METODE ANALISIS LABORATORIUM GENETIKA MOLEKULER SAMPEL HIU PAUS (Rhincodon typus)
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016
Teknik dan Tahapan Analisis Molekuler Sampel Hiu Paus (Rhincodon typus): Proses Ekstraksi, PCR (Polymerase Chain Reaction) dan Elektroforesis Technique and Molecular Analysis Stage from Whale Shark (Rhincodon typus) samples: Process of Extraction, PCR (Polymerase Chain Reaction) and Electrophoresis Samsul Bahri1, Khajar Imaniar1, Mahardika Rizki Himawan1, Hawis Madduppa2 1 Program Magister Ilmu Kelautan IPB 2 Fakultas Kelautan dan Perikanan IPB Abstrak Hiu paus (Rhincodon typus) merupakan spesies terbesar di dunia. Hiu paus tersebar di seluruh perairan Indonesia dan menjadikan Indonesia sebagai habitat dan jalur migrasinya. Praktikum terhadap sampel hiu paus yang telah dilakukan menggunakan metode ekstraksi chelex dan dilanjutkan dengan kegiatan PCR (polymerasi Chain Reaction) dan elektroforesis. Hasil yang diperoleh menunjukkan 8 sampel yang dianalisis mengandung DNA dengan munculnya band positif pada hasil elektroforesis. Hasil dari analisis sampel hiu paus selanjutnya dapat digunakan untuk proses analisis visual DNA. Kata kunci: Hiu paus (Rhincodon typus), Metode Chelex, DNA Abstract Whale shark (Rhincodon typus) is a biggest species in the world. Whale shark are spreading around Indonesia and render Indonesia as their habitat and migration way. The practicum for whale shark samples have been done by chelex extraction method and runned with PCR (polymerasi Chain Reaction) and electrophoresis process. Analysed results by 8 samples showed the samples are contained DNA with positive band showed in electrophoresis. The whale shark DNA samples can be running for further DNA visual analysis. Key word: Whale shark (Rhincodon typus), chelex method, DNA Pendahuluan Hiu paus (Rhincodon typus) dapat ditemukan di hampir semua wilayah Indonesia seperti di perairan Sabang, Pantai Utara Jawa Timur, Bali, Nusa Tenggara, Alor, Flores, Kalimantan, Sulawesi, Maluku, dan Papua. Oleh karena itu, peluang bagi masyarakat untuk bertemu ikan terbesar di dunia ini cukup besar dan dapat dimanfaatkan untuk penelitian. Hiu paus merupakan satwa yang dilindungi di Indonesia, sesuai dengan KEPMEN KP No.
18 Tahun 2013 Tentang Penetapan Status Perlindungan Penuh Ikan Hiu Paus. Hiu paus (Rhincodon typus) merupakan spesies ikan terbesar di dunia. Ukurannya dapat mencapai 20 meter dan bobot 34 ton (Norman 2007). Daerah penyebarannya luas meliputi perairan tropis hingga subtropis hangat yaitu antara 30°LU dan 35°LS dengan kisaran suhu 21°– 30°C (KKJI 2014). Menurut Motta et al. (2010) ikan ini merupakan pemakan zooplankton yang cenderung jinak. Hal ini berbeda dari hiu
pada umumnya yang merupakan karnivora dan buas. Penelitian mengenai beberapa aspek kehidupan hiu paus yang meliputi aspek biologi dan ekologi hingga saat ini cukup banyak dilakukan, seperti di Ninggalo Reef Australia (Steven et al. 2001), Afrika Timur (Stewart 2009), Belize (Heyman et al. 2001), California (Nelson et al. 2007), dan Mexico (Motta et al. 2010). Selain itu, di Indonesia penelitian mengenai penyebarannya sudah dilakukan di Taman Nasional Teluk Cendrawasih (Himawan 2014). Perairan Indonesia yang terletak di wilayah tropis merupakan salah satu jalur migrasi dan habitat hiu paus. Terbukti dari sering munculnya ikan ini hampir di sepanjang tahun maupun menetap secara musiman di perairan tertentu (WWF 2013). Penelitian terkait genetika populasi hiu paus (Rhincodon typus) penting untuk dilakukan guna melihat struktur populasi, keragaman genetik dan kekerabatan hiu paus (Rhincodon typus) yang terdapat di Indonesia bahkan di Asia tenggara. Pada praktikum kali ini akan diajarkan metode analisis laboratorium pada studi kasus menggunakan sampel hiu paus (Rhincodon typus). Metode Metode yang digunakan pada praktikum ini adalah metode ekstraksi dengan menggunakan Chelex. Chelex merupakan suatu senyawa ekstraksi yang terdiri dari Resin dan molecular grade water. Chelex yang digunakan pada praktikum ini adalah chelex 100. Sampel yang digunakan pada praktikum adalah sampel daging hiu paus (Rhincodon typus). Sampel jaringan yang diperoleh telah ditransport sesuai dengan prosedur standar yang direkomendasikan oleh Eckert et al. (1999). Sampel disimpan dalam tube berukuran 10 ml yang berisi
larutan ethanol 96% guna menjaga kualitas sampel dan diganti ketika lautan ethanol mulai mengalami perubahan warna. Sampel yang telah diperoleh kemudian dibawa ke laboratorium untuk dilakukan uji laboratorium lebih lanjut. 2.1 Waktu dan tempat Praktikum dilakukan di Laboratorium Marine Biodiversity and Biosystematics Departemen Ilmu dan Teknologi Kelautan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Institut Pertanian Bogor. Praktikum dilaksanakan pada tanggal 12 April 2016 dimulai pada pukul 19.00 WIB hingga selesai. 2.2 Alat dan Bahan Alat dan bahan yang digunakan tersedia di Laboratorium Marine Biodiversity and Biosystematics. Alat yang digunakan pada praktikum meliputi: Tabel: Alat dan bahan yang digunakan pada praktikum No Alat Kegunaan 1. Thermocycle Mesin PCR 2. Pinset Penjepit Sampel 3. Centrifuge Pemutar Sampel 4. Vortex Pengaduk Sampel Micro 5. Pipeting Pipet 6. Heating Block Pemanas Sampel Melihat Genom 7. Mesin UV Elektro 8. Microwave Pemanas Gel 9. Electro Champber Analisis Genom Pelindung 10. Glove Tangan Mencegah 11. Masker Kontaminasi 12. Bunsen Pensteril Alat 13. Tisu Handuk Pembersih Pelindung 14. Glove Elektroforesis Tangan
15. 16.
Microtube 1.5 Ml Tube 2.0 Ml
No 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Bahan Chelex 100% Master Mix Primer LTEi9 Primer H950 ddH2O Aquades Ethanol 96%
Tempat Sampel Tempat Sampel Kegunaan Reagent Ekstraksi Reagent Primer Depan Primer Belakang Reagent Mencuci Sampel Pengawet
2.3 Langkah Kerja Ekstraksi Metode ekstraksi yang digunakan pada praktikum ini adalah metode dengan menggunakan chelex. Proses ekstraksi DNA menggunakan metode Chelex 10% dengan komposisi air molekuler dan resin 100%. Jaringan yang diambil merupakan jaringan otot yang banyak mengandung mitokondria, hal ini dikarenakan DNA target yang akan diambil berasal dari DNA mitokondria. Langkah kerja dari metode ini sendiri akan diuraikan dalam bentuk grafik skema dibawah ini. Siapkan tabung Chelex 10%
Lakukan pelabelan pada tabung chelex
Gunakan penjepit steril untuk mengambil daging sampel
Lakukan vortex dan spinning pada sampel yang telah di ekstraksi
Lakukan langkah 3 dan 4 pada semua sampel
Masukkan daging sampel kedalam chelex
panaskan sampel pada suhu 90o selama 45 menit
Lakukan kembali vortex dan spinning pada sampel yang telah dipanaskan
selesai
Gambar: Tahapan proses ekstraksi dengan menggunakan metode chelex PCR (polymerasi Chain Reaction) Amplikasi sampel produk esktraksi dilakukan menggunakan teknik PCR
(Polymerase Chain Reaction) secara in vitro dengan menggunakan primer depan Fish F1 [5’-TCA ACC AAC CAC AAA GAC ATT GGC AC-3’] dan primer belakang Fish R1 [5’-TAG ACT TCT GGG TGG CCA AAG AAT CA-3’] yang direkomendasikan oleh Alberto Abreu-Grobois et al. (2006). PCR dilakukan dalam kondisi 2 µl template DNA, 9 µl ddH2O, 1,25 µl Primer depan dan belakang (10 mM), dan 12,5 µl KAPPA ready mix. Proses teknik PCR dilakukan dengan menggunakan mesin PCR (thermo cycler) dengan total siklus yaitu 38 siklus. Setiap siklusnya terdiri atas denaturation pada suhu 94°C selama 30 detik, annealling pada suhu 50°C selama 30 detik, dan extention pada suhu 72°C selama 45 detik. Kemudian dilanjutkan dengan final elongated pada suhu 72°C selama 5 detik. Elektroforesis Elektroforesis merupakan suatu metode pemisahan senyawa kimia yang berprinsip pada laju pergerakan molekul dalam aliran listrik (Maduppa 2014). Proses elektroforesis dilakukan bertujuan untuk melihat komponen DNA yang terdapat pada sampel tukik. Elektroforesis dilakukan pada gel agarose 0.5% yang telah diisi etidium bromide dengan konsentrasi 25 µg/ml dengan marker 100 bp DNA Ladder menggunakan tegangan 100V selama 25 menit. visualisasi DNA dilakukan dengan menggunakan UV dan didokumentasikan dengan alat geldocs yang dapat memperlihatkan band DNA memalui layar komputer. Hasil dan Pembahasan Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan maka diperoleh hasil elektroforesis dari beberapa sampel yang telah dilakukan. Hasil elektroforesis dari semua sampel menunjukkan band yang positif. Hal tersebut dapat dilihat pada
gambar hasil elektroforesis yang ditujukkan dibawah ini.
Gambar: Hasil elektoforesis dari sampel hiu paus (Rhincodon typus) Gambar diatas menunjukkan sampel dengan band yang positif. Band positif mengindikasikan bahwa semua sampel yang telah diekstraksi dengan menggunakan metode chelex dan PCR (Polymerase Chain Reaction) yang berjumlah 8 buah mengandung DNA dari sampel hiu paus yang telah dilakukan. Dari hasil yang diperoleh maka produk PCR yang telah diperoleh dapat dilakukan ketahap proses selanjutnya untuk mendapatkan produk sekuens dalam bentuk visual (chromatogram). Data ini selanjutnya akan dianalisis menggunakan software Mega Analysis untuk dapat dibaca data sekuens yang telah diperoleh. Daftar Pustaka Abreu-Grobois A, Horrocks J, Formia A, Dutton P, LeRoux R, VélezZuazo X, Soares L, Meylan P. 2006. New mtDNA dloop primers which work for a variety of marine turtle species may increase the resolution of mixed stock analyses. Di dalam: International Sea Turtle Society. 26th Annual Symposium on Sea Turtle Biology and Conservation; 2006 April 3-8; Island of Crete, Greece: International Sea Turtle Society. Hal 179. 1601.
Eckert KL, Bjorndal KA, Abreu-Grobois FA, Donnelly M, Editors. 1999. Research and Management Techniques for the Conservation of Se a Turtles. Washington (2-8317-0364-6): IUCN/SSC Marine Turtle Specialist Group. Heyman WD, Rachel TG, Bjorn k, Robert EJ. 2001. Whale Shark Rhincodon typus aggregate to feed on fish spawn in Belize. Marine Ecology Progress Series. 215: 275-282. Himawan MR. 2014. Komposisi Hiu Paus Berdasarkan Jenis Kelamin dan Ukuran serta Perilaku Kemunculannya di Kawasan Taman Nasional Teluk Cendrawasih [Skripsi]. Program Studi Ilmu dan Teknologi Kelautan. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Madduppa H. 2014. Bioekologi dan Biosistematika Ikan Terumbu. Bogor (ID): IPB Press. Motta PJ, Maslanka M, Heuter RE, Davis RL, Parra R, Mulvany SL, Habegger Ml, Strother JA, Mara KR, Ganrdiner JM, Tyminsky JP, Zeigler LD. 2010. Feeding anatomy, filter-feeding rate, and diet of whale sharks (Rhincodon typus) during surface ram filter feeding off the Yucatan Peninsula, Mexico. Fisheries Research. 113: 199-212. Nelson JD, Eckert SA. 2007. Foraging Ecology of Whale Shark (Rhincodon typus) Within Bahia de Los Angeles, Baja California Norte, Mexico. Fisheries Research. 84: 47-64. Norman BM, John DS. 2007. Size and maturity status of the whale shark (Rhincodon typus) at Ningaloo Reef in
Western Australia. Fisheries Research. 84: 81-86.
of tagging studies in 2007 & 2008. HSWRI Technical Report. 368: 1-61.
Steven GW, Taylor JG, Pearce AF. 2001. The seasonal aggregation of whale sharks at Ningaloo Reef, Western Australia: currents, migrations and the El Ni˜no/ Southern Oscillation. Environmental Biology of Fishes. 61: 1–11. Stewart BS. 2009. Movements and habitats of whale sharks of East Africa: Results
Lampiran: Dokumentasi Alat bahan
dan yang
digunakan pada praktikum
ekstraksi
Asisten sedang memberikan pengarahan
Spinning sampel agar terendam bersama chelex
Asisten menjelaskan cara penggunaan alat Sampel dipanaskan (heating) agar terjadi proses lisis pada sampel
Kegiatan ekstraksi sampel hiu paus
Proses sampel telah
vorteks yang di
Hasil elektroforesis sampel hiu paus
