12
METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan pada bulan Mei 2009 sampai dengan April 2010, bertempat di Bagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah sampel darah dan DNA sapi madura, sapi limousin dan sapi FH koleksi Laboratorium Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan IPB. Jumlah keseluruhan sampel yang digunakan adalah 81 sampel, terdiri atas 40 sampel sapi madura, 10 sampel sapi FH, dan 31 sampel sapi limousin (Tabel 1). Sampel darah sapi madura diawetkan dalam alkohol absolut, sampel berasal dari peternakan rakyat di kabupaten Sampang dan Bangkalan, Madura. Koleksi sampel sapi limousin dan sapi FH dalam bentuk DNA. Sampel sapi FH berasal dari Koperasi Peternakan Susu (KPS) Kunak Bogor, sedangkan sampel sapi limousin berasal dari Balai Embrio Ternak (BET) Cipelang, Jawa Barat.
Tabel 1 Sampel yang digunakan dalam penelitian Sapi madura
Asal Sampel Sampang Bangkalan BET Cipelang KPS Kunak Bogor
Sapi limousin Sapi FH Total Keterangan: ♂ = Jantan; ♀ = Betina.
Jumlah Sampel 30 10 31 10 81
Tahun Koleksi 2009 2009 2008 2009
Jenis Kelamin ♂&♀ ♂&♀ ♀ ♂&♀
Metode Ekstraksi dan Isolasi DNA Ekstraksi dan isolasi DNA dari sampel darah sapi menggunakan DNA Extraction Kit for Fresh Blood (GeneAid Canada) yang dimodifikasi. Empat tahapan ekstraksi dan isolasi DNA telah dilakukan sebagaimana tertera pada manual kit, yaitu pelisisan, pengikatan, pencucian dan pengendapan DNA. Modifikasi dilakukan pada tahap pelisisan sel darah yang disimpan dalam alkohol. Alkohol sebagai media penyimpan dibuang dengan sentrifugasi 1000 g selama 10
13
menit. Sel-sel darah kemudian direndam dalam akuades selama 20 menit dan dilanjutkan dengan sentrifugasi 1000 g selama 10 menit. Sel-sel darah yang sudah bebas dari alkohol disuspensikan dalam bufer 1x STE (0.5 M Sodium chloride; Tris-HCl 0.2 M; EDTA 0.02 M; pH 8.0) kemudian dilisis menggunakan proteinase K 0.125 mg/ml dan sodium dodesil sulfat 1% sambil dikocok pelan dalam suhu 56 oC selama 1 jam. Tahap pemisahan dan pemurnian molekul DNA mengikuti petunjuk DNA Extraction Kit for Fresh Blood.
Amplifikasi BoLA DRB 3.2 Amplifikasi lokus BoLA DRB 3.2 dilakukan secara in vitro menggunakan metode polymerase chain reaction (PCR). Primer forward yang digunakan adalah AF135: 5’–ATCCTCTCTCTGCAGCACATTTCC–3’ dan primer reverse AF137: 5’–TCGCCGCTGCACAGTGAAACTCTC–3’. Kedua primer diatas didisain oleh Van Eijk et al. (1992) sebagai HLO30 dan HLO32 dengan target DNA hasil amplifikasi berukuran 284 bp. Pereaksi PCR terdiri atas 10-100 ng sampel DNA, primer forward dan reverse masing-masing 1 µM, dNTP mix 120 µM, MgCl2 100 µM, dan Taq polymerase RBC 1 unit beserta bufernya. Total volume pereaksi adalah 25 μl dalam tabung 0.2 ml. Reaksi PCR dilakukan menggunakan mesin thermocycler TaKaRa yang telah diprogram untuk kondisi predenaturasi pada suhu 94 oC selama 5 menit, 30 siklus denaturasi 94 oC selama 1 menit, penempelan (annealing) pada suhu 57 oC selama 1 menit, pemanjangan 64 oC selama 1 menit. Pemanjangan akhir dilakukan pada suhu 72 oC selama 2 menit.
Pemotongan dengan Enzim Restriksi Identifikasi variasi alel BoLA-DRB 3.2 menggunakan metode PCR-RFLP yang dikembangkan oleh Van Eijk (1992). Produk PCR dipotong menggunakan enzim restriksi endonuklease RsaI, HaeIII (NEB biolabs, New England-USA), dan BstYI (Fermentas). Produk PCR yang menunjukkan pita tunggal di atas gel kemudian dipotong dengan enzim restriksi. Sebanyak 2 μl produk PCR dipotong dengan enzim restriksi 3 unit. Unit aktifitas enzim restriksi yang digunakan berlebih untuk memastikan tidak ada incomplete digestion. Proses pemotongan
14
produk PCR oleh ketiga enzim dilakukan dalam inkubator pada suhu 37 oC selama 3 jam hingga satu malam (± 18 jam).
Visualisasi Produk PCR dan PCR-RFLP Pemisahan produk PCR dilakukan menggunakan polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) 8% dan produk PCR-RFLP menggunakan PAGE 8% yang dilanjutkan dengan pewarnaan sensitif perak menurut Tegelström (1986). Elektroforesis dijalankan pada tegangan 100 V sampai pewarna bromtimol blue dari loading bufer mencapai tepi katoda gel.
Konfirmasi Tipe Alel BoLA DRB 3.2 Pola hasil pemotongan PCR-RFLP dikonfirmasikan dengan pola pemotongan yang telah diidentifikasi oleh Van Eijk et al. (1992), Gelhaus et al. (1995) dan Maillard et al. (1999) (Lampiran 1). Identifikasi alel BoLA DRB 3.2 menggunakan kombinasi pola pemotongan enzim RsaI, BstYI, dan HaeIII (Lampiran 2).
Analisis Data Frekuensi tipe pola pemotongan dihitung dengan rumus sebagai berikut: x i = ni / N Keterangan: xi
= Frekuensi tipe i
ni
= Jumlah tipe i dalam populasi
N
= Jumlah total tipe dalam populasi
Frekuensi genotipe dihitung berdasarkan rumus Nei (1987) sebagai berikut: Xii = nii / N Keterangan: Xii
= Frekuensi genotipe ii
nii
= Jumlah individu bergenotip ii
N
= Jumlah total individu
15
Frekuensi alel dihitung berdasarkan jumlah individu bergenotipe homozigot dan heterozigot dengan menggunakan rumus Nei (1987) sebagai berikut: Xi = (2nii + Σ nij)/2N x 100% Keterangan:
Xi
= Frekuensi alel i (%)
nii
= Jumlah individu bergenotipe ii
nij
= Jumlah individu bergenotipe ij
N
= Jumlah total individu
Analisis keragaman genetik pada populasi dilakukan dengan cara membandingkan nilai hetrozigositas hasil penelitian (Ho) dengan nilai heterozigositas yang diharapkan (He) (Nei 1973 diacu dalam Freeland 2005). Rumus yang digunakan adalah sebagai berikut: He = 1 – ƩXi2
Ho = Ʃnij / N Keterangan: nij
= jumlah individu bergenotipe ij
N
= jumlah total individu
Xi
= frekuensi Alel i
Analisis kesetimbangan populasi menggunakan Uji Chi-squared dengan cara membandingkan frekuensi genotipe hasil pengamatan dengan frekuensi genotipe
pada
populasi
setimbang
Hardy-Weinberg.
Uji
Chi-squared
menggunakan rumus sebagai berikut: χ 2= Ʃ(O – E)2 / E Keterangan: O
= jumlah individu bergenotip ii, ij,...jj hasil pengamatan
E
= jumlah individu bergenotip ii, ij,...jj yang diharapkan,
Kriteria Uji yang digunakan adalah: jika angka sigifikansi atau p-value lebih besar dari 0.01 atau χ2
hitung
≤ χ2tabel, maka populasi dalam keadaan
16
setimbang, jika p-value lebih kecil dari 0.01 atau χ2hitung ≥ χ2tabel, maka populasi tidak setimbang. Derajat bebas pengujian adalah k – 2, karena dalam analisis dilakukan dua kali pendugaan, yaitu pendugaan frekuensi alel dan frekuensi genotipe. Sedangkan k adalah kombinasi yang mungkin terbentuk dari banyaknya alel.
