METODE CEPAT UNTUK PENENTUAN KADAR YOHIMBIN DALAM Pausinystalia yohimbe DAN PRODUK KOMERSIALNYA SECARA SPEKTROFOTOMETRI DERIVATIF ULTRAVIOLET
WIJI ASTUTI
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2006
ABSTRAK WIJI ASTUTI. Metode Analisis Cepat untuk Penentuan Kadar Yohimbin dalam Pausinystalia yohimbe dan Produk Komersialnya secara Spektrofotometri Derivatif Ultraviolet. Dibimbing oleh ELLY SURADIKUSUMAH dan MOHAMAD RAFI. Yohimbin merupakan senyawa alkaloid utama pada tanaman Pausinystalia yohimbe serta banyak digunakan dalam obat-obatan dan produk komersial sebagai afrodisiak dan untuk pengobatan impotensi. Senyawa ini bersifat halusinogenik pada dosis tinggi. Metode yang baik dan dapat dipercaya untuk penetapan kadar yohimbin sangat diperlukan sehingga dapat diketahui dosis pemakaian yang aman sehingga efek negatifnya dapat ditekan. Metode spektrofotometri derivatif ultraviolet (SDUV) dikembangkan untuk penentuan kadar yohimbin pada bubuk korteks P. yohimbe dan produk komersialnya Irex max® tanpa pemisahan awal dan reagen pewarna. Metode ini didasarkan pada pengukuran amplitudo puncak ke garis dasar spektrum derivatif ke-2 pada panjang gelombang (λ) 284.6 nm untuk P. yohimbe dan spektrum derivatif pertama pada λ 290.1 nm untuk produk komersial. Kurva kalibrasi diperoleh linear pada kisaran konsentrasi 5–50 µg ml-1. Koefisien korelasi dan % SBR berturut turut adalah 0.9993 dan 1.15% untuk P. yohimbe serta 0.9998 dan 0.83% untuk produk komersial. Berdasarkan metode penambahan standar diperoleh persen perolehan kembali sebesar 93.31–114.41%. Metode referensi yang digunakan adalah metode kromatografi cair kinerja tinggi Bowman dan PT Bintang Toedjoe Indonesia. Contoh dianalisis menggunakan metode SDUV dan kedua metode referensi. Hasil uji t dan uji F menunjukkan rerata hasil analisis SDUV dan KCKT Bowman tidak berbeda nyata pada nilai kepercayaan 95%.
ABSTRACT WIJI ASTUTI. A Rapid Method for Determination of Yohimbine in Pausinystalia yohimbe and Its Commercial Product by Ultraviolet Derivatif Spectrophotometry. Supervised by ELLY SURADIKUSUMAH and MOHAMAD RAFI. Yohimbine is a major alkaloid compound in Pausinystalia yohimbe and widely used as an aphrodisiac and impotence treatment. It is hallucinogenic in large doses. A good and reliable method for determination of yohimbine was highly desireable in order to know the safe dose, so the negative effects could be minimized. Ultraviolet derivative spectrophotometry (UVDS) method has been developed for determination of yohimbine in P. yohimbe cortex powder and its commercial product Irex max® without pre-separation and color reagent. This method is based on the measurement of peak to baseline amplitude of second derivative spectra at 284.6 nm for P. yohimbe and first derivative spectra at 290.6 nm for commercial product. The callibration curves were linear over the concentration range 5–50 µg ml-1. The correlation coefficients and %RSD were 0.9993 and 1.15% for P. yohimbe and 0.9998 and 0.83% for commercial product, respectively. The recovery was 93.31–114.41% according to standard addition method. High performance liquid chromatography Bowman and Bintang Toedjoe Co methods were used as reference methods. The samples were analyzed by UVDS and both reference methods. The t and F tests showed no significant differences regarding mean values between the results of UVDS and HPLC Bowman methods at 95 % level confidence.
METODE CEPAT UNTUK PENENTUAN KADAR YOHIMBIN DALAM Pausinystalia yohimbe DAN PRODUK KOMERSIALNYA SECARA SPEKTROFOTOMETRI DERIVATIF UV
WIJI ASTUTI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2006
Judul Skripsi : Metode Cepat untuk Penentuan Kadar Yohimbin dalam Pausinystalia yohimbe dan Produk Komersialnya secara Spektrofotometri Derivatif Ultraviolet Nama : Wiji Astuti NIM : G44201005
Disetujui : Pembimbing I,
Pembimbing II,
Ir. Elly Suradikusumah, MS NIP 130350043
Mohamad Rafi, S.Si
Diketahui : Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor
Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, MS NIP 131473999
Tanggal Lulus :
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium Kimia Analitik Departemen Kimia IPB dan laboratorium Pusat Studi Biofarmaka IPB sejak bulan Juni sampai bulan Desember 2005, dengan judul Metode Cepat untuk Penentuan Kadar Yohimbin dalam Pausinystalia yohimbe dan Produk Komersialnya secara Spektrofotometri Derivatif Ultraviolet. Terimakasih penulis ucapkan kepada Ibu Ir. Elly Suradikusumah, MS sebagai pembimbing I dan Bapak Mohamad Rafi, S.Si selaku pembimbing II dari Departemen Kimia IPB atas bimbingannya selama penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Penelitian ini didanai oleh Hibah penelitian A2 dari program Hibah Kompetisi A2 Departemen Kimia. Ucapan terimakasih juga penulis ucapkan kepada Ibu Prof. Dr. Ir. Latifah K. Darusman, MS beserta staf laboratorium Biofarmaka IPB atas bantuannya untuk analisis menggunakan spektrofotometer UV Solutions, Bapak Herry, S.Si dari Balai Budidaya Air Tawar Sukabumi atas bantuannya untuk analisis menggunakan KCKT, dan Bapak Agus Triyantoro, S.Si dari PT Bintang Toedjoe Indonesia atas bantuannya untuk analisis contoh dengan metode KCKT PT Bintang Toedjoe serta pemberian standar yohimbin·HCl, contoh bubuk korteks P. yohimbe dan Irex max®. Selain itu penulis mengucapkan terimakasih kepada Om Eman, laboran-laboran, tim alkaloid dan temanteman laboratorium Kimia Analitik IPB yang telah banyak membantu selama pelaksanaan penelitian, Mas Heri yang telah banyak membantu untuk urusan administrasi kolokium, seminar, dan sidang, sahabatku Eka Sri Handayani, Emil, dan keluarga SAS atas kebersamaannya, juga Mbak Tiwi dan Mbak Nana atas kekeluargaannya. Ucapan terimakasih juga disampaikan kepada Ayah, Ibu, adik-adikku, dan seluruh keluarga atas segala doa dan restunya, Mas Hari Susanto atas doa, dukungan, dan kasih sayangnya serta seluruh pihak yang telah membantu hingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Maret 2006
Wiji Astuti
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Klaten pada tanggal 11 April 1983 dari ayah Drs. Supardijono dan ibu Sumarmi. Penulis merupakan putri pertama dari tiga bersaudara. Tahun 2001 penulis lulus dari SMUN 1 Klaten dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi masuk IPB. Penulis memilih Program Studi Kimia, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten praktikum mata kuliah Kimia Dasar TPB alih tahun pada tahun ajaran 2003/2004, Kimia untuk TPB tahun ajaran 2005/2006, Kimia Anorganik 2 pada tahun ajaran 2004/2005, Spektroskopi pada tahun ajaran 2004/2005, Kimia Analitik pada tahun ajaran 2004/2005, serta mata kuliah Elektroanalitik pada tahun ajaran 2005/2006. Tahun 2002-2004 penulis aktif sebagai pengurus Unit Kegiatan Mahasiswa Paguyuban Seni Gerak Raga Rasa Seroja Putih IPB. Bulan Juli-Agustus 2004 penulis melaksanakan Praktik lapangan di Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI Cibinong dengan judul Seleksi Isolat Monascus purpureus Potensial Penghasil Lovastatin pada Medium Limbah Gandum Jenis Bran.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ......................................................................................................
ix
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... ....
ix
DAFTAR LAMPIRAN...............................................................................................
x
PENDAHULUAN ................................................................................................ ....
1
TINJAUAN PUSTAKA Yohimbin ......................................................................................................... .... Sediaan Herbal ................................................................................................ .... Spektrofotometri ............................................................................................. .... Spektrofotometri Derivatif .............................................................................. .... Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi (KCKT) ................................................ .... Pengembangan dan Validasi Metode Analisis ................................................ ....
1 2 2 2 3 3
BAHAN DAN METODE Alat dan Bahan ............................................................................................... .... Analisis Kuantitatif dengan Metode SDUV ................................................... .... Validasi Metode ............................................................................................... .... Analisis Kuantitatif dengan Metode KCKT Bowman ..................................... .... Analisis Kuantitatif dengan Metode KCKT PT Bintang Toedjoe Indonesia.... ....
4 4 4 5 5
HASIL DAN PEMBAHASAN Penentuan Kondisi Optimum Pengukuran........................................................ .... Validasi Metode ............................................................................................... .... Metode Referensi ............................................................................................. ....
5 8 8
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan .......................................................................................................... .... Saran ................................................................................................................ ....
9 9
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... ....
9
LAMPIRAN ......................................................................................................... ....
12
DAFTAR TABEL Halaman 1 Hasil analisis kuantitatif yohimbin dengan metode SDUV ....................................
8
2 Persen perolehan kembali pada penambahan standar yang dianalisis dengan SDUV.........................................................................................................
8
3 Hasil penentuan yohimbin pada serbuk korteks yohimbe dan produk komersial dengan metode KCKT dan SDUV.........................................................
9
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Struktur kimia yohimbin .................................................................................... ....
2
2 Penurunan spektrum serapan ............................................................................ ....
2
3 Spektrum derivatif pita serapan Gauss .............................................................. ....
2
4 Spektrum derivatif contoh bubuk P. yohimbe, produk komersial Irex max®, dan standar yohimbin pada konsentrasi 20 µg ml-1 ................................................. ....
6
5 Spektrum serapan standar, bubuk korteks P. yohimbe, dan produk komersial Irex max® pada konsentrasi 20 µg ml-1 pada berbagai kecepatan penyapuan ......... ....
7
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Bagan alir penelitian secara umum .................................................................... ....
13
2 Data persen perolehan kembali pada uji akurasi bubuk korteks P. yohimbe dan herbal komersial Irex max® dengan metode SDUV .......................................... ....
14
3 Kromatogram yang diperoleh dari KCKT metode Bowman ............................ ....
15
4 Kurva standar bubuk korteks P. yohimbe dan produk komersial yang dianalisis dengan KCKT metode Bowman ....................................................................... ....
18
5 Uji statistik (uji t dan uji F) pada bubuk korteks P. yohimbe dengan metode SDUV dan KCKT Bowman .............................................................................. ....
19
6 Uji statistik (uji t dan uji F) pada produk komersial Irex max® dengan metode SDUV dan KCKT Bowman .............................................................................. ....
21
7 Uji statistik (uji t dan uji F) pada bubuk korteks P. yohimbe dengan metode SDUV dan KCKT PT Bintang Toedjoe ............................................................ ....
22
8 Uji statistik (uji t dan uji F) pada produk komersial Irex max® dengan metode SDUV dan KCKT PT Bintang Toedjoe............................................................ ....
23
PENDAHULUAN Yohimbin merupakan senyawa alkaloid utama pada tanaman Pausinystalia yohimbe (P. yohimbe) serta banyak digunakan dalam obat-obatan dan produk komersial sebagai afrodisiak dan pengobatan terhadap impotensi (Singh et al. 2004; Arruda & Aucellio 2002). Selain memiliki efek positif yang bermanfaat, senyawa ini dapat menyebabkan beberapa efek samping, seperti parestesia, insomnia, hipertensi, gemetar, sakit kepala, antidiuresis, dan pada dosis tinggi merupakan halusinogen yang berbahaya. Penetapan kadar yohimbin dalam produk komersial atau obat-obatan sangat diperlukan mengingat pentingnya untuk mengetahui dosis pemakaian yohimbin yang aman dan tepat agar efek negatifnya dapat diminimalkan. Beberapa teknik analisis kuantitatif telah dikembangkan untuk menentukan kandungan yohimbin dalam contoh. Teknik analisis tersebut antara lain fosforimetri (Arruda & Aucelio 2002), spektrofotometri (Singh et al. 2004), kromatografi gas-spektrometri massa (Betz et al. 1995), dan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) (Chiba et al. 1998). Metode spektrofotometri memiliki sensitifitas yang cukup rendah untuk alkaloid indol (limit deteksinya pada kisaran µg g-1), sedangkan fluorometri, limit deteksinya lebih baik tetapi harus digabungkan dengan teknik pemisahan seperti KCKT (Arruda & Aucellio 2002). Fosforimetri telah ditetapkan sebagai teknik yang bagus untuk penentuan molekul organik dalam jumlah kecil dan selektivitasnya dapat ditingkatkan dengan menggunakan optimasi beberapa variabel eksperimen (Arruda & Aucelio 2002), akan tetapi terhambat oleh ketidaksediaan peralatan. KCKT dan KG-SM merupakan metode analisis yang sangat baik dan sensitif tetapi membutuhkan peralatan dan bahan kimia yang cukup mahal. Spektrofotometri derivatif ultraviolet (SDUV) merupakan teknik analisis yang banyak dikembangkan saat ini dan telah diaplikasikan pada berbagai bidang. Teknik analisisnya menggunakan kombinasi dua metode yaitu, kemometrik (analisis data kimia) dan spektrofotometri ultraviolet (UV). Alasan berkembangnya teknik SDUV ini disebabkan adanya beberapa keuntungan seperti peningkatan resolusi spektrum yang bertumpang tindih, mampu menghasilkan daerah sidik jari yang jauh lebih baik daripada spektrum absorbsi, dan dapat mereduksi gangguan matriks (O’Haver 1979; Popovic et al. 2000;
Skujins 1986). SDUV saat ini banyak digunakan untuk analisis kuantitatif pada senyawa-senyawa organik, karakterisasi dan kontrol kualitas dalam bidang farmasi, anorganik, biokimia dan biomedis (Popovic et al. 2000; Skujins 1986). Teknik SDUV saat ini telah digunakan untuk analisis berbagai senyawa organik, seperti butamirat sitrat dalam obat batuk (Malliou et al. 2003), pseudoefedrin sulfat dan deksbrompeniramin maleat dalam sediaan farmasi (Palabiyik & Onur 2004), permethrin dalam sampo (Kazemipour et al. 2002), kafein dalam minuman cola, kopi, dan teh (Alpdogan et al. 2002), asam askorbat pada sayursayuran (Aydogmus et al. 2004), melatonin dan piridoksin HCl dalam campuran biner (Uslu et al. 2002), lamivudin dan zidovudin dalam campuran biner (Uslu & Ozkan 2002), serta losartan dalam obat (Ansari et al. 2004). Sepanjang pengetahuan penulis, penelitian yang menggunakan SDUV untuk analisis kuantitatif yohimbin dalam suatu contoh herbal sampai saat ini belum ada. Mengingat banyaknya keuntungan yang dapat diperoleh dari teknik SDUV, perlunya untuk menetapkan kadar yohimbin dalam contoh guna mengantisipasi efek negatif yang ditimbulkan, serta telah banyaknya aplikasi penggunaan SDUV untuk analisis kuantitatif senyawa-senyawa organik, maka penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan penggunaan SDUV guna penentuan kadar yohimbin dalam contoh bubuk korteks P. yohimbe dan produk komersialnya yaitu Irex max®. Ketelitian dan keakuratan metode ini dievaluasi menggunakan beberapa parameter validasi, yaitu linearitas, presisi, limit deteksi, limit kuantitasi, dan akurasi. Penelitian ini berlangsung antara bulan Juni sampai Desember 2005 serta dilaksanakan di laboratorium Kimia Analitik Departemen Kimia dan laboratorium Pusat Studi Biofarmaka Institut Pertanian Bogor.
TINJAUAN PUSTAKA Yohimbin Yohimbin (metil 17α-hidroksiyohimban16α-karboksilat) yang memiliki rumus molekul C21H26N2O3 (BM = 354.43 g mol-1) adalah alkaloid indol yang dapat ditemukan pada berbagai tanaman (Chiba et al. 1998). Selain P. yohimbe (Betz et al. 1995) dan P. pachyceras (Staerk et al. 2000) yang banyak
ditemukan di Afrika Barat, yohimbin juga dapat ditemukan pada tanaman pule pandak (Rauwolfia serpentina) (Singh et al. 2004; Arruda & Aucelio 2002). Struktur kimia yohimbin dapat dilihat pada Gambar 1. H
N
N H
H H
Penentuan nilai gradien tunggal dA/dλ diplot versus panjang gelombang (λ) akan menghasilkan plot derivatif ke-1. Plot derivatif ke-1 ini dapat menjadi subjek kemiringan yang sama untuk menghasilkan nilai d2A/dλ2 saat diplot versus λ yang memberikan nilai derivatif ke-2. Hal ini berlangsung lebih lanjut pada derivatif yang berikutnya hingga ke-n, sehingga menghasilkan dnA/dλn versus λ. Spektrum derivatif pita serapan Gauss dapat dilihat pada Gambar 3 (Owen 1996).
OH O O
dA dλ
A
Gambar 1 Struktur kimia yohimbin. Sediaan herbal Sediaaan herbal yang digunakan pada penelitian adalah bubuk korteks P. yohimbe (yang diperoleh dari PT Bintang Toedjoe Indonesia) dan produk komersialnya yaitu Irex max®. Komposisi herbal dalam Irex max® antara lain, kulit kayu P. yohimbe 125 mg, Eurycoma longifolia radix 30 mg, Panax ginseng radix 50 mg, dan Retrofrakti fructus 5 mg. Spektrofotometri Metode spektrofotometri adalah metode analisis yang didasarkan pada interaksi antara cahaya (radiasi elektromagnetik) dengan materi. Dasar analisis kuantitatif metode spektrofotometri adalah hukum Lambert-Beer, yaitu A = ε.b.c dengan A adalah absorbansi, ε absorbtivitas molar (L cm-1 mol-1), b panjang sel (cm), dan c konsentrasi (mol L-1) (Hendayana et al. 1994). Spektrofotometri Derivatif Konsep derivatisasi spektrum telah ada sejak tahun 1953. Proses derivatisasi spektrum dilakukan dengan cara menurunkannya dengan persamaan matematis pada spektrumnya, seperti menentukan gradien spektrum serapan (Gambar 2).
Gambar 2 Penurunan spektrum serapan.
λ
λ
(a)
(b)
2
dA dλ2
d3 A dλ3
λ
λ
(c)
(d)
d4A dλ4 λ
(e) Gambar 3
Spektrum derivatif pita serapan Gauss (a) derivatif ke-0, (b) derivatif ke-1, (c) derivatif ke-2, (d) derivatif ke-3, dan (e) derivatif ke-4.
Spektrum derivatif yang dihasilkan oleh spektrofotometer dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain fungsi celah monokromator, keseluruhan tingkat noise, noise karena adanya konversi analog ke digital, tipe penghalusan yang digunakan, jumlah dan frekuensi data yang dikumpulkan, jumlah data yang diambil untuk penghalusan, dan metode derivatisasi yang digunakan (Skujins 1986). Noise adalah gangguan yang disebabkan oleh sifat instrumen elektronik dan hasil distribusi statistik foton yang diemisikan oleh sumber cahaya (Owen 1996). Spektrum derivatif dari alat dengan merk berbeda memiliki beberapa perbedaan dalam beberapa hal yaitu, amplitudo dan lebar puncak yang dihasilkan, perbandingan amplitudo dan lebar puncak, rasio sinyal dengan noise (S/N), serta perbedaan pan-
jang gelombang yang memberikan serapan maksimum (Skujins 1986). Analisis kuantitatif pada spektrofotometri derivatif menggunakan pengukuran amplitudo versus konsentrasi dengan distorsi spektrum yang dapat diterima selama pengaruh S/N terhadap ketelitian pengukuran dipertahankan minimum. Dasar analisis kuantitatifnya adalah hukum Lambert-Beer. Hukum ini pada derivatif ke-n yang diturunkan terhadap λ dirumuskan dengan rumus berikut: dnA dnε = n ⋅c⋅d dλn dλ dengan A adalah absorban, ε absorbtivitas molar (M-1cm-1), c konsentrasi (M) dan d lebar celah (cm) (Fell et al. 1981). Berdasarkan persamaan tersebut konsentrasi analat berbanding lurus dengan amplitudo puncak derivatif ke-n pada panjang gelombang tertentu. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) KCKT merupakan teknik pemisahan dan digunakan secara luas untuk analisis kuantitatif. Alasan kepopulerannya karena sensitif, dapat digunakan untuk pengukuran kuantitatif yang akurat, serta cocok untuk pemisahan spesi non volatil dan bahan utama industri (Skoog et al. 1998). KCKT berbeda dengan kromatografi klasik, pada KCKT menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, yaitu 2–8 mm, dengan ukuran partikel penunjang 50 µm, dan laju aliran dipertinggi dengan tekanan tinggi (Khopkar 1990). Analisis kualitatif KCKT menggunakan parameter waktu retensi dan kuantitatif menggunakan parameter luas puncak (Hargiss 1988). Pengembangan dan Validasi Metode Analisis Pengembangan metode analisis Pengembangan metode analisis dilakukan untuk menunjukkan bahwa metode tersebut merupakan metode yang cocok untuk tujuan yang diinginkan. Menurut Eurachem (1998) terdapat dua bentuk pengembangan metode, pertama memulai ide yang baru, keahlian dan pengalaman untuk menghasilkan metode yang cocok dan kedua adalah mengadopsi metode yang telah ada dan dibuat perubahan kecil sehingga cocok untuk penerapan yang baru. Setelah dilakukan pengembangan metode, maka metode tersebut perlu divalidasi.
Validasi metode Validasi metode adalah suatu proses untuk membuktikan bahwa metode analisis diterima untuk suatu tujuan yang diinginkan. Parameter validasi menurut International Conference on Harmonization (ICH) adalah linearitas, presisi (keterulangan, keterulangan menengah, dan reprodusibilitas/ ketertiruan), limit deteksi, limit kuantitasi, akurasi, kisaran, robustness, dan spesifitas (ICH 1995) Linearitas Linearitas merupakan kemampuan untuk memperoleh hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi (jumlah) analat dalam contoh. Linearitas dicapai apabila nilai r2 yang diperoleh ≥ 0.997 (ICH 1995). Presisi Presisi merupakan kedekatan nilai diantara sejumlah pengukuran yang diperoleh dari sejumlah contoh yang diukur dibawah kondisi yang sama. Presisi yang digunakan pada penelitian ini hanya 1 pengujian, yaitu keterulangan pada hari yang sama. Persen simpangan baku relatif (% SBR) ditentukan untuk melihat hasil uji presisi dan dirumuskan sebagai:
SB=
[∑ i (x i -x) 2 ]1/2 (n-1)1/2
SBR (%) =
100.SB x
dengan SB ialah simpangan baku, xi kadar zat aktif pada setiap pengulangan, x kadar zat aktif rata-rata, n jumlah pengulangan, dan SBR ialah simpangan baku relatif. Uji presisi dapat diterima apabila nilai % SBR yang diperoleh ≤ 2.0% (ICH 1995). Limit deteksi dan limit kuantitasi Limit deteksi (LD) adalah konsentrasi analat terkecil yang menghasilkan respon yang dapat terdeteksi diatas tingkatan noise dari sistem biasanya 3 kali sistem noise. Limit kuantisasi (LK) adalah konsentrasi analat terendah yang dapat diukur secara tepat dan akurat. Menurut ICH (1995) LD dan LK dapat ditentukan dengan simpangan baku intersep, dengan rumus:
LD=
SB x3.3 S
LK=
SB x10 S
dengan SB merupakan simpangan baku intersep kurva kalibrasi dan S merupakan kemiringan kurva kalibrasi. Akurasi Akurasi adalah kedekatan nilai yang telah didapat dibandingkan dengan nilai yang diperoleh dari metode referensi (ICH 1995). Akurasi dilaporkan sebagai persen perolehan kembali dengan penambahan sejumlah analat ke dalam contoh yang diketahui konsentrasinya dan dibandingkan nilai yang terukur dengan nilai yang sebenarnya. Persen perolehan kembali, dapat ditentukan dengan rumus : Perolehan kembali (%) =
(CT-CS) × 100% CD
dengan CT merupakan jumlah senyawa yang diperoleh dari penetapan kadar dengan metode yang kita digunakan, CS jumlah senyawa dalam contoh, dan CD jumlah standar yang ditambahkan. Nilai persen perolehan kembali yang diharapkan dari substansi obat dalam campuran adalah 98.0–102.0% (ICH 1995).
BAHAN DAN METODE Alat dan Bahan
Metode KCKT menggunakan peralatan KCKT Thermofiniggan dengan kolom Chromosorb C-8. KCKT dioperasikan pada laju alir 1.0 ml menit-1, detektor UV 274 nm, volume injeksi 10 µl, dan fase gerak adalah asetonitril dan bufer (40:60 v/v). Fase gerak disaring dengan membran penyaring 0.45 µm. Metode SDUV menggunakan peralatan spektrofotometer UV-Vis Hitachi U 2800 dengan piranti lunak UV Solution keluaran Hitachi versi 2.0 dan kuvet kuarsa berukuran 1 cm. Bahan-bahan yang digunakan adalah produk komersial Irex max® (tiap kapsul mengandung 125 mg kulit kayu P. yohimbe), bubuk korteks P. yohimbe (diperoleh dari PT Bintang Toedjoe Indonesia, klaim label mengandung 1.54% yohimbin), air destilata, standar yohimbin·HCl, metanol untuk KCKT, dan larutan bufer (bufer disiapkan dengan melarutkan 2 ml asam trifluorosetat dan 1 ml trietilamina dalam air deionisasi, ditera hingga 1 liter dengan air deionisasi, kemudian pH dibuat menjadi 2.4 dengan amonium hidroksida).
Analisis Kuantitatif dengan Metode SDUV Pemilihan orde derivatisasi Yohimbin·HCl dilarutkan pada konsentrasi 20 µg ml-1 yohimbin. Bubuk korteks P. yohimbe dan produk komersial Irex max® dipreparasi hingga diperoleh konsentrasi akhir setara dengan 20 µg ml-1 yohimbin. Spektrum derivatif nol sampai tiga diperoleh dengan meragamkan kecepatan penyapuan, orde derivatif, orde penghalusan, dan jumlah jendela untuk penghalusan. Preparasi larutan standar Larutan stok standar yohimbin 100 µg ml-1 disiapkan dengan cara ditimbang sejumlah standar yohimbin·HCl setara dengan 0.0100 g yohimbin, dilarutkan dengan akuabidestilata, dihomogenkan dengan vorteks selama 10 menit kemudian ditera hingga 100 ml dengan akuabidestilata. Kurva kalibrasi diperoleh dengan mengencerkan larutan stok dengan akuabidestilata hingga dihasilkan konsentrasi: 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, dan 50 µg ml-1. Preparasi larutan contoh Sejumlah bubuk korteks P. yohimbe dan produk komersial ditimbang dengan bobot setara dengan 500 µg yohimbin, dilarutkan dengan akuabidestilata, lalu dihomogenkan dengan vorteks selama 10 menit. Masingmasing campuran kemudian disaring dan ditera pada labu takar 25 ml dengan akuabidestilata hingga dihasilkan konsentrasi akhir setara dengan 20 µg ml-1 yohimbin. Validasi Metode Uji linearitas Kurva kalibrasi diperoleh dengan 8 tingkat konsentrasi yohimbin, yaitu 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, dan 50 µg ml-1 dan masing-masing tingkat konsentrasi dibuat 3 kali ulangan. Linearitas ditentukan melalui metode regresi kuadrat terkecil. Uji presisi Presisi metode ini ditentukan dengan keterulangan pada hari dan konsentrasi yang sama. Masing-masing contoh dibuat sebanyak 6 kali ulangan dan disiapkan seperti prosedur yang telah terurai sebelumnya. Limit deteksi dan limit kuantitasi Limit deteksi dan limit kuantitasi ditentukan dengan menggunakan simpangan baku intersep dan kemiringan kurva standar. Rumus
yang digunakan seperti telah dijelaskan pada bab sebelumnya.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji akurasi Akurasi dilaporkan sebagai nilai persen perolehan kembali. Sejumlah bubuk korteks P. yohimbe dan produk komersial ditimbang dengan bobot setara dengan 5.0 mg yohimbin dilarutkan dengan akuabidestilata, kemudian dihomogenkan dengan vorteks selama 10 menit. Masing-masing campuran disaring dan ditera pada labu takar 100 ml dengan air akuabidestilata. Sejumlah 5.00 ml dari larutan ini dimasukkan dalam labu takar (25 ml) yang mengandung 3.75, 6.25, dan 8.75 ml standar yohimbin (100 µg ml-1), dan ditera dengan air akuabidestilata hingga dihasilkan konsentrasi akhir setara dengan 25, 35, dan 45 µg ml-1 yohimbin. Masing-masing tingkat konsentrasi disiapkan dalam 3 kali ulangan.
Penentuan Kondisi Optimum Pengukuran
Analisis Kuantitatif dengan Metode KCKT (Bowman et al. 1996, diacu dalam Lunn 2000) Preparasi larutan standar Larutan stok standar yohimbin 100 µg ml-1 disiapkan dengan cara ditimbang sejumlah standar yohimbin·HCl setara dengan 0.0100 g yohimbin, lalu dilarutkan dalam metanol, dihomogenkan dengan vorteks selama 30 menit, dan ditera dengan metanol hingga volume akhir 100 ml. Kurva kalibrasi diperoleh dengan mengencerkan larutan stok dengan metanol hingga dihasilkan 3 tingkat konsentrasi: 10, 30, dan 50 µg ml-1. Preparasi larutan contoh Sejumlah bubuk korteks P. yohimbe dan produk komersial ditimbang dengan bobot setara dengan 750 µg yohimbin dilarutkan dengan metanol, kemudian dihomogenkan dengan vorteks selama 30 menit. Masingmasing campuran kemudian disaring dan ditera pada labu takar 25 ml dengan metanol. Analisis Kuantitatif dengan Metode KCKT (PT Bintang Toedjoe Indonesia)
Metode tidak dapat dipublikasikan. Bagan alir penelitian secara umum dapat dilihat pada Lampiran 1.
Spektrum serapan bubuk korteks P. yohimbe dan produk komersial Irex max® yang terukur dengan metode spektrofotometri UV konvensional menunjukkan serapan yang lebih tinggi walaupun disiapkan pada konsentrasi yang sama dengan standar yaitu setara dengan 20 µg ml-1 yohimbin (Gambar 5a1 dan 4a2). Hal ini terjadi karena adanya gangguan matriks substansi-substansi yang menyerap sinar UV pada contoh serta adanya hamburan larutan dan suspensi yang masih terbawa pada saat penyaringan. Berkaitan dengan hal tersebut maka metode spektrofotometri UV konvensional tidak cocok digunakan untuk analisis kuantitatif yohimbin dalam kedua contoh karena yang terukur bukan hanya serapan yohimbin tetapi juga serapan matriks dari contoh. Metode SDUV yang berdasarkan pada transformasi fungsi matematika spektrum dapat mengatasi masalah tersebut karena proses derivatisasi dapat mengurangi efek serapan matriks contoh. Hal ini dapat dijelaskan karena matriks pengganggu yang dapat diperkirakan sebagai fungsi linear atau fungsi kuadrat dengan melalui beberapa kali proses derivatisasi maka efek matriks pengganggu dapat dikurangi secara sempurna. Berdasarkan hal tersebut maka orde derivatisasi bergantung pada fungsi polinomial yang digunakan untuk menggambarkan efek pengganggu (Popovic et al. 2000). Spektrum derivatif ke-1, 2, dan 3 bubuk korteks P. yohimbe dan produk komersial Irex max® pada kisaran panjang gelombang (λ) 200–370 nm dapat dilihat pada Gambar 4. Spektrum derivatif ke-1 dan ke-2 pada kecepatan penyapuan 200 nm menit-1 dengan faktor penghalusan yang tinggi (Orde penghalusan 3 untuk kedua contoh serta jumlah jendela 43 untuk bubuk korteks P. yohimbe dan 27 untuk produk komersial Irex max® dipilih sebagai kondisi optimum untuk penentuan kadar yohimbin pada kedua contoh). Amplitudo puncak ke garis dasar (Dz) spektrum derivatif ke-2 pada λ 286.4 nm (2D286.4) dipilih sebagai kondisi optimum untuk penentuan kadar yohimbin dalam bubuk korteks P. yohimbe (Gambar 4c1). Efek matriks pengganggu telah tereliminasi dengan baik pada kondisi ini. Hal ini ditunjukkan dengan adanya tumpang tindih sempurna spektrum contoh bubuk korteks P. yohimbe dan standar
2.5
2.5
2.0
2.0
1.5
1.5
1.0
1.0
0.5
0.5
0.0
0.0
200
250
300
350
nm
200
250
(a1)
300
350
nm
(a2)
0.020
0.020
0.015
0.015
0.010
0.010
0.005
0.005
0.000
0.000
-0.005
-0.005
-0.010
-0.010 -0.015
-0.015
-0.020
-0.020
-0.025
-0.025
-0.030
-0.030
-0.035
-0.035
-0.040
-0.040
-0.045
-0.045 200
250
300
350
nm
200
250
(b1)
300
nm
350
(b2)
0.0010 0.0010
0.0005
0.0005
0.0000
0.0000
-0.0005
-0.0005
-0.0010
-0.0010
200
250
300
350
nm
200
250
(c1)
300
350
nm
(c2) 0.00015
0.00010
0.00010 0.00005
0.00005
0.00000 0.00000
-0.00005 -0.00005
-0.00010 200
250
300
(d1)
350
nm
200
250
300
350
nm
(d2)
Gambar 4 Spektrum derivatif contoh bubuk korteks P. yohimbe (—), produk komersial Irex max® (—), dan standar yohimbin (—) pada konsentrasi 20 µg ml-1 : (a) spektrum serapan/ derivatif ke-0, (b) derivatif ke-1, (c) derivatif ke-2, (d) derivatif ke-3.
sehingga menandakan hanya serapan senyawa yohimbin saja yang terlihat pada daerah tersebut. Spektrum derivatif ke-3 pada Gambar 4d1 terlihat bertumpang tindih antara spektrum contoh dan standar, tetapi tidak dipilih sebagai kondisi optimum untuk penentuan kadar. Hal dilakukan karena semakin tinggi orde derivatif maka akan semakin tinggi pula noise yang dihasilkan sehingga akan menurunkan nilai rasio sinyal dengan noise (S/N) (Popovic et al. 2000). Kondisi optimum untuk penentuan kadar yohimbin dalam produk komersial dipilih pada Dz spektrum derivatif ke-1 pada λ 290.6 nm (1D290.6) seperti yang tersaji pada Gambar 4b2. Tumpang tindih antara spektrum standar dan contoh memang tidak sempurna seperti pada kondisi 2D286.4, tetapi pada kondisi ini serapan matriks penggangu telah tereliminasi dengan baik bila dibandingkan kondisi yang lain seperti terlihat pada Gambar 4c2 dan 4d2. Perbedaaan pemilihan orde derivatif yang digunakan untuk penentuan kadar yohimbin pada kedua contoh karena adanya perbedaan matriks pengisi atau perbedaan senyawasenyawa yang terkandung pada kedua contoh tersebut. Alkaloid yang terdapat pada kulit kayu dan korteks P. yohimbe antara lain: yohimbin, β-yohimbin, pseudoyohimbin, ajmalisin, dan alkaloid-alkaloid minor seperti aloyohimbin, korinantin dan korinantein (Kutney & Brown 1966, diacu dalam Zanolari 2006). Selain alkaloid-alkaloid tersebut pada produk komersial Irex max® juga terdapat senyawa-senyawa turunan saponin, tanin, dan senyawa-senyawa lain yang secara fisiologis dapat melancarkan sirkulasi atau peredaran darah pada sistem syaraf pusat atau sistem syaraf tepi yang berasal dari tanaman-tanaman afrodisiak lain yang menjadi pengisi dalam produk komersial tersebut, yaitu Eurycoma longifolia radix, Panax ginseng radix, dan Retrofrakti fructus. Kecepatan penyapuan berhubungan dengan resolusi spektrum yang dihasilkan. Semakin tinggi kecepatan penyapuan yang digunakan maka resolusi yang dihasilkan menjadi kurang baik. Kecepatan penyapuan yang digunakan adalah 100, 200, 400, 800, dan 1200 nm menit-1 (Gambar 5). Resolusi puncak yang cukup baik terlihat pada kecepatan penyapuan 100 dan 200 nm menit-1 (Gambar 5a dan 5b). Kecepatan penyapuan yang dipilih sebagai kondisi optimum adalah kecepatan penyapuan 200 nm menit1 karena memiliki resolusi yang cukup baik dengan waktu penyapuan yang lebih cepat.
2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 200
250
300
350
nm
(a) 2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0 200
250
(b)
300
350
nm
2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 200
250
(c)
300
350
300
350
nm
2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 200
250
nm
(d) 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 200
250
300
350
nm
(e) Gambar 5 Spektrum serapan standar (—), bubuk korteks P. yohimbe (—), dan produk komersial Irex max® (—) pada konsentrasi 20 µg ml-1 pada berbagai kecepatan penyapuan: (a) 100, (b) 200, (c) 400, (d) 800, (e) 1200 nm menit-1.
Validasi Metode
Tabel 2
Parameter validasi metode yang digunakan adalah linearitas, presisi, limit deteksi (LD), limit kuantitasi (LK), dan akurasi. Kurva kalibrasi yohimbin dengan metode SDUV merupakan hubungan antara Dz dan konsentrasi standar. Kurva kalibrasi standar untuk penentuan kadar yohimbin dalam bubuk korteks P. yohimbe dengan metode regresi kuadrat terkecil adalah y = 2.6185.10-6 + 7.8649.10-6x, y merupakan nilai Dz yohimbin pada derivatif ke-2 (λ 286.4) dan x merupakan konsentrasi yohimbin dalam µg ml-1. Kurva kalibrasi pada produk komersial adalah y = 1.4168.10-4 + 4.2275.10-4x, y merupakan nilai Dz yohimbin pada derivatif ke-1 pada λ 290.6 dan x merupakan konsentrasi yohimbin dalam µg ml-1. Metode ini linear pada kisaran konsentrasi 5–50 µg ml-1. Berdasarkan metode regresi kuadrat terkecil dihasilkan linearitas yang bagus dan mematuhi hukum Beer, ditunjukkan dengan nilai koefisien korelasi (r) yang mendekati 1, yaitu 0.9993 dan 0.9998. Nilai simpangan baku intersep yang menunjukkan perkiraan variabilitas metode serta simpangan baku kemiringan yang menunjukkan simpangan sensitifitas regresi pada masing-masing kondisi juga ditentukan dengan nilai seperti terlihat pada Tabel 1 (ICH 1995). Presisi/ keterulangan pada hari yang sama dikatakan bagus dan ditunjukkan dengan nilai %SBR <2% (ICH 1995) dari 6 kali ulangan contoh, yaitu 1.15% dan 0.83%. Nilai LD dan LK juga ditentukan dengan metode ini (Tabel 1). Keakuratan metode ini ditunjukkan dengan nilai persen perolehan kembali. Nilai persen perolehan kembali dengan metode penambahan standar berada pada kisaran 93.31–114.41% (Tabel 2). Berdasarkan hasil tersebut, akurasi SDUV pada penentuan kadar yohimbin dalam bubuk korteks P. yohimbe dan produk komersial dikatakan cukup baik sehingga dapat menjadi metode alternatif untuk kontrol kualitas dalam industri jamu dan farmasi.
Persen perolehan kembali pada penambahan standar yang dianalisis dengan SDUV % perolehan kembali ± batas galat * 114.41 ± 0.00 102.65 ± 7.34 93.31 ± 0.00
Contoh Bubuk korteks P. yohimbe
*
Produk 104.91 ± 1.04 komersial 101.47 ± 0.33 100.97 ± 1.36 Irex max® Rerata dari 3 ulangan dan batas galat pada tingkat kepercayaan 95% (Lampiran 2)
Metode Referensi
Metode referensi yang digunakan adalah metode KCKT Bowman (1996, diacu dalam Lunn 2000) dan PT Bintang Toedjoe Indonesia. Metode KCKT Bowman menggunakan fasa terbalik dengan fase gerak asetonitril dan bufer (40:60 v/v), laju alir 1.0 ml menit-1, kolom C-8, detektor UV 274 nm, dan volume injeksi 10 µl. Berdasarkan metode ini puncak yohimbin terlihat pada waktu retensi 6.1 menit (Lampiran 3). Kurva kalibrasi yohimbin dengan metode ini merupakan hubungan antara luas puncak dan konsentrasi standar. Kelinearan kurva berada pada kisaran 10–50 µg ml-1 dengan nilai koefisien korelasi (r) yang cukup tinggi, yaitu 0.9987 (Lampiran 4), sedangkan untuk metode KCKT PT Bintang Toedjoe tidak dapat dipublikasikan. Nilai kadar yohimbin dalam bubuk korteks P. yohimbe dan produk komersial Irex max® ditentukan dengan metode KCKT Bowman dan PT Bintang Toedjoe serta metode SDUV. Nilai keterulangan metode SDUV lebih baik, dapat dilihat dari nilai %SBR<2% (ICH 1995). Perbandingan hasil dari metode KCKT dan SDUV menunjukkan nilai yang cukup baik seperti terlihat pada Tabel 3 yang ditunjukkan dengan uji statistik untuk membandingkan nilai ragam (uji F) dan nilai rerata (uji t) kadar yohimbin yang diperoleh dari masing-masing metode. Berdasarkan uji F, nilai ragam hasil analisis pada kedua contoh
Tabel 1 Hasil analisis kuantitatif yohimbin dengan metode SDUV Parameter Kondisi Kisaran konsentrasi (µg ml-1) Persamaan regresi Koefisien korelasi Simpangan baku intersep Simpangan baku kemiringan %SBR* LD (µg ml-1) LK (µg ml-1) * Pengukuran 6 kali ulangan
Bubuk korteks P. yohimbe 2 D286.4 5–50 y = 2.6185.10-6 + 7.8649.10-6x 0.9993 2.0249.10-6 2.8901.10-7 1.15 0.9459 2.8664
Produk komersial Irex max® 1 D290.6 5–50 y = 1.4168.10-4 + 4,2275.10-4x 0.9998 1.6651.10-4 1.1471.10-5 0.83 1.2998 3.9387
Tabel 3 Hasil penentuan kadar yohimbin pada bubuk korteks P. yohimbe dan produk komersial dengan metode KCKT dan SDUV Klaim label (%) Bubuk korteks P. yohimbe Rerata kadar (%) 1.54 ± batas galatc %SBR F hitung F tabel t hitung t tabel Material
KCKT Bowmana
Uji statistik SDUV dan KCKT Bowman
1.62 ± 0.12 2.83
SDUVb
Uji statistik SDUV dan KCKT PT Bintang Toedjoe
1.62 ± 0.02 6.063** 5.786 0.000* 4.303
1.15
Produk komersial Irex max® Rerata kadar (%) – 0.46 ± 0.04 0.49 ± 0.004 ± batas galatc %SBR 3.33 0.83 F hitung 14.062** 5.786 F tabel t hitung 3.337* 4.303 t tabel a Rerata 3 kali ulangan, b Rerata 6 kali ulangan c Batas galat pada nilai kepercayaan 95% * Tidak berbeda nyata, ** berbeda nyata pada nilai kepercayaan 95%
menggunakan metode KCKT Bowman dan SDUV berbeda secara signifikan (σKCKT2 ≠ σUVDS2) pada tingkat kepercayaan 95% ditunjukkan dengan nilai F hitung yang lebih besar dari F tabel (Lampiran 5 dan 6). Uji t dengan H0 = µKCKT = µUVDS dan H1 = µKCKT ≠ µUVDS (H = hipotesis, µ = rerata), dihasilkan nilai t hitung pada masing-masing contoh lebih kecil dari nilai t tabel (Lampiran 5 dan 6). Berdasarkan hasil tersebut maka nilai rerata pada kedua contoh yang diperoleh dari kedua metode tersebut tidak berbeda secara signifikan, jadi hipotesis uji (H0) yang menyatakan rerata hasil yang diperoleh dengan metode SDUV sama dengan rerata KCKT dapat diterima secara statistik. Nilai ragam dan rerata kadar yohimbin pada kedua contoh yang diperoleh dari metode KCKT PT Bintang Toedjoe dan SDUV menunjukkan nilai F dan t hitung lebih besar dari nilai F dan t tabel (Lampiran 7 dan 8). Berdasarkan hasil tersebut maka H0 ditolak karena nilai rerata kadar yohimbin yang diperoleh dari kedua metode tersebut tidak sama secara statistik (µKCKT ≠ µUVDS).
KCKT PT Bintang Toedjoeb 2.35 ± 0.13 5.23
43.659** 5.050 14.386** 2.571
0.54 ± 0.01 8.941** 5.050 9.521** 2.365
2.26
pa membutuhkan preparasi contoh yang cukup kompleks dan menunjukkan hasil yang cukup baik secara statistik ketika dibandingkan dengan metode referensi KCKT Bowman. Validasi metode menunjukkan bahwa metode ini cukup baik digunakan pada penentuan kadar dan kontrol kualitas yohimbin dalam industri jamu dan farmasi. Saran
Penelitian ini hanya menggunakan bebe-rapa parameter validasi yaitu, linearitas, pre-sisi pada hari yang sama, limit deteksi, limit kuantitasi, dan akurasi sebagai pengevaluasi hasil. Perlu dilakukan validasi metode dengan parameter validasi yang lain seperti presisi menengah, robustness, reprodusibilitas, spesifitas, dan uji kesesuaian sistem, sehingga lebih menyakinkan lagi bahwa metode ini memang baik dan dapat digunakan sebagai kontrol kualitas dalam industri farmasi dan jamu.
DAFTAR PUSTAKA SIMPULAN DAN SARAN Simpulan
Metode SDUV merupakan metode yang cukup baik dan dapat dipercaya untuk analisis yohimbin pada bubuk korteks P. yohimbe dan produk komersial Irex max® tan-
Alpdogan G, Karabina K, Sungur S. 2002. Derivative spectrophotometric determination of caffeine in some beverages. Turk J Chem 26:295-302. Ansari M, Kazemipour M, Baradaran M, Jalalizadeh H. 2004. Derivative spectrophotometric method for determination of losar-
tan in pharmaceutical formulation. IJPT 3:21-25. Arruda AF, Aucelio RQ. 2002. Roomtemperature phosphorimetry for the selective determination of yohimbine in the presence of reserpine-like indolic alkaloids. Anal Sci 18:831-834. Aydogmus Z, Cetin SM, Ozgur MU. 2001. Determination of ascorbic acid in vegetables by derivatif spectrophotometry. Turk J Chem 26:697-704. Betz JM, White KD, der Marderosian AH. 1995. Gas chromatographic determination of yohimbine in P. yohimbe products commercial [Abstrak]. J AOAC 78:1189-1194. Chiba R, Shinriki M, Ishii Y, Tanaka A. 1998. High performance liquid chromatographic determination of yohimbine in serum by chemiluminescence detection. Anal Sci 14: 975-978. Eurachem, A Focus for Analytical Chemistry in Europe. 1998. The fitness for purpose of analytical methods. Theddington: LGC. Fell AF, Jarvle DR, Stewart MJ. 1981. Analysis for paraquat by second- and fourth-derivative spectroscopy. Clin Chem 27:288-292. Hargiss LG. 1988. Analytical Chemistry Principles and Techniques. New Jersey: Prentice-Hall. Hendayana S, Kadarohman A, Sumarna A, Supriatna A. 1994. Kimia Analitik Instrumen. Ed ke-1. Semarang: IKIP Semarang Press. [ICH] Intenational Conference and Harmonization. 1995. Text on Validation of Analytical procedures. http://www.ich.org/cache/ compo/276-254-1.html. [15 maret 2005]. Kazemipour M, Noroozian E, Tehrani MS, Mahmoudian M. 2002. A new secondderivative spectrophotometric method for determination of permethrin in shampoo [komunikasi singkat]. J Phar Bio Anal 30:1379-1384.
Khopkar SM. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. A. Saptorahardjo, penerjemah. Jakarta: UI-Press. Terjemahan dari: Basic Concepts of Analytical Chemistry. Lunn G. 2000. HPLC Method for Pharmaceutical Analysis. Volume ke-4. New York: John Wiley & Son. Malliou ET, Antoniou CG, Koundourellis JE. 2003. Determination of butamyrate citrate in cough preparations by derivatif UV spectrophotometry and high performance liquid chromatography. Anal Sci 19:563568. O'Haver TC. 1979. Potential clinical applications of derivative and wavelength modulation spectrometry. Clin Chem 25:15481553. Owen T. 1996. Fundamentals of UV-visible Spectroscopy. Waldbronn: HewlettPackard Co. Palabiyik IM, Onur F. 2004. Di dalam: Aydin K, Editor. Simultaneous Spectrophotometric Analysis of Binary Mictures of Pseudoephedrine Sulphate and Dexbrompheniramine Maleat in Pharmaceutical Preparations Using Chemometric Techniques. 4th AACD Congress; Adnan Menderes University, 29 Sept-3 Oct 2004. Turkey: Proceeding book 065. hlm 128130. Popovic GV, Pfendt LB, Stefanovic VM. 2000. Analytical Application of Derivative Spectrophotometry. J Serb Chem Soc65:457-472. Staerk D et al. 2000. Leismanicidal, antiplasmodial and cytotoxic activty of indole alkaloids from Corynathe pachyceras. Planta Med 66:531-536. Singh DK, Srivasta B, Sahu A. 2004. Spectrophotometric determination of rauwolfia alkaloids: estimation reserpine in pharmaceuticals. Anal Sci 20:571-573 Skoog DA, Holler FJ, Nieman TA. 1998. Principles of Instrumental Analysis. Ed ke5. Philadelphia: Saunders College. Skujins S. 1986. Application of UV-Visible Derivatif Spectrophotometry. Steinhauserstrasse: Varian AG.
Uslu B, Ozkan SA. 2002. Determination of lamivudine and zidovudine in binary mixtures using first derivative spectrophotometric, first derivative of the ratio spectra and high performance liquid chromatography UV methods. Anal Chim Acta 466: 175-185. Uslu B, Ozkan SA, Aboul-Enein HY. 2002. Spectrophotometric determination of melatonin and piridoxine HCl in binary mixture using first derivative of the ratio spectra methods. Anal Lett 34:2305-2317. Zanolari B. 2003. Natural aphrodisiacs: Studies of commercially-available recipes, and phytochemical investigation of Erythroxylum vacciniifolium Mart. (Erythroxylaceae) from Brazil [disertasi]. Lausanne: Institut Farmakognosi dan Fitokimia, Universitas Lausanne.
LAMPIRAN
Lampiran 1 Bagan alir penelitian secara umum Sediaan produk komersial Irex max®
Bubuk korteks P. yohimbe
Standar Yohimbin·HCl
Dipreparasi
Dipreparasi
Analisis kuantitatif
SDUV
KCKT
Kondisi optimum pengukuran : kecepatan penyapuan, orde derivatif, orde penghalusan, dan jumlah jendela
Validasi metode
Linearitas, koefisien korelasi, %SBR, %perolehan kembali, LD dan LK
Kadar
Bowman
Kadar
PT Bintang Toedjoe
Kadar
Dibandingkan dengan uji F dan uji t
Hasil berbeda nyata atau tidak secara statistik
Lampiran 2 Data persen perolehan kembali pada uji akurasi bubuk korteks P. yohimbe dan produk komersial Irex max® dengan metode SDUV
Bubuk korteks P. yohimbe
0.00022 0.00022 0.00022 0.00028 0.00029 0.00029 0.00034 0.00034 0.00034
Yohimbin yang diperoleh /CT (µg) 691.0 691.0 691.0 881.7 913.5 913.5 1072.4 1072.4 1072.4
Yohimbin contoh/ CS (µg) 263.1 263.1 263.1 263.1 263.1 263.1 263.1 263.1 263.1
Yohimbin yang ditambahkan/ CD (µg) 374.0 374.0 374.0 623.3 623.3 623.3 872.6 872.6 872.6
Produk komersial ® Irex max
0.01129 0.01134 0.01121 0.01531 0.01533 0.01538 0.01977 0.01939 0.01947
659.3 662.2 654.5 897.0 898.2 901.1 1160.8 1138.3 1143.0
266.3 266.3 266.3 266.3 266.3 266.3 266.3 266.3 266.3
374.0 374.0 374.0 623.3 623.3 623.3 872.6 872.6 872.6
Contoh
Amplitudo
Contoh perhitungan : % Perolehan kembali
= CT-CS ×100%
CD 691.0 − 263.1 = × 100% 374.1 = 114.41%
%Perolehan kembali 114.41 114.41 114.41 99.24 104.35 104.35 93.31 93.31 93.31 105.08 105.86 103.80 101.19 101.38 101.84 102.51 99.93 100.47
Lampiran 3 Kromatogram yang diperoleh dari metode KCKT Bowman
(a)
(b)
(c) Kromatogram standar yohimbin ; (a) 10 µg ml-1, (b) 30 µg ml-1, dan (c) 50 µg ml-1
Lanjutan Lampiran 3
(1)
(2)
(3) Kromatogram bubuk korteks P. yohimbe pada 3 kali ulangan
Lanjutan Lampiran 3
(1)
(2)
(3) Kromatogram produk komersial Irex max® pada 3 kali ulangan
Lampiran 4
Kurva standar bubuk korteks P. yohimbe dan produk komersial yang dianalisis dengan metode KCKT Bowman
Konsentrasi (ppm) 9.9730 29.8189 49.8648
Waktu retensi 6.192 6.145 6.143
Luas puncak 297739 1024581 1635666
luas puncak
Bobot timbang standar yohimbin·HCl : 0.0110 g 354.43 g mol 1 Konsentrasi stok (ppm) = 11.0 mg × × −1 390.93 g mol 10 L = 99.7296 mg/L Pengenceran: V1.M1 = V2.M2 1.0 ml × 99.7296 mg L = M2 10 ml = 9.9730 mg/l Berdasarkan perhitungan regresi linear diperoleh nilai persamaan y = -17451.5936 + 33538.8977x dengan koefisien korelasi (r) sebesar 0.9987. 1800000 1600000 1400000 1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 0
y = -17451.5936 + 33538.8977x r = 0.9987
0
10
20
30 konsentrasi (ppm)
40
50
60
Lampiran 5 Uji statistik (uji t dan uji F) pada bubuk korteks P. yohimbe dengan metode SDUV dan KCKT Bowman Kadar yohimbin bubuk korteks P. yohimbe dengan metode KCKT Bowman Ulangan 1 2 3 Rerata Simpangan baku SBR (%) Batas galat
Bobot timbang (g) 0.0492 0.0490 0.0490 -
Waktu retensi 6.118 6.127 6.122 -
Luas puncak 1058495 1012391 1072700 -
Kadar (%b/b) 1.63 1.57 1.66 1.62 0.0458 2.83 0.12
Contoh perhitungan kadar ulangan 1: Diket : Bobot timbang : 0.0492 g Luas area : 1058495 Persamaan kurva standar : y = -17451.5936 + 33538.8977x y = -17451.5936 + 33538.8977x 1058495 = -17451.5936 + 33538.8977x x = 32.08055922 mg/L g = 0.8020139805 mg 0.8020139805 mg
% (b/b)
=
× 100%
49.2 mg
= 1.63% S % SBR = ×100 Rataan 0.0458 × 100 = 1.62 = 2.83% Batas galat pada tingkat kepercayaan 95% = 1.62% ± t.σ n
= 1.62% ± 4,313 × 0,0458 3
= 1.62% ± 0.12 Kadar yohimbin bubuk korteks P. yohimbe dengan metode SDUV pada 2D284.6 Ulangan 1 2 3 4 5 6 Rerata Simpangan baku (S) SBR (%) Batas galat
Bobot timbang (g) 0.0315 0.0324 0.0326 0.0325 0.0328 0.0328 -
Amplitudo 0.00016 0.00017 0.00017 0.00017 0.00017 0.00017 -
Kadar (%b/b) 1.59 1.64 1.63 1.64 1.62 1.62 1.62 0.0186 1.15 0.02
Lanjutan Lampiran 5 Contoh perhitungan kadar ulangan 4: Diket : Bobot timbang : 0.0325g Amplitudo : 0.00017 Persamaan kurva standar : y = 2.6185.10-6 + 7.8649.10-6 x y = 2.6185.10-6 + 7.8649.10-6 x 0.00017 = 2.6185.10-6 + 7.8649.10-6 x x = 21.2821 mg/L g = 0.5320 mg 0.5320 mg
% (b/b) =
% SBR
× 100%
32.5 mg
= 1.62% S = ×100 Rataan = 0.0186 ×100 1.62
= 1.15 % Batas galat pada tingkat kepercayaan 95% = 1.62% ± t.σ n = 1.62% ± 2.571 × 0.0186 6
= (1.62 ± 0.02) % Uji t dan uji F Diketahui : = 0.0458 s1 = 0.0186 s2 Uji F F hitung
=
n1 = 3 n2 = 6
s12 s 22
2 = 0.04582
0.0186
F tabel Uji t t hitung
= 6.063 = 5.786 (ragam tidak sama/ berbeda nyata) = =
µ1 -µ 2 (s12 /n1 +s 22 /n 2 ) 1.62-1.62
(s12 /n1 +s 22 / n 2 ) = 0.000 t tabel = 4.303 (t hitung tidak berbeda nyata dengan t tabel, terima H0, nilai rerata kadar yohimbin antara kedua metode tidak berbeda nyata).
Lampiran 6 Uji statistik (uji t dan uji F) pada produk komersial Irex max® dengan metode SDUV dan KCKT Bowman Kadar yohimbin produk komersial Irex max® dengan metode KCKT Ulangan 1 2 3 Rerata Simpangan baku SBR (%) Batas galat
Bobot timbang (g) 0.1949 0.1953 0.1949 -
Waktu retensi 6.118 6.067 6.043 -
Luas puncak 1142104 1204562 1180648 -
Kadar (%b/b) 0.44 0.47 0.46 0.46 0.0153 3.33 0.04
Kadar yohimbin bubuk korteks P. yohimbe dengan metode SDUV pada 2D284.6 Ulangan 1 2 3 4 5 6 Rerata Simpangan baku (S) SBR (%) Batas galat
Bobot timbang (g) 0.1084 0.1088 0.1095 0.1084 0.1085 0.1082 -
Uji t dan uji F Diketahui : = 1.53. 10-2 s1 = 4.08.10-3 s2 Uji F F hitung
F tabel Uji t t hitung
=
Amplitudo 0.00910 0.00921 0.00938 0.00900 0.00908 0.00889 -
Kadar (%b/b) 0.49 0.49 0.49 0.48 0.49 0.49 0.49 4.08.10-3 0.83 0.004
n1 = 3 n2 = 6
s12 s 22
2 = 0.0153 2 0.00408 = 14.062 = 5.786 (ragam tidak sama/ berbeda nyata)
= =
µ1 -µ 2 2 1
(s /n1 +s 22 /n 2 ) | 0.46 − 0.49 |
(0.01532 / 3 + 0.004082 / 6) = 3.3374 t tabel = 4.303 (t hitung tidak berbeda nyata dengan t tabel, terima H0, jadi nilai rerata kadar yohimbin antara kedua metode tidak berbeda nyata).
Lampiran 7 Uji statistik (uji t dan uji F) pada bubuk korteks P. yohimbe dengan metode SDUV dan KCKT PT Bintang Toedjoe Kadar yohimbin bubuk korteks P. yohimbe dengan metode KCKT PT Bintang Toedjoe Ulangan 1 2 3 4 5 6 Rerata Simpangan baku (S) SBR (%) Batas galat
%yohimbin·HCl 2.485 2.590 2.469 2.649 2.535 2.833 2.593 0.135 5.20 0.129
Contoh perhitungan %yohimbin : Diket : %yohimbin·HCl Perhitungan: 354.43 g mol-1 %yohimbin = × 2.485% 390.93 g mol-1 = 2.25% Uji t dan uji F Diketahui : = 0.1229 s1 = 0.0186 s2 Uji F F hitung
% kadar yohimbin 2.25 2.35 2.24 2.40 2.30 2.57 2.35 0.1229 5.23 0.13
: 2.485%
n1 = 6 n2 = 6
=
s12 s 22
=
0,1229 0,0186
2
F tabel Uji t t hitung
2
= 43.659 = 5.050 (ragam tidak sama/ berbeda nyata) =
µ1 -µ 2 (s12 /n1 +s 22 /n 2 )
2.35 − 1.62 (0.12292 / 6 +0.01862 / 6) = 14.386 =
Db
⎡ ⎤ ⎢ ⎥ 2 2 2 ⎢ ( s1 /n1 +s 2 /n 2 ) ⎥ = ⎢ -2 2 2 ⎥ 2 2 s /n s /n ⎢ ( 1 1) ( 2 2 ) ⎥ ⎢ n +1 + n +1 ⎥ 2 ⎣ 1 ⎦
= 5.3204 ~ 5 t tabel = 2.571 (derajat bebas 5) t hitung berbeda nyata dengan t tabel, tolak H0, jadi nilai rerata kadar yohimbin antara kedua metode berbeda nyata.
Lampiran 8 Uji statistik (uji t dan uji F) pada produk komersial Irex max® dengan metode SDUV dan KCKT PT Bintang Toedjoe Kadar yohimbin produk komersial Irex max® dengan metode KCKT PT Bintang Toedjoe Ulangan 1 2 3 4 5 6 Rerata Simpangan baku SBR (%) Batas galat
Yoh·HCl (mg) 2.975 2.980 3.096 3.080 2.971 2.943 -
Contoh perhitungan : Diket : Yoh·HCl Perhitungan: =
Yohimbin (mg) 2.697 2.702 2.807 2.792 2.694 2.668 -
%b/b 0.54 0.54 0.56 0.56 0.54 0.53 0.54 0.0122 2.26 0.01
: 2.975 mg 354.43 g mol
yohimbin
Bobot (mg) 500 500 500 500 500 500 -
390.93 g mol
-1 -1
×2.975
= 2.697 mg Uji t dan uji F Diketahui : = 0.0122 s1 = 0.00408 s2 Uji F F hitung
F tabel Uji t t hitung
=
n1 = 6 n2 = 6
s12 s 22
2 = 0.0122 2 0.00408 = 8.9413 = 5.050 (ragam tidak sama/ berbeda nyata)
=
µ1 -µ 2 2 1
(s /n1 +s 22 /n 2 )
0.54 − 0.49 (0.01222 / 6 +0.004082 / 6) = 9.521
=
Db
⎡ ⎤ ⎢ ⎥ 2 2 2 ⎢ ( s1 /n1 +s 2 /n 2 ) ⎥ -2 = ⎢ 2 2 ⎥ 2 2 ⎢ ( s1 /n1 ) ( s 2 /n 2 ) ⎥ ⎢ n +1 + n +1 ⎥ 2 ⎣ 1 ⎦
= 6.5464 ~ 7 t tabel = 2.571 (derajat bebas 7) t hitung berbeda nyata dengan t tabel, tolak H0, jadi nilai rerata kadar yohimbin antara kedua metode berbeda nyata.
