PENUNTUN PRAKTIKUM
GENETIKA DAN BIOLOGI MOLEKULER
JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS ISLAM NEGERI ALAUDDIN MAKASSAR
2015
PERATURAN TATA TERTIB PRAKTIKUM GENETIKA DAN BIOLOGI MOLEKULER 1. 2.
3. 4. 5.
6. 7. 8. 9. 10. 11. 12.
Peserta praktikum harus hadir tepat pada waktu. Keterlambatan > 10 menit berakibat peserta praktikum TIDAK BOLEH mengikuti praktikum pada hari yang bersangkutan. Peserta praktikum diwajibkan mengenakan jas praktikum dan berpakain sesuai kode etik (bersepatu, tidak berkaos oblong, pakaian tidak ketat, dll.). Pelanggaran atas ketentuan ini berakibat peserta praktikum TIDAK BOLEH mengikuti praktikum. Setiap peserta wajib membuat laporan sementara dan laporan resmi percobaan sebelumnya sebagai syarat untuk mengikuti praktikum. Setiap peserta praktikum bertanggung jawab pada ketertiban dan kebersihan laboratorium. Setiap kelompok wajib membawa lap atau tissue. Setiap peserta praktikum wajib memperhatikan kemungkinan kontaminasi bahan yang digunakan. Oleh karena itu TIDAK DIPERBOLEHKAN mengembalikan kembali reagensia ke dalam botol. Peserta wajib membawa pipet untuk mengambil bahan. Setiap pipet untuk satu macam bahan (reagen, apabila pipet sudah digunakan untuk bahan tertentu, TIDAK BOLEH digunakan untuk bahan lainnya. Peserta tidak diperkenankan makan, minum, merokok, dan menggunakan alat komunikasi selama acara praktikum berlangsung. Peserta mengembalikan peralatan laboratorium dalam keadaan bersih dan kering. Kerusakan peralatan dan bahan yang terjadi selama praktikum menjadi tanggung jawab peserta. Peserta wajib mengikuti seluruh kegiatan praktikum, mulai asistensi, seluruh percobaan, dan responsi. Peserta yang tidak dapat mengikuti praktikum sesuai jadwal, diperbolehkan mengikuti inhal dengan membayar biaya administrasi. Inhal maksimum untuk 2 percobaan. Peserta wajib mematuhi seluruh ketentuan lain yang berlaku di lingkungan Laboratorium. Hal-hal yang belum tertuang dalam peraturan tata tertib ini akan diatur lebih lanjut oleh koordinator praktikum.
Samata, September 2015
Dosen Pengampu
Kepala Laboratorium Jurusan Biologi UIN Alauddin Makassar
Dr. Cut Muthiadin, S.Si., M,Si Isna Rasdianah Aziz, S.Si., M.Sc
Eka Sukmawaty, S.Si., M.Si
1
DAFTAR ISI
Peraturan Tata Tertib Praktikum Genetika dan Biologi Molekuler ........................................................ 1 Praktikum 1: KEANEKARAGAMAN MAKHLUK HIDUP ............................................................. 3 Praktikum 2: PENGAMATAN MORFOLOGI LALAT Drosophila sp. ........................................... 6 Praktikum 3: PERSILANGAN DIHIBRID PADA Drosophila sp. .................................................... 8 Praktikum 4: ALEL GANDA .............................................................................................................. 10 Praktikum 5: GEN GANDA ................................................................................................................ 13 Praktikum 6: GENETIKA POPULASI .............................................................................................. 17 Praktikum 7: ISOLASI DNA BAWANG BOMBAY DENGAN CARA SEDERHANA................ 18 Praktikum 8: ELEKTROFORESIS DNA (SDS-PAGE) ................................................................... 20
2
PRAKTIKUM 1. KEANEKARAGAMAN MAKHLUK HIDUP 1. KEANEKARAGAMAN PADA TUMBUHAN Tujuan : Untuk Mengetahui adanya variasi pada tumbuhan Landasan Teori Keanekaragaman adalah sifat beda dari organisme dalam satu spesies atau populasi. Dengan adanya sifat beda akan terjadi variasi atau keanekaragaman dari organisme dalam suatu spesies. Jika kita mengamatzai sifat-sifat yang ada pada makhluk hidup baik pada hewan maupun tumbuhan akan terlihat adanya persamaan-persamaan dan perbedaan-perbedaan. Hal ini terjadi karena adanya sifat-sifat yang menurun dan adanya pengaruh lingkungan. Hewan dan tumbuhan juga mempunyai variasi antara lain dalam bentuk, warna dan ukuran. Bahan yang digunakan 1. bunga bougenvile
4. daun puring
2. bunga mawar
5. bunga pukul empat
3. bunga soka Prosedur 1. Tentukan bahan yang hendak digunakan dan juga sifat yang akan diamati apakah warna, bentuk, ukuran atau sifat-sifat yang lain. 2. Amati sifat dari bahan yang telah ditentukan, cari variasi yang ada. 3. Jumlah bahan yang diamati sebaiknya cukup banyak untuk menghasilkan hasil yang cukup baik. 4. Catat hasil pengamatan saudara dalam lembar yang tersedia. Masalah 1. adakah variasi sifat dari tumbuhan yang saudara amati? 2. adakah persamaan dan perbedaannya? 3. variasi sifat apa yang paling banyak? 4. apa kesimpulan yang dapat saudara ambil dari data pengamatan tersebut Lembar Pengamatan 1. Obyek yang diamati ; ………….. 2. Macam sifat yang diamati : -
Bentuk :……………
-
Warna : ……………
-
Dll
Hasil Pengamatan Macam sifat : ……………..
3
No
Variasi
Jumlah
Keterangan
2. KEANEKARAGAMAN PADA MANUSIA Tujuan 1. Untuk mengetahui variasi sifat pada manusia khususnya sifat-sifat fisik 2. Untuk mengetahui penyebaran sifat-sifat dan melihat persamaan sifat yang terbanyak dalam populasi kelas. Landasan Teori Tidak ada manusia yang tepat sama, individu satu dengan yang lainnya mempunyai persamaan dan perbedaan, sifat yang menurun; baik sifat kualitatif maupun sifat kuantitatif. Perbedaan yang ada diantara individu yang satu dengan yang lainnya ditentukan oleh faktor genetik dan faktor lingkungan. Akibat adanya pengaruh lingkungan ini, maka individu yang bergenotip sama kemungkinan akan mempunyai fenotif yang berbeda. Adanya pewarisan sifat, dalam populasi dapat kita lihat adanya sifat yang sangat bervariasi sehingga kecil kemungkinan dilihat adanya persamaannya. Fenotip
Genotip
Lingkungan
Berbagai sifat yang diwariskan secara poligenik sehingga variasinya cukup luas seperti warna kulit, tinggi badan, kecerdasan (IQ), sidik jari, refraksi mata dll Sifat-sifat pada manusia tersebar dengan penyebaran yang khas untuk populasi tertentu. Prosedur 1. Kegiatan ini dilakukan secara berkelompok, tiap kelompok diusahakan terdiri dari putra putri 2. Lakukan candra pada sifat-sifat yang nampak pada setiap anggota kelompok, sekurangkurangnya 5 sifat. (lihat tabel 1)
4
3. Tuliskan hasil pen-candraan pada tabel 2 yang tersedia, tentukan pula kemungkinan genotip dari sifat tersebut dengan mengingat sifat dominant dan resesifnya. 4. Buat cakram genetika berdasarkan hasil yang tertulis dalam tabel. Usahakan sifat setiap individu dalam anggota kelompok diberi warna yang berbeda. Jika kelompok terdiri dari 5 orang anggota berarti ada lima warna dalam cakram genetika. 5. Tentukan angka indeks setiap anggota kelompok. Tabel 1 Sifat dominan / resesif dari berbagai sifat/ciri Sifat / Ciri Daun Telinga
Keterangan Daun telinga bebas/menggantung dominan terhadap yang melekat (2 fenotip) Lekuk Pipi/Pipit Pipi yang berlekuk pipi dominan terhadap yang tidak berlekuk pipi (2 fenotip) Rambut Keriting Dominan terhadap yang biasa/lurus (3 fenotip) Ibu jari dapat Dominan terhadap yang tidak dibengkokkan sampai pergelangan tangan (2 dibengkokkan fenotip) Lidah Dapat menggulung dominan terhadap yang tidak dapat menggulung (2 fenotip) Ibu Jari Membentuk sudut, tidak membentuk sudut (2 fenotip) Warna Rambut Hitam dominan terhadap yang coklat (2 fenotip) Golongan Darah Gol. A dan B dominan terhadap O, sedang Gol. A dan B dominan sesamanya (4 fenotip) Tabel 2. Hasil Pengamatan Cirri yang diamati A 1. Jenis kelamin 2. Tinggi Badan 3. Bentuk Rambut 4. Lidah 5. Ibu Jari Tangan 6. Telinga 7. Dst
B
C
D
Untuk mengisi tabel ini ciri dibandingkan dengan teman satu kelompok, dan tidak perlu membandingkan dengan kelompok lain. Ciri yang diperoleh tidak menunjukkan sifat atau ciri yang satu lebih unggul dari sifat yang lain. Kesimpulan ……….
5
PRAKTIKUM 2. PENGAMATAN MORFOLOGI LALAT DROSOPHILA sp. I.
Tujuan
Dapat membedakan variasi sifat pada ikan Guppy (Poecilia reticulata) dengan berbagai tipe warna/corak. II.
Landasan Teori
Adanya perbedaan jenis maupun karakter antara individu satu dengan yang lainnya disebabkan oleh adanya perkawinan. Pada organisme yang berkembang biak secara seksual individu baru adalah hasil kombinasi informasi genetik yang di sumbangkan oleh 2 gamet yang berbeda yang berasal dari kedua parentalnya. Dari penampakan morfologis, ikan guppy jantan memiliki bentuk dan corak warna tubuh lebih menarik dan cemerlang daripada ikan betinanya. Perbedaan ciri kelamin berdasarkan : -
Ciri primer: Ikan guppy jantan mempunyai organ yang bernama testis, sedangkan ikan guppy betina mempunyai organ yang bernama ovari.
-
Ciri sekunder : ikan guppy jantan warna pada badan ikan yang menutupi hampir seluruh bagian badannya, modifikasi dari sirip anal menjadi gonopodium, dan bentuk ekor yang panjang dan lebar berwarna menarik seperti merah, kuning, hijau, dan lain – lain . Sedangkan ciri sekunder pada ikan guppy betina adalah warna hanya pada bagian ekor dan sedikit pada pangkal ekornya, memiliki bentuk perut yang lebih besar, serip ekor tidak panjang dan tidak lebar, serta warna ikan guppy betina kusam dan tidak menarik (Sarida M, dkk 2010).
III. Prosedur 1. Amati sampel ikan guppy
6
2. Lakukan pengamatan tentang : a. Jenis kelamin: jantan atau betina b. Warna : tubuh dan ekor c. Bentuk sirip dan ekor 3.
Gambarkan hasil pengamatan saudara
IV. Pertanyaan 1. Adakah variasi ikan guppy yang saudara amati 2. Ciri apakah yang terbanyak ditemukan pada pengamatan? Tentukan persamaan dan perbedaan yang menonjol terutama tentang warna tubuh, tipe sirip dan ekor 3. Bagaimana ciri-ciri ikan guppy jantan dan betina?
7
PRAKTIKUM 3. PERSILANGAN DIHIBRID PADA DROSOPHILA sp. Tujuan 1. Mengetahui keturunan hasil dari persilangan dihibrid pada ikan guppy berdasarkan tipe warna tubuh dan ekor 2. Menguji/membuktikan Hukum Mendel II Landasan Teori Sifat – sifat yang dimiliki oleh makhluk hidup dikendalikan oleh sepasang gen. Satu alel berasal dari induk jantan dan satu allel dari induk betina. Pada waktu gametogenesis tejadi peristiwa segregasi yang menyebabkan dibentuknya dua gamet haploid (yang berbeda genotipnya). Pada waktu fertilisasi terjadi kombinasi antara gamet jantan dengan gamet betina secara bebas. Interaksi antara gen dengan alelnya dapat bersifat dominan resesif, kodominan, semidominan, resesif homozigot letak atau dominan homozigot letal. Alat dan Bahan 1.
Ikan guppy betina tipe ekor normal warna hitam
2.
Ikan guppy jantan tipe ekor bengkok/menjumbai warna merah
Prosedur
a.
Menentukan parental dari masing-masing individu.
b. Menentukan fenotipe dan gamet pada masing-masing individu. c.
Menentukan hasil persilangan berupa F1.
d. Menentukan hasil persilangan berupa F2. e.
Menentukan hasil rasio fenotip dan genotip.
f.
Menghitung hasil persentase persilangan
Tabel 4. Hasil Pengamatan Parental
Tabel 5. Hasil Pengamatan F2 Hari/tanggal
Keturunan F1
Banyaknya
Jumlah
8
Genotip
Fenotip
Pertanyaan 1. Berapakah persentase hasil persilangan pada F2? 2. Apakah uji Chi square telah menunjukkan perbandingan yang diharapkan? Kesimpulan
9
PRAKTIKUM 4. ALEL GANDA Tujuan Mengenal beberapa sifat keturunan pada manusia yang ditentukan oleh pengaruh alel ganda dan mencoba menetapkan genotip dirinya sendiri. Landasan Teori Pada tumbuhan, hewan dan manusia dikenal beberapa sifat keturunan yang ditentukan oleh suatu seri alel ganda. Alat dan Bahan 1. Jari tangan dan darahnya sendiri 2. Loop Percobaan 1 Dengan menggunakan sebuah loop, tiap orang praktikan mengamati sisi atas dari jari-jari tangannya sendiri. Perhatikan dengan seksama apakah pada segmen digitalis tengah dari jari-jari tangan tampak jelas tumbuh rambut. Sifat ini ditentukan oleh suatu seri alel ganda : H1 = rambut terdapat pada semua jari. Ibu jari tidak dipakai H2 = rambut pada jari kelingking, manis dan tengah H3 = rambut pada jari manis dan tengah H4 = rambut pada jari manis saja H5 = tiada rambut pada semua empat jari Dominan dari alel-alel itu ialah : H1 H2 H3 H4 H5 Hasil Pengamatan a.
Percobaan 1 Rambut di ruas tengah jari tangan. Tanggal ; …………
Alel Ganda H1
Hasil Individu
Hasil Kelas Jumlah
Persentase
H2 H3 H4 H5
10
b. Percobaan 2 (Penentuan Golongan Darah) IV.
Alat dan Bahan -
Gelas Preparat
-
Serum anti A
-
Serum anti B
-
Kapas
-
Alcohol
-
Lancet
V.
Cara Kerja 1.
Siapkan alat dan bahan yang akan digunakan dalam percobaan
2.
Tekankan lancet pada ujung jari, kemudian ujung jari dipencet untuk dikeluarkan darahnya.
3.
Titikkan darah di dua bagian tempat di permukaan gelas preparat.
4.
Di titik I teteskan serum A dan di titik II teteskan serum B.
5.
Perhatikan penggumpalan yang mungkin terjadi pada salah satu titik atau malah tak terjadi penggumpalan.
6. VI.
Buat analisis dan kesimpulannya. LANDASAN TEORI
Golongan darah ABO yang ditemukan oleh Landsteiner dalam tahun 1900 dan factor Rh ditemukan oleh Landsteiner bersama Wiener dalam tahun 1942 juga ditentukan oleh alel ganda. Untuk golongan darah tipe ABO misalnya dikenal alel ganda IA, IB dan i. harus dipahami pengertian tentang antigen zat anti (antibodi) dan aglutinasi (proses penggumpalan darah). Orang yang bergolongan darah A di dalam serum darahnya dijumpai antibody B. Orang yang bergolongan darah B di dalam serum darahnya dijumpai antibody A. orang yang bergolongan darah AB didalam serum darahnya tidak dijumpai antibody. Orang yang bergolongan darah O, di dalam serum darahnya dijumpai antibody A dan B Meskipun semua praktikan sebenarnya telah mengetahui golongan darah masing-masing namun dalam percobaan ini mereka belajar menetapkkan sendiri golongan daranya. Disediakan 2 macam antiserum, yaitu antiserum A, antiserum B Dengan bantuan table di bawah anda akan mengetahui golongan darah anda, yaitu : Bila diuji dengan
Aglutinasi
Golongan Darah
Serum anti A saja
Ada
A
Serum anti B saja
Ada
B
Anti A dan Anti B
Ada
AB
Anti A dan Anti B
Tidak ada
O
11
VII.
Hasil Pengamatan
Percobaan ; Menetapkan golongan darah. Tanggal :…………….. Jenis Pengujian
Hasil individu (beri tanda X)
Gol. Darah A
Hasil kelas Jumlah
Persentase
Gol. Darah B Gol. Darah AB Gol. Darah O Rh positif Rh negative Buatlah diagram silsilah dalam keluarga ayah dan ibu anda khusus mengenai golongan darah ABO (jika diketahui). Tunjukkan letak anda di dalam lingkungan silsilah itu. Bagaimana kira-kira genotip anda ? Pertanyaan : 1. Buatlah laporan mengenai pengamatan kelas. Kesimpulan
12
PRAKTIKUM 5. GEN GANDA 1. PEMBENTUKAN SIDIK JARI PADA TANGAN MANUSIA Tujuan : 1. Untuk mengetahui pola sulur jari tangan 2. Menguji perbandingan genetik pola sulur dari populasi mahasiswa dalam satu kelas (dengan menggunakan chi square) Landasan Teori Sulur-sulur dermis diwariskan secara poligen. Sulur-sulur dermis seseorang akan tetap mulai usia 3 – 4 bulan kehamilan dan tidak dipengaruhi oleh lingkungan. Berdasarkan system galton dapat dibedakan 3 pola utama yaitu : 1. Pola Arch atau pola lengkung (A) 2. Pola Loop atau pola sosok (L) 3. Pola Whorl atau pola lingkaran (W) Pola Loop pada dua macam yaitu : 1. Loop radial bila yang terbuka ke ujung jari 2.Loop ulnar bila yang terbuka ke pangkal jari Pola Loop mempunyai satu triradius, pola whorl mempunyai lebih dari satu triradius sedang pola arch tidak memiliki triradius. Frekuensi pola-pola tersebut di atas berbeda untuk setiap bangsa, juga berbeda untuk laki-laki dan perempuan. Pada populasi orang kulit putih dan kulit hitam banyak dijumpai yang memiliki pola loops. Sedangkan pola whorl banyak dijumpai pada populasi bangsa mongoloid, populasi penduduk asli Australia dan populasi Malanesia di Pasifik. Pola Arch dijumpai paling sedikit ditemukan untuk semua populasi bangsa, biasanya jumlahnya kurang dari 10%. Hanya pada populasi Bushman (bangsa Negroid yang hidup di Afrika selatan) pola Arch dijumpai lebih dari 10%. Dalam populasi rata-rata pola Arch dijumpai 5% pola Loop 65 – 70% sedang pola Whorl 25 – 30%. Alat dan Bahan 1. Tinta stempel 2. Kertas tulis 3. Kaca pembesar Loop 4. Bantalan stempel Prosedur Kerja 1. Kenakan 10 jari tangan Saudara pada bantalan stempel 2. Tempelkan masing-masing jari tang pada kertas yang telah tersedia
13
3. Amati bekas sidik jari saudara pada kertas dengan menggunakan loop/laca pembesar 4. tentukan tipe/pola sulur ke sepuluh jari tangan saudara 5. Hitung frekuensi masing-masing pola pada seluruh kelas masukkan dalam table kolom O (= observed value) kemudian uji dengan statistik chi square (pergunakan taraf signifikan 5%). Hasil Pengamatan Tabel 6. Hasil pengamatan Nama : …………… Ibu Jari Tangan
Telunjuk
Jr. Tengah
Jr. Manis
Kelingking
Kanan
Tangan Kiri
Tabel 7. Hasil Pengamatan : Jari tangan pada kelompok kelas No Nama Mhs Jumlah tiap jenis pola sulur jari Arch Loop Whorl
Jumlah
ket
Jumlah
Tabel 8. Hasil pengamatan : Perhitungan chi square Arch Loop O e 5 70 d d2/e
Whorl
Jumlah
25
100
Pertanyaan : 1. Samakah pola dari kesepuluh jari tangan saudara. Jika tidak sama pola mana yang terbanyak 2. Pola apa yang terbanyak dari kelas saudara?
14
3. Jika ada penyimpangan, apakah penyimpangan itu terjadi secara kebetulan? Penyimpangan itu dapat kita terima atau tidak. Diskusikan dengan kelompok anda Catatan : Chi square (X2) = jumlah dari penyimpangan yang dikwadratkan dibagi jumlah hasil yang diharapkan. X2 = ∑ (d2/e) Keterangan : X2 = Chi Square D = Deviaton (penyimpangan) = (O-e) E = Expexted value (hasil yang diharapkan) O = Observed value (hasil yang diharapkan) Hasil Chi square dibandingkan dengan tabel statistik di bawah ini ; Derajat P=0,00 p=0,50 p= 0,25 p=0,10 p=0,05 p=0,01 kebebasan 1 0,02 0,45 1,32 2,71 3,84 6,64 2 0,21 1,39 2,77 4,60 5,99 9,21 3 0,58 2,37 4,11 6,25 7,82 11,34 4 1,06 3,36 5,39 7,78 9,49 13,28 5 1,61 4,35 6,63 9,24 11,07 15,09 6 2,20 5,35 7,84 10,64 12,59 16,81 7 2,83 6,35 9,04 12,02 14,07 18,48 8 3,49 7,34 10,22 13,36 15,51 20,09 9 4,17 8,34 11,39 14,68 16,92 21,67 10 4,87 9,34 12,55 15,99 18,32 23,21 Dapat diterima ………………ditolak
2. PENENTUAN JUMLAH SULUR/RIGI JARI TANGAN Tujuan 1. Untuk mengetahui jumlah rigi pada setiap mahasiswa 2. Untuk mengetahui ada tidaknya penyimpangan dengan frekuensi pada populasi pada umumnya (dengan chi square) Landasan Teori Jumlah sulur atau rigi-rigi jari tangan berbeda untuk laki-laki dan perempuan. Jumlah rigi dihitung mulai dari triradius sampai pusat dari pola sulur jari. Triradius yaitu titik-titik dari mana rigi-rigi menuju ke tiga arah dengan sudut kira-kira 1200. Pola Arch tidak memiliki triradius
15
sehingga perhitungan rigi tidak dilakukan. Jika ada dua atau lebih triradius maka yang diambil adalah hasil perhitungan sulur terbanyak Untuk mendapatkan jumlah perhitungan rigi maka dari semua jari dijumlahkan : hal ini disebut dengan Total Finger Ridge Count. Pada perempuan jumlah rigi rata-rata 127 sedang pada laki-laki 144 (Suryo, Genetika manusia, 1986). Alat dan Bahan 1. Tinta stempel 2. Kertas tulis 3. Kaca pembesar 4. Bak stempel Prosedur 1. Kenakan 10 ujung jari tangan saudara pada tinta stempel dan tempelkan kertas yang tersedia (dapat menggunakan hasil cap jari pada praktikum penentuan pola sulur) 2. Hitung jumlah rigi-rigi dari kesepuluhan jari tangan saudara 3. Masukkan hasil perhitungan saudara dalam tabel 4. Hitung rata-rata jumlah rigi pada mahasiswa putra dan putri 5. Uji perbandingan genetik dengan menggunakan chi square dengan taraf signifikansi 5%. Hasil Pengamatan
Pola Sulur
Ibu Jari A L o-o
A = Arch
W
Jr. telunjuk A L o-o
L = Loop
Jr. tengah W A L o-o
W
Jr. manis A L o-o
W
kelingking A L W o-o
W = Whorl
Pada pola sulur beri tanda sek (√) pada kolom yang sesuai jumlah rigi pada mahasiswa seluruh kelas. No. Mahasiswa 1 2 3 4 5 Dst Uji Perbandingan genetik O e
Jumlah rigi Laki-laki
Jumlah rigi Laki-laki
Perempuan
Perempuan
16
144
d
127
d2/e Lihat tabel statistik di halaman sebelumnya Pertanyaan : 1. Berapa jumlah sulur saudara? ( total finger ridge count) 2. Berapa rata – rata sulur pada mahasiswa putera dan puteri dikelas saudara? 3. Setelah diuji dengan chi square krsimpulan apa yang saudara lakukan?
Jawaban :
Kesimpulan :
17
PRAKTIKUM 6. GENETIKA POPULASI
18
PRAKTIKUM 7. ISOLASI DNA BAWANG BOMBAY DENGAN CARA SEDERHANA Tujuan Mengetahui DNA bawang bombay Landasan Teori DNA dapat ditemukan dalam semua sel yang mengandung inti, khusus untuk tumbuhan DNA akan lebih mudah diambil dari seri jaringan lunak misalnya tunas, ujung akar, daging buah, embrio dan lain-lain . Untuk mengisolasi DNA dari daging buah diperlukan teknik dan bahan yang sangat sederhana. Teknik isolasi DNA ini dapat dilakukan disebuah laboratorium dengan fasilitas alat dan bahan yang terbatas. DNA hasil isolasi ini dapat dianalisis lebih lanjut untuk keperluan misalnya pencarian bibit unggul, uji kekerabatan dan lain-lain.
A. Alat Alat-alat yang digunakan pada praktikum ini antara lain : gelas beker 250 ml dan 100 ml, gelas pengaduk, corong gelas, kertas filter, pipet, ice box, sentrifuge, kertas saring, botol flakon, tube, mikropipet, blender dan freezer. B. Bahan Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum ini antara lain : akuades, larutan buffer, isoprophyl alcohol, juice umbi bawang Bombay, es batu, TE-EDTA, alcohol 70%. C. Cara Kerja Adapun cara kerjanya sebagai berikut : 1.
Bawang Bombay dikupas sebanyak 2 buah, kemudian dipotong lalu dimasukkan ke dalam blender dan ditambahkan air secukupnya, lalu di blender dengan kecepatan sedang hingga menjadi juice
2.
Sebanyak 50 ml juice umbi bawang Bombay dimasukkan ke dalam gelas beker 300 ml
3.
Sebanyak 100 ml larutan buffer ditambahkan ke dalam gelas beker kemudian diaduk dengan gelas pengaduk selama kurang lebih 3 menit
4.
Kemudian dimasukkan ke dalam 4 buah mikropipet dan disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit hingga menghasilkan supernatant
5.
Corong gelas disiapkan dengan kertas filter di atas botol flakon, botol flakon diletakkan di atas es batu 19
6.
Supernatant/lapisan bening dituang ke atas kertas filter sampai diperoleh filtrate sebanyak 100 ml
7.
Perlahan-lahan melalui dinding gelas beker ditambahkan 100 ml isoprophyl alcohol dingin
8.
Botol flakon ditutup hingga rapat kemudian digoyang perlahan-lahan hingga terbentuk tiga lapisan dalam botol flakon.
9.
Lapisan tengah yang terlihat seperti kabut (benang-benang DNA) diambil dengan mikropipet dan dimasukkan ke dalam tube 0,5 ml
10.
Sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit
11.
Supernatan dibuang, pelet dicuci dengan alcohol 70% sebanyak 100 μl
12.
Sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit
13.
Diperoleh pelet kemudian pelet ditambahkan dengan TE-EDTA
14.
Kemudian tube disusun dalam rak gabus dan dimasukkan ke dalam freezer
Data pengamatan
Kesimpulan
20
PRAKTIKUM 8. ELEKTROFORESIS DNA (SDS-PAGE)
I. Tujuan Praktikum Untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari molekul DNA atau RNA dengan elektroforesis SDS-PAGE.` II. Landasan Teori Protein-protein atau asam nukleat dapat dipisahkan satu dari yang lain atas dasar pebedaan muatan listrik. Pada praktikum ini, mahasiswa akan diperlihatkan hasil elektroforesis DNA dengan teknik elektroforesis agarose dan memisahkan protein-protein yang sudah diisolasi dari bawang bombay dengan SDS-PAGE. Protein-protein dapat dipisahkan berdasarkan berat molekul. SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate – polyacrilamide gel electrophoresis) adalah teknik elektroforesis yang sering digunakan dalam analisis protein di laboratorium. Sempel protein denaturasi (dipanaskan) dan dicampur dengan SDS (yang merupakan detergen yang anionik) dengan akibat kompleks protein-detergen itu bermuatan negatif dan protein yang lebih besar menpunyai muatan negatif yang lebih besar.. Kompleks protein-detergen itu akan dibawa oleh medan listrik ke arah kutub positif (anoda). Gel akrilamide berfungsi sebagai dasar atau alas atas gerakan sampel protein. Konsentrasi akrilamide menentukan ukuran poripori gel dan ukuran pori-pori gel menentukan jarak yang ditempuh oleh kompleks protein-SDS. Jadi berapa faktor harus ditentukan untuk memaksimalkan pemisahan protein-protein melalui teknik SDS-PAGE (antara lain: kadar SDS, konsentrasi gel akrilamide dan ukuran gelnya, kemurnian sampel protein dan jumlah sampel yang diletakkan pada gel; voltage yang digunakan pada alat elektroforesis dan selama medan listrik dihidupkan). III. Alat dan Bahan Alat Alat-alat yang digunakan meliputi: beaker glas (10 dan 250, 500, dan 1000 ml), sarung tangan, spatula, batang pengaduk, gelas ukur, erlenmeyer, aluminium foil, pipet ukur, pipet, timbangan digital, mikropipet, sentrifuge, refrigator, pH meter, eppendorf, masker, power supply, plakon, perangkat elektroforesis SDS-PAGE dan kamera digital. Bahan Bahan yang digunakan meliputi: ekstrak antigen OMP, amonium persulfat (APS), akrilamid, aquades steril, bis-akrilamid, SDS, Tris base, TEMED, Glysin, β-mercapetanol, metanol, NaCl, asam asetat glasial, bromofenol biru, gliserol, Coomassie Briliant Blue R-250 (CBB R250), marker protein (Biorad), dan Tris-HCl. Prose dur Kerja Persia pan Gel 21
1. Bersihkan plat kaca dengan akuades dan etanol (70%) 2. Susun lempeng kaca serta spacer. Celah antara lempeng dengan spacer ditutup dengan agar 2% secukupnya. 3. Untuk menyiapkan gel poliakrilimide-SDS 10%, ikutilah tabel yang di bawah. Siapkan gel pemisah dulu. ****Pakai sarung tangan dan hati-hati dengan bahan yang berisi akrilamide**** ****Janganlah menambah ammonium persulfat serta TEMED sebelum Anda siap menuangkan campuran akrilamide ke dalam plat kaca yang sudah disiapkan oleh karena bahan tersebut berfungsi sebagaik katalyst polimerisasi akrilamide**** gel pemisah
gel penumpuk
Bahan
(tabung reaksi 1)
(tabung reaksi 2)
akrilamide 30%/bisakrilamide 0,8%
5 mL
3,05 mL
1,5M Tris-HCl pH=8,8
3,4 mL
---
1,5M Tris-HCl pH=6,8
---
2,0mL
Akuades
5,1mL
4,65mL
SDS 10%
148μL
85μL
amonium persulfat 10%
100μL
75μL
TEMED
10μL
7,5μL
4. Tuang campuran gel pemisah ke dalam ruang antara lempeng kaca, Sisakan kira-kira 2,5 cm dari tepi atas lempeng kaca untuk gel penumpuk. Teteskan isobutanol untuk menyingkirkan udara pada bagian atas gel dan agar batas antar gel dapat terbentuk dengan baik. Biarkan gel pemisah berpolimerisasi selama kurang lebih 30 menit. Siapkan gel penumpuk. 5. Setelah gel pemisah berpolimerisasi, tuangkan campuran gel penumpuk di atasnya. Sisipkan sisir plastik (pembentuk sumur sampel). Biarkan hingga gel penumpuk berpolimerisasi. 6.
Setelah gel penumpuk berpolimerisasi, lepas sisir dari bagian atas dan klem serta spacer bagian bawah.
7.
Letakkan lempeng kaca yang berisi gel secara vertikal pada alat electroforesis dan kemudian klem. Isi tempat dapar dengan dapar elektroda. Singkirkan gelembung udara pada bagian bawah gel.
Bagian B: Persiapan sampel-sampel protein (sampel-sampel protein akan disiapkan petugas lab) 1) Pakailah sarung tangan dan teknik keselamatan di laboratorium yang benar. 2) Tentukan waterbath pada temperatur 100 C. 3) Keluarkan sampel protein dari kulkas. 22
4) Siapkan 3 tabung mikrocentrifus lagi dan tandai dengan S2, GS2, ES2. Tambah 450 µL buffer sampel dan 25μL -merkaptoetanol ke setiap tabung tersebut. Transfer 50 µL sampel protein S, GS dan ES ke tabung mikrosentirfus S2, GS2, dan ES2 masingmasing. 5) Pada sampel protein M, GP dan EP, tambah 900µL buffer dan 25μL sampel ke setiap tabung tersebut.
-merkaptoetanol
6) Tutup dan vorteks pelan-pelan supaya endapannya dicampur rata dengan buffer. 7)
Masukan 6 tabung mikrosentrifus (yaitu M, 2S, GS2, GP, ES2, EP) ke dalam waterbath yang mendidih. Biarkan 5 menit.
8) Tentukan bahwa tabung mikrosentrifus berkeseimbangan dan masukkan ke dalam alat mikrosentrifus. Putar selama 3 menit pada kecepatan 14.000 rpmBagian C: Loading and running the gel 1. Masukkan 10μL sampel protein (yaitu M, 2S, GS2, GP, ES2, EP) ke dalam sumur masingmasing dengan pipet otomatik atau dengan Hamilton syringe. Pada sumur yang terakhir masukkan 10μL protein petanda. Catat nomor sumur dan isinya. 2. Hubungkan alat elektroforesis dengan power supply. Jalankan elektroforesis selama 4 jam atau lebih (voltage yang ditentukan pada alat elektroforesis tergantung waktu yang ada untuk menjalankannya). Bagian D: Pewarnaan Gel 1. Setelah watku untuk menjalalan pemisahan protein selesai, matikan power supply dan lepaskan semua kabel dari alat elektroforesis. 2. Pakai sarang tangan. Buka klem. Angkat spacer pada kedua sisi lempeng kaca, kemudian pisahkan satu lempeng kaca dari gel. Potong gel pada batas antara gel penumpuk dan gel pemisah. Tandai salah satu ujung gel (catat petanda yang Anda buat supaya ingat). 3. Dengan hati-hati angkat gel dan rendam dalam larutan pewarna selama 30-60 menit. 4. Pindahkan ke tempat larutan pencuci. Ganti larutan pencuci beberapa kali hingga warna latar belakang memudar dan pita-pita protein jelas terlihat.
Hasil
Terangkan hasil yang Anda dapat. 1. Foto hasil gel dan masukkan foto tersebut dalam laporan Anda. Berikan beberapa komentar atas apa yang terlihat pada foto gel. Kesimpulan
23
