MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA
DIPLOMOVÁ PRÁCE
BRNO 2014
HANA AMBROŽOVÁ
Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin
Falšování masných výrobků Diplomová práce
Vedoucí práce: MVDr. Olga Cwiková, Ph.D.
Vypracovala: Bc. Hana Ambrožová
Brno 2014
ČESTNÉ PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem práci: „Falšování masných výrobků“ vypracovala samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s § 47b zákona č. 111/1998 Sb., o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědom/a, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle § 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Brně dne:……………………….. …………………………………………………… podpis
PODĚKOVÁNÍ Touto cestou bych chtěla poděkovat vedoucí mé diplomové práce MVDr. Olze Cwikové, Ph.D. za odborné vedení, připomínky, poskytnutí literatury, čas a trpělivost. Poděkování patří také RNDr. Aleně Ansorgové, Ph.D. za odborný dohled a pomoc při měření.
ABSTRAKT Diplomová
práce
je
zaměřena
na
problematiku
falšování
masných
výrobků
a dále jsou v ní popsány metody jejich detekce. Falzifikace potravin je problémem, který trvá už od středověku. Porušení autenticity se nevyskytuje pouze u masných výrobků, ale setkáváme se s ní ve všech komoditách. V práci jsou popsány dozorové orgány, které se zabývají kontrolou potravin. Blíže jsou rozebrány masné výrobky z hlediska poškození jejich pravosti. Mezi nejčastěji používané metody detekce falšování potravin patří vysokotlaká kapalinová chromatografie, enzymová imunoanalýza, polymerázová řetězová reakce. V praktické části se diplomová práce zabývá stanovením čistých svalových bílkovin u trvanlivých a fermentovaných masných výrobků pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie. V další části je stanovena drůbeží svalovina u těch výrobků, u kterých legislativa zakazuje její používání, a to pomocí heterogenní nekompetitivní imunoanalýzy. Při stanovení čisté svalové bílkoviny bylo z 25 vzorků shledáno 7 vzorků (24 %) jako nevyhovujících a při stanovení nedeklarované drůbeží svaloviny byly z 24 vzorků zjištěny 4 vzorky (17 %) jako nevyhovující. Klíčová slova: porušení autenticity, metody detekce, státní dozor, drůbeží svalovina, čistá svalová bílkovina
ABSTACT The diploma thesis is focused on issues connected with falsification of meat products and methods to detect this type of falsification are mentioned in the thesis, as well. Food falsification is a problem, which has persisted since the Middle Ages. A break authentisity doesn´t appear only in meat products but also in all commodities. Surveillance authorities, whose job is to check food are described in the thesis. Meat products from the point of view of their break authentisity are discussed in more detail in the thesis. High pressure liquid chromatography, enzyme-linked-immunosorbent-assay, polymerase chain reaction belong to the most used detect methods of the food falsification. The practical part of the thesis contains determination of pure muscular proteins in durable and fermentated meat products by means of high pressure liquid chromatography. In the next part poultry masculature is determined
in
products
using
noncompetitive
heterogeneous
immunoassay,
in which legislation bans using of mentioned type of masculature. In the determination of net muscle protein were found 7 of 25 samples (24 %) as unsatisfactory and in the determination of poultry muscle 4 of 24 samples detected (17 %) as unsatisfactory.
Key words: breach of authenticity, detection methods, surveillance authorities, poultry muscle, net muscle protein
OBSAH 1
ÚVOD........................................................................................................................ 9
2
LITERÁRNÍ PŘEHLED ......................................................................................... 10 2.1
Historie falšování ............................................................................................. 10
2.2
Falšování potravin ............................................................................................ 10
2.2.1 2.3
Důvody falšování potravin........................................................................ 11
Přehled falšovaných potravin ........................................................................... 12
2.3.1
Maso a masné výrobky ............................................................................. 12
2.3.2
Strojně oddělené maso (SOM) .................................................................. 14
2.3.3
Čistá svalová bílkovina ............................................................................. 15
2.3.3.1 Způsoby stanovení čisté svalové bílkoviny........................................... 16 2.4
Dozorové orgány .............................................................................................. 18
2.4.1
Státní zemědělská a potravinářská inspekce ............................................. 18
2.4.2
Státní veterinární správa ČR (SVS) .......................................................... 19
2.4.3
Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský (ÚKZÚZ) .................... 19
2.4.4
Orgány ochrany veřejného zdraví ............................................................. 20
2.5
Klasické metody průkazu falšování potravin ................................................... 21
2.5.1 2.6
Mikroskopické metody ............................................................................. 21
Moderní metody průkazu falšování potravin ................................................... 22
2.6.1
Fyzikálně – chemické metody .................................................................. 22
2.6.1.1 Kapalinová chromatografie ................................................................... 23 2.6.2
Imunochemické metody ............................................................................ 25
2.6.2.1 ELISA ................................................................................................... 25 2.6.3
Molekulárně biologické metody ............................................................... 27
2.6.3.1 PCR (polymerase chain reaction).......................................................... 27 3
CÍL PRÁCE ............................................................................................................. 30
4
MATERIÁL A METODIKA .................................................................................. 31 4.1
Stanovení čisté svalové bílkoviny pomocí HPLC ............................................ 31
4.1.1
Materiál ..................................................................................................... 31
4.1.2
Pracovní pomůcky .................................................................................... 32
4.1.3
Chemikálie ................................................................................................ 33
4.1.4
Pracovní postup......................................................................................... 33
4.2
Stanovení drůbeží svaloviny pomocí „sandwich“ ELISA ............................... 36
5
4.2.1
Materiál ..................................................................................................... 36
4.2.2
Pracovní pomůcky .................................................................................... 37
4.2.3
Chemikálie ................................................................................................ 37
4.2.4
Pracovní postup......................................................................................... 38
VÝSLEDKY A DISKUZE...................................................................................... 40 5.1
Stanovení čisté svalové bílkoviny .................................................................... 40
5.2
Stanovení drůbeží svaloviny ............................................................................ 51
6
ZÁVĚR .................................................................................................................... 55
7
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ..................................................................... 57
8
SEZNAM OBRÁZKŮ ............................................................................................ 65
9
SEZNAM TABULEK ............................................................................................. 66
1
ÚVOD
Tématem falšování potravin jsem se zabývala již ve své bakalářské práci. Pro aktuálnost tématu jsem se rozhodla v této problematice pokračovat. Je zde několik otázek, na něž je potřeba odpovědět: „Proč je porušení autenticity tak rozšířené? Co vede výrobce k tomu, aby klamali spotřebitele?“ Již v dávné minulosti bylo falšování velice rozšířené. Například ve středověku bylo porušení autenticity piva trestáno smrtí. V diplomové práci jsem se zaměřila na falšování masných výrobků. Hlavní příčinou, proč dochází k jejich falzifikaci, jsou ekonomické důvody. Dochází k tomu, že drahé suroviny jsou nahrazovány těmi levnějšími, aniž by byl o tom spotřebitel informován (například náhrada svalové bílkoviny bílkovinou sójovou). Dalším případem je klamavé označení na obalu, kdy jsou na výrobku uvedeny údaje, které neodpovídají skutečnosti (například nepravdivé tvrzení, že výrobek obsahuje 80 % masa). Také to, že výrobek je neznámého původu, lze považovat za klamání spotřebitele. Proto byly zřízeny dozorové orgány, jako jsou Státní zemědělská a potravinářská inspekce, Orgány ochrany veřejného zdraví, Státní veterinární správa a Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský, které musí zabránit tomu, aby se takové produkty dostávaly na trh. Nutné je mít i moderní přístroje, kterými se průkaz falšování rychle potvrdí. Mezi nejčastěji používané metody patří vysokotlaká kapalinová chromatografie, polymerázová řetězová reakce nebo enzymová imunoanalýza. Důležitá je kontrola již od prvovýroby, kdy platí, že z nekvalitní suroviny kvalitní nevyrobíme. Výrobci si však neuvědomují, že pokud nedodrží stanovené složení, mohou tak ohrozit i život spotřebitele. Například přídavek sójové bílkoviny, která patří do skupiny alergenů, může vyvolat alergickou reakci. Jestliže SZPI nebo další dozorové orgány přijdou na takové podvodné praktiky, pak osobám, které tyto výrobky uvádějí na trh, hrozí sankce stanovené zákonem č. 110/1997 Sb. o potravinách v aktuálním znění. Největším problémem je nízká informovanost populace. Proto jsem vypracovala diplomovou práci, v níž se problematikou falšování potravin zabývám.
9
2
LITERÁRNÍ PŘEHLED
2.1 Historie falšování Záměrné porušení autenticity a předražování potravin se nejvíce rozšířilo v dobách války a neúrody. V potravním kodexu bylo falšování jednotlivých potravin definováno a zakazováno, např. přidávání mouky do uzenářských výrobků. Z historie jsou známy případy, kdy falšování piva bylo trestáno smrtí. Mezi 13. a 16. stoletím byl nejčastěji falšován chléb, víno, pivo a koření. V Anglii v roce 1319 byl k trestu smrti odsouzen řezník, z důvodu prodeje nekvalitního hovězího masa. Vína se falšovala přídavkem cukrů, škrobů a dalších látek. Tyto látky neohrožovaly zdraví konzumenta, ale měly vliv na sníženou kvalitu vína. Po 18. století se falšování potravin stalo nebezpečné, např. kdy byl ocet falšovaný kyselinou sírovou (Tsimidou, 2003).
2.2 Falšování potravin Falšování neboli falzifikace, pochází z latinského slova „falzum“ a znamená napodobování. Senzorické hodnocení potravin je nezastupitelným znakem v oblasti potravinářství. Hodnotí se možná změna barvy, vůně, chutě či textury (Fellows, 2000). Další hodnocení se provádí na základě chemických a fyzikálních změn, například stanovení hmotnosti, tuku, pH, vlákniny apod. Odhalování falšovaných potravin by nebylo možné bez nákladných laboratorních technik, jako je vysokotlaká kapalinová chromatografie (HPLC), heterogenní kompetitivní a nekompetitivní imunoanalýza („sandwich“ ELISA), polymerázová řetězová reakce (PCR) apod. (Cuhra, 2011). Mezi příklady falšování potravin, se kterými se setkáváme, patří klamavé označení na obalu, které je v rozporu se zákonem a uvádění potravin do oběhu, které jsou: - špatně označené - zdravotně závadné - s uplynulým datem použitelnosti - původu neznámého (Kabešová, 2003)
10
Dalším způsobem falšování je záměna potraviny za jinou levnější, nastavování potravin levnější složkou, přítomnost nedeklarovaných složek, nastavení nebo falšování potravin ke zlepšení jejich vlastností, nedodržení deklarovaného technologického postupu, uvádění vyššího než skutečného obsahu složky, nesprávné uvádění geografického původu nebo způsobu produkce, zneužití známé značky nebo použití jiného obalového materiálu (Čížková et al., 2012). 2.2.1 Důvody falšování potravin Falšování potravin je známo už od středověku a postihuje nejen spotřebitele, ale i výrobce
a
distributory.
Potraviny
rozhodně
nepatří
mezi
komodity,
které by nepodlehly falšování. Snaha ošidit spotřebitele začíná již na začátku výroby. Falšování
potravinářských
surovin
a
potravin
postihuje
všechny
komodity
potravinářských výrobků. Jedná se zejména o drahé produkty nebo výrobky, které se vyrábějí ve větším množství. Provádí se tak z důvodu, že jejich falšování může přinést výrobci zisk (Kalivas et al., 2014).
11
2.3 Přehled falšovaných potravin 2.3.1 Maso a masné výrobky Jako
maso
jsou
definovány všechny části
těl
živočichů
buď
v čerstvém,
nebo upraveném stavu, které jsou vhodné k lidské výživě. Chemické složení masa je uvedeno v tabulce 1 (Steinhauser, 2000). Masný výrobek se získává zpracováním masa nebo dalším opracováním masných výrobků. U těchto výrobků musí být z řezné plochy zřejmé, že výrobek ztratil znaky charakteristické pro čerstvé maso (Katina, 2010). Tabulka 1 Chemické složení masa (Steinhauser, 2000) složky masa obsah (%) voda
75
bílkoviny
19
tuky
2,5
dusíkaté látky nebílkovinné
2
bezdusíkaté látky
0,5
anorganické látky
1
Složení masných výrobků Při výrobě nesmí být použity močové a pohlavní orgány, zvukovody, rohovina chrupavky hrtanu a průdušnice, oči, oční víčka a drůbeží hlava. Použití některých výrobních surovin je omezeno vyhláškou č. 326/2001 Sb. v aktuálním znění a týká se pouze určitých skupin masných výrobků. K masu, případně i strojně oddělenému masu, se při výrobě masných výrobků přimíchává řada pomocných látek a přísad v rozsahu a množství dle zvyklostí, které se vztahují k jednotlivým skupinám výrobku. Jde o pitnou vodu, dusitanové solicí směsi, koření, mouku, bílkovinné přísady a škrob (Katina, 2010).
12
Dle vyhlášky č. 326/2001 Sb. se masné výrobky dělí na tyto skupiny: -
tepelně neopracované masné výrobky
-
tepelně opracované masné výrobky
-
trvanlivé tepelně opracované masné výrobky
-
fermentované trvanlivé masné výrobky
-
polokonzervy
-
konzervy
-
kuchyňský masný polotovar
Jakostní požadavky dle vyhlášky č. 326/2001 Sb. (příloha č. 4) Při nakrojení masných výrobků nesmí docházet k uvolňování tuku nebo vody. V nákroji nesmí být cizí části, které nejsou součástí složení masného výrobku, a pozůstatky razítek. Nesmí zde být ani nezpracované a kolagenní části, tuhé kůže, shluky koření nebo jiných složek, jestliže nejsou charakteristickým znakem výrobku. Vložka masných výrobků nesmí vypadávat z nákroje. Povrch masných výrobků nesmí být lepkavý, oslizlý, netypicky svraštělý ani jinak narušený, porostlý plísní, pokud se však nejedná o ušlechtilé druhy plísní, které jsou typické pro daný výrobek. Chuť výrobku musí být charakteristická a nesmí vykazovat cizí příchutě nebo příchuť po narušené surovině. Příklady falšování Mezi příklady falšování patří použití jiného než deklarovaného druhu masa. Identifikace druhu a původu masa je pro spotřebitele důležité z důvodu ekonomických, zdravotních a v neposlední řadě také z důvodu náboženského vyznání. Nejvíce diskutovaným tématem, v roce 2013, byl výskyt nedeklarovaného koňského masa ve výrobku Lasagne. Analýza dokázala náhradu hovězího masa masem koňským, a to v rozsahu nejméně 60 % (Kopřiva, 2013). Dalším způsobem falšování je zvýšení obsahu tuku v masných výrobcích, zvýšení obsahu vody a použití přísad, které ovlivňují vlastnosti masa např. škroby (Ballin, 2010).
13
2.3.2 Strojně oddělené maso (SOM) Definice Dle nařízení Evropského parlamentu a Rady č. 853/2004 v aktuálním znění, o hygienických pravidlech pro potraviny živočišného původu se SOM rozumí produkt, který je získaný mechanickým oddělováním masa z kostí nebo z celých těl poražené drůbeže tak, že se ztratí nebo změní struktura svalových vláken. Jedná se o zbytky kuřete (skelety) obsahující kromě zbytků masa (svalové tkáně) také pojivovou tkáň (šlachy, chrupavky) a kosti, které se namelou a v separátorech se protlačí přes síto. Kostní úlomky nesmí přes síto proniknout, ale ve většině případů se tomu však nezabrání. Strojně oddělené maso neboli drůbeží separát tvoří základ takřka 1/5 uzenin vyskytujících se na českém trhu. Je však méně hodnotný z hlediska výživy, chuti a vůně. U takových výrobků je nutné přidávat barviva, zvýrazňovače chuti a konzervanty, jež drží hmotu pohromadě (Pospěchová, 2013). Porovnání obsahu bílkovin a tuků v kuřecím mase a separátu je uveden v tabulce 2. Tabulka 2 Chemické složení kuřecího masa a separátu (Krbcová, 2013) druh tuky (%) bílkoviny (%) kuřecí maso SOM
2 – 15
18 - 23
7,5 - 19,5
12 - 21,5
Technologie zpracování Vykosťování masa ručním opracováním je značně pracné, proto byly vyvinuty tzv. mechanické separátory, které oddělí zbytky masa od kostí pomocí vysokého tlaku. Dle použitého pracovního postupu dělíme mechanické separátory na kontinuální a dávkovací. Mezi mechanické separátory pracující přerušovaně patří separátor typu „INJECT–STAR“. Jedná se o hydraulický separátor, kdy masité kosti jsou tlačeny do separační komory. Zde dochází k drcení kostí a získaná masitá měl je vytlačována štěrbinami mezi kroužky (Ingr, 1996).
14
Mezi nejznámější kontinuálně pracující separátory patří americký šnekový separátor „BEEHIVE“. Kosti se zbytky masa určené k separaci se nejdříve ve speciální řezačce rozdrtí na drť, jež je tlačena do separační hlavy. Zde pomocí síta dochází k protlačování drti na masovou měl. Síto má různý otvor dle druhu separované suroviny o průměru 0,4-2,5 mm (Budig, 1995). Mezi další zařízení, která jsou vhodná k získání SOM, jsou separační řezačky. Jejich principem je rýhovaný nůž, který odvádí tužší části a kosti ke středu a odkud odcházejí odděleně od mělněného masa (Pipek, 1998). Legislativa V příloze č. 4 vyhlášky č. 326/2001 Sb. v aktuálním znění, o masných výrobcích jsou vypsány výrobky, do kterých je při výrobě zakázáno používat strojně oddělené maso: kabanos, špekáček, vídeňský párek, debrecínský párek, jemný párek, lahůdkový párek, ostravská klobása, šunkový salám, gothajský salám, český salám a junior salám. V případě použití SOM do těchto výrobků jde o klamání spotřebitele a výrobci hrozí sankce dle zákona č. 110/1997 Sb. 2.3.3 Čistá svalová bílkovina Čistou
svalovou
bílkovinou
se
rozumí
bílkoviny
nekolagenní
povahy,
tj. sarkoplazmatické a myofibrilární. U spousty masných výrobků dochází k porušení autenticity přídavkem sójové nebo pšeničné bílkoviny, které slouží jako náhrada svalové bílkoviny (Pipek, 1998).
15
2.3.3.1 Způsoby stanovení čisté svalové bílkoviny V potravinách se vyskytují látky obsahující dusík. Jde o látky anorganické (dusičnany) nebo organické (bílkoviny atd.). Pro stanovení obsahu bílkovin v potravinách se nejčastěji používá metoda stanovení celkového obsahu dusíku, vyjádřeného tzv. hrubou bílkovinou. Mezi tzv. hrubé bílkoviny se zahrnují i dusíkaté látky nebílkovinné povahy. Další způsobem stanovení bílkovin je stanovení tzv. čisté bílkoviny. Jednotlivé metody nejprve eliminují přítomnost nebílkovinných dusíkatých látek ze vzorku a následně je stanoven celkový dusík (Hálková et al., 2001). 1) Stanovení ČSB přes vázaný 3-methylhistidin V kyselém hydrolyzátu zbytku po extrakci vzorku 80% ethanolem se zjistí koncentrace 3-methylhistidinu (3-MeHis), který je vázaný ve svalových bílkovinách aktinu a myosinu. Následně se dopočítá obsah ČSB. ČSB (g/100 g vzorku) = 3-MeHis (mg/100 g vzorku) a) Chromatografické stanovení 3-MeHis MeHis, který je přítomný v hydrolyzátu vzorku se po derivatizaci fluorescaminem separuje na koloně, která je naplněná silikagelem s vázanými oktadecylovými skupinami (C18). Množství 3-MeHis se pak detekuje fluorimetricky. b) Izotachoforetické stanovení vázaného 3-MeHis MeHis přítomný v hydrolyzátu vzorku se separuje v kapiláře, následně se ve v hodně zvoleném systému elektrolytů detektuje vodivostním detektorem (Poulter, 1980). 2) Stanovení ČSB přes celkový kreatin V kyselém hydrolyzátu vzorku se zjistí koncentrace kreatininu. Obsah čistých svalových bílkovin se spočítá ze vzorce: ČSB (g/100 g vzorku) = obsah kreatinu ve vzorku (mg/100g) / 20 a) Spektrofotometrické stanovení kreatininu Kreatinin tvoří s alkalickým pikrátem sodným červeně zbarvený komplex. Intenzita zbarvení se stanovuje při 495 nm a je úměrná koncentraci kreatininu.
16
b) Chromatografické stanovení kreatininu Kreatinin, který je přítomný v hydrolyzátu vzorku se separuje na koloně naplněné silikagelem s navázanými sulfobutylovými skupinami. Detekce probíhá při 210 nm. c) Izotachoforetické stanovení kreatininu Kreatinin, který je přítomný v hydrolyzátu vzorku, se po separaci v kapiláře detekuje vodivostním detektorem (Kvasnička, 2003). 3) Stanovení ČSB metodou podle Kjeldahla Celkový obsah čistých bílkovin se vypočítá z celkového obsahu dusíku pomocí metody dle Kjeldahla. Procentuální obsah celkového dusíku se přepočítá na celkovou bílkovinu vynásobením faktorem 6,25. Tato hodnota je odvozena z poznatku, že 1 g živočišné bílkoviny obsahuje 160 mg dusíku (ČSN ISO 1871, 2010). Ze vzorku potraviny lze dusíkaté látky nebílkovinné povahy odstranit srážením bílkovin pomocí trichloroctové kyseliny nebo taninu. Po vysrážení a oddělení čistých bílkovin ze vzorku potraviny se bílkoviny mineralizují pomocí koncentrované kyseliny sírové při teplotě varu (Davídek, 1981). Rozklad je urychlen zvýšením teploty varu a vhodným katalyzátorem. Dusík obsažený v bílkovinách je mineralizací převeden na síran amonný. Ze síranu amonného se v alkalickém prostředí uvolní amoniak. Amoniak spolu s vodní párou se předestiluje v destilačním přístroji do předlohy se známým nadbytečným množstvím kyseliny sírové. ČSB je nutno dopočítat odečtením hodnoty kolagenu (Kvasnička, 2003). Stanovení kolagenu Pro kolagen je charakteristickou aminokyselinou 4-hydroxyprolin, který se kromě elastinu v jiných živočišných bílkovinách nevyskytuje. Podle jeho obsahu lze usuzovat na
množství
přítomného
kolagenu.
Stanovení
4-hydroxyprolinu
se
provádí
spektrofotometricky. Po hydrolýze vzorku se 4 - hydroxyprolin oxiduje chloraminem-T. Oxidovaný produkt se stanovuje spektrofotometricky při 558 nm po reakci s p-dimethylaminobenzaldehydem a po vynásobení zjištěného obsahu faktorem 8,0 se získá obsah kolagenu (Kvasnička, 2003). Výpočet: Obsah kolagenu [%] = obsah 4-hydroxyprolinu [%] x 8,00 Obsah svalových bílkovin [%] = obsah celkových bílkovin [%] – obsah kolagenu [%]
17
2.4 Dozorové orgány Dozorové
orgány
provádějí
úřední
kontroly
v celém
potravinovém
řetězci
od prvovýroby až po prodej spotřebiteli. Jejich hlavním úkolem je kontrola a zajištění kvality potravin a také ochrana spotřebitelů před klamavými praktikami výrobců. 2.4.1 Státní zemědělská a potravinářská inspekce Státní zemědělská a potravinářská inspekce (SZPI) je dozorovým orgánem, který dle svých možností kontroluje potraviny a suroviny, které slouží k výrobě potravin a dále tabákové a zemědělské výrobky. Jako orgán kontrolující kvalitu potravin je podřízen ministerstvu zemědělství. Úkolem SZPI je kontrolovat potraviny při jejich výrobě, skladování, přepravě i prodeji. Cíleně se zaměřuje na různé výrobky a do míst, kde se předpokládá výskyt nekvalitních potravin. Hlavním úkolem není monitorování, ale ochrana občanů a státu z hlediska ekonomického. Zároveň brání spotřebitele před zdravotně závadnými potravinami a před klamavě označenými potravinami, s prošlým datem použitelnosti nebo neznámého původu (ANONYM 5). Dle zákona č. 146/2002 Sb. v aktuálním znění, o Státní zemědělské a potravinářské inspekci a o změně některých souvisejících zákonů je účelem zákona zřízení SZPI. Jedná se o správní úřad, který je podřízený Ministerstvu zemědělství. V čele inspekce je ústřední ředitel, kterého řídí ministerstvo. Mezi činnosti SZPI patří: -
kontrola, zda zemědělské výrobky, potraviny, suroviny nebo tabákové výrobky splňují požadavky stanovené zvláštními právními předpisy,
-
zda při výrobě či uvádění do oběhu zemědělských výrobků, surovin, potravin nebo tabákových výrobků jsou dodržovány podmínky stanovené zvláštními právními předpisy,
-
zda nedochází ke klamání spotřebitele,
-
zda jsou zemědělské výrobky, potraviny nebo suroviny nebo tabákové výrobky uváděné na trh bezpečné,
-
zda zásoby jí ohlášené podnikatelem podle zákona o potravinách a tabákových výrobcích odpovídají skutečnosti apod.
18
2.4.2 Státní veterinární správa ČR (SVS) Podle veterinárního zákona č. 166/1999 Sb. v aktuálním znění, Státní veterinární správa přijímá opatření ke zdolání nákaz, zoonóz a zabránění jejich šíření. Jedná se o podezření výskytu a šíření nemocí, které jsou přenosné ze zvířete na člověka. Shromažďuje a vyhodnocuje získané informace. Vykonává dozor nad dodržováním zákazu očkování proti určitým nákazám a nemocem přenosných ze zvířete na člověka. U zvířat a živočišných produktů z dovozu určuje, která očkování brání jejich importu. Dle zákona č. 110/1997 Sb. v aktuálním znění, o potravinách vykonávají státní dozor:
nad dodržováním povinností stanovených tímto zákonem a zvláštními předpisy při výrobě, skladování, přepravě, dovozu a vývozu surovin a potravin živočišného původu,
-
při prodeji surovin a potravin živočišného původu v tržnicích a na tržištích, při prodeji potravin živočišného původu v prodejnách a prodejních úsecích, kde dochází k úpravě masa, mléka, ryb, drůbeže, vajec nebo k prodeji zvěřiny a v prodejnách potravin, pokud jsou místy určení, při příchodu surovin a potravin živočišného původu z členských států Evropské unie,
-
nad prováděním klasifikace těl jatečných zvířat podle § 4a a podle přímo použitelných předpisů
Evropských společenství upravujících klasifikaci
jatečných zvířat. 2.4.3 Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský (ÚKZÚZ) Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský se řídí zákonem č. 147/2002 Sb. Je zřízen Ministerstvem zemědělství České republiky v roli specializovaného orgánu státní správy. Je organizační složkou státu a správním úřadem. Hlavní sídlo ÚKZUZ je v Brně, jeho činnost je však zabezpečována na pracovištích na území celé České republiky. Provádí odborné a zkušební úkony. Hlavním úkolem ÚKZÚZ je dozor nad prováděním klasifikace těl jatečných zvířat. Provádí správní řízení a rovněž vykonává jiné správní činnosti, kontrolní a dozorové činnosti v oblasti výživy rostlin, osiv a sadby pěstovaných rostlin, trvalých kultur a v oblasti živočišné produkce (ANONYM 3, 2009).
19
2.4.4 Orgány ochrany veřejného zdraví Mezi orgány ochrany veřejného zdraví patří Ministerstvo zdravotnictví, krajské hygienické stanice, Ministerstvo obrany a Ministerstvo vnitra. Vykonávají státní dozor nad dodržováním povinnosti, které jsou stanoveny zákonem č. 110/1997 Sb., ve znění pozdějších předpisů a zvláštním právním předpisem (zákon č. 258/2000 Sb. a dále ve znění pozdějších předpisů) při poskytování stravovacích služeb. Zároveň vykonávají státní dozor nad dodržováním povinností, které jsou stanoveny zákonem č. 110/1997 Sb., ve znění pozdějších předpisů a zvláštním právním předpisem (zákon č. 258/2000 Sb., ve znění pozdějších předpisů) ke zjištění možných příčin ohrožení nebo poškození zdraví jedince a pro zamezení šíření infekčních onemocnění nebo jiného možného poškození zdraví jedince z potravin.
20
2.5 Klasické metody průkazu falšování potravin Vzhledem k jejich jednoduchosti a rychlosti patří klasické metody mezi často používané. 2.5.1 Mikroskopické metody Mikroskopické metody jsou v určitých případech vhodným řešením pro stanovení složek v potravinách. Většinou ale nejsou pro praktické použití standardizovány a chybí dostatečné množství informací o jejich citlivosti. Přesto mohou být v určitých případech jediným řešením pro zjištění složení potravin a posouzení jejich možného zfalšování (Lücker et al., 1999). V masných výrobcích se nejčastěji vyskytuje pšeničný lepek nebo sójová bílkovina. Histologie umožňuje získání informací o obsahu tkání v masných výrobcích. Touto metodou lze pomocí barvení preparátů odhalit falšování masných výrobků např. náhradami méněcennými částmi těl jatečných zvířat nebo surovinami rostlinného původu (Flint, 1994). Drobné masné výrobky a měkké salámy se mohou falšovat např. přídavkem kůže, chrupavek a kostí, které se dostávají do výrobku s přídavkem strojně odděleného masa (ANONYM 2). Na obrázku1 je zobrazen kostní úlomek jako důkaz falšování masných výrobků pomocí strojně odděleného masa.
Obrázek 1 Kostní úlomek v masném výrobku (ANONYM 2) 21
2.6 Moderní metody průkazu falšování potravin Potraviny jsou velmi různorodý materiál, který lze falšovat mnoha způsoby. Proto byly vyvinuty metody pro odhalení falšování, které se dělí do 3 základních skupin: fyzikálně - chemické imunochemické molekulárně biologické 2.6.1 Fyzikálně – chemické metody Chromatografie je fyzikálně - chemická separační metoda, jejímž principem je dělení látek mezi dvěma fázemi. První je fáze mobilní, která je pohyblivá a druhá je fáze stacionární, která je nepohyblivá. Separace látek se provádí na základě různé afinity složek k mobilní a stacionární fázi. Složky, které mají větší afinitu ke stacionární fázi, se pohybují pomaleji, než složky vázané na mobilní fázi (Švec, 2009). Rozdělení chromatografických metod: 1. Podle fyzikálně chemického principu dělení
rozdělovací chromatografie
adsorpční chromatografie
gelová chromatografie
afinitní chromatografie
iontově výměnná chromatografie
2. Podle skupenství mobilní fáze
plynová chromatografie
kapalinová chromatografie
3. Podle uspořádání stacionární fáze
kapilární chromatografie
kolonová (sloupcová) chromatografie
chromatografie na papíře
chromatografie na tenké vrstvě (tenkovrstvá chromatografie)
4. Podle účelu použití
reparativní chromatografie
analytická chromatografie (Klouda, 2003). 22
2.6.1.1 Kapalinová chromatografie V kapalinové chromatografii je mobilní fází kapalina. O separaci složek vzorku rozhoduje interakce složek se stacionární fází a použitá mobilní fáze. Analyt se během separace dělí mezi mobilní a stacionární fázi. Čas, který stráví analyt v jedné nebo druhé fázi je závislý od afinity analytu ke stacionární a mobilní fázi (Borkovcová, 2011). Dle rozložení stacionární fáze rozeznáváme tenkovrstvou, kolonovou a papírovou kapalinovou chromatografii. Vzhledem k tomu, že nelze vzorek převádět na plyn, je vhodná pro separaci těkavých a tepelně nestálých sloučenin (Popl, 1981). Základní součástí chromatografu (čerpadlo, směšovací zařízení, dávkovací zařízení, kolona, detektor a vyhodnocovací zařízení) jsou zobrazeny na obrázku 2.
Obrázek 2 Schéma kapalinového chromatografu (Komprda, 2003) Využití při detekci falšování potravin Metoda se používá pro detekci falšování arganového oleje slunečnicí nebo sójovým bobem na základě stanovení triacylglycerolů (Salghri, 2014). U pražené kávy dochází k porušení autenticity tím, že kvalitní kávové boby jsou nahrazovány sójou nebo pšenicí. Falšování se následně prokáže detekcí sacharidů ve vzorcích kávy (Domingues et al., 2014). 23
Pomocí této metody lze stanovit i fenolické látky, vitamíny a trans mastné kyseliny. Dále slouží ke stanovení polyfenolických látek v zeleninové a ovocné šťávě. Podle jejich obsahu se rozhodne, zda došlo k porušení autenticity (Obón et al., 2011). Jiné studie využily metodu HPLC ke stanovení sloučenin biuretu, močoviny a cyromazinu, které signalizují zvýšení obsahu dusíku v mléčných výrobcích a tím porušení autenticity mléčných produktů (MacMahon et al., 2012). Dalším příkladem použití HPLC metody je detekce přídavku kravského mléka při výrobě mozzarelly, jež má být vyrobena pouze z mléka buvolího. Jako marker pro detekci
falšování
byl
použit
syrovátkový
protein
β
laktoglobulin
(Czerwenka et al., 2010). Widmer et al. (1992) využili metodu HPLC k detekci falšování ovocných šťáv na základě zjištění přídavku cukrů, barviv a organických kyselin. Nejvíce používaným způsobem porušení autenticity ovocných šťáv je přídavek vody.
24
2.6.2 Imunochemické metody Enzymová imunoanalýza je citlivá imunochemická metoda, která ke značení antigenu nebo protilátky využívá enzymy. Jako enzym slouží peroxidáza nebo alkalická fosfatáza. Všechny heterogenní systémy mají tři základní vlastnosti: -
jeden reaktant se obvykle naváže na pevnou fázi,
-
k oddělení nenavázaného reagentu dochází při promývání,
-
výsledkem je barevná reakce (Crowther, 2001)
2.6.2.1 ELISA Antigen, který je značený enzymem soutěží s antigenem ze vzorku o volná vazebná místa při vazbě na specifickou protilátku. Po navázání antigenu (značeného nebo ze vzorku) je nutné odseparovat nenavázané antigeny od komplexu protilátkaantigen (Ishikawa, 1999). „Sandwich“ ELISA Jedná se o heterogenní nekompetitivní enzymovou imunoanalýzu. Stanovovaný antigen ze vzorku reaguje s dvěma protilátkami, které jsou v reakční směsi v přebytku. Jedna protilátka bývá značená, druhá protilátka je navázána na pevnou fázi a umožňuje separaci vznikajícího imunokomplexu. Analyt (antigen) je vázán mezi dvěma protilátkami (sendvič). Velikost měřeného signálu je přímo úměrná koncentraci stanovovaného antigenu (Asensio et al., 2008). Na obrázku 3 je zobrazeno schéma „sandwich“ ELISA metody.
Obrázek 3 Schéma „sandwich“ ELISA metody (Schneiderka, 2004) 25
Využití při detekci falšování potravin Metoda ELISA se používá pro zjištění záměny druhů mléka. Studie prokázaly, že je schopná detekovat přídavek 0,001 % kravského mléka v ovčích nebo buvolích sýrech a také 0,01% přídavek kravského mléka do měkkých sýrů záměnou za mléko kozí (Hurley et al., 2006). Metoda má uplatnění i pro masné výrobky, ovocné šťávy, pro stanovení alergenů, mykotoxinů, hormonů, proteinů a k odhalení původu krmiv. Často se využívá pro detekci mykotoxinu ochratoxinu A, který se může nacházet v kávě i kakau (Asensio et al., 2008). Další využití metody je pro stanovení sójové bílkoviny v masných výrobcích, stanovení rostlinných bílkovin v sušeném mléce a pro odhalení záměny ovčího a kozího mléka za mléko kravské (Puchades, 2013). Ecker et al. (2013) využili tuto metodu ke stanovení lupiny v sušenkách, chlebě, rýžových placičkách a nudlích. Metoda má také uplatnění pro stanovení nedeklarovaného vepřového masa v mletém hovězím mase. Metodu využili Martin et al. (1998), kdy z 28 testovaných vzorků zjistili falšování vepřovým masem u 27 vzorků masa v množství až 48 %.
26
2.6.3 Molekulárně biologické metody 2.6.3.1 PCR (polymerase chain reaction) Jedná se o molekulárně biologickou metodu. Polymerázová řetězová reakce neboli PCR je metoda zabývající se zmnožením specifických úseků DNA. Pomocí této metody lze na základě komplementarity bází, které jsou obsaženy v molekule nukleové kyseliny, namnožit cílový úsek nukleové kyseliny (Komprda, 2003). PCR spočívá v replikaci nukleových kyselin. Jedná se o cyklické střídání tří fází, kdy každá probíhá za určité teploty (obrázek 4). Nejdříve dochází k denaturaci DNA působením teploty 94 °C, kdy dochází k oddělení řetězců DNA. Druhým krokem je hybridizace primerů při teplotě 30-65 °C, kdy dochází k nasedání a spojení komplementárních řetězců nukleových kyselin. Posledním krokem je syntéza nových řetězců DNA pomocí DNA polymerázy, při teplotě 72 °C. Optimální počet cyklů závisí na výchozí koncentraci templátové DNA a pohybuje se od 25 do 35 cyklů. Zařízení se nazývá termocykler. Výsledným produktem jsou úseky DNA definované délky, tzv. amplikony (Šmarda et al., 2005).
Obrázek 4 Cyklus PCR (Šmarda et al., 2005)
27
Druhy PCR Real-time PCR je založena na sledování průběhu polymerázové řetězové reakce v tzv. „reálném čase," a to pomocí fluorescenčních sond nebo barviv (interkalační barviva). Pro značení primerů a sond se používají tzv. fluorofory, které vyzařují světlo určité vlnové délky po absorpci světla jiné vlnové délky. Výhodou této metody je, že kromě cyklického střídání teplot umožňuje detekci fluorescence a monitoring postupu PCR bez potřeby detekovat produkty pomocí elektroforézy. Real-time PCR se provádí pomocí přístrojů nazvaných cyclery. Kvantifikace se provádí pomocí analýzy amplifikačních křivek vzniklé vynesením získané fluorescence proti pořadovému číslu daného cyklu (Fajardo et al., 2008). Mnohonásobná (multiplexní) PCR je metoda, kdy je do reakční směsi dáno několik dvojic primerů, které dokážou rozpoznat několik různých sekvencí. V jedné reakční směsi umožňuje vyhledat několik genů současně. Metoda je cenově dostupná. Používá se pro detekci změn na dlouhých úsecích DNA a k ověřování vzájemně nezávislých oblastí na DNA (Pantůček, 2005). Využití při detekci falšování potravin Analýza DNA je rychlý a ekonomický nástroj k identifikaci záměny dražších olejů levnějšími. DNA byla testována pomocí PCR v olivách, namletých semenech a pro porovnání také u olejů jiného rostlinného druhu např. slunečnicového nebo sójového oleje (Vietina et al., 2013). Saez et al. (2004) zjistili, že PCR metoda je vhodná pro identifikaci záměny vepřového masa v masných výrobcích drůbeží svalovinou nebo drůbežím separátem na základě specifických primerů. PCR metoda byla také použita k identifikaci a kvantifikaci mandarinek v pomerančové šťávě. Výsledky ukázaly, že šťávy obsahovaly 2,6x více mandarinek než pomerančů. Jednalo se o záměnu druhu ovoce a tím ke klamání spotřebitele (Aldeguer et al., 2014).
28
Calleja et al. (2005) pomocí PCR metody odhalili falšování mléčných výrobků. Studie prokázaly přítomnost kozího mléka v ovčích výrobcích na základě specifických primerů. PCR je možné použít i pro stanovení přídavku kravského mléka do mléka kozího. Studie prokázala, že z celkového počtu 160 vzorků kozího mléka bylo 41,2 % falšováno mlékem kravským (Rodrigues et al., 2012). Čížková et al. (2012) využili PCR metodu k detekci alergenních složek (např. arašídů), dále k detekci druhů brambor, detekci „exotických“ druhů masa, identifikaci Basmati rýže ve směsích rýže, stanovení masa lososa nebo tuňáka v konzervách, k identifikaci použitých druhů ovoce apod. Dále se využívá k rozlišení jednotlivých subtypů v rámci daného druhu patogenních bakterií a k rozlišení druhů rostlin a živočichů (Aguado et al., 2001).
29
3
CÍL PRÁCE
Cílem předložené diplomové práce bylo: 1. Nastudovat problematiku falšování masných výrobků a systému státní kontroly. 2. Nastudovat metody, kterými lze falšování masných výrobků odhalit. 3. Vybrat, zavést a optimalizovat vhodnou metodu pro stanovení čisté svalové bílkoviny v masných výrobcích. Vybrat vhodnou metodu pro detekci jednotlivých druhů masa v masných výrobcích. 4. Vybrat vhodný soubor potravin (masných výrobků) z tržní sítě a u těchto výrobků: -stanovit čistou svalovou bílkovinu (%), -identifikovat drůbeží svalovinu. 5. Získané výsledky vyhodnotit, zpracovat do tabulek a z porovnání s údaji výrobce na obalu potravin vyvodit závěry. 6. Poznatky zpracovat do diplomové práce.
30
4
MATERIÁL A METODIKA
Vzorky pro jednotlivé analýzy byly zakoupeny v supermarketech i u malých prodejců. Analyzováno bylo celkem 50 vzorků, které byly uchovány do doby analýzy v chladničce při 6 °C. Ve většině případů se jednalo o vakuově balené salámy. První část diplomové práce se zabývala stanovením čisté svalové bílkoviny (ČSB) v masných výrobcích (poličan, selský salám, vysočina apod.) pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Druhá část diplomové práce spočívala v detekci nedeklarované drůbeží svaloviny pomocí „sandwich“ ELISA metody. Analýza vzorků byla provedena v chemické a mikrobiologické laboratoři Ústavu technologie potravin Mendelovy univerzity v Brně.
4.1 Stanovení čisté svalové bílkoviny pomocí HPLC 4.1.1 Materiál Pro stanovení ČSB bylo zakoupeno celkem 25 vzorků masných výrobků. Seznam jednotlivých vzorků pro stanovení ČSB je uveden v tabulce 3 a 4. Tabulka 3 Seznam analyzovaných vzorků (1-14) číslo druh vzorku počet vzorku vysočina 1 vysočina 2 vysočina 3 5 vysočina 4 vysočina 5 herkules 6 herkules 7 herkules 8 5 herkules 9 herkules 10 paprikáš 11 paprikáš 12 4 paprikáš 13 paprikáš 14
31
Tabulka 4 Seznam analyzovaných vzorků (15-25) číslo druh vzorku počet vzorku poličan 15 poličan 16 poličan 17 5 poličan 18 poličan 19 lovecký salám 20 lovecký salám 21 4 lovecký salám 22 lovecký salám 23 šunka standard 24 1 šunka výběrová 25 1 Seznam výrobců analyzovaných vzorků je uveden v tabulce 5. Pořadí výrobců uvedených v tabulce neodpovídá pořadí v tabulce 11 a 12. Tabulka 5 Seznam výrobců, distributorů jednotlivých masných výrobků výrobek výrobce x distributor vysočina herkules paprikáš poličan lovecký salám šunka standard šunka výběrová
Baroni, Pejskar, Steinhauser, Interspar, Zřud Krásno, Interspar, Vocílka, Pikok, Pejskar Pikok, Pejskar, Vocílka, Krásno Albert, Interspar, Vocílka, Pejskar, Pikok Krahulík, Pikok, Vocílka, Pejskar Albert Krásno
4.1.2 Pracovní pomůcky
kapalinový chromatograf (HPLC) s UV/VIS detektorem
kolona ZORBAX XDB-C18, 150x4,6mm, 5 µm
desintegrátor Diax 900
sušárna na 105°C
magnetická míchačka, míchadla
minitřepačka VORTEX
analytické váhy
předvážky
automatické pipety 1-5 ml, 100-1000 µl a 10-100 µl 32
mikrostříkačka Hamilton 10 µl
Erlenmeyerovy baňky 100 ml se zátkami
vialky o objemu 1,8 ml
odměrný válec 10 ml a 50 ml
odměrné baňky 1000 ml, 50 ml, 25 ml a 10 ml
kádinky 500 ml, 250 ml, 25 a 10 ml
4.1.3 Chemikálie
kreatinin bezvodý - standard
1-oktansulfonát sodný monohydrát
dihydrogenfosforečnan sodný bezvodý (NaH2PO4)
hydrogenfosforečnan disodný dodekahydrát (Na2HPO4 .12H2O)
kyselina sírová 98%
hydroxid sodný
demineralizovaná voda
pH papírky
4.1.4 Pracovní postup 1) Příprava roztoku 30% H2SO4 Do odměrné baňky bylo dáno asi 500 ml demineralizované vody. Poté bylo odměřeno 167 ml koncentrované kyseliny sírové, která byla přilévána do odměrky s vodou a opatrně míchána. Po dolití demineralizovanou vodou po rysku, byla baňka promíchána a označena. 2) Příprava roztoku 10M NaOH Do kádinky bylo naváženo 20 g NaOH a byla přidána demineralizovaná voda, poté bylo vloženo míchadélko, které na magnetické míchačce dané látky promíchalo. 3) Příprava fosfátového pufru pH=4 Do odměrné baňky bylo naváženo 6,0 g NaH2PO4, který byl rozpuštěn v demineralizované vodě a doplněn po rysku. Do další odměrné nádoby bylo naváženo 17,9 g Na2HPO4.12H2O. Po rozpuštění v demineralizované vodě se odměrka doplnila po rysku.
33
Do odměrky bylo dáno 50 ml 0,2M NaH2PO4 a 50 ml 0,2M Na2HPO4, pak doplněno po rysku demineralizovanou vodou a promícháno. Pomocí pH papírku bylo zkontrolované pH = 4. 4) Příprava mobilní fáze Do odměrky bylo naváženo 0,35 g 1-oktansulfonátu sodného monohydrátu, který byl doplněn fosfátovým pufrem po rysku. 5) Příprava vzorku a kyselá hydrolýza Masný výrobek o hmotnosti 10 g byl zhomogenizován na desintegrátoru. Do odměrné baňky byly naváženy 2,0 g zhomogenizovaného vzorku, ke kterému bylo přidáno 30 ml 30% H2SO4, baňka byla následně umístěna do sušárny na 105 °C. Hydrolýza probíhala minimálně 14 hodin. Po ochlazení byl obsah baňky převeden do odměrky a doplněn po rysku demineralizovanou vodou. Obsah odměrky byl zfiltrován přes papírový filtr. Do odměrky bylo napipetováno 2,5 ml hydrolyzátu a přidáno 10 ml fosfátového pufru, Roztok byl zneutralizován na pH 5 - 8 pomocí NaOH, ochlazen a doplněn
fosfátovým
pufrem
po
rysku.
Nakonec
byl
roztok
přefiltrován
přes membránový filtr a umístěn do malé vialky. 6) Příprava koncentrovaného standardu a kalibrační řady kreatininu Do odměrky bylo na analytických vahách naváženo 20 mg kreatininu a přidán fosfátový pufr. Odměrka byla důkladně protřepána na vortexu a doplněna fosfátovým pufrem po rysku. Koncentrace roztoku byla ~2 mg/ml. Jednotlivé kalibrační roztoky byly připravovány do malých vialek podle tabulky 6. Tabulka 6 Příprava kalibračních roztoků objem standardu objem fosfátového pufru kreatininu 20 µl 980 µl
výsledná koncentrace kreatininu ~40 µg/ml
15 µl
985 µl
~30 µg/ml
10 µl
990 µl
~20 µg/ml
5 µl
995 µl
~10 µg/ml
2,5 µl
997,5 µl
~5 µg/ml
34
Pro odměření objemu 5 µl a 2,5 µl se použila mikrostříkačka Hamilton. Vialky se uzavřely a důkladně protřepaly. Roztoky kalibrační řady se analyzoval pomocí HPLC do 48 hodin po jejich přípravě. 7) Parametry HPLC analýzy
kolona ZORBAX XDB-C18, 150x4,6 mm, 5 µm, ekvilibrace kolony mobilní fází 30 min
teplota kolony: 35 °C
mobilní fáze: 3mM 1-oktansulfonát sodný ve fosfátovém pufru: methanol (97:3), isokraticky
průtok mobilní fáze: 0,5 ml/min
doba analýzy: 10 min
objem nástřiku: 20 µl
UV/VIS detektor: vlnová délka 230 nm
8) Výpočty Výpočet rovnice kalibrační přímky a výpočet koncentrací roztoků vzorků byl proveden v programu ChemStation. Výpočet výsledné koncentrace kreatinu byl proveden dle vzorce:
cm....... výsledná koncentrace kreatininu ve vzorku c ......... koncentrace v µg/ml kreatininu v roztoku vzorku vypočítaná programem ChemStation z kalibračního grafu V........ objem odměrky 25 ml m ....... navážka vzorku (čerstvé hmotnosti)¨ Výpočet obsahu čisté svalové bílkoviny (ČSB) byl proveden podle následujícího vzorce:
35
4.2 Stanovení drůbeží svaloviny pomocí „sandwich“ ELISA 4.2.1 Materiál Pro stanovení nedeklarované drůbeží svaloviny bylo zakoupeno 25 vzorků masných výrobků, kdy 1 vzorek sloužil jako standard. Seznam vzorků analyzovaných ELISA metodou pro průkaz nedeklarované drůbeží svaloviny je uveden v tabulce 7. Tabulka 7 Seznam analyzovaných vzorků (1-25) počet číslo druh vzorku vzorku šunkový salám 1 3 šunkový salám 2 šunkový salám 3 gothajský salám 4 gothajský salám 5 3 gothajský salám 6 vídeňský párek 7 vídeňský párek 8 3 vídeňský párek 9 špekáček 10 špekáček 11 3 špekáček 12 kabanos 13 2 kabanos 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
ostravská klobása ostravská klobása ostravská klobása jemný párek jemný párek debrecínský párek debrecínský párek debrecínský párek junior salám junior salám kuřecí šunkový salám (standard)
3 2
3 2 1
Seznam výrobků a jednotlivých výrobců je uveden v tabulce 8. Pořadí uvedené v tabulce neodpovídá pořadí v tabulce 14. 36
Tabulka 8 Seznam výrobců, distributorů analyzovaných vzorků vzorek výrobce x distributor šunkový salám gothajský salám vídeňský párek špekáček kabanos ostravská klobása jemný párek debrecínský párek junior salám kuřecí šunkový salám
Krásno, Schneider, Clever Kostelecké uzeniny, Havelková, SPAR Masokombinát Plzeň, Kostelecké uzeniny, Steinex Váhala, Kostelecké uzeniny, Uzeniny Písek Steinex, U Švagra Steinhauser, Krásno, Steinex Schneider, Kostelecké uzeniny U Švagra, Masokombinát Plzeň, Steinex Krásno, Steinex Schneider
4.2.2 Pracovní pomůcky
váha
plastové sáčky
odměrný válec na 1000 ml
homogenizátor
pipeta (kapátko) o objemu 3 ml
CDR zkumavky
4.2.3 Chemikálie
ABTS roztok (azino-bis-ethylbenzothiazolin-sulfonová kyselina)
STOP roztok (vodný roztok fluoridu sodného)
enzymové činidlo
37
4.2.4 Pracovní postup Příprava vzorku: Reprezentativní vzorek o hmotnosti 10 g byl vložen do plastového sáčku s cca desetinásobným množstvím vody a následně byl po dobu 1 minuty homogenizován. Po 2 – 3 minutové sedimentaci bylo odebráno pár kapek roztoku. Víčka zkumavek byla označena číslicemi od 1 do 25 (obrázek 5). Příprava vybarvovacího roztoku (CDR): do příslušných imunozkumavek byla přidána 1 kapka ABTS koncentrátu (obrázek 6) a zkumavky byly uzavřeny. Postup analýzy: Do první zkumavky bylo pomocí čisté pipety přidáno 5 - 6 kapek vzorku (homogenizátu). Zkumavka byla uzavřena a 3 - 4 krát promíchána. Maximální doba výdrže byla 10 minut. Po 10 minutách byla tyčinka vyjmuta z imunozkumavky a promývána 10 sekund pod tekoucí vodou, následným otřepáním byla odstraněna přebytečná voda. Promývání bylo prováděno v minutových intervalech u všech zkumavek. Omytá tyčinka byla vložena do příslušné imunozkumavky s enzymem a promíchána (obrázek 7). V enzymu byla tyčinka ponechána 10 minut. Po 10 minutách byla tyčinka vyjmuta a 30 sekund opět promývána, následně byla odstraněna přebytečná voda. Poté byla tyčinka umístěna do předem připraveného CDR roztoku a tam ponechána maximálně 10 minut. Do CDR zkumavky pak byly přidány 4 kapky STOP roztoku a zkumavka byla promíchána na zastavení barevné reakce. Pozitivním výsledkem bylo tmavě zelené zabarvení.
Obrázek 5 Sada používaných imunozkumavek
38
Obrázek 6 STOP roztok pro ukončení reakce (fluorid sodný) a ABTS
Obrázek 7 Imunozkumavky s enzymem
39
5
VÝSLEDKY A DISKUZE
Vzorky byly analyzovány pomocí následujících metod: obsah ČSB (%) byl stanoven pomocí HPLC metody a obsah nedeklarované drůbeží svaloviny metodou ELISA.
5.1 Stanovení čisté svalové bílkoviny V praktické části diplomové práce bylo pomocí HPLC metody analyzováno 25 vzorků a zjištěn u nich obsah čisté svalové bílkoviny v %. Celkem 5 vzorků patřilo do skupiny trvanlivých tepelně opracovaných masných výrobků, 2 vzorky do tepelně opracovaných a zbylých 18 vzorků patřilo do trvanlivých fermentovaných masných výrobků. Z celkového počtu 25 vzorků byly provedenou analýzou shledány 4 vzorky jako nevyhovující (16 %). Pokud se však vezme v úvahu rozšířená nejistota, tak počet nevyhovujících vzorků byl 6 (24 %). Legislativní požadavek na minimální obsah ČSB stanovený vyhláškou 326/2001 Sb. (příloha 4), v aktuálním znění pro maso, masné výrobky, je uveden v tabulce 9. Tabulka 9 Vyhláška 326/2001 Sb., minimální obsah ČSB u masných výrobků výrobek ČSB (% hmotnost nejméně) vysočina 13 poličan 16 lovecký salám 15 paprikáš 14 herkules 14 šunka standard 10 šunka výběrová 13 Požadavky na složení jednotlivých masných výrobků dle vyhlášky 326/2001 Sb. (příloha 4) v aktuálním znění, pro maso a masné výrobky jsou uvedeny v tabulce 10. Tabulka 10 Požadavky na vybrané masné výrobky výrobek charakteristika šunka standard obsah ČSB nejméně 10% hmotnostních šunka výběrová obsah ČSB nejméně 13% hmotnostních, použití barviv, škrobu, vlákniny, rostlinných a jiných živočišných bílkovin se nepřipouští vysočina, poličan, herkules, lovecký obsahuje pouze maso hovězí a vepřové, salám, paprikáš použití vlákniny, SOM nebo drůbežího SOM, rostlinných a jiných živočišných bílkovin se nepřipouští
40
Obsah ČSB byl vypočítán podle stanoveného obsahu kreatinu v masných výrobcích podle vzorce:
Výsledky koncentrace kreatinu a obsahu ČSB jsou uvedeny v tabulce 11. Tabulka 11 Průměrné hodnoty koncentrace kreatinu a ČSB u jednotlivých masných výrobků výrobek kreatin ČSB výsledky c (mg/100 g) - průměr průměr (%) +/vysočina 1 295,09 14,75 vysočina 2 260,81 13,04 vysočina 3 277,98 13,90 vysočina 4 251,15 12,56 + vysočina 5 374,64 18,73 herkules 1 357,15 17,86 herkules 2 304,48 15,22 herkules 3 311,39 15,57 herkules 4 325,90 16,30 herkules 5 266,22 14,73 paprikáš 1 362,89 18,14 paprikáš 2 276,42 13,82 + paprikáš 3 332,49 16,62 paprikáš 4 293,94 14,70 poličan 1 361,54 18,08 poličan 2 362,27 18,11 poličan 3 289,56 14,48 + poličan 4 348,64 17,43 poličan 5 320,07 16,00 lovecký salám 1 399,98 20,00 lovecký salám 2 331,58 16,58 lovecký salám 3 262,04 13,10 + lovecký salám 4 504,28 25,21 šunka standard 202,64 10,13 šunka výběrová 312,52 15,63 Na základě údajů uvedených v tabulce 11, legislativní požadavek nesplnily 4 vzorky (16 %), to znamená., že každý 6. výrobek byl falšovaný. S ohledem na hodnoty rozšířené nejistoty uvedené v tabulce 12, byl počet nevyhovujících vzorků 6 (24 %). 41
Tabulka 12 Hodnoty směrodatné odchylky, relativní směrodatné odchylky (RDS) a rozšířené nejistoty u jednotlivých masných výrobků výrobek směrodatná RDS rozšířená výsledky odchylka (%) nejistota +/vysočina 1 vysočina 2 vysočina 3 vysočina 4 vysočina 5 herkules 1 herkules 2 herkules 3 herkules 4 herkules 5 paprikáš 1 paprikáš 2 paprikáš 3 paprikáš 4 poličan 1 poličan 2 poličan 3 poličan 4 poličan 5 lovecký salám 1 lovecký salám 2 lovecký salám 3 lovecký salám 4 šunka standard šunka výběrová
0,12 0,19 0,14 0,07 0,32 0,32 0,27 0,47 0,11 0,00 0,20 0,40 0,07 0,14 0,05 0,14 0,08 0,23 0,20 1,42 0,44 0,13 3,73 0,002 0,12
0,79 1,43 1,02 0,52 1,69 1,80 1,75 3,01 0,70 0,00 1,08 2,86 0,40 0,93 0,27 0,79 0,54 1,30 1,24 7,10 2,66 0,98 14,80 0,02 0,77
± 0,23 ± 0,37 ± 0,28 ± 0,13 ± 0,63 ± 0,64 ± 0,53 ± 0,94 ± 0,23 ± 0,00 ± 0,39 ± 0,79 ± 0,13 ± 0,27 ± 0,10 ± 0,29 ± 0,16 ± 0,45 ± 0,40 ± 2,84 ± 0,88 ± 0,26 ± 7,46 ± 0,00 ± 0,24
+ + + + + + -
Po zvážení hodnot rozšířené nejistoty, lze konstatovat, že 6 výrobků (24 %) nesplnilo legislativní požadavek, z toho: 2 vzorky vysočiny (33 %), 1 vzorek paprikáše (17 %), 2 vzorky poličanu (33 %) a 1 vzorek loveckého salámu (17 %).
42
22 20 18 16 Obsah ČSB (%)
14
12 10 8 6 4 2 0
Vysočina 1
Vysočina 2
1
Vysočina 3
Vysočina 4
Vysočina 5
Obrázek 8 Porovnání obsahu ČSB (%) u vzorků vysočiny od jednotlivých výrobců. Legislativní limit (13 %) je zvýrazněn oranžovou čarou Z obrázku 8 je zřejmé, že legislativní požadavek na obsah ČSB nesplnila vysočina 4. Vysočina č. 4 obsahovala 12,56 % ČSB. Pokud se však vezme v úvahu hodnota rozšířené nejistoty u vysočiny 2, která je ± 0,37, tak výrobek také neodpovídá legislativnímu požadavku na obsah ČSB (13 %). To znamená., že z 5 testovaných výrobků bylo u 2 vzorků (40 %) prokázáno falšování.
43
22 20 18
16 Obsah ČSB (%)
14 12 10 8 6 4 2 0 1
Herkules 1
Herkules 2
Herkules 3
Herkules 4
Herkules 5
Obrázek 9 Porovnání obsahu ČSB (%) u vzorků herkules od jednotlivých výrobců. Legislativní limit (14 %) je zvýrazněn oranžovou čarou Z obrázku 9 je zřejmé, že u masného výrobku herkules nebylo prokázáno falšování z hlediska nedodržení legislativních požadavků na obsah ČSB (14 %).
44
22
20 18
Obsah ČSB (%)
16
14 12 10
8 6 4
2 0 1
Paprikáš 1
Paprikáš 2
Paprikáš 3
Paprikáš 4
Obrázek 10 Porovnání obsahu ČSB (%) u vzorků paprikáš od jednotlivých výrobců. Legislativní limit (14 %) je zvýrazněn oranžovou čarou Z obrázku 10 je patrné, že se hodnotily vzorky od 4 výrobců. Po provedení analýzy a výpočtu ČSB byl zjištěn 1 nevyhovující výrobek a to paprikáš 2. Obsahoval 13,82 % místo deklarovaných 14 % ČSB, avšak nutné je brát v úvahu nejistotu měření ± 0,79.
45
20 18 16
Obsah ČSB (%)
14 12 10 8 6 4 2
0 1
Poličan 1
Poličan 2
Poličan 3
Poličan 4
Poličan 5
Obrázek 11 Porovnání obsahu ČSB (%) u vzorků poličan od jednotlivých výrobců. Legislativní limit (16 %) je zvýrazněn oranžovou čarou Z obrázku 11 je zřejmé, že požadavek na obsah ČSB nesplnil poličan 3, který obsahoval pouze 14,48 % ČSB. Poličan 5 obsahoval 16 % ČSB, pokud se však vezme v úvahu hodnota rozšířené nejistoty ± 0,40, tak výrobek také neodpovídá legislativnímu požadavku na obsah ČSB (16 %). Závěrem lze říci, že z 5 testovaných výrobků bylo falšováno 40 %.
46
Obsah ČSB (%)
30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Lovecký salám 1
Lovecký salám 2
1
Lovecký salám 3
Lovecký salám 4
Obrázek 12 Porovnání obsahu ČSB (%) u vzorků loveckého salámu od jednotlivých výrobců. Legislativní limit (15 %) je zvýrazněn oranžovou čarou Z obrázku 12 vyplývá, že požadavek na obsah ČSB nesplnil lovecký salám 3, který obsahoval pouze 13,10 % ČSB místo deklarovaných 15 %.
47
18 16 14
Obsah ČSB (%)
12 10 8 6 4 2 0 1
Šunka
Šunka výběrová
Obrázek 13 Porovnání obsahu ČSB (%) u vzorků šunky standard a šunky výběrové od různého výrobce. Legislativní limit pro šunku standard (10 %) je zvýrazněn zelenou čarou a legislativní limit ČSB pro šunku výběrovou (13 %) je zvýrazněn oranžovou čarou Z obrázku 13 je zřejmé, že u šunky standard i šunky výběrové nebylo prokázáno falšování z hlediska nedodržení legislativních požadavků na obsah ČSB tj. šunka standard 10 %, šunka výběrová 13 %.
48
Co se týká obsahu ČSB, bylo z celkového počtu 25 vzorků analýzou prokázáno falšování u 24 % výrobků. Vyhláška 326/2001 Sb. (příloha 4), v aktuálním znění pro maso a masné výrobky, stanovuje minimální množství ČSB (%) v jednotlivých masných výrobcích. Jestliže dojde k nedodržení předpisů, jedná se o klamání spotřebitele. Hlavním důvodem snížení obsahu ČSB může být pro výrobce cena suroviny. Vepřové i hovězí maso, ze kterých má být vysočina, poličan a další produkty vyrobeny, jsou stále více nedostatkovým zbožím. S nedostatkem suroviny roste i jeho cena, a to je pro některé výrobce rozhodujícím faktorem pro falšování. Čistá svalová bílkovina je bílkovina svalu bez pojivových a kolagenních částí, tudíž čím méně masný výrobek obsahuje ČSB, tím méně libového masa bylo použito na jeho výrobu (Pipek, 1998). Mezi nevyhovující výrobky patřila vysočina, poličan, lovecký salám a paprikáš. Na základě vyhlášky 326/2001 Sb., v aktuálním znění pro maso a masné výrobky je vysočina
definována
jako
trvanlivý
tepelně
opracovaný
masný
výrobek,
u kterého bylo ve všech částech dosaženo teploty 70°C po dobu 10 min. Obsah čistých svalových bílkovin musí být nejméně 13 % a tuku nejvýše 50 %. Na základě stanovení ČSB pomocí HPLC metody bylo prokázáno, že 40 % vzorků vysočiny obsahovalo méně ČSB než je deklarováno. To, že dochází k falšování vysočiny, potvrzuje i tisková zpráva SVS z roku 2004, kdy byl nižší obsah ČSB analyzován u dvou vzorků vysočiny pocházející od dvou domácích výrobců (ANONYM 1, 2004). Mezi další falšované výrobky patřil poličan. Na základě stanovení ČSB byly prokázány 2 nevyhovující vzorky z 5 testovaných (40 %). Na základě vyhlášky 326/2001 Sb. v aktuálním znění, je poličan definován jako trvanlivý fermentovaný masný výrobek určený k přímé spotřebě, u kterého v průběhu fermentace, zrání, sušení a uzení za definovaných podmínek došlo ke snížení aktivity vody na hodnotu 0,93. Obsah čistých svalových bílkovin musí být nejméně 16 % a tuku nejvýše 50 %. Klamavé praktiky výrobců poličanu potvrzuje také časopis dTest, který v roce 2013 zjistil, že 6 výrobků z celkových 13 nesplnilo legislativní požadavek na množství ČSB. Laboratoř naměřila v 6 nevyhovujících salámech obsah ČSB od 11,89 % do 15,03 % (ANONYM 4, 2013) U loveckého salámu bylo rovněž analýzou prokázáno porušení autenticity, kdy 1 ze 4 testovaných výrobků obsahoval méně ČSB (13,1 %) než je deklarováno. Lovecký salám, stejně jako poličan, patří mezi trvanlivé fermentované masné výrobky. 49
Poslední výrobek, který neobstál v hodnocení obsahu ČSB byl paprikáš. Legislativní požadavek nesplnil 1 ze 4 testovaných výrobků, který obsahoval méně ČSB (13,82 %) než bylo deklarováno. Analýzy na odhalení falšování masných výrobků provedli inspektoři SZPI v roce 2003, kdy odebrali v obchodní síti 229 vzorků trvanlivých masných výrobků od 34 výrobců. Z celkového množství 229 vzorků 4 vzorky nevyhovovaly předpisům. Smyslovým požadavkům neodpovídaly 2 výrobky, v 1 vzorku byl prokázán nepovolený obsah drůbežího masa a další vzorek neobsahoval předepsané minimální množství ČSB (Kolejková, 2004). To, že je falšování masných výrobků velmi rozšířené potvrzuje i SZPI. V roce 2004 provedla kontrolu, zda výrobci dodržují tzv. „masnou vyhlášku“. Inspektoři SZPI hodnotili celkem u 293 vzorků dodržování smyslových požadavků (chuť, vůně, vzhled), a to u trvanlivých a tepelně opracovaných masných výrobků, z nichž 10 vzorků (3,4%) neodpovídalo předpisům stanovených vyhláškou 326/2001 Sb. U dalších 36 vzorků se provedlo laboratorní měření na průkaz skutečného složení výrobků. Celkem u 20 vzorků (55,5 %) bylo prokázáno, že výrobci stále porušují předpisy, a to i v několika parametrech. Analýzy prokázaly, že z 20 vzorků 12 vzorků obsahovalo nepovolenou drůbeží svalovinu, 6 vzorků mělo nižší podíl drůbežího masa, 4 vzorky vykazovaly nižší obsah masa, 1 vzorek obsahoval neodpovídající množství tuku a 2 vzorky měli neodpovídající hodnotu aktivity vody (Kolejková, 2004). Porušení autenticity nenastává jen v důsledku nižšího obsahu ČSB. I přídavek rostlinných bílkovin je nežádoucí a dochází tím ke klamání spotřebitele. Tremrová a Renčová (2007) prováděly studii, kdy zjišťovaly právě přítomnost rostlinných bílkovin
(pšeničné,
sójové)
v masných
výrobcích
pomocí
ELISA
metody
a histologických metod. Z celkového počtu 108 výrobků bylo 51,8 % nevyhovujících. Výsledky dokazují, že výrobci běžně používají rostlinné přídavky bez ohledu na legislativu. Nejhůře dopadl salám herkules, kdy z celkového počtu 15 vzorků nevyhovělo požadavku na přítomnost pšeničné bílkoviny 12 z nich. Lze konstatovat, že používání rostlinných přídavků ať už pšeničné nebo sójové bílkoviny je u masných výrobků velice rozšířené i přesto, že legislativa zakazuje u některých druhů jejich používání. Proto se stále více vyvíjejí metody pro stanovení rostlinných bílkovin z důvodu ochránit spotřebitele z hlediska ekonomického, ale i jako ochrana zdraví před alergenními složkami, které jej mohou ohrozit. 50
5.2 Stanovení drůbeží svaloviny Druhá část diplomové práce se zabývala stanovením nedeklarované drůbeží svaloviny v masných výrobcích pomocí nekompetitivní imunoanalýzy. Jednalo se o kvalitativní analýzu, kdy výsledkem byla barevná reakce. V případě pozitivního výsledku se roztok zbarvil zeleně. Testováno bylo 25 vzorků, z toho 1 vzorek sloužil jako standard ke srovnání (kuřecí šunkový salám). Vzorky byly odebrány od tří výrobců, s výjimkou junioru, jemného párku a kabanosu pocházejících od dvou výrobců. Z celkového počtu 24 vzorků byly 4 vzorky (17 %) pozitivní na přítomnost nedeklarované drůbeží svaloviny. Legislativní požadavek vyhlášky 326/2001 Sb. (příloha 4), v aktuálním znění pro maso, masné výrobky, ryby, ostatní vodní živočichy a výrobky z nich, vejce a výrobky z nich je uveden v tabulce 13. Tabulka 13 Požadavky na surovinu pro vybrané výrobky (vyhláška 326/2001 Sb.) základní surovina
vzorek špekáček,
kabanos,
vídeňský
debrecínský párek, junior
párek, hovězí, vepřové a telecí maso, nepřipouští se
použití
masa
strojně
odděleného
a drůbežího strojně odděleného jemný párek, šunkový salám, gothajský hovězí a vepřové maso, nepřipouští salám
se použití
masa
strojně
odděleného
a drůbežího strojně odděleného ostravská klobása
vepřové maso, nepřipouští se použití masa strojně odděleného a drůbežího strojně odděleného
51
Seznam analyzovaných vzorků i s výsledky je uveden v tabulce 14. Tabulka 14 Seznam vzorků a výsledky falšování (+/-) číslo druh vzorku výsledek vzorku +/šunkový salám 1 + šunkový salám 2 šunkový salám 3 gothajský salám 4 gothajský salám 5 + gothajský salám 6 + vídeňský párek 7 vídeňský párek 8 + vídeňský párek 9 špekáček 10 špekáček 11 špekáček 12 kabanos 13 kabanos 14 ostravská klobása 15 ostravská klobása 16 ostravská klobása 17 jemný párek 18 jemný párek 19 debrecínský párek 20 debrecínský párek 21 debrecínský párek 22 junior salám 23 junior salám 24 25 kuřecí šunkový + salám (standard) Z celkového počtu 24 vzorků (+ 1 vzorek jako standard), u kterých byla provedena analýza nedeklarované drůbeží svaloviny, bylo falšovaných 17 % výrobků. To znamená, že falšování se dopustili 4 výrobci. Nevyhovující výrobky: 1 vzorek šunkového salámu (25 %) 2 vzorky gothajského salámu (50 %) a 1 vzorek vídeňských párků (25 %).
52
Výsledky stanovení nedeklarované drůbeží svaloviny jsou zobrazeny na obrázku 14.
Obrázek 14 Zprava: imunozkumavka č. 2 - použitý standard, imunozkumavky č. 1, 3, 4,5 - nevyhovující vzorky z hlediska přítomnosti nedeklarované drůbeží svaloviny (č. 1 - šunkový salám, č. 3 - vídeňský párek a č. 4, 5 - gothajský salám) Na základě výsledků analýzy byl zjištěn přídavek drůbeží svaloviny u těchto výrobků: šunkový salám, vídeňský párek a dále u dvou vzorků gothajského salámu. Předmětem zájmů spotřebitele je kvalita a složení masných výrobků. Jakýkoliv přídavek drůbeží svaloviny nebo drůbežího SOM je u těchto výrobků zakázaný. Otázkou zůstává, zda se jednalo o záměrné přidání SOM nebo byl výskyt způsoben nedostatečným omytím příslušného zařízení např. kutru. Použitá metoda stanovila pouze přítomnost drůbeží svaloviny, nikoliv však její množství. Tudíž nelze určit, zda byl výskyt podmíněn nedbalostí nebo jestli porušení autenticity bylo záměrné a ve velké míře. Hlavní důvod, proč je strojně oddělené maso přidáváno do masných výrobků, je ekonomický. Inspektoři
SZPI
v roce
2003
zveřejnili
seznam
výrobků
a
výrobců,
u kterých prokázali přídavek drůbeží svaloviny a drůbežího separátu. Výčet potravin, u kterých SZPI zjistila výskyt drůbeží svaloviny je uveden v tabulce 15. 53
Tabulka 15 Masné výrobky falšované drůbeží svalovinou (Kolejková, 2003) název potraviny výrobce kontrolovaná osoba Staročeský špekáček
J+J Radoš, Lom u Mostu
Koloniál, Velké Chvolno
gothajský salám
Maso Radvanovice,
potraviny Domino,
Karlovice u Turnova
Turnov
StonAl, Petrovice u
jednota Havířov
vídeňský párek
Karviné Schneider Masokombinát E. Duchanová, Plzeň
junior
Plzeň
Dozor
nad
falšováním
potravin
která v roce 2004
uveřejnila
výsledky
provádí kontrol
i
Státní
veterinární
odebraných
vzorků
správa, salámů
z Jihomoravského a Jihočeského kraje. Výsledky ukázaly přídavek nepovoleného drůbežího masa u 2 vzorků gothajského salámu, šunkového salámu, spišských párků, lahůdkových párků, salámu Extra Junior a špekáčků od jedné domácí firmy. Nepovolené strojně oddělené maso bylo zjištěno opět u gothajského salámu, lahůdkových
párků,
salámu
junior
a
špekáčků
od
dvou
různých
firem
(ANONYM 1, 2004). V měkkých salámech či klobáskách se kromě SOM vyskytuje, stejně jako u trvanlivých salámů, sójová bílkovina. Renčová, Tremlová (2009) pomocí nepřímé kompetitivní ELISA metody zjistily přídavek sójových bílkovin v masných výrobcích. Detekční limit sójové bílkoviny je 0,5 %. Testování se podrobilo 131 vzorků masných výrobků typu salámy nebo klobásy, které byly uvedeny na trh v České republice. Sójová bílkovina byla stanovena u 84 % zkoumaných výrobků, u kterých nebyla deklarována na obale. K falšování dochází i v případě, kdy je dražší maso nahrazováno levnějším druhem masa. Ayaz et al. (2006) provedl studii k odhalení, zda dochází ke klamání spotřebitele právě náhradou druhů masa. Bylo analyzováno celkem 100 druhů masa a masných výrobků: 28 vzorků fermentovaných salámů, 14 vzorků tepelně opracovaných salámů, 11 vzorků párků, 16 vzorků mletého masa a masových kuliček, 9 vzorků syrového masa, 7 vzorků vařeného masa, 2 šunky, 5 konzervovaných výrobků, 5 vzorků slaniny a 3 vzorky pastrami. Z celkového počtu stanovovaných vzorků bylo 22 výrobků nevyhovujících, kdy došlo k náhradě hovězího masa za drůbeží či koňské maso a naopak. 54
6
ZÁVĚR
V diplomové práci jsem se zabývala problematikou porušení autenticity masných výrobků. Falšování masných výrobků je dlouho přetrvávajícím problémem v oblasti výroby potravin a zdaleka se nejedná se o problém několika posledních let. Toto záměrně nepoctivé jednání výrobců může mít negativní dopad na zdravotní stav konzumentů.
Zdravotní
aspekty
falšování
jsou
spojené
hlavně
s výskytem
potravinových alergií. Nebezpečí vzniká v případě neoznačení alergenních složek na obale nebo v případě kontaminace technologického zařízení. Hlavním důvodem falšování je stránka ekonomická, kdy výrobce potřebuje vložit do výrobku minimální náklady a prodat jej za co nejvyšší cenu. Bohužel většina českých spotřebitelů nedává přednost kvalitě, nýbrž usiluje o nízkou nákupní cenu. Ze stejných ekonomických důvodů se do výrobků přidává i drůbeží svalovina, případně drůbeží SOM. Pro stanovení drůbeží svaloviny v masných výrobcích byla v této diplomové práci použita metoda sandwich“ ELISA. Z 24 analyzovaných vzorků bylo prokázáno 17 % vzorků jako nevyhovujících (tj. 4 výrobky). Mezi nevyhovující výrobky patřily: 2 vzorky gothajského salámu, 1 vzorek šunkového salámu a 1 vzorek vídeňských párků. Nelze však určit, zda byl výskyt zapříčiněn nedbalostí nebo jestli bylo porušení autenticity záměrné. K
podobným výsledkům dospěla i SZPI,
která také zjistila přítomnost nedeklarované drůbeží svaloviny u gothajského salámu, vídeňských párků, ale také u salámu junior. Mnohdy nelze přesně určit, zda se jedná ze strany výrobce o záměrné falšování či nedbalost při výrobě. O tomto faktu svědčí i nedávný případ z Uherskohradišťska, kdy při ohlášené veterinární kontrole dozorové orgány zjistily přítomnost nedeklarované drůbeží svaloviny v masných výrobcích typu gothajský salám, šunkový salám. Výrobce se však hájil tím, že laboratorní výsledky byly pouze kvalitativní nikoliv však kvantitativní. Výrobce následně přiznal, že se jednalo o nedostatečné omyté technologické zařízení (kutr). Jednalo se o jeden z mnoha případů, který nakonec skončil udělením pokuty a o jeden z mála případů, který souvisel se špatnou hygienou. Pro stanovení ČSB (%) byla použita metoda HPLC s UV/VIS detektorem. Z celkového počtu 25 vzorků bylo falšování prokázáno u 24 % (tj. 6 výrobků). Za nevyhovující byly označeny: 2 vzorky vysočiny, 2 vzorky poličanu, 1 vzorek paprikáše a 1 vzorek loveckého salámu.
55
Námi zjištěné výsledky bohužel korespondují se zjištěním SZPI, kdy ve stejných skupinách masných výrobků (trvanlivé a fermentované masné výrobky) zjistila nedodržení požadavků na obsah ČSB (%). Nicméně je nutné, aby spotřebitelé věnovali svoji pozornost informacím na obalech potravin, kontrolovali složení jednotlivých výrobků a nekupovali potraviny pochybného původu. Bohužel většina zákazníků se nedívá na kvalitu, nýbrž na cenu.
56
7
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY
Knižní publikace a časopis AYAZ, Y., AYAZ, N. D., EROL, I.; 2006: Detection of species in meat and meat products using enzyme-linked immunosorbent assay, Journal of Muscle Foods, Turkey, 17 (2): 214-220 s. AGUADO, V., VITAS, A. I., GARCÍA – JALÓN, I.; 2001: Random amplified polymorphic DNA typing applied to the study of cross-contamination by Listeria monocytogenes in processed food products. Journal Food Protection., Spain, 64 (5): 716–720 s. ALDEGUER, M., ANDREO, M. L., GABALDÓN, J. A., PUYET, A.; 2014: Detection of mandarin in orange juice by single-nucleotide polymorphism qPCR assay, Food Chemistry, vol. 145: 1086-1091 s. ASENSIO, L., GONZÁLEZ, I., GARCÍA, T., MARTÍN, R.; 2008: Determination of food authenticity by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Food Control, Spain, 19 (1): 1- 8 s.
BALLIN, N. Z.; 2010: Authentication of meat and meat products, Meat Science, 86 (3): 577-587 s. BUDIG, J., KLÍMA, D.; 1995: Suroviny a materiál pro masnou výrobu, STEINHAUSER a kolektiv, 460 – 464 s, 1995, hygiena a technologie masa, LAST, Tišnov, 664 s. CALLEJA, L., I., FAJARDO, V., MARTÍN, I., HERNÁNDEZ, P. E., GARCÍA, T., MARTÍN, R.; 2005: Application of Polymerase Chain Reaction to Detect Adulteration of Sheep's Milk with Goats’ Milk, Journal of Dairy Science, Spain, 88 (9): 3115-3120 s.
57
CROWTHER J.; 2001: Metods in Molecular Biology - The Elisa guidebook, Humana press, New Jersey, 414 s. CUHRA P.; 2011: Zkušenosti s prokazováním falšování potravin v uplynulých letech, s. 8 – 15, ČÍŽKOVÁ H., (ed.). Metody a kritéria pro ověřování autenticity potravin a potravinářských surovin. Key publishing s.r.o, Ostrava, 127 s. CZERWENKA CH., MÜLLER L., LINDNER W.; 2010: Detection of the adulteration of water buffalo milk and mozzarella with cow’s milk by liquid chromatography–mass spectrometry analysis of β-lactoglobulin variants, Food Chemistry, Austria, 122 (3): 901-908 s. ČÍŽKOVÁ H., ŠEVČÍK R., RAJCHL A., PIVOŇKA J., VOLDŘICH M.; 2012: Trendy v autenticitě potravin a v přístupech k detekci falšování, Chemické listy, 106 (10): 903-910 s. DAVÍDEK J.; 1981: Laboratorní příručka analýzy potravin. 2. vyd. SNTL Nakladatelství technické literatury, Praha, 720 s.
DOMINGUES D., S., PAULI E. D., JULIA E. M., MASSURA F. W., CRISTIANO V., SANTOS M. J., NIXDORF S. L.; 2014: Detection of roasted and ground coffee adulteration by HPLC by amperometric and by post-column derivatization UV–Vis detection, Food Chemistry, Spain, 146: 353-362 s.
ECKER CH., ERTL A., PULVERER V., NEMES A., SZEKELY P., PETRASCH A., LINSBERGER – MARTIN G., CICHNA – MARKL M.; 2013: Validation and comparison of a sandwich ELISA, two competitive ELISAs and a real-time PCR method for the detection of lupine in food, Food Chemistry, Austria, 141 (1): 407-418 s.
58
FAJARDO, V., GONZÁLES, I., MARTÍN, I., ROJAS, M., HERNÁNDEZ, P. E., GARCÍA, T., MARTÍN, R.; 2008: Real-time PCR for detection and quantification of red deer (Cervus elaphus), fallow deer (Dama dama), and roe deer (Capreolus capreolus) in meat mixtures, Meat science, Spain, 79 (2): 289-298 s.
FELLOWS, P.; 2000: Food Processing Technology: Principles and Practice (2nd Edition). Woodhead Publishing Limited, 227 s.
FLINT, O.; 1994: Food microscopy. - Microscopy Handbooks 30. Bios Scientific Publishers Limited, Oxford, 125 s. HÁLKOVÁ, J., RUMÍŠKOVÁ, M., RIEGLOVÁ, J.; 2001: Analýza potravin. 2. vyd., Újezd u Brna, 94 s.
HURLEY, I., P., COLEMAN, R. C., IRELAND, H. E., WILLIAMS, J. H. H.; 2006: Use of sandwich IgG ELISA for the detection and quantification of adulteration of milk and soft cheese, International Dairy Journal, vol. 16 (7): 805-812 s.
INGR, I.; 1996: Technologie masa, MZLU, Brno, 273 s.
ISHIKAWA, E.; 1999: Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology, Elsevier Science, Amsterdam, 333 s.
KALIVAS, J., GEORGIOU, C. A., MOIRA, M., TSAFARAS, I., PETRAKIS, E. A., MOUSDIS, G. A.; 2014: Food adulteration analysis without laboratory prepared or determined reference food adulterant values, Food chemistry, 148: 289-293 s. KLOUDA, P.; 2003: Moderní analytické metody. Pavel Klouda, Ostrava, 132 s. KOMPRDA, T.; 2003: Hygiena potravin – cvičení, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, Brno, 50 s.
59
KVASNIČKA, F.; 2003: Sborník metodik vypracovaný v rámci řešení projektu č. EP9179 Metody pro posuzování shody a detekci falšování potravin, Vysoká škola chemicko-technologická, Praha, 18 s. LÜCKER, E., EIGENBRODT, E., WENISCH, S., FAILING, K., LEISER, R., BÜLTE, M.; 1999: Development of an integrated procedure for the detection of central nervous tissue in meat products using cholesterol an neuron-specific enolase as marker. Journal of Food Protection, 62: 268 – 276 s.
MACMAHON, S., BEGLEY, T. H., DIACHENKO, G. W., STROMGEN, S. A.; 2012: A liquid chromatography–tandem mass spectrometry method for the detection of economically motivated adulteration in protein-containing foods, Journal of Chromatography A, 1220: 101-107 s.
MARTIN, D. R., CHAN, J., CHIU, J. Y.; 1998: Quantitative evaluation of pork adulteration in raw ground beef by radial immunodiffusion and enzyme-linked immunosorbent assay, Journal of Food Protection, USA, 61 (12): 1686-1690 s. OBÓN, J. M., DÍAZ-GARCÍA, M. C., CASTELLAR, M. R.; 2011: Red fruit juice quality and authenticity control by HPLC. Journal of Food Composition and Analysis, Spain, 24 (6): 760 – 771 s. PIPEK, P.; 1998: Technologie masa II, nakl. Karmelitánské, Kostelní Vydří, 348 s. PIPEK, P., POUR, M.; 1998: Hodnocení jakosti živočišných produktů, Vyd. 1, Česká zemědělská univerzita, Praha, 139 s. POPL, M., KUBÁT, J.; 1981: Základy chromatografie. SNTL, Praha, 152 s.
POULTER,
N.
H.,
LAWRIE,
R.
A.;
1980:
The
practical
application
of 3 - methylhistidine in determining the lean meat content of food products. Meat Science, 4 (1): 21-31 s.
60
PUCHADES, R., MAQUIEIRA, A.; 2013: Chapter 7 – ELISA Tools for Food PDO Authentication, Comprehensive Analytical Chemistry, Spain, 60: 145-193 s. RENČOVÁ, E., TREMLOVÁ, B.; 2009: ELISA for Detection of Soya Proteins in Meat Products, Veterinary Research Institute, Brno, 78: 667-671 s.
RODRIGUES, N. P. A., GIVISIEZ, P. E. N., QUEIROGA, R. C. R. E., AZEVEDO, P. S., GEBREYES, W. A., OLIVEIRA, C. J. B.; 2012: Milk adulteration: Detection of bovine milk in bulk goat milk produced by smallholders in northeastern Brazil by a duplex PCR assay, Journal of Dairy Science, Spain, 95 (5): 2749-2752 s. SAEZ, R., SANZ, Y., TOLDRÁ, F.; 2004: PCR based fingerprinting techniques for rapid detection of animal species in meat products. Meat Science, Spain, vol. 66 (3): 659–665 s.
SALGHRI, R., ARMBRUSTER, W., SCHWACK, W.; 2014: Detection of argan oil adulteration with vegetable oils by high-performance liquid chromatography– evaporative light scattering detection, Food Chemistry, 153: 387-392 s. STEINHAUSER, L.; 1995: Hygiena a technologie masa, Vydavatelství potravinářské literatury Steinhauser - Last, Tišnov, 664 s. STEINHAUSER, L.; 2000: Produkce masa, Vydavatelství potravinářské literatury Steinhauser - Last, Tišnov, 464 s. ŠMARDA J., DOŠKAŘ J., PANTŮČEK R., RŮŽIČKOVÁ V., KOPTÍKOVÁ J., 2005, Metody molekulární biologie, kap. PANTŮČEK, R., DOŠKAŘ, J.; 2005: Aplifikace nukleových kyselin, 85-104 s., Masarykova univerzita, Brno, 188 s. ŠVEC, F.; 2009, Co dnes hýbe kapalinovou chromatografií? Chemické Listy 103: 266−270 s.
61
TSIMIDOU, M., BOSKOU, D.; 2003: Adulteration of foods, Encyclopedia of Food Science and Nutrition (Second Edition), Academic Press, Greece, 42-47 s.
VIETINA, M., AGRIMONTI, C., MARMIROLI, N.; 2013: Detection of plant oil DNA using high resolution melting (HRM) post PCR analysis: A tool for disclosure of olive oil adulteration, Food chemistry, 141 (4): 3820-3826 s.
WIDMER, W., CANCALON, NAGY, S.; 1992: Methods for determining the adulteration of citrus juices, Trends in Food Science & Technology, USA, 3: 278 – 286 s. Zákony a vyhlášky ZÁKON č. 110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů. ZÁKON č. 166/1999 Sb., ze dne 13. července 1999 o veterinární péči a o změně některých souvisejících zákonů (veterinární zákon). VYHLÁŠKA č. 326/2001 Sb., kterou se provádí § 18 písm. a), d), g), h), i) a j) zákona č. 110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích pro maso, masné výrobky, ryby, ostatní vodní živočichy a výrobky z nich, vejce a výrobky z nich. ZÁKON č. 146/2002 Sb., o Státní zemědělské a potravinářské inspekci a o změně některých souvisejících zákonů. ZÁKON č. 147/2002 Sb., o Ústředním kontrolním a zkušebním ústavu zemědělském a o změně některých souvisejících zákonů Nařízení Evropského Parlamentu a Rady (ES) č. 853/2004 ze dne 29. dubna 2004, kterým se stanoví zvláštní hygienická pravidla pro potraviny živočišného původu. ČSN ISO 1871, (2010): Potraviny a krmiva – Obecné pokyny pro stanovení dusíku metodou podle Kjeldahla, Český normalizační institut, Praha, 12 s.
62
Internetové stránky ANONYM 1; Falšování se nesmí tolerovat. Databáze online [cit. 2014-04-12]. Dostupné na:
ANONYM 2; Mikroskopické vyšetření masných výrobků. Databáze online [cit. 201402-28]. Dostupné na: ANONYM 3; 2009: O ústavu. Databáze online [cit. 2014-02-2]. Dostupné na:
ANONYM 4; 2013: Test krájeného poličanu. Databáze online [cit. 2014-04-2]. Dostupné na: ANONYM 5; Kontrolní činnost SZPI. Databáze online [cit. 2014-04-2]. Dostupné na: BORKOVCOVÁ I.; 2011: Kapalinová chromatografie (HPLC, UPLC) – studijní materiál. Databáze online [cit. 2014-03-15]. Dostupné na: KABEŠOVÁ; 2003: Identifikace druhů masa v masných výrobcích. Databáze online [cit. 2014-02-25]. Dostupné na: KATINA, J.; 2010: Označování masných výrobků. Databáze online [cit. 2014-02-25]. Dostupné na: KOLEJKOVÁ, D.; 2003: Státní zemědělská a potravinářská inspekce kontrolovala masné
výrobky.
Databáze
online
[cit.
2014-04-04].
Dostupné
na:
KOLEJKOVÁ, D.; 2004: Státní zemědělská a potravinářská inspekce znovu kontrolovala dodržování „masné vyhlášky“. Databáze online [cit. 2014-04-04]. Dostupné na:
63
KOLEJKOVÁ, D.; 2004: Státní zemědělská a potravinářská inspekce vyhodnotila druhé kolo kontrol masných výrobků. Databáze online [cit. 2014-04-04]. Dostupné na:
KOPŘIVA P.; 2013: Analýza prokázala falšování hovězího masa koňským minimálně 60%. Databáze online [cit. 2014-02-25]. Dostupné na: KRBCOVÁ, L.; 2013: Neříkejte separátu separát, přejí si výrobci uzenin. Databáze online [cit. 2014-02-25]. Dostupné na: POSPĚCHOVÁ P.; 2013: Jak je to se strojně odděleným masem. Databáze online [cit. 2014-3-02]. Dostupné na: SCHNEIDERKA P. Kapitoly z klinické biochemie 2. vydání. Databáze online [cit. 2014-03-02]. Dostupné na: TREMLOVÁ B., RENČOVÁ E., 2007: Prověření přítomnosti rostlinných proteinů zejména sóji a pšeničné mouky v masných výrobcích, kde je přidávání těchto proteinů legislativou zakázáno, metodami histologickými a ELISA. Databáze online [cit. 20144-02]. Dostupné na:
64
8
SEZNAM OBRÁZKŮ
Obrázek 1 Kostní úlomek v masném výrobku (ANONYM 2) .......................................... 21 Obrázek 2 Schéma kapalinového chromatografu (Komprda, 2003) .............................. 23 Obrázek 3 Schéma „sandwich“ ELISA metody (Schneiderka, 2004) ............................ 25 Obrázek 4 Cyklus PCR (Šmarda et al., 2005) ................................................................ 27 Obrázek 5 Sada používaných imunozkumavek ............................................................... 38 Obrázek 6 STOP roztok pro ukončení reakce (fluorid sodný) a ABTS ........................... 39 Obrázek 7 Imunozkumavky s enzymem ........................................................................... 39 Obrázek 8 Porovnání obsahu ČSB (%) u vzorků vysočiny od jednotlivých výrobců. Legislativní limit (13 %) je zvýrazněn oranžovou čarou ................................................ 43 Obrázek 9 Porovnání obsahu ČSB (%) u vzorků herkules od jednotlivých výrobců. Legislativní limit (14 %) je zvýrazněn oranžovou čarou ................................................ 44 Obrázek 10 Porovnání obsahu ČSB (%) u vzorků paprikáš od jednotlivých výrobců. Legislativní limit (14 %) je zvýrazněn oranžovou čarou ................................................ 45 Obrázek 11 Porovnání obsahu ČSB (%) u vzorků poličan od jednotlivých výrobců. Legislativní limit (16 %) je zvýrazněn oranžovou čarou ................................................ 46 Obrázek 12 Porovnání obsahu ČSB (%) u vzorků loveckého salámu od jednotlivých výrobců. Legislativní limit (15 %) je zvýrazněn oranžovou čarou ................................. 47 Obrázek 13 Porovnání obsahu ČSB (%) u vzorků šunky standard a šunky výběrové od různého výrobce. Legislativní limit pro šunku standard (10 %) je zvýrazněn zelenou čarou a legislativní limit ČSB pro šunku výběrovou (13 %) je zvýrazněn oranžovou čarou ............................................................................................................................... 48 Obrázek 14 Zprava: imunozkumavka č. 2 - použitý standard, imunozkumavky č. 1, 3, 4,5 - nevyhovující vzorky z hlediska přítomnosti nedeklarované drůbeží svaloviny ............ 53
65
9
SEZNAM TABULEK
Tabulka 1 Chemické složení masa (Steinhauser, 2000) ................................................. 12 Tabulka 2 Chemické složení kuřecího masa a separátu (Krbcová, 2013)...................... 14 Tabulka 3 Seznam analyzovaných vzorků (1-14) ............................................................ 31 Tabulka 4 Seznam analyzovaných vzorků (15-25) .......................................................... 32 Tabulka 5 Seznam výrobců, distributorů jednotlivých masných výrobků ....................... 32 Tabulka 6 Příprava kalibračních roztoků ....................................................................... 34 Tabulka 7 Seznam analyzovaných vzorků (1-25) ............................................................ 36 Tabulka 8 Seznam výrobců, distributorů analyzovaných vzorků .................................... 37 Tabulka 9 Vyhláška 326/2001 Sb., minimální obsah ČSB u masných výrobků .............. 40 Tabulka 10 Požadavky na vybrané masné výrobky ........................................................ 40 Tabulka 11 Průměrné hodnoty koncentrace kreatinu a ČSB u jednotlivých .................. 41 Tabulka 12 Hodnoty směrodatné odchylky, relativní směrodatné odchylky .................. 42 Tabulka 13 Požadavky na surovinu pro vybrané výrobky (vyhláška 326/2001 Sb.) ...... 51 Tabulka 14 Seznam vzorků a výsledky falšování (+/-) ................................................... 52 Tabulka 15 Masné výrobky falšované drůbeží svalovinou (Kolejková, 2003) ............... 54
66
