilakukan pula terhadap ekstrak kasar enzim (ekstrak kasar
enzim) dan larutan enzim hasil fraksinasi amonium sulfat. Setelah semua sampel siap, gel elekroforesis yang telah disiapkan dipasang kedalam set-up alat SDS-PAGE. Larutan
running Buffer dituangkan ke dalam tank lalu keenam larutan disuntikkan ke dalam gel elektroforesis dengan standar protein marker. Setelah itu penutup alat dipasang dan stop kontak listrik disambungkan ke power supply pada tegangan tetap 200V. Alat dijalankan selama kurang lebih 1 jam. Setelah blue dye keluar dari gel, alat dimatikan. Gel yang terjadi dikeluarkan dari alat kemudian dimasukkan ke dalam larutan staining dan dibiarkan kurang lebih 15 menit. Selanjutnya gel dipindahkan kedalam larutan destaining dan dibiarkan sampai bersih (pita-pita proteinnya telihat jelas).
26 III.4.8 Penentuan Parameter Kinetika (Vmaks dan KM) Dengan menggunakan alat SmartspecTM 3000 Bio-Rad yang diatur untuk rentang waktu 160 detik dan setiap 10 detik diukur serapan hasil reaksi antara 200 μL substrat H2O2 dengan variasi konsentrasi 0 sampai 50mM dalam 250 μL buffer fosfat 50mM pH 7 dengan 50 μL larutan enzim murni hasil freez dry pada panjang gelombang 240 nm. Data yang diperoleh dibuat dalam bentuk grafik. Dari grafik tersebut ditentukan laju reaksi awal untuk setiap konsentrasi substrat. Berdasarkan data laju reaksi awal dan konsentrasi substrat dibuat plot Lineaweaver-Burk sehingga dapat ditentukan harga Vmaks dan KM. Percobaan diulangi dengan cara yang sama menggunakan alat spektrofotometer Shimadzu UV. Data serapan yang terukur dapat langsung dibaca oleh alat dan ternyata tidak berbeda dengan data sebelumnya yang menggunakan alat berbeda.
III.5
Demonstrasi Percobaan Kinetika Katalase
Konsep dasar percobaan kinetika katalase yang ada dalam preparatory problem 36
International Chemistry Olimpiad 2006 (IChO 2006) dipresentasikan dihadapan guruguru yang tergabung dalam Musyawarah Guru Mata Pelajaran (MGMP) Kimia Kota Bandung pada tanggal 1 Desember 2007. Berbagai tanggapan dan komentar memberi peluang untuk mendemonstrasikan percobaan tersebut didepan guru dan siswa. Demonstrasi dimulai dihadapan guru-guru MGMP Kimia Kota Bandung pada tanggal 5 Januari 2008 dan dengan pendekatan personal guru yang bersangkutan percobaan tersebut berturut-turut didemonstrasikan didepan guru dan siswa SMU 23 (1 Maret 2008), SMU 1 (8 maret 2008), MAN 2 (15 Maret 2008), dan SMUT Krida Nusantara (19 Maret 2008) berdasarkan penuntun percobaan dalam lampiran B. Setiap selesai mendemonstrasikan percobaan, dilakukan kuisioner tanpa paksaan untuk mengetahui sejauh mana tanggapan guru dan siswa terhadap percobaan tersebut. Format kuisioner dapat dilihat pada lampiran C.
