Validasi Metode Analisis α-mangostin Dalam Plasma Darah Manusia Secara In Vitro Dengan Metode Spektrofotometri Ultraviolet

P ro sid ing Sem ina r Na siona l & Wo rkshop “Pe rkemba ngan Te rki ni Sa in s Fa rma si & K l in i k 5” | Padang , 6 -7 No vembe r 2015

Validasi Metode Analisis α-Mangostin Dalam Plasma Darah Manusia Secara In Vitro Dengan Metode Spektrofotometri Ultraviolet (Validation of Analitycal Method of α-Mangosteen in Plasma In Vitro by ultraviolet spectrophotometry Method) Roslinda Rasyid 1* ; Widya Kardela2 ;Wulan Widyawati1 1Fakultas 2Sekolah

Farmasi, Universitas Andalas Padang Tinggi Ilmu Farmasi Padang

Corresponding email: [email protected] ABSTRAK α-Mangostin merupakan salah satu senyawa yang memiliki aktifitas antibakteri, antijamur, antitumor, antiinflamasi dan antioksidan. Adanya ikatan antara obat dan protein dalam plasma akan berpengaruh terhadap efek terapeutik dari suatu obat. α-Mangostin yang terikat dengan protein dalam plasma harus dibebaskan. Validasi metode analisis α-mangostin dalam plasma darah manusia secara In Vitro ini menggunakan metode spektrofotometri ultraviolet yang bertujuan untuk menganalisis dan mengetahui kadar α-mangostin dalam plasma darah manusia. Metode pengendapan protein dengan pelarut metanol bertujuan untuk membebaskan obat yang terikat dengan protein. Pengukuran serapan dilakukan panjang gelombang 316,2 nm. Larutan standar α-mangostin pada rentang 2-10 µg/mL menghasilkan persamaan regresi y = 0,1584 + 0,0586x dengan r 0,9947. Hasil penelitian memberikan nilai akurasi dan presisi yang baik, nilai akurasi pada konsentrasi 2, 4, dan 6 µg/mL masing-masing yaitu 95,221%, 93,2593% dan 93,4584%, dan memberikan nilai presisi intra day yaitu 1,2146%, 1,8553% dan 0,8052%. Presisi inter day diperoleh 3,0838%, 4,2284% dan 1,9597%. Batas deteksi (BD) 0,0032µg/mL dan batas kuantitasi (BK) 0,0106 µg/mL. Hasil analisis kadar α-mangostin dalam plasma darah manusia secara In Vitro yaitu 3,747 % ± 93,9799%. Berdasarkan hasil penelitian, validasi metode analisis αmangostin dalam plasma darah manusia secara In Vitro dengan metode spektrofotometri ultraviolet sudah memenuhi kriteria yang dipersyaratkan. Kata Kunci: Spektrofotometri ultraviolet, validasi analisis, α-mangostin, In vitro PENDAHULUAN Obat tradisional merupakan salah satu

α-Mangostin kemopreventif

memiliki

efek

efektif

dalam

yang

alternatif untuk memenuhi kebutuhan obat

karsinogenesis kolon sistem bioassay. Temuan

baru. Pencarian obat baru dapat dimulai dari

mereka menunjukkan bahwa paparan lebih

isolasi dan identifikasi senyawa utama dari

lama

bahan alam. Salah satu senyawa tersebut yang

perkembangan tumor. Dalam studi lain tentang

memberikan khasiat pada pengobatan yaitu α-

efek α- mangostin pada sel leukemia manusia,

mangostin. α-Mangostin merupakan salah satu

hasil menunjukkan bahwa α- mangostin dapat

senyawa turunan xanton (Yunitasari, 2011).

membantu pencegahan dan pengobatan kanker

untuk

α-mangostin

dapat

menekan

362


(Jhonson, et al., 2012). Banyak penelitian yang

Berdasarkan

hal

tersebut

maka

lain juga menunjukkan aktivitas α-mangostin

penelitian ini memilih metode spektrofotometri

sebagai antioksidan, antitumor, antiviral dan

ultraviolet sebagai metode yang digunakan

antiinflamasi

2008).

untuk penetapan kadar α-mangostin dalam

Konsentrasi obat bebas yang berikatan dengan

plasma secara in vitro, metode ini mampu

reseptorlah yang menentukan besarnya efek

menjelaskan

farmakologik yang diberikan oleh suatu obat,

berdasarkan panjang gelombang maksimum

dimana reseptor sebagian besar terdapat dalam

suatu senyawa. Hasil pemeriksaan spektrum UV

sel-sel jaringan. Oleh karena sebagian besar sel-

senyawa

sel

maka

memperlihatkan

darah

panjang gelombang 243,5 nm dan 316,5 nm

jaringan

pemeriksaan

(Chaverri,

diperfusi kadar

et

oleh obat

al.,

darah, dalam

merupakan suatu metode yang paling akurat

informasi

α-mangostin serapan

dari

dalam

struktur

metanol

maksimum

pada

(Ghazali, et al., 2010).

untuk pemantauan dan pengoptimalan manfaat terapi obat dalam pelayanan farmasi (Shargel, et

METODE PENELITIAN

al., 2005).

Alat dan Bahan α-Mangostin

Adanya ikatan antara obat dan protein

murni,

plasma

darah

dalam plasma akan berpengaruh terhadap efek

manusia golongan AB diperoleh dari Palang

terapeutik dari suatu obat. α- Mangostin yang

Merah Indonesia (PMI) Padang, kloroform p.a

terikat 70 % pada protein harus dibebaskan,

(Merck), etil asetat p.a (Merck), metanol p.a

salah

(Merck),

satu

caranya

dengan

pengendapan

Spektrofotometer

double

beam

protein. Pelarut organik yang digunakan bisa

(Shimadzu UV-1800), spektrofotometer infra

bercampur dengan air seperti metanol. Metanol

red (Thermo Scientific), pipet volume (Iwaki),

akan menurunkan kelarutan protein sehingga

labu ukur, sentrifugator (DKC), vortex, tabung

protein mengendap dan obat akan terbebas dari

reaksi

sisi ikatan protein (Harahap, 2010). Uji sampel

erlenmeyer (Iwaki), pipet tetes, pipet mikro

plasma secara in vitro dilakukan dengan tujuan

(Eppendorf), spatel, gelas ukur, buret, batang

sebagai langkah awal menuju analisis yang lebih

pengaduk, timbangan analitik.

(Iwaki),

rak,

pipet

ukur

(Iwaki),

bermanfaat yaitu analisis sampel plasma in vivo. Dari penelitian sebelumnya diperoleh

Prosedur Penelitian

kadar α-mangostin dalam ekstrak kulit buah

Pemeriksaan kemurnian dengan plat KLT

muda segar, kulit buah masak segar, kulit buah

silika gel 60

muda kering, kulit buah masak kering dan kulit

Siapkan

larutan

induk

untuk

batang Garcinia mangostana dengan metoda

pembanding yaitu α-mangostin 1000 µg/mL

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (Etatutwuni,

dalam metanol, sampel dengan konsentrasi 250

2013), dan juga diperoleh kadar α-mangostin

µg/mL dan untuk campuran pembanding dan

dalam ekstrak kulit buah muda, kulit buah

sampel 1:1. Kemudian siapkan plat KLT 10 x 4

matang dan kulit batang Garcinia mangostana

cm, buat masing-masing garis penotolan 1 cm

secara berturut - turut 4,19%, 15,85%, dan

dari tepi atas dan 1 cm dari dari tepi bawah.

3,88%

Larutan α-mangostin yang telah disiapkan

dengan

(Agustina, 2014).

metoda

TLC-Densitometri

ditotolkan sebanyak 2 μL pada plat KLT, lalu

363


dimasukkan ke dalam chamber yang telah

serapan,

tentukan

dijenuhkan dengan fase gerak kloroforom : etil

(Harahap, 2010).

persamaan

regresinya

asetat (9:1) (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2010). Tutup chamber dan biarkan

Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi

sampai fase gerak mencapai garis atas pada plat.

Setelah

diperoleh

kurva

kalibrasi,

Chamber dibuka, plat KLT diambil dan dikering

konsentrasi terkecil yang masih dapat dideteksi

anginkan. Kemudian diamati di bawah lampu UV

(BD) dan terdeteksi secara kuantitasi (BK)

254 nm. Tentukan nilai Rf.

dihitung secara statistik melalui garis linier dari kurva standar (Harahap, 2010).

Pembuatan Larutan Induk α-Mangostin 100 µg/mL

Penetapan kadar dan uji akurasi dengan α-Mangostin

ditimbang

dengan

seksama 10 mg, kemudian dilarutkan dalam 100

persen

kembali

α-mangostin

dalam plasma in vitro

ml metanol dalam labu ukur, diperoleh larutan α-mangostin dengan konsentrasi 100 µg/mL.

perolehan Larutan

induk

α-mangostin

konsentrasi 100 µg/mL dipipet sebanyak 2 mL, masukkan ke dalam labu ukur 5 mL. Setelah itu,

Penentuan panjang gelombang maksimum α-

ditambahkan dengan plasma sampai tanda batas

mangostin

sehingga didapatkan konsentrasi 40 µg/mL.

Dipipet 1 mL dari larutan induk(100

Konsentrasi tersebut dipipet masing-masing 0,5

µg/mL) masukkan ke dalam labu ukur 10 mL,

mL, 1 mL, dan 1,5 mL ditambahkan metanol

kemudian ditambahkan metanol sampai tanda

sampai tanda batas dalam labu ukur 10 mL

batas.

sehingga didapatkan konsentrasi α-mangostin

Ukur

spektrofotometer

serapan ultraviolet

menggunakan pada

panjang

masing-masing 2 µg/mL, 4 µg/mL dan 6 µg/mL.

gelombang 200-400 nm dan ditentukan panjang

Masing-masing larutan tersebut divortek selama

gelombang serapan maksimumnya (Harahap,

satu menit lalu disentrifus pada kecepatan 4.000

2010).

rpm selama 35 menit. Bagian supernatannya diambil

Pembuatan kurva kalibrasi

lalu

serapannya

spektrofotometer

Dipipet masing – masing 0,2 mL ; 0,4

gelombang

ultraviolet

diukur

dengan

pada

panjang

maksimum

α-mangostin,

mL ; 0,6 mL ; 0,8 mL ; 1 mL larutan induk

pengulangan dilakukan sebanyak tiga kali,

dengan konsentrasi 100 µg/ml ke dalam labu

kemudian nilai presisi dan akurasinya dihitung

ukur 10 ml, tambahkan metanol sampai tanda

(Harmita,

2004).

batas, sehingga diperoleh larutan α-mangostin

kedekatan

hasil

dengan konsentrasi 2 µg/mL, 4 µg/mL, 6 µg/mL,

senyawa yang dianalisa dengan suatu metode uji

8 µg/mL, 10 µg/mL. Ukur serapan masing-

yang dilambangkan dengan KV (Koefisien

masing

Variasi), persyaratan nilai KV ≤ 2%.

konsentrasi

spektrofotometer

tersebut

ultraviolet

pada

dengan

Presisi

menggambarkan

pengulangan

penentuan

panjang

gelombang serapan maksimum α-mangostin. Buat kurva kalibrasi antara konsentrasi dengan

Presisi Larutan

standar

dengan

berbagai

konsentrasi (2 µg/mL, 4 µg/mL dan 6 µg/mL) 364


sebanyak tiga kali pengulangan diukur pada hari

6. Penetapan kadar dan uji akurasi dengan

yang sama untuk variabel intra-day, kemudian

persen perolehan kembali

tiga hari berturut-turut untuk variabel inter-day.

Hasil perhitungan kadar α-mangostindengan

Konsentrasi standar α-mangostin dari sampel

konsentrasi 2 µg/ml,4 µg/ml dan 6 µg/ml

dihitung dengan persamaan garis lurus yang

adalah 1,9044 µg/ml, 3,7303 µg/ml dan

didapat dari kurva kalibrasi. Presisi diukur

5,6075 µg/ml dengan nilai akurasi berturut-

sebagai Relatif Standar Deviasi (RSD) atau

turut 95,221%%, 93,2593% dan 93,4584% .

Koefisien Variasi (KV).

7. Kadar α-mangostin dalam plasma darah manusia secara In Vitro yaitu 3,747 % ±

HASIL DAN DISKUSI

93,9799%.

Hasil Dari penelitian yang telah dilakukan diperoleh hasil sebagai berikut :

Diskusi KLT dilakukan dengan fase diam plat

1. KLT dilakukan dengan fase diam plat silika

silika gel 60 F254 dan fase gerak kloroform :

gel 60 F254 dan fase gerak kloroform :

metanol (9:1). Dari KLT yang telah dilakukan

metanol (9:1). Dari KLT yang telah dilakukan

diperoleh nilai Rf untuk standar α-mangostin

diperoleh nilai Rf untuk standar α-mangostin

adalah 0,533, nilai Rf untuk sampel adalah

adalah 0,533, nilai Rf untuk sampel adalah

0,533, dan nilai Rf untuk campuran standar dan

0,533, dan nilai Rf untuk campuran standar

sampel adalah 0,533 (gambar 1).

dan sampel adalah 0,533. 2. Panjang gelombang maksimum α-mangostin dengan metanol 316,2 nm. 3. Hasil

pengukuran

konsentrasi

serapan

larutan

deretan

α-mangostin

menghasilkan persamaan regresi linier y = 0,1584 + 0,0586x, nilai koefisien korelasinya (r) = 0,9947. 4. Uji batas deteksi dan batas kuantitasi Dari hasil pengujian diperoleh batas deteksi α-mangostin yaitu 0,00312 µg/ml dan batas kuantitasi yaitu 0,01058 µg/mL.

Gambar 1. Kromatogram uji kualitatif αmangostin dilihat dibawah lampu UV 254 nm Setelah uji kemurnian α-mangostin

5. Pengujian presisi

tahap selanjutnya adalah penetapan kadar yang

Penentuan presisi intra-day dan inter-day

sebelumnya

larutan standar α-mangostin dilakukan pada

gelombang, dilakukan dengan penyiapan larutan

konsentrasi 2 µg/ml,4 µg/ml dan 6 µg/ml.

induk α-mangostin dengan konsentrasi 100

Untuk presisi intra-day diperoleh nilai % RSD

µg/mL dan untuk penetapan panjang gelombang

berturut-turut adalah 1,2146%,1,8553%

maksimumnya

dan 0,8052%. Sedangkan untuk presisi inter-

konsentrasi 10 µg/mL yang dibuat dari larutan

day

induk, panjang gelombang maksimum yang

diperoleh

nilai

%

RSD

3,0838%,

dilakukan

penentuan

digunakan

larutan

panjang

dengan

4,2284% dan 1,9597%. 365


didapat adalah 316,2 nm. Panjang gelombang

Standar deviasi dari kurva kalibrasi dari

maksimum α-mangostin tersebut digunakan

kurva kalibrasi tersebut yaitu 0,02203 µg/mL,

untuk pembuatan kurva kalibrasi dan untuk

batas deteksi yaitu 0,00312 µg/ml dan batas

menghitung persen perolehan kembali.

kuantitasinya 0,01058 µg/ml. Batas deteksi merupakan kadar senyawa terkecil yang dapat dianalisis yang dapat memberikan respon signifikan. Sedangkan batas kuantitasi adalah jumlah senyawa terkecil yang dapat dianalisis. Penentuan nilai batas deteksi dan kuantitasi sangat tergantung pada nilai b (kemiringan garis, dimana hubungan linier yang ideal dicapai jika nilai b = 0 dan r = -1 atau r = -1 tergantung pada arah garis). Metode analisis dikatakan

Gambar 2. Spektrum absorban dengan panjang gelombang α-mangostin murni

kurang sensitif apabila b bernilai negatif sehingga memberikan nilai BD (batas deteksi) dan BK (batas kuantitasi) yang lebih besar. Dari

Pembuatan kurva kalibrasi α-mangostin

data yang didapat terlihat bahwa metode ini

dibuat dari beberapa konsentrasi yaitu pada

dapat dikatakan sensitif karena memberikan

konsentrasi 2, 4, 6, 8 dan 10 µg/mL. Pada

nilai b > 0, dimana memberikan nilai b = 0,0586.

masing-masing

Kadar

konsentrasi

ini

diukur

α-mangostin

dalam

plasma

darah

serapannya pada panjang gelombang 316,2 nm.

manusia secara In Vitro yaitu 3,747 % ±

Hasil kurva serapan dari deretan konsentrasi

93,9799%,

tersebut menghasilkan persamaan regresi linier

akurasinya dihitung (Harmita, 2004). Untuk

y = 0,1584 + 0,0586x dengan nilai koefisien (r)

penentuan penetapan kadar dan akurasi larutan

yaitu

ini

sampel α-mangostin dengan konsentrasi 2

karena

µg/mL,4 µg/mL dan 6 µg/mL, diperoleh nilai %

memenuhi kriteria penerimaan yaitu 0,99 ≤ r <

akurasi berturut-turut 95,221%, 93,2593% dan

1, sehingga penggunaan metode tersebut dapat

93,4584%. Berdasarkan kriteria di atas dan data

digunakan untuk analisis α-mangostin dalam

yang diperoleh, maka dapat dikatakan bahwa

plasma secara in vitro dengan hasil yang baik

metode analisis yang digunakan memenuhi

(Priyambodo, 2007).

kriteria akurasi dan presisi. Menurut (Harmita,

0,9947.

menunjukkan

Koefisien hasil

yang

korelasi linier,

2004),

kemudian

akurasi

nilai

adalah

presisi

ukuran

dan

yang

menunjukkan ketepatan hasil yang diperoleh dari suatu metode analisis dengan kadar sebenarnya. Sebagai parameter untuk akurasi menggunakan persen perolehan kembali. Pada literatur disebutkan harga persen perolehan Gambar 3. Kurva Kalibrasi α-Mangostin

kembali berkisar antara 80-110% (Harmita, 2004). Dari penelitian, larutan α-mangostin dengan konsentrasi 2 µg/mL,4 µg/mL dan 6 366


µg/mL diperoleh presisi intra-day dengan nilai

secara

% RSD berturut-turut adalah 1,2146%,1,8553%

spektrofotometer

dan 0,8052%, sedangkan untuk presisi inter-day

memenuhi kriteria akurasi, presisi dan

diperoleh nilai % RSD 3,0838%, 4,2284% dan

linieritas.

1,9597%.

2.

Penetapan ditambahkan

vitro

dengan ultraviolet

metode sudah

Kadar α-mangostin dalam plasma darah manusia secara In Vitro yaitu 3,747 % ±

KESIMPULAN 1.

in

kadar dalam

α-mangostin plasma

yang

93,9799%,

manusia

DAFTAR PUSTAKA Adnan, A. Z. (1991). Penelitian Farmasi dalam Tantangan Masa. Padang: Pusat Penelitian Universitas Andalas. Agustina, R.(2014). Analisis α-Mangostin dari Ekstrak Kulit Buah Muda, Kulit Buah Matang dan Kulit Batang Manggis (Garcinia mangostana, L) dengan TLC Scannner. Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Andalas, Padang Chaverri, J. P., Rodriguez, N. C., Ibarra, M. O., & Rojas, J. M. P. (2008). Medicinal properties of mangosteen (Garcinia mangostana). Food and Chemical Toxicology, 46, 3227-3239. Chaverri J. P., Reyes-Fermin L. M., Nolasco A. E. G., Orozco I. M., & Medina-Campos O. N. (2009), ROS scavenging capacity and neuroprotective Effect of α-mangostin against 3-nitropropionic acid in cerebellar granula neurons. Exp Toxicol Pathol, 61: 491-501. Dachriyanus, (2004). Analisa Struktur Senyawa Organik secara Spektroskopi. Padang: PenerbitAndalas University Press. Dachriyanus., Katrin, D. O., Oktarina, R., Ernas, O., Suhatri, dan Mukhtar, M. H. (2007). Uji efek αmangostin terhadap kadar kolesterol total, trigliserida, kolesterol HDL, dan kolesterol LDL darah mencit putih jantan serta penentuan lethal dosis 50 (LD50). J. Sains Tek. Far., 12, (2), 64-73. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. (1979). Farmakope Indonesia Edisi III, KOPRISub Unit Direktorat Jendral, Jakarta. Departeman Kesehatan Republik Indonesia. (1995). Farmakope Indonesia Edisi IV, Jakarta Day, A . R & Underwood, A . L. (2002). Analisis Kimia Kuantitatif. (Edisi 6). Jakarta : Erlangga. Etatutwuni. (2013). Analisis α-Mangostin dari Ekstrak Kulit Buah dan Kulit Batang Garcinia mangostana, L

dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Andalas, Padang. Ghazali, S.A.I.S.M., Lian, G.E.C., & Ghani, K.D.A. (2010). Chemical Constituent from Roots of Garcinia mangostana Linn. J. Chemistry, 2, 134142. Gibson, J. (1995). Anatomi dan Fisiologi Modern untuk Perawat. (Edisi V). Jakarta : EGC Harahap, Y. 2010. Sample Preparation, Bioavailbility and Bioequivalency. Jakarta : Departement Farmasi UI. Harahap, Y., Mansur, U., & Estherina, C. (2008). Validasi Metode Analisis Cilostazol dalam Plasma In Vitro secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Majalah Ilmu Kefarmasian, 5, (1), 9-20. Harmita. 2004. Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya. Majalah Ilmu Kefarmasian. I, (3), 117-135. Iswari, K.,& Sudaryono, T. (2007). 4 Jenis Olahan Manggis, Si Ratu Buah Dunia dari Sumbar. BPPTSumbar. Sumbar Barat. Johnson, E. L., & Stevenson, R. (1991). Dasar Kromatografi Cair. Penerjemah: Kosasih Padmawinata. Bandung: Penerbit ITB. Kenji, M., Yukihiro, A., Emi, K., Tetsuro, I., Kenji, O., Toshiyuki, T., Munekazu,I., & Yoshinori, N. (2003). Cytotoxic benzophenone derivatives from Garcinia species display a strong apoptosis-inducing effect against human leukemia celllines. Biol Pharm Bull. 26: 569-571. Rohman, A. 2009. Kromatografi untuk Analisis Obat. (Edisi I). Yogyakarta : Graha Ilmu. Rohman, A. & Gandjar, I.G. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta : Cetakan Pertama, Pustaka Pelajar. Satiadarma. 2004. Azas Pengembangan Prosedur Analisis. (Edisi I). Surabaya: Universitas Airlangga.

367


Shargel, L., Wu-Pong, S., & Yu, Andrew B.C. (2005). Biofarmasetika & Farmakokinetika Terapan, Edisi kelima. Surabaya: Universitas Airlangga. Suksamram, S., Suwannapoch, P., Ratananukul, P., Aroonlerk, N., & Suksamram, A. (2002). Xanthones from the green fruit hulls of garcinia mangostana. Journal of Natural Product, 65, 761-763. Syamsudin, Tjokrosonto S., Supargiyono, Wahyuono S., and Mustofa. 2009. In vitro and in vivo antiplasmodial activities of active constituents isolated from the stem bark of G. parvifolia

(Miq)Miq. South East Asian Journal of Trop. Med. and Pub. Health. Watson, D.G. (1999). Pharmaceutical Analysis : A textbook for pharmacy student and pharmaceutical chemists. New York : Harcourt Publishers. Widmann, F. K. (1995). Tinjauan Klinis Atas Hasil Pemeriksaan Laboratorium .(Edisi 9). Penerjemah: Gandasoebroto. Jakarta: EGC. Yunitasari, L. (2011). Gempur 41 Penyakit Dengan Buah Manggis Khasiat dan Cara Pengolahan Untuk Kesehatan. Yogyakarta: Pustaka baru press.

368

Validasi Metode Analisis α-mangostin Dalam Plasma Darah Manusia Secara In Vitro Dengan Metode Spektrofotometri Ultraviolet

Recommend Documents