MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE

MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA

DIPLOMOVÁ PRÁCE

BRNO 2013

SYLVIE SKALIČKOVÁ

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chemie a biochemie

Izolace a stanovení laktoferinu z lidských slin pomocí kapalinové chromatografie Diplomová práce

Vedoucí práce:

Vypracovala:

doc. RNDr. Vojtěch Adam, Ph.D.

Bc. Sylvie Skaličková

Konzultant: Mgr. Ondřej Zítka, Ph.D.

Brno 2013

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Izolace a stanovení laktoferinu z lidských slin pomocí kapalinové chromatografie, vypracovala samostatně a použila jsem jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.

dne .................................................. podpis..............................................

Experimentální část této diplomové práce byla realizována na výzkumné infrastruktuře vybudované v rámci projektu CZ.1.05/2.1.00/03.0072 Centrum senzorických, informačních a komunikačních systémů (SIX) operačního programu Výzkum a vývoj pro inovace.

Finanční podpora byla poskytnuta Evropským fondem pro regionální rozvoj a státním rozpočtem České republiky.

PODĚKOVÁNÍ Tímto chci poděkovat za odborné vedení mé diplomové práce Mgr. Ondřeji Zítkovi, Ph.D. a doc. RNDr. Vojtěchu Adamovi, Ph.D. Mé poděkování také patří celé pracovní skupině prof. Ing. René Kizeka, Ph.D. za vytvoření příjemných pracovních podmínek. Dále děkuji své rodině, která mi poskytla zázemí a podporu při mém studiu.

ABSTRAKT Glykoprotein laktoferin se nejvíce vyskytuje v mateřském mléce, krevní plasmě, potu, slzách a slinách. Mimo železotransportní funkce v organismu, také vykazuje antibakteriální, protikarcinogenní a protizánětlivé účinky. Jeho zvýšená koncentrace v organismu ukazuje na probíhající zánětlivé onemocnění a díky tomu je laktoferin považován za potencionální marker imunitních onemocnění, pro které jsou sliny perspektivním diagnostickým médiem. Cílem této práce bylo optimalizovat podmínky separace a stanovení laktoferinu z lidských slin pomocí iontově-výměnné kapalinové chromatografie s monolitickou kolonou a off-line fotometrickou detekcí využívající metody pyrogallovou červeň, metodu dle Bradfordové a Biuretovu metodu. Pomocí metody SDS-PAGE bylo ověřeno, že izolované frakce obsahovaly pouze laktoferin. Tato metoda vykazuje vysokou citlivost a selektivitu. Získané výsledky byly porovnány se standardní enzymově značenou imunoanalýzou, která se pro stanovení laktoferinu běžně využívá v klinických studiích. Klíčová slova: iontově výměnná kapalinová chromatografie, monolitická kolona, spektrofotometrie, laktoferin, sliny

ABSTRACT Lactoferrin, which is globular glycoprotein, is an important component of mamalian milk, blood, sweat, tears and saliva. This ferro-transfering protein has antibacterial, anticancerogenic and anti-inflammatory activity. The highest level of lactoferrin in organism signifying the inflammatory processes due to saliva is the perspective diagnostic medium. The aim of this study was to optimize conditions for separation and determination of lactoferrin from human saliva using ion exchange chromatography with monolithic column off-line coupled with spectrometric detection using Pyrogallol red, Bradford´s method and Biuret method. The purity of the isolated fractions was verified by SDS-PAGE. This method proved very sensitive detection and hight selectivity. Results were correlated with standard enzyme-linked immunosorbent assa kit wich is generally used in clinical practice.

Keywords:

ion

exchange

liquid

spectrophotometry, lactoferrin, saliva

chromatography,

monolithic

column,

OBSAH 1 ÚVOD .......................................................................................................................... 10 2 LITERÁRNÍ ČÁST ..................................................................................................... 11 2.1 Sliny ...................................................................................................................... 11 2.2 Laktoferin.............................................................................................................. 11 2.2.1 Regulace syntézy laktoferinu a jeho metabolismus ....................................... 12 2.2.2 Laktoferin v diagnostice imunitních onemocnění ......................................... 13 2.2.3 Význam laktoferinu ....................................................................................... 13 3.3 Metody stanovení laktoferinu ............................................................................... 15 3.3.1 Iontově výměnná kapalinová chromatografie................................................ 16 3.3.1.1 Kolony využívané v IELC ..................................................................... 16 3.3.1.2 Monolitická kolona ................................................................................. 17 3.3.2 Spektrofotometrické metody.......................................................................... 19 3.3.3 Enzymově značená imunoanalýza (ELISA) .................................................. 20 3 CÍLE PRÁCE ............................................................................................................... 21 4 MATERIÁL A METODY ........................................................................................... 22 4.1 Chemikálie ............................................................................................................ 22 4.2 Příprava vzorků slin .............................................................................................. 22 4.3 Iontově výměnná kapalinová chromatografie s UV detekcí ................................. 22 4.4 Polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS-PAGE)......................................... 23 4.5 Fotometrická detekce laktoferinu ......................................................................... 23 4.6 Enzymově značená imunoanalýza ........................................................................ 24 4.7 Statistické vyhodnocení ........................................................................................ 25 5 VÝSLEDKY A DISKUZE .......................................................................................... 26 5.1 Optimalizace izolace laktoferinu z lidských slin .................................................. 26 5.1.1 Optimalizace gradientu .................................................................................. 26 5.1.2 Vliv rychlosti průtoku mobilní fáze na eluci laktoferinu ............................... 27 5.1.3 Vliv iontové síly mobilní fáze na eluci laktoferinu ....................................... 28 5.1.4 Van Deemterova rovnice ............................................................................... 29 5.1.5 SDS-PAGE analýza vzorků slin .................................................................... 29 5.2 Optimalizace off-line fotometrické detekce ......................................................... 30 5.3 Analýza vzorků slin .............................................................................................. 32

5.3.1 Návratnost ...................................................................................................... 32 5.3.2 Analýza vzorků slin ....................................................................................... 33 5.3.3 Korelace IELC s ELISA analýzou ................................................................. 34 6 ZÁVĚR ........................................................................................................................ 36 7 ZDROJE INFORMACÍ ............................................................................................... 37 8 SEZNAM ZKRATEK ................................................................................................. 50 9 SEZNAM OBRÁZKŮ ................................................................................................. 51 10 SEZNAM TABULEK ............................................................................................... 52

1 ÚVOD V současné době, kdy se neustále zvyšuje výskyt nových civilizačních onemocnění, je kladen důraz na jejich včasnou diagnózu. Díky tomu narůstá tlak společnosti pro nalezení nových markérů, které by pomohly rychle a spolehlivě tyto onemocnění odhalit, a tím zvýšit úspěšnost jejich léčby. Zároveň vzniká požadavek na nalezení takového markéru, který by pro odběr nevyžadoval invazivní zákrok, což splňuje například moč, stolice, sliny a ostatní tělní sekrety. Právě sliny jsou významným diagnostickým médiem pro stanovení onemocnění, které vykazují spojitost s imunitním systémem organismu. Jednou z významných složek slin je laktoferin, který je v této práci studován. V literatuře je spojován se zánětlivými procesy v organismu, a to díky jeho výjimečným vlastnostem. Poprvé byl jeho výskyt zaznamenán v mateřském mléce, kde spolu s ostatními biologicky významnými látkami podporuje tvorbu imunity mláďat. Avšak laktoferin se uplatňuje i jako nutriční doplněk ve výživě dospělých jedinců. Jedná se tedy o velmi významný protein, který se stává v současné době předmětem mnoha experimentů a studií v oblastech proteomiky, genomiky, metalomiky, nutriomiky a mnoha dalších. Rozvoj metod a zdokonalení analytických přístupů pro jeho analýzu je tedy nezbytný a hraje významnou roli v oboru instrumentálních technik. Dosud bylo publikováno mnoho metod, které umožňují laktoferin

velmi

přesně

detekovat,

například

iontově-výměnná

kapalinová

chromatografie, enzymově značená imunoanalýza či hmotnostní spektrometrie. Avšak čím více se budou rozvíjet nároky laktoferinu jako markéru imunitních onemocnění, tím více budou požadovány senzitivnější metody pro jeho detekci. Součastně je také třeba brát ohled na jeho izolaci z biologických vzorků, protože jak již mnohé studie naznačují, laktoferin je považován za potenciální lék proti zánětlivým onemocněním, ale i například proti rakovině. Tyto aspekty dělají z laktoferinu velice slibnou sloučeninu, významnou nejen pro vědeckou sféru, ale také pro komerční účely.

10

2 LITERÁRNÍ ČÁST 2.1 Sliny Sliny jsou směsí biologicky významných glykoproteinů, proteinů, enzymů, hormonů, minerálů, elektrolytů rozpuštěných ve vodě (Schenkels, Lcpm, Veerman, E. C. I. et al. 1995; Humphrey, S. P. and Williamson, R. T. 2001) a jsou produkovány především velkými párovými velkými slinnými žlázami. Obsah vody a v ní rozpuštěných látek kolísá v závislosti na momentálním fyziologickém stavu organismu, přičemž tyto procesy jsou řízené vegetativním nervovým systémem na základě podmíněných a nepodmíněných reflexů (Humphrey, S. P. and Williamson, R. T. 2001). Sliny se podílejí na přenosu chuti k chuťovým pohárkům, zvlhčují dutinu ústní, štěpí sacharidy a tuky na jednodušší sloučeniny, mají antimikrobní, desinfekční a ochranné účinky (Amerongen, A. V. N. and Veerman, E. C. I. 2002). Sliny jsou potencionálním diagnostickým médiem pro mnoho nemocí, které jsou především spojené s funkcí imunitního systému, rakoviny, onemocnění zubů a dásní i psychiatrických a neurologických poruch (Castagnola, M., Picciotti, P. M. et al. 2011). Sliny byly již v mnoha předchozích studiích využity pro stanovení laktoferinu, který je spojován se vznikem řady nemocí (Kirstila, V., LenanderLumikari, M. et al. 1996; Rudney, J. D., Hickey, K. L. et al. 1999; Fine, D. H., Furgang, D. et al. 2002; Haghighat, N. and AlHashimi, I. 2003; Grange, P. A., Marcelin, A. G. et al. 2004; Jentsch, H., Sievert, Y. et al. 2004; Komine, K., Kuroishi, T. et al. 2007).

2.2 Laktoferin Laktoferin je glykoprotein o molekulové hmotnosti 80 kDa, který je složen z 692 aminokyselin (Powell, M. J. and Ogden, J. E. 1990; Rey, M. W., Woloshuk, S. L. et al. 1990) a jeho isoelektrický bod (pI) byl stanoven v rozmezí 8 – 8,5 (Levay, P. F. and Viljoen, M. 1995; Lonnerdal, B. and Iyer, S. 1995). Struktura laktoferinu je uspořádána do peptidového řetězce, který je strukturovaný do dvou domén N a C (Obr. 1). Obě tyto domény mají schopnost na sebe vázat atom většiny divalentních kovů jako je Fe2+ nebo také Cu2+, Zn2+ a Mn2+ (Levay, P. F. and Viljoen, M. 1995; Lonnerdal, B. and Iyer, S. 1995). Výskyt tohoto proteinu byl zaznamenán v sekretech mucinózních buněk a lze jej detekovat v mateřském mléce, slzách, krevní plasmě, potu, spermatu, vaginálním výtoku a také ve slinách (Levay, P. F. and Viljoen, M. 1995). 11

Obrázek 1: 3-D struktura lidského laktoferinu obsahujícího dva ionty Fe2+ vázané v každé z jeho dvou domén (zdroj: www.expasy.org).

VObr. mnoha studiích bylo prokázáno, že laktoferin vykazuje 1: 3-D struktura lidského Laktoferinu obsahujícího dva ionty Fe2+ vázané v každé z jeho

antimikrobní,

dvou domén (zdroj:www.expasy.org).

antikarcinogenní, protizánětlivé a protiplísňové účinky, a to díky schopnosti vázat na sebe aktivní ionty kovů, které některé druhy bakterií vyžadují pro svůj růst (Arslan, S. Y., Leung, K. P. et al. 2009). Proto je laktoferin zařazován do nespecifického imunitního systému savců. V lékařských studiích je jeho zvýšená koncentrace v organismu spojována s probíhajícím zánětlivým onemocněním (Sukharev, A. Ye, Yermolayeva, T. N. et al. 2009). 2.2.1 Regulace syntézy laktoferinu a jeho metabolismus Regulace syntézy laktoferinu závisí na typu buněk produkujících tento protein. V mléčné žláze je jeho syntéza řízena hormonem prolaktinem (Nakajima, K., Nakamura, M. et al. 2008). V endometriu je syntéza laktoferinu řízena epidermálním růstovým faktorem a estrogenem (Teng, C. T., Gladwell, W. et al. 2002). Bylo také zjištěno, že exogenní žlázy jej produkují nepřetržitě. V neutrofilních buňkách je laktoferin syntetizován během jejich diferenciace a poté je uložen ve speciálních granulech a následně se produkce laktoferinu zastavuje (Inoue, M., Yamada, J. et al. 1993). V mnoha studiích bylo potvrzeno, že hladina laktoferinu se mění s věkem, je závislá na pohlaví jedince a také se jeho koncentrace v krevním séru zvyšuje v proliferační fázi menstruačního cyklu (Adlerova, L., Bartoskova, A. et al. 2008). Biologické vlastnosti laktoferinu jsou zprostředkovány určitými receptory na povrchu 12

cílových buněk. Tyto receptory jsou specifické pro každý typ buňky a mohou se nacházet například v nosních epitelech, hepatocytech, monocytech, makrofázích, lymfocytech, trombocytech, fibroblastech a některých bakteriích jako je Staphylococcus aureus nebo Pseudomonas hydrophila (Beddek, A. J. and Schryvers, A. B. 2010). V některých buňkách se mimo receprotrů pro laktoferin, nachází receptory pro transferin, které současně umožňují navázání transferinu (Lopez, S. A., Nonnecke, E. B. et al. 2012). V organismu je laktoferin metabolizován přes receptorem zprostředkovanou endocytózu fagocytujících buněk s následným přenosem železa do feritinu skrze přímé vstřebávání v játrech (Regoeczi, E. 1997). Do metabolismu laktoferinu jsou zapojeny pravděpodobně i ledviny, které odebírají laktoferin z krevního oběhu, odkud jsou jeho fragmenty vyloučeny močí (Abrink, M., Larsson, E. et al. 2000). 2.2.2 Laktoferin v diagnostice imunitních onemocnění Díky tomu, že se laktoferin vyskytuje v mnoha sekretech a spadá do nespecifického imunitního systému, je často označován jako markér některých onemocnění. Ve slinách byla jeho zvýšená koncentrace zaznamenána u pacientů s paradontózou (Glimvall, P., Wickstrom, C. et al. 2012), u lidí se zánětlivým onemocněním střev (Nakao, K., Imoto, I. et al. 1997) a také u lidí trpící Sjögrenovým syndromem, který se projevuje sníženou produkcí slin a pocitem sucha v ústech. Zvýšená hladina laktoferinu byla také potvrzena v krevní plasmě u lidí s diseminovanou intravaskulární koagulopatií (Ozsan, H. G., Pehlivan, M. et al. 2000) a dědičnou meningitidou (Maffei, F. A., Heine, R. P. et al. 1999). Naopak sníženou hladinu laktoferinu v krevní plasmě vykazují jedinci s AIDS (Van der Strate, B. W. A., Harmsen, M. C. et al. 1999). Laktoferin je také často spojován se zánětlivými onemocněními střevního traktu. V nedávno publikované studii byla prokázána korelace hladiny laktoferinu ve stolici u pacientů postižených chronickým průjmem a Crohnovou chorobou (Langhorst, J. and Boone, J. 2012). V praxi tak může být laktoferin využit jako doplňkový markér výše zmíněných onemocnění. 2.2.3 Význam laktoferinu Je známo, že laktoferin má nenahraditelný význam v imunitním systému všech savců. Spolu s ostatními proteiny v mateřském mléce přispívá k posílení imunity mláďat, 13

v dospělosti se podílí na řízení získané imunity, a vykazuje další účinky, které jsou uvedeny na Obrázku 2 (Brock, J. H. 2002).

Immunomodulátor Protizánětlivé

Antioxidant

Protinádorové

Protiparazitní

Homeostáza železa Absorbce železa

Protiplísni

LAKTOFERIN

Transkripční faktor

Antivirální

Proteáza

Tvorba granulocytů

Antimicrobiální Inhibitor proteáz

Autoprotilátka Prokoagulant

Obrázek 2: Role laktoferinu v lidském organismu. Díky těmto vlastnostem, je laktoferin považován za potencionální konkurenci dosud hojně využívaným antibiotikům, ale taky jako podpůrný lék pro léčbu rakoviny, Alzheimerovy nemoci a onemocnění spojené se zánětlivými procesy probíhajícími

Obr. 2: Role laktoferinu v lidském organismu

ve střevním traktu (Ward, P. P., Paz, E. et al. 2005). Jeho synergické působení na medikamentní léčbu bylo prokázáno u hepatitidy C, AIDS, cytomegalovirů a H. Pylori (van der Strate, B. W. A., Beljaars, L. et al. 2001) (Viani, R. M., Gutteberg, T. J. et al. 1999) (Kaito, M., Iwasa, M. et al. 2007) (Tursi, A., Elisei, W. et al. 2007). Rekombinantní lidský laktoferin podáváný vaginálně, zabraňuje předčasnému porodu (Otsuki, K., Yakuwa, K. et al. 2005). Nezanedbatelný je i jeho protektivní vliv proti rakovině tlustého střeva (Kozu, T., Iinuma, G. et al. 2009), ale i proti rakovině plic, jazyka, močového měchýře, štítné žlázy (Tsuda, H., Fukamachi, K. et al. 2006). Mimo pozitivní účinky na lidské zdraví, bylo prokázáno, že laktoferin prodlužuje dobu údržnosti masných výrobků (Umuhumuza, Liliane Clarisse 2011), (Naidu, A. S. 2002). Do budoucna by tedy mohl být využíván v potravinářském průmyslu pro své protektivní účinky. V současnosti se laktoferin začíná objevovat jako účinná látka v potravinových doplňcích pro zvýšení imunity, zubních pastách, nosních či očních kapkách (Brouwer, 14

Cpjm, Rahman, M. et al. 2011). Pro tyto účely jsou prováděny studie, které by umožnily produkci laktoferinu pomocí mikroorganismů či transgenních organismů (Conesa, C., Calvo, M. et al. 2010).

3.3 Metody stanovení laktoferinu Vzhledem k významnosti laktoferinu jako markéru některých zánětlivých onemocnění, se objevují analytické studie s cílem zlepšit senzitivitu a selektivitu jeho detekce v různých biologických matricích. Dle databáze Web of Science počet článků s klíčovým slovem “lactoferrin“ od roku 1965 neustále narůstá (Obr. 3A) a je také zřejmý zvyšující se trend citací těchto článků (Obr. 3B). A 180

B 6000

160

5000 140 4000 Počet citací

Počet publikací

120 100 80 60

3000 2000

40 1000 20 0

0 1965 1970 1975 1980 1985 1990 1995 2000 2005 2010

1965 1970 1975 1980 1985 1990 1995 2000 2005 2010

Rok

Rok

Obrázek 3: A) Počet publikací a B) počet citací článků s klíčovým slovem „lactoferrin“ dle databáze Web of Science.

Obr. 3: A) Počet publikací a B) počet citací článků s klíčovýmpro slovemstanovení „laktoferin“ dle databáze Web of Science. Nejvíce využívanými metodami laktoferinu je iontově

výměnná

kapalinová chromatografie s UV detekcí, spektrofotometrické, elektrochemické a imunoseparační metody. Literatura se však také zmiňuje o stanovení laktoferinu pomocí vysoko-účinné kapalinové chromatografie s detektorem diodového pole (DAD) (Drackova, M., Borkovcova, I. et al. 2009) nebo pomocí vysoko-účinné kapalinové chromatografie s UV detekcí (Palmano, K. P. and Elgar, D. F. 2002). Vzhledem k vhodnosti metod kapilární elektroforézy pro stanovení proteinů (Ptacek, P. 1991) byl laktoferin stanoven i pomocí čipové gelové elektroforézy (Zitka, O., Krizkova, S. et al. 2010).

15

3.3.1 Iontově výměnná kapalinová chromatografie Iontově výměnná chromatografie (IELC), patří do separačních průtokových technik. Poprvé byla použita pro analalýzu neorganických iontů v roce 1975 (Small, H., Stevens, T. S. et al. 1975). Její specifitou je, že stacionární fází je iontoměnič, který může obsahovat buď kladně (anex) či záporně (katex) nabité skupiny, kovalentně imobilizované na částicích nosiče. Principem je pak vzájemná výměna iontů mezi analytem, stacionární a mobilní fází. V protékající mobilní fázi obsažené nabité ionty jsou elektrostatickými silami přitahovány a zadržovány ke stacionární fázi. Pro uvolnění imobilizovaných iontů na stacionární fázi pak musí dojít ke změně podmínek jako je teplota kolony, pH a iontová síla mobilní fáze. Poté dochází k uvolnění analytů a tak k jejich separaci (Staby, A., Nielsen, J. et al. 2009). Přístrojové uspořádání pro iontově výměnnou kaplinovou chromatografii je stejné jako u většiny chromatografických metod s rozdílem použitých kolon. Někdy bývá zapojen i sběrač frakcí (Obr. 4A). Pro detekci se u IELC nejvíce používá UV (Ye, X. Y., Yoshida, S. et al. 2000) či fluorescenční detekce (Ravindran, G. and Bryden, W. L. 2005), která je pro analyty nedestruktivní. V literatuře je také popsáno využití hmotnostní spetrometrie (Pont, F., Luciani, B. et al. 2001) či detektorů na principu měření konduktivity (Palermo, C., Muscarella, M. et al. 2013). Tento typ chromatografie tak lze využít pro separaci a purifikaci aminokyselin, peptidů, proteinů a nabitých organických i anorganických sloučenin. Ze vzorku lze laktoferin pomocí IELC izolovat díky podstatně odlišnému izoelektrickému bodu od pI proteinů ostatní matrice vzorku (Hynek, R. 1995; Recio, I. and Visser, S. 1999),(Salmon, V., Legrand, D. et al. 1997),(Ye, X. Y., Yoshida, S. et al. 2000). V literatuře je také popsána IELC ve spojení s afinitní chromatografií (Uchida, T., Dosako, S. et al. 2003). 3.3.1.1 Kolony využívané v IELC Kolony pro IELC bývají nejčastěji na bázi syntetických polymerů s příslušnými funkčními skupinami: triethylaminoetyl-, sulfo-, karboxy-, které jsou zejména vhodné pro výměnu protiiontů, zakoncentrování látek po jejich adsorpci, separaci příbuzných iontů jako je tomu u aminokyselin, a separaci látek iontového charakteru od neiontových (Dinh, N. P., Cam, Q. M. et al. 2009). Ionexy na bázi celulosy, jsou především vhodné pro chromatografii biopolymerů. Připravují se reakcí celulosy v alkalickém

prostředí

s příslušnou 16

funkční

skupinou,

například:

karboxymethylcelulosy, fosfocelulosy, sulfoetylcelulosy a anexy pro vazbu kyselých a neutrálních bílkovin – dietylaminoelycelulosy a trietylaminoetylcelulosy. Speciálně pro vazbu nukleových kyselin se využívá tris-etanolaminoaminoetyl celulosa. Výhodou celulosových nosičů oproti ostatním je možnost separace v rozsahu pH 2 – 10, opakované použití po regeneraci a značná schopnost vázat bílkoviny (Kim, U. J. and Kuga, S. 2001). Další skupina iontoměničů je na bázi polysacharidu dextranu zesíťovaného

epichlorhydrinem.

Tyto

vynikají

velkou

adsorpční

kapacitou

pro bílkoviny, avšak dochází u nich k objemovým změnám v důsledku mechanického namáhání (Yu, L. L., Shi, Q. H. et al. 2011). Větší mechanické odolnosti vůči matrici vykazují iontoměniče na bázi polysacharidu agarosy, ve které byly odstraněny nabité polysacharidy a

reakcí

s 2,3-dibromopropanolem

v alkalickém

prostředí

byly

zesíťovány (Tiainen, P., Per-Erik, G. et al. 2007). Různorodost kolon pro IELC tak umožňuje separaci velkého množství látek, proto je tato analytická metoda dosud jednou z nejvyužívanějších pro analýzu proteinů. 3.3.1.2 Monolitická kolona Rychlým a robustním nástrojem pro separaci proteinů se staly monolitické kolony, které jsou tvořeny jedním kusem pórovitého materiálu vhodným pro analýzu velkých molekul (Obr. 4B). Kolony mohou být vyrobeny jako klasické válcové kolony nebo ve tvaru disku. Jako sorbent se zde využívá methakrylát nebo silika, které mohou být modifikovány různými funkčními skupinami. Díky jejich konstrukci jsou vhodné pro separaci velkých molekul za vyššího průtoku a také nižšího tlaku, který by je mohl poškodit (Barut, M., Podgornik, A. et al. 2005). Vykazují výborné separační vlastnosti a vysokou vazebnou kapacitu (Krenkova, J., Gargano, A. et al. 2009). V neposlední řadě mohou být modifikovány a tak značně vylepšují efektivitu separace, například modifikace epoxidovými skupinami s dietylaminem byly použity pro analýzu oligonukleotidů (Sykora, D., Svec, F. et al. 1999). Kyselinou fosforečnou modifikovaný methakrylát vykazuje dobré separační výsledy, dynamickou vazebnou kapacitu a polopropustnost, taktéž i nízký zpětný tlak pro separaci peptidů a proteinů (Chen, X., Tolley, H. D. et al. 2010). Methakrylátové monolitické kolony nesoucí 3-N,Ndiethylamino-2-hydroxypropyl a kvartérní amin jsou velice stabilní i v extrémních podmínkách, například alkalickém pH (Mihelic, I., Krajnc, M. et al. 2001; Vidic, J., Podgornik, A. et al. 2007). Pro výrobu monolitických kolon lze také využít grafting 17

(proces, kdy dochází k pevnému spojení interkalačního činidla s povrchem použitého vrstevnatého silikátu a tím k vyšší teplotní stabilitě), který umožňuje vysoké zastoupení funkčních skupin monomeru na povrchu. Monolitická vrstva tak byla připojena na plastovou stěnu mikrofluidního čipu (Stachowiak, T. B., Rohr, T. et al. 2003). V nedávno

publikované

studii

byla

popsána

příprava

kolony

pomocí

UV

fotopolymerizace, která výrazně zlepšila separační vlastnosti monolitické kolony (Takahashi, M., Hirano, T. et al. 2012). V současnosti je snaha o výrobu monolitických kolon s normalizovanými a přesnými póry. Uniformní póry o velikosti cca 1500 nm jsou zejména vhodné pro separaci DNA (Ivancic-Jelecki, J., Brgles, M. et al. 2009; Sousa, A., Bicho, D. et al. 2011), virových částic (Gutierrez-Aguirre, I., Banjac, M. et al. 2009) nebo mikroorganismů jako je Staphylococcus aureus (Buszewski, B., Szumski, M. et al. 2009). Monolitické disky CIM byly také využity pro 2D separaci proteinů pomocí jedné chromatografické kolony, tzv. conjoint liquid chromatography (CLC) (Branovic, K., Lattner, G. et al. 2002). A Mobilní fáze

PC

Sběrač frakcí

Software: BioLogic DuoFlow

AB

B

O S

O

O

A UV

B

Nástřikový ventil

Chromatografické pumpy

Monolytická kolona

Odpad

~ 50µm

Obr. 4: A)Obrázek Schéma iontově výměnné kapalinové chromatografie monolitickou CIM kolonu s UV detektor 4: A) Schéma iontově výměnné kapalinovévyužívající chromatografie využívající Kapalina byla na CIM kolonu dopravována pomocí dvou pump za pomocí vysokotlakého gradientu. Výstup z kolony byl n monolitickou kolonu s UV detektorem sběračem frakcí. B) Monolitická UV detektor, který sloužil CIM pro úpravu nastavení sběru frakcí.a B) Monolitická kolona.

kolona.

18

3.3.2 Spektrofotometrické metody Pro rychlé stanovení proteinů jsou zejména vhodné spektrofotometrické metody, které vynikají jednoduchostí instrumentace a možnosti automatizace. Výhodou je i možnost využití chromogenních činidel ke zvýšení citlivosti těchto metod. Pro stanovení bílkovin se jsou v literatuře nejčastěji popsány metody s využitím biuretova činidla, pyrogallové červeně a metody dle Bradfordové, ale i ostatní jako je Lowryho metoda nebo BCA metoda. Tyto metody pracují na principu tvorby barevného komplexu s proteiny, který je následně kvantifikován pomocí spektrofotometru. Biuretova metoda závisí na reakci peptidové vazby s Cu(II) v alkalickém prostředí, kde vzniká modrofialový komplex s absorbančním maximem λmax = 540 nm. Nevýhodou metody je nízká

citlivost

(100 mg.l-1)

a

závislost

správnosti

a

přesnosti

výsledků

na aminokyselinovém složení (Levin, R. and Brauer, R. W. 1951). Jednou z nejcitovanějších metod je Lowryho metoda, která se vyznačuje vyšší citlivostí po přidání Folinova činidla, avšak vzniklý barevný komplex není v čase stabilní (Peterson, G. L. 1977). Podobných výsledků dosahuje také BCA metoda, která má větší stabilitu jak vzniklého komplexu, tak i reagencií (Krieg, R. C., Dong, Y. et al. 2005). Dalším činidlem, vhodným pro stanovení proteinů, je pyrogallová červeň. Tato metoda je založena na tvorbě modře zbarveného proteinového komplexu v přítomnosti molybdenu(VI) v kyselém prostředí (Fiorina, J. C., Aimone-Gastin, I. et al. 2001) detekovatelném při λmax = 280 nm. Nejvyšší citlivost pro stanovení bílkovin vykazuje metoda dle Bradfordové, kterou poprvé v roce 1976 popsala Dr. Marion Bradford (Bradford, M. M. 1976). Principem je adsorpční vazba barviva Coomassie Brilliant Blue G-250 na molekulu proteinu. Vznik tohoto komplexu je spojován s přítomností bazických aminokyselin (primárně argininu, lysinu a histidinu) v proteinu. Do těchto interakcí jsou zapojeny především Van der Waalsovy síly a hydrofobní interakce. Počet ligandových vazeb barviva ke každé proteinové molekule je proporcionální k celkovému počtu pozitivních nábojů v celém proteinu. Absorbance vzniklého komplexu je nejčastěji detekována při λmax = 595 nm. Výhodou této metody je, že barvivo neinteraguje s většinou solí, rozpouštědel, pufrů, thiolů, redukčních činidel a kovových chelatačních agentů, které se mohou nacházet ve vzorcích (Compton, S. J. and Jones, C. G. 1985). Na druhou stranu barvivo Coomassie nereaguje s volnými aminokyselinami, peptidy a nízkomolekulárními proteiny. Také byl zaznamenán 19

negativní vliv surfaktantů, které i v minimálních koncentracích zapříčiňují precipitaci reagentu (Martin, M. M., Rockholm, D. C. et al. 1985). 3.3.3 Enzymově značená imunoanalýza (ELISA) Imunochemické metody vynikají svojí citlivostí pro stanovení a měření koncentrace proteinů. Principem je reakce antigenu a protilátky (z nichž jeden je fixován na nosiči) a promývání nenavázaných reaktantů. K detekci se používá navázání protilátky ke značenému enzymu, který obvykle za katalýzy mění zbarvení substrátu, které je následně možné kvantifikovat pomocí spektrofotometrických metod. Nejvíce využívané metody pro kvantitativní stanovení laktoferinu jsou dosud imunoseparační metody jako je enzymově značená imunoanalýza (Hutchens, T. W., Henry, J. F. et al. 1989), ale také afinitní membránová chromatografie (Wolman, F. J., Gonzalez Maglio, D. et al. 2007) či nověji pseudoafinitní chromatografie (Ng, Paul K. and Yoshitake, Tomohiko 2010), radioimunoanalýza (Sykes, J. A. C., Thomas, M. J. et al. 1982),(Boxer, L. A., Coates, T. D. et al. 1982), či luminiscenčně založená imunoanalýza (Maacks, S., Yuan, H. Z. et al. 1989). Pro tyto metody se limity detekce pohybují v rozmezí 10 ng.ml-1 – 0,2 mg.ml-1. V současnosti se však pro stanovení laktoferinu více využívají komerční kyty.

20

3 CÍLE PRÁCE 

optimalizace

izolace

laktoferinu

pomocí

iontově-výměnné

kapalinové

chromatografie 

optimalizace fotometrické detekce pro stanovení laktoferinu izolovaného ze vzorků slin



korelace ELISA a iontově-výměnné kapalinové chromatografie s off-line fotometrickou detekcí pro stanovení laktoferinu ze vzorků slin

21

4 MATERIÁL A METODY 4.1 Chemikálie Standard bovinního laktoferinu byl zakoupen od firmy Sigma Aldrich (USA). HPLC metanol (>99,9%; v/v) byl zakoupen od firmy Merck (Dortmund, Německo). Ostatní chemikálie byly pořízeny od firmy Sigma-Aldrich v ACS čistotě, pokud není uvedeno jinak. Zásobní roztoky laktoferinu (1 mg.ml-1) byly připraveny v ACS vodě a uchovány v temnu při -20 °C. Pracovní standardy byly denně připraveny ředěním zásobních roztoků v mobilní fázi A. Hodnoty pH byly zaznamenány pomocí WTW inoLab Level 3 s terminal Level 3 (Weilheim, Německo), kontrolovaným programem MultiLab Pilot (Weilheim, Německo). pH-elektroda (SenTix H, pH 0..14/0..100°C/3 mol.l-1 KCl) byla pravidelně kalibrována sadou WTW pufrů (Weilheim, Německo). Deionizovaná a demineralizovaná voda byla vyrobena pomocí reverzní osmózy za použití Aqua Osmotic 02 (Aqua Osmotic, Tišnov, Česká republika) a následně přečištěna pomocí Millipore RG (Millipore Corp., USA, 18 MΏ) na Mili-Q vodu.

4.2 Příprava vzorků slin K experimentu bylo vybráno 9 zdravých osob ve věku 23 – 28 let (7 žen a 2 muži) a 1 osoba trpící celiakií (vzorek č. 10, žena). Vzorky slin byly odebírány pomocí odběrových zkumavek Salivette (Sarstedt, Německo). Přiložená buničina byla žvýkána po dobu 2 min. Následovala centrifugace vzorků v Salivette zkumavce při 3000 rpm, 5 min (Universal 320, Hettich Zentrifugen, Německo). Odebraný vzorek byl naředěn 1:1 s 25 mM Tris-HCl (pH = 7) a přefiltrován přes mikrofiltr (microStar 0.45µm CA, Costar Cambridge). Takto připravený vzorek byl analyzován pomocí iontově výměnné kapalinové chromatografie s UV detekcí a vyseparované frakce byly off-line fotometricky analyzovány pomocí automatického spektrofotometru.

4.3 Iontově výměnná kapalinová chromatografie s UV detekcí Systém kapalinového chromatografu Biologic DuoFlow (Biorad, USA) byl složen ze dvou chromatografických pump pro dopravu elučních pufrů, monolitické kolony s jedním CIM diskem, který byl modifikován -SO3- funkčními skupinami (Bia Separations, Slovinsko), dávkovacího ventilu s 2 ml dávkovací smyčkou, UV-VIS detektoru a automatického sběrače frakcí. Kapalina byla na CIM kolonu dopravována 22

pomocí dvou pump za pomocí vysokotlakého gradientu. Výstup z kolony byl napojen na čtyřkanálový UV detektor, který sloužil pro úpravu nastavení sběru frakcí. Jako mobilní fáze A (MFA) byl použit 25 mM Tris-HCl o pH 7, mobilní fáze B (MFB) byla složena z 2 M NaCl v MFA. Průtok mobilní fáze byl 4 ml.min-1. Laktoferin byl eluován lineárně se zvyšujícím gradientem NaCl: 0-6 ml (0% B) → 6-12 ml (100% B) → 1216 ml (100% B) → 16-17 ml (0% B), 17-21 ml (0% B). Detektor byl nastaven na 280 nm (maximum absorpce aromatických aminokyselin). Frakce laktoferinu o objemu 1 ml byla sbírána v elučním objemu 10,6 ml – 11,6 ml pomocí automatického sběrače frakcí (Biorad, USA).

4.4 Polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS-PAGE) Izolované

frakce

laktoferinu

byly

analyzovány

polyakrylamidovou

gelovou

elektroforézou v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE). Pro studium laktoferinu byl použit 7,5% separační gel a koncentrace zaostřovacího gelu byla 5 %. SDS-PAGE probíhala na aparatuře Maxigel od firmy Biometra (Německo). Separace probíhala při napětí 150 V, dokud čelo proteinů nedosáhlo dolního konce gelu (~ 1 h). Během separace byl gel chlazen vodou. SDS-PAGE a detekce proteinů stříbrem byly provedeny podle klasických protokolů (Krizkova, S., Hrdinova, V. et al. 2008). Gel byl inkubován 1 hod v roztoku 1 (1,14%

kyseliny octové, 6,4% metanolu, 0,1%

formaldehydu) s následným propláchnutím 3× 15 min v roztoku 2 (metanol s MiliQ vodou v poměru 1:1). Poté byl opět inkubován 1 min v roztoku 3 (0,02% thiosíran sodný) a propláchnut 2× 20s destilovanou vodou. Následovala další inkubace 20 min v roztoku 4 (0,02% AgNO3, 0,076% formaldehydu) a propláchnutí 20s destilovanou vodou. Na závěr byl gel inkubován v roztoku 5 (6% Na2CO3, 0,0004% Na2S2O3, 0,05% formaldehydu) a byl pozorován vznik zbarvení. Po získání optimálního zabarvení (asi 3 min) byl gel ihned propláchnut 2×2 min destilovanou vodou. Pro zafixování byl hotový gel inkubován v roztoku 6 (6,4% methanolu a 1,14% kyseliny octové).

4.5 Fotometrická detekce laktoferinu Pro fotometrickou analýzu laktoferinu byl použit automatický spektrofotometr BS–200 (Mindray, Čína), který se skládá z kyvetového prostoru (temperovaný na 37 ±0,1 °C), reagenčního prostoru s karuselem pro reagencie a přípravu vzorků (temperovaný na 4 ±1 °C) a optického detektoru (Sochor, J., Ryvolova, M. et al. 2010). Zdrojem 23

světla byla halogen-wolframová žárovka. Přenos vzorků a reagencí byl zabezpečen robotickým ramenem s dávkovací jehlou (chyba dávkování do 1 % objemu). Kontaminace byla minimalizována díky proplachování jak dávkovací jehly, tak míchadla MilliQ vodou. Ke stanovení laktoferinu pyrogallovou červení bylo ke 200 µl reagencie (50 mM sukcinová kyselina, 3,47 mM benzoát sodný, 0,06 mM molybdát sodný, 1,05 mM oxalát sodný a 0,07 mM pyrogallová červeň) (Yang, Jui-Yi, Chien, Tzu- I. et al. 2009), (Pupkova, V. I. and Prasolova, L. M. 2007), (da Silva, Adriana Scotti and Falkenberg, Miriam 2011) (Skalab-kit, Svitavy Česká republika) přidáno 4 µl vzorku. U metody dle Bradfordové (Seevaratnam, Rajini, Patel, Barkha P. et al. 2009), (Field, Anjalie and Field, Jeffrey 2010), (Carlsson, Nils, Borde, Annika et al. 2011) bylo k 190 µl reagencie (0,01% Coomassie Brilliant Blue G-250, 4,7% ethanol, 8,5% kyselina fosforečná v destilované vodě) přidáno 10 µl vzorku (Zor, T. and Seliger, Z. 1996). Pro stanovení bílkovin biuretovým činidlem bylo do kyvety napipetováno 150 μl biuretového činidla (100 mM vinan sodno-draselný, 100 mM NaOH, 15 mM KI, 6 mM CuSO4) a následně 3 μl vzorku. Po 10 minutách inkubace při 37 °C byla změřena absorbance při vlnové délce λ = 546 nm. Obsah kyvet po nadávkování vzorku byl ihned promíchán automatickým míchadlem a analyzován. Detekce probíhala při 578 nm a doba reakce byla 10 min. Absorbance byla odečítána v čase, kde byla zaznamenána maximální absorbance pro všechny body kalibrace a to v čase 18 sekund.

4.6 Enzymově značená imunoanalýza Mikrotitrační destička byla pokryta 100 µl kozími anti-laktoferin protilátkami (SantaCruz Biotechnology, USA) zředěnými 1:5000 nebo 1:3000 0,05 M uhličitanovým pufrem (0,032 M Na2CO3 a 0,068 M NaHCO3, pH 9,6) při 4 °C po dobu 16 hodin. Poté byl volný povrch jamek 30 minut při 37 °C blokován 1 % bovinním sérovým albuminem (w/v) v PBS pufru (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,4 mM NaH2PO4, a 4,3 mM Na2HPO4, pH 7,4) s následným promýváním jamek 5× s 350 µl 0,05 % (v/v) PBS-T (Hydroflex, TECAN, USA). Do takto připravených jamek bylo napipetováno 100 µl standardu nebo připraveného vzorku slin a mikrotitrační destička byla inkubována při 37 °C 1 hodinu. Po promytí jamek PBS pufrem, bylo přidáno 100 µl monoklonální myší protilátky proti laktoferinu (SantaCruz Biotechnology, USA) ředěné 1:5000 nebo 1:10000 v PBS pufru. Mikrotitrační destička byla inkubována 60 min při 37 °C. Po promytí PBS pufrem, bylo do jamek přidáno 100 µl kuřecích protimyších 24

protilátek značených křenovou peroxidázou (SantaCruz Biotechnology, USA) ředěných 1:1500 nebo 1:2000 a destička byla inkubována 60 min při 37 °C. Po inkubaci a promytí 100 µl 0,001% (w/v) TMB v 0,2 M acetátu sodném okyseleném na pH 5,8 kyselinou citronovou s 0,037 % (v/v) H2O2. Po 30 minutách byla reakce ukončena 50 µl H2SO4 a po 5 minutách byla měřena absorbance při 450 nm (Infinite M200 Pro, TECAN, USA).

4.7 Statistické vyhodnocení Data byla zpracována pomocí programu MICROSOFT EXCEL® (USA). Výsledky jsou vyjádřeny jako ± standardní odchylky (SD), pokud není uvedeno jinak (EXCEL®). Limity detekce (3 signál/šum, 3S/N) byly vypočteny dle Long and Winefordner (Long, G. L. and Winefordner, J. D. 1983), kde N je standardní odchylka signálu šumu, pokud není uvedeno jinak. Návratnost metody byla vyhodnocena metodou standardního přídavku. Před extrakcí bylo přidáno ke vzorkům slin 100 µl standardu laktoferinu (50 µg.ml-1) a 100 µl vody. Koncentrace laktoferinu byly následně odvozeny z kalibrační křivky. Současně byl analyzován samotný standardní přídavek. Výpočet návratnosti byl proveden dle Causon (Causon, R. 1997) a Bugianesi et al. (Bugianesi, R., Serafini, M. et al. 2000).

25

5 VÝSLEDKY A DISKUZE Pro separaci laktoferinu byl využit kapalinový chromatograf, ke kterému byla připojena monolitická kolona. Tato kolona je díky své konstrukci šetrná ke struktuře proteinu, neboť lze separaci provádět při vysokém průtoku a přitom při velmi nízkém tlaku, aniž by došlo k poškození struktury proteinu (Adam, V., Zitka, O. et al. 2008; Zitka, O., Krizkova, S. et al. 2010). Tyto strukturní změny proteinů v závislosti na tlaku v koloně byly již v minulosti studovány (Kukacka, J., Zitka, O. et al. 2007; Zitka, O., Horna, A. et al. 2007; Zitka, O., Krizkova, S. et al. 2013). Pro separaci byl využit postup, jehož parametry byly optimalizovány v práci (Adam, V., Zitka, O. et al. 2008). V tomto experimentu byla provedena optimalizace postupu pro izolaci laktoferinu ze slin, kde byla sledována rychlost průtoku mobilní fáze a koncentrace solí obsažených v elučním pufru. Dále byly testovány metody fotometrické detekce. Získané výsledky byly nakonec korelovány s klinicky běžně využívanou ELISOU pro stanovení laktoferinu.

5.1 Optimalizace izolace laktoferinu z lidských slin Jako mobilní fáze A byl použit 25 mM Tris-HCl (pH 7), který vykazoval minimální vliv na eluci laktoferinu z monolitické kolony během nástřiku, avšak vykazoval dobrou účinnost pro eluci ostatních bílkovin obsažených ve slinách. Jako mobilní fáze B byl zvolen 2 M NaCl v 25 mM Tris HCl (pH 7). Eluce probíhala vzestupným gradientem. 5.1.1 Optimalizace gradientu Pro efektivní separaci laktoferinu od ostatních proteinů bylo nezbytné optimalizovat lineárně zvyšující se gradient, který byl určen z výšky a šířky píku. (Obr. 5A). Standard laktoferinu (50 µg.ml-1) byl z kolony eluován 5 ti různými zvyšujícími se gradienty s následnou isokratickou elucí a zakončením re-ekvilibrací kolony: i, 0-6 ml (0% B), 6 7 ml (100% B), 12-16 ml (100% B), 16-17 ml (100% B), 17-21 ml (0% B); ii, 0-6 ml (0% B), 6 -10 ml (100% B), 12-16 ml (100% B), 16-17 ml (100% B), 17-21 ml (0% B); iii, 0-6 ml (0% B), 6 -12 ml (100% B), 12-16 ml (100% B), 16-17 ml (100% B), 17-21 ml (0% B); iv, 0-6 ml (0% B), 6 -14 ml (100% B), 12-16 ml (100% B), 16-17 ml (100% B), 17-21 ml (0% B) a v, 0-6 ml (0% B), 6 -16 ml (100% B), 12-16 ml (100% B), 16-17 ml (100% B), 17-21 ml (0% B). Na obrázku 5B je vidět, že se signál laktoferinu zvyšoval s delší eluční části gradientu a výška píku dosahovala maxima 65 mAU 26

při použití gradientu iii. Delší eluční gradient iv, a v, následně vykazoval klesající trend výšky píku. Při sledování vlivu rychlosti elučního gradientu na šířku píku byl zaznamenán rostoucí lineární trend, tedy s delší eluční části gradientu docházelo k pomalejší eluci laktoferinu a rozmývání píku. Na základě získaných výsledků byl jako nejvhodnější gradient pro eluci laktoferinu zvolen lineárně zvyšující se gradient iii.

A

B 0,7

0,07

0,6

0,06

0,5

0,05

0,4

0,04

i, 0-6 ml (0% B), 6 - 7 ml (100% B), 12-16 ml (100% B), 16-17 ml (100% B), 17-21 ml (0% B) ii, 0-6 ml (0% B), 6 -10 ml (100% B), 12-16 ml (100% B), 16-17 ml (100% B), 17-21 ml (0% B) iii, 0-6 ml (0% B), 6 -12 ml (100% B), 12-16 ml (100% B), 16-17 ml (100% B), 17-21 ml (0% B) iv, 0-6 ml (0% B), 6 -14 ml (100% B), 12-16 ml (100% B), 16-17 ml (100% B), 17-21 ml (0% B)

iii

iv

Šířka píku (min)

ii

v

Gradient (% B)

i

0,3

0,03

Šířka píku (min)

0,2

0,02

Výška píku (AU)

0,1

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

21

Výška píku (AU)

v, 0-6 ml (0% B), 6 -16 ml (100% B), 12-16 ml (100% B), 16-17 ml (100% B), 17-21 ml (0% B)

0,01

0

0 i

Objem mobilní fáze (ml)

ii

iii iv Gradient

v

Obr. 5: A) Optimalizace lineárně vzestupného gradientu označené jakogradientu i, ii, iii, iv a označené v. B) Závislostjako výškyi,a ii, šířky Obrázek 5: A) Optimalizace lineárně vzestupného iii,píku iv naa -1 gradientu. Pro optimalizaci byl použit 2 M NaCl v mobilní fázi A a rychlost průtoku byla 4 ml.min . Detaily metody jsou v kapitole 4.3. v.uvedeny B) Závislost výšky a šířky píku na gradientu. Pro optimalizaci byl použit 2 M NaCl

v mobilní fázi A a rychlost průtoku byla 4 ml.min-1. Detaily metody jsou uvedeny v kapitole 4.3. 5.1.2 Vliv rychlosti průtoku mobilní fáze na eluci laktoferinu Optimální rychlost průtoku mobilní fáze (2 ml.min-1, 2,5 ml.min-1, 3 ml.min-1, 3,5 ml.min-1, 4 ml.min-1, 4,5 ml.min-1 a 5 ml.min-1) byla testována na základě porovnání výšky a šířky píku standardu laktoferinu (50 µg.ml-1). Cílem bylo laktoferin z kolony eluovat v co nejkratším čase a v nejmenším možném objemu, aby nedocházelo k jeho naředění. Z výsledků je patrné (Obr. 6A), že se zvyšujícím se průtokem se píky zvyšují a to do průtoku 4 ml.min-1, poté dochází k opětovnému poklesu signálu. Stejný trend byl zaznamenán při sledování šířky píku. S rychlejším průtokem se šířka píku snižovala. Tento výrazný pokles je zřejmý do rychlosti průtoku 4 ml.min-1, kdy při rychlejších průtocích se již šířka píku výrazně nemění, což vyplývá i z grafického znázornění na Obr. 6B. Pro eluci laktoferinu z monolitické kolony byla tedy vybrána rychlost průtoku 4 ml.min-1, kdy byly píky nejvyšší a vykazovaly dobrou symetrii. 27

5.1.3 Vliv iontové síly mobilní fáze na eluci laktoferinu Vedle rychlosti průtoku je pro izolaci laktoferinu také nezbytné optimalizovat iontovou sílu mobilní fáze, kterou je laktoferin vysolen z monolitické kolony. Proto byly testovány koncentrace NaCl 1,5 M, 2 M, 2,5 M a 3 M v 25 mM Tris-HCl (pH 7) (MFB). Ze získaných výsledků vyplývá, že vyšší koncentrace NaCl usnadňuje eluci laktoferinu. Tento trend dokazuje i chromatogram na Obr. 6C, kde je vidět, že se píky zvyšují se silnější iontovou silou a to až do koncentrace NaCl 2 M. S vyšší koncentrací NaCl byl následně zpozorován pokles signálu. Bylo také zaznamenáno, že šířka píku se snižuje do koncentrace 2 M a s vyšší koncentrací NaCl je přibližně stejná. Efektivní eluce bylo tedy dosaženo při koncentraci NaCl 2 M (Obr. 6D). Podle některých studií bylo prokázáno, že vyšší koncentrace solí v izolovaných frakcích může způsobit denaturaci laktoferinu a proto byla vybrána nejnižší možná koncentrace NaCl, aby bylo zabráněno možné destabilizaci struktury laktoferinu (Verheul, M. and Roefs, Spfm 1998). A

B 60 50

Šířka píku (min)

Absorbance (mAU)

30

20 10 0 2,0 ml.min-1 2,5 ml.min-1 3,0 ml.min-1

2

3,5 ml.min-1 4,0 ml.min-1 4,5 ml.min-1

3

4

5,0 ml.min-1

5

0,07

1

0,06

0,04 0,6 0,03 0,4 0,2

D 60 50

Šířka píku (min)

10 0 1,0 M NaCl 1,5 M NaCl 2,0 M NaCl

2

2,5 M NaCl 3,0 M NaCl

3

4

5

6

Výška píku (AU)

0,01 0

1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

Retenční čas (min)

0,08 0,07 0,06

0,05 0,04 0,03 Šířka píku (min) Výška píku (AU)

0,02

Výška píku (AU)

Absorbance (mAU)

40 20

0,02

2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Rychlost průtoku (ml.min-1)

Retenční čas (min)

30

Šířka píku (min)

0

6

C

0,05

0,8

Výška píku (AU)

40

1,2

0,01 0

1,0

1,5 2,0 2,5 3,0 Koncentrace NaCl (M)

Obr. 6: A) Chromatogram proložení píků standardu laktoferinu (50 µg.ml-1) při různém průtoku (2 – 5 ml.min-1) mobilní fáze. B) Závislost -1 průtoku MF na šířce a výšce píků. C) Chromatografický záznam při proložení píků standardu laktoferinu (50 µg.ml-1) eluovaného zvolenou iontovou sílou (1 M – 3 M NaCl) mobilní fáze B. D) Závislost průtoku MF na šířce a výšce píků. Detaily metody jsou uvedeny v kapitole 4.3.

Obrázek 6: A) Chromatogram proložení píků standardu laktoferinu (50 µg.ml ) při různém průtoku mobilní fáze. B) Závislost průtoku MF na šířce a výšce píků. C) Chromatografický záznam při proložení píků standardu laktoferinu (50 µg.ml-1) eluovaného zvolenou iontovou sílou mobilní fáze B. D) Závislost průtoku MF na šířce a výšce píků. Detaily metody jsou uvedeny v kapitole 4.3. 28

5.1.4 Van Deemterova rovnice Pro stanovení optimální průtokové rychlosti CIM diskové kolony byla vypočítána van Deemterova rovnice: (H=L/N; N=16 × (tr/Wbase)2), která vyjadřuje závislost výšky ekvivalentní teoretickému patru na rychlosti průtoku mobilní fáze. Analýza účinnosti kolony byla vypočítána z lineárních rychlostí průtoku při optimálním gradientu, který je popsán výše. Na základě získaných výsledků z van Deemterovy rovnice vyplývá, že optimální výška teoretického patra HETP byla stanovena mezi rychlostmi průtoku 4 až 5 ml.min-1 (Obr. 7).

Výška teoretického patra (µm)

80

70 60 50 40 30 20 10 0 0

2

4

Rychlost průtoku

6

8

(ml.min-1)

Obrázek 7: Závislost výšky ekvivalentu teoretického patra na lineárně zvyšujícím se průtoku mobilní fáze pro CIM monolitický disk. Další detaily jsou uvedeny v kapitole 4.3. Obr. 7: Závislost výšky ekvivalentu teoretického patrana lineárně zvyšujícím se průtoku mobilní fáze pro CIM monolitický disk Dependence of height equivalent of theoretical plate (HETP) on 5.1.5 SDS-PAGE analýza vzorků slin detaily jsou uvedeny v kapitole linear flow rate of mobile phase for CIM monolithic disc. Další 4.3.

Optimalizovaná metoda byla použita pro izolaci laktoferinu z lidských slin. Vzorky připravené dle kapitoly 4.2 byly izolovány a frakce o objemu 1 ml byly sbírány v čase 2,6 – 3,1 min, jak je znázorněno na Obrázku 8A. Ze získaného chromatogramu je patrné, že většina proteinů, které se ve slinách nachází, mají nižší pI než laktoferin a jsou eluovány v dřívějším retenčním čase. Izolovaný laktoferin byl společně se vzorkem plných slin podroben analýze pomocí SDS-PAGE, jejíž parametry jsou uvedeny v kapitole 4.4. Elektroforeogram vzorku neizolovaných slin, je zobrazen na Obrázku 8B. Je zde patrné, že sliny obsahují mnoho proteinů, které je třeba od laktoferinu oddělit. Na dalším elektroforeogramu (Obr. 8C) jsou stejné vzorky slin, ze kterých byl 29

izolován laktoferin pomocí monolitické kolony. Na všech dráhách je patrný pouze jeden proužek, který v porovnání s žebříčkem má molekulovou hmotnost 77 kDa, což odpovídá přibližné molekulové hmotnosti laktoferinu. Intenzita proužku izolovaného laktoferinu koresponduje se zjištěnou koncentrací laktoferinu pomocí optimalizované metody pro jeho izolaci. Zároveň bylo pomocí SDS-PAGE potvrzeno, že vzorky s izolovaným laktoferinem neobsahovaly žádné kontaminace. B

A

kDa Mr 0,60

Vzorek 0,50

1

2

3

4

5

1

2

3

4

5

6

7

260 150 100 75

Standard

Absorbance (AU)

50 0,40 37

Standard laktoferinu 50 µg.mL-1

0,30

0,20

25 C

kDa Mr

6

7

260 150 100 75

0,10

0,00 50

Vzorek

37 1

2

3

4

Retenční čas (min)

25

Obrázek 8: A) Proložení chromatogramu vzorku a standardu laktoferinu (50 µg.ml1). Čárkovanou čarou je vyznačená sbíraná frakce. B) Elektroforeogram 7 testovaných vzorků slin C) Elektroforeogram izolovaných frakcí vzorků slin

Obr. 8: A) Proložení chromatogramu vzorku a standardu laktoferinu (50 µg.ml-1). Čárkovanou čarou je vyznačená sbíraná frakce. B) Elektroforeogram 7 testovaných vzorků slin C) Elektroforeogram izolovaných frakcí vzorků slin po iontově-výměnné kapalinové chromatografii. po iontově-výměnné kapalinové chromatografii. Parametry jsou uvedeny v kapitole Parametry jsou uvedeny v kapitole 4.3 a 4.4.

4.3 a 4.4.

5.2 Optimalizace off-line fotometrické detekce Dále byly testovány metody pro off-line fotometrickou detekci. Pro fotometrické stanovení koncentrace laktoferinu z izolovaných frakcí byly vybrány tři metody, které se běžně používají ke stanovení proteinů a to pyrogallová červeň (Pupkova, V. I. and Prasolova, L. M. 2007; Yang, J. Y., Chien, T. I. et al. 2009; Silva, A. S. and Falkenberg, M. 2011), metoda dle Bradfordové (Seevaratnam, R., Patel, B. P. et al. 2009; Field, A. and Field, J. 2010; Carlsson, Nils, Borde, Annika et al. 2011) a biuretovo činidlo (Ohnishi, S. T. and Barr, J. K. 1978). Ke zjištění limitu detekce (3*S/N (Long, G. L. 30

and Winefordner, J. D. 1983)) metod byla sestavena 15 ti bodová kalibrační závislost laktoferinu, která byla připravena v roztoku 2 M NaCl v koncentračním rozmezí od 1 µg.ml-1 do 1000 µg.ml-1. V případě metody využívající pyrogallovou červeň (Obr. 9A) byla linearita kalibrační křivky R2 = 0,9899 v koncentračním rozmezí 15,62 – 1000 µg.ml-1 s limitem detekce 1 µg.ml-1 (RSD = 6 %, n = 3, Tab. I). Kalibrační řada analyzovaná biuretovou metodou (Obr. 9B) vykazovala linearitu R2 = 0,999 v koncentračním rozmezí 62,5 - 1000 µg.ml-1. Limit detekce 3S/N činil 10 µg.ml-1 (RSD = 5 %, n = 3, Tab. I). Kalibrace laktoferinu získaná pomocí metody dle Bradfordové (Obr. 9C, D) byla lineární ve dvou částech. Pro analýzu laktoferinu bylo vybráno koncentrační rozmezí od 1 do 62,5 µg.ml-1 s R2 = 0,9916. Limit detekce této metody byl 0,01 µg.ml-1 (RSD = 4 %, n = 3, Tab. I).

B

A 80 70

LOD = 10 µg.ml-1

1200

60

Absorbance (mAU)

Absorbance (mAU)

1400

LOD = 1 µg.ml-1

50 40 30 20

y = 0.0657x + 3.8218 R² = 0.9899

10

1000 800 600 y = 0,9285x + 208,53 R² = 0,9997

400 200 0

0

0

0

500 1000 1500 Koncentrace (µg.ml-1)

500 1000 Koncentrace (µg.ml-1)

1500

C300

Absorbance (mAU)

250 200 150 D 150

LOD = 0,01 µg.ml-1

100 100

50

50

y = 2.0274x + 8.4619 R² = 0.9916

0 0

0 0

200

400

20 600

40 800

60 1000

80 1200

Koncentrace (µg.ml-1)

Obrázek 9: Graf závislosti absorbance na koncentraci laktoferinu v získaných frakcích pomocí iontově-výměnné kapalinové chromatografie analyzovaných v off-

line Obr. provedení pyrogallové červeně, B) biuretova činidla a C)pomocí metody dle 9: Graf pomocí závislosti A) absorbance na koncentraci laktoferinu v získaných frakcích iontově-výměnné kapalinové ch analyzovaných v off-line provedení pomocí (A) pyrogalové červeně, (B) biuretova činidla a (C) metody dle Bradfordové v

-1 -1 -1. (D) Lineární Bradfordové v koncentračním rozmezí 0,061 část µg.ml – 1000 . D) Lineární metodou dle Bradfordo rozmezí 0,061 µg.ml-1 – 1000 µg.ml kalibrační křivkyµg.ml laktoferinu detekovaného

µg.ml-1. Ostatní detaily jsou uvedeny v kapitole 4.5.

část kalibrační křivky laktoferinu detekovaného metodou dle Bradfordové od 0,2 do 62,5 µg.ml-1. Další parametry jsou uvedeny v kapitole 4.5. 31

Tabulka 1: Fotometrické stanovení proteinů. Metoda

a

Rovnice regrese

Lineární dynamický rozsah (µg.ml-1)

R2

LODa

LOQb

RSDc

(µg.ml-1)

(µg.ml-1)

(%)

Pyrogallová červeň

y = 0,065x + 3,821

16 - 1000

0,990

1

3

6

Biuretovo činidlo

y = 0,928x + 208,530

62,5 - 1000

0,999

10

30

5

0,01

0,03

4

dle Bradfordové y = 2,027x + 8,461 0,1 – 62,5 0,992 Limit detekce, b Limit kvantifikace, c Relativní směrodatná odchylka

Pro dosažení vysokého limitu detekce stanovení laktoferinu je nejvhodnější metoda dle Bradfordové. Vzhledem k tomu, že v publikovaných studiích byly naměřené koncentrace laktoferinu ve slinách v rozmezí 10,54 µg.ml-1 (Jentsch, H., Sievert, Y. et al. 2004) až 47 µg.ml-1 (Rudney, J. D. and Smith, Q. T. 1985), byla pro off-line detekci zvolena fotometrická metoda dle Bradfordové. Pro ověření detekce i v off-line provedení byla 15 ti bodová kalibrační závislost připravena také v pufru, který je součástí mobilní fáze A pro separaci laktoferinu, a kterým jsou sliny ředěny, aby byla vyvrácena možnost interference laktoferinu s NaCl. Tato kalibrační řada laktoferinu byla analyzována pomocí iontově výměnné kapalinové chromatografie s následnou fotometrickou detekcí izolovaných frakcí metodou dle Bradfordové. Zjištěné hodnoty absorbance byly při porovnání stejné jako u kalibrace laktoferinu připraveného v prostředí eluentu tedy mobilní fáze B. V porovnání s ostatními autory Adam et al. 100 µg.ml-1 (Adam, V., Zitka, O. et al. 2008), Yoshise et al. 100 µg.ml-1 (Yoshise, R. E., Matsumoto, M. et al. 2007), Sykes et al. 200 µg.ml-1 (Sykes, J. A. C., Thomas, M. J. et al. 1982) a Drackova et al. 4,5 µg.ml-1 (Drackova, M., Borkovcova, I. et al. 2009) vykazuje námi optimalizovaná metoda nižší limity detekce.

5.3 Analýza vzorků slin 5.3.1 Návratnost Sliny jsou komplexem mnoha látek, které spolu mohou interferovat a tím zkreslovat získané výsledky, proto byla stanovena návratnost separace laktoferinu metodou standardního přídavku o koncentraci 50 µg.ml-1 dle optimalizované metodiky. Ze získaných hodnot byla vypočítána průměrná návratnost 51 ± 5 % (n=3). Nedostatečná návratnost je způsobena nízkou přenosovou kapacitou hmoty CIM disku. Na druhou

32

stranu, díky minimální předpřípravě vzorků a možnosti využití až 5 ti CIM disků v sérii se může kapacita separace zvýšit. 5.3.2 Analýza vzorků slin Vzorky slin pro analýzu laktoferinu byly připraveny podle postupu znázorněného na Obr.

10.

Před

izolací

laktoferinu

pomocí

iontově-výměnné

kapalinové

chromatografie byly připravené vzorky slin podrobeny fotometrické analýze metodou dle Bradfordové pro určení celkové koncentrace proteinů. Naměřené absorbance byly přepočítány pomocí následující kalibrační přímky (y = 4,8658x + 7204,7) a zjištěná koncentrace ve slinách se pohybovala v rozmezí 490 µg.ml-1 až 860 µg.ml-1. Stanovené koncentrace korespondují s literaturou, která udává celkové množství proteinů ve slinách od 720 do 2450 µg.ml-1 (Bonilla, C. A. 1972; Jenzano, J., Legette, Z. et al. 1994). Pro stanovení laktoferinu ze slin byly vzorky izolovány pomocí iontově výměnné kapalinové chromatografie. Optimalizované podmínky separace byly: průtok mobilní fáze 4 ml.min-1 a koncentrace NaCl v mobilní fázi B pro vysolení proteinu z kolony 2 M. V elučním objemu 10,6 ml – 11,6 ml, byla sbírána frakce o objemu 1 ml. Odebrané frakce obsahující laktoferin byly následně off-line fotometricky analyzovány metodou dle Bradfordové.

Celulóza

Vzorek slin odebraný do Salivette zkumavky

Off-line fotometrická analýza

Centrifugace 5000 g 5 min, 4 °C

ELISA

Centrifugovaný vzorek slin Mikrofiltr 0,45 µm

Izolace pomocí IELC

Mikrofiltrace

Ředění vzorku 25 mM Tris-HCl (pH 7)

Obrázek 10: Příprava vzorků slin pro stanovení laktoferinu. Podrobnosti jsou uvedeny v kapitole 4.2. Obr. 10: Příprava vzorků slin pro stanovení laktoferinu. Podrobnosti jsou uvedeny v kapitole 4.2.

33

Koncentrace laktoferinu se u studovaných zdravých osob (muži a ženy ve věku 18 – 23 let) po přepočtu na celkový obsah proteinů (hodnoty jsou uvedené jako µg laktoferinu na mg celkových proteinů) pohybovala v rozmezí 130 ± 10 až 240 ± 20 µg.mg-1 s průměrným obsahem laktoferinu ve slinách 170 ± 10 µg.mg-1 (n=3) (Tab. II). U osoby trpící celiakií (vzorek č. 10) byla zjištěna 2,5× vyšší hladina laktoferinu než u průměrných hodnot u zdravých jedinců (Tab. II). Vyšší hladinu laktoferinu u celiaků dokládají i další studie (Barresi, G. and Tuccari, G. 1983; Fine, K. D., Ogunji, F. et al. 1998), kde byla zjištěna vyšší koncentrace laktoferinu ve střevní mukóze s negativním testem u kontrolních vzorků. Vzhledem k tomu, že se u jedinců trpící touto chorobou po styku nebo pozření lepku vytváří imunitní reakce s následnou tvorbou zánětu střevní sliznice, může tento patologický stav vést ke zvýšené koncentraci laktoferinu v organismu (Sollid, L. M. 2002). Tabulka 2: Analýza vzorků slin. c (proteiny)b

c (laktoferin)

c (laktoferin/celkové proteiny) c

(µg.ml-1)

(µg.ml-1)

(µg/mg proteinů)

1

490 ±30

80 ±7

230 ± 20

2

700 ±50

70 ±6

130 ± 10

3

630 ±70

70 ±6

240 ± 20

4

560 ±40

60 ±5

170 ± 10

5

690 ±50

30 ±2

190 ± 20

6

680 ±50

50 ±4

150 ± 10

7

790 ±60

60 ±5

150 ± 10

8

600 ±40

70 ±6

230 ± 20

9

860 ±60

60 ±5

130 ± 10

Vzoreka

10 500 ±40 110 ±10 420 ± 30 a Vzorky č. 1 – 9 byly odebrány (n = 3) od zdravých osob ve věku 23 – 28 let, vzorek 10 pochází od ženy (28) trpící celiakií. Bradfordové.

c

b

Celková koncentrace proteinů byla stanovena pomocí fotometrické metody dle

Koncetrace laktoferinu se pohybovala v rozmezí 130 ± 10 až 240 ± 20 µg.mg -1 s

průměrným obsahem laktoferinu ve slinách 170 ± 10 µg.mg-1(n = 3).

5.3.3 Korelace IELC s ELISA analýzou Vzorky lidských slin byly analyzovány pomocí komerčního kytu pro enzymově značenou imunoanalýzu laktoferinu dle kapitoly 4.4. Metoda byla kalibrována pro rozsah koncentrace laktoferinu 0,625 to 10 ng.ml-1 a vykazovala linearitu R2 = 0,999 a limit detekce byl stanoven na 0,1 ng.ml-1. Pomocí metody ELISA a iontově-výměnné 34

kapalinové chromatografie s UV detekcí bylo analyzováno 6 vzorků od zdravých osob a jednoho pacienta trpící celiakií. Následně byla provedena korelace, která je prezentována regresním koeficientem R2 = 0,8564 (Obr. 10). Pro stanovení laktoferinu vyvkazuje enzymově značená imunoanalýza vyšší limity detekce ve srovnání s iontověvýměnnou kapalinovou chromatografií s off-line fotometrickou detekcí a vyniká vyšší opakovatelností analýzy, avšak se jedná o poměrně drahou a časově náročnou metodu. Výhoda IELC s offline fotometrickou detekcí spočívá v rychlosti analýzy a nižších nákladech na analýzu. Vzhledem ke vzájemné korelaci obou metod je IELC s off-line fotometrickou detekcí vhodná technika pro analýzu menšího množství vzorků, ale také lze tuto metodu využít pro diagnostiku onemocnění spojených se zánětlivými procesy probíhající v organismu, kde se laktoferin jeví jako potencionální marker. 160 140

y = 5,6913x + 3,4562 R² = 0,8564

IELC (µg.ml-1)

120 100 80 60 40 20 0 0

5

10

15

20

25

ELISA (µg.ml-1)

Obrázek 11: Korelační závislost zjištěných koncentrací laktoferinu pomocí metody ELISA a IELC (n = 3). Parametry metod jsou uvedeny v kapitole 4.3 a 4.6.

Obr. 11: Korelační závislost zjištěných koncentrací laktoferinu pomocí ELISY a IELC (n = 3). Parametry metody jsou uvedeny v kapitole 4.3 a 4.6.

35

6 ZÁVĚR Laktoferin je významný glykoprotein, který je nejvíce zastoupen v mateřském mléce a ostatních tělních tekutinách jako je moč, krev, pot, slzy a sliny. Vzhledem k jeho prokázaným účinkům na imunitní systém organismu se jedná o sloučeninu, která by mohla v budoucnu sloužit jako marker některých druhů onemocnění. V neposlední řadě byl také prokázán pozitivní vliv na lidské zdraví, a tedy se otvírá možnost prosazení laktoferinu jako potencionálního medikamentu pro léčbu zánětlivých onemocnění, rakoviny nebo chorob spojené s patogenními mikroorganismy. Tato práce je zaměřena na izolaci a stanovení laktoferinu z lidských slin pomocí iontově-výměnné kapalinové chromatografie s monolitickou kolonou a následnou off-line fotometrickou detekcí. Parametry metody byly v tomto experimentu optimalizovány. Pro eluci laktoferinu pomocí kapalinové chromatografie byl vybrán lineárně zvyšující se gradient 0 → 6 ml (0% B), 6 → 12 ml (100% B), 12→16 ml (100% B), 16→17 ml (0% B), 17→21 ml (0% B), 2 M koncentrace NaCl v mobilní fázi B a rychlost průtoku 4 ml.min-1. Čistota izolovaného

laktoferinu

byla

ověřena

pomocí

SDS-PAGE.

Z testovaných

fotometrických metod pro detekci laktoferinu v izolovaných frakcích slin byla vybrána metoda dle Bradfordové. Limit detekce metody byl stanoven na 0,01 µg.ml-1. Vzhledem ke složitosti matrice slin, umožňuje optimalizovaná metoda laktoferin izolovat od ostatních interferujících sloučenin, které se ve slinách nachází, prostřednicvím monolitické kolony, která díky své konstrukci umožňuje jeho izolaci bez poškození struktury molekuly. Obsah laktoferinu se v lidských slinách u 9 ti zdravých osob pohyboval v rozmezí 130 ± 10 až 240 ± 20 µg.mg-1 s průměrným obsahem laktoferinu ve slinách 170 ± 10 µg.mg-1. U osoby trpící celiakií byla spozorována 2,5× vyšší koncentrace laktoferinu. Tyto výsledky tedy potvrzují vztah laktoferinu k zánětlivým onemocněním organismu. Vzhledem k tomu, že dosud nejpoužívanější metodou pro stanovení laktoferinu je enzymově značená imunoanalýza, byly získané výsledky korelovány s regresním koeficientem R2= 0,8564. Výsledky této práce ukazují, že spojením separační techniky využívající monolitickou kolonu a klasické fotometrické metody dle Bradfordové implementované do automatického analyzátoru je tento postup, který může být navíc snadno plně automatizovatelný, vhodný pro tyto typy studia.

36

7 ZDROJE INFORMACÍ ABRINK, M., E. LARSSON, et al., Expression of lactoferrin in the kidney: Implications for innate immunity and iron metabolism. Kidney International.2000, 57(5): 2004-2010.

ADAM, V., O. ZITKA, et al., Lactoferrin isolation using monolithic column coupled with spectrometric or micro-amperometric detector. Sensors.2008, 8(1): 464-487.

ADLEROVA, L., A. BARTOSKOVA, et al., Lactoferrin: a review. Veterinarni Medicina.2008, 53(9): 457-468.

AMERONGEN, A. V. N. and E. C. I. VEERMAN, Saliva - the defender of the oral cavity. Oral Diseases.2002, 8(1): 12-22.

ARSLAN, S. Y., K. P. LEUNG, et al., The effect of lactoferrin on oral bacterial attachment. Oral Microbiology and Immunology.2009, 24(5): 411-416.

BARRESI, G. and G. TUCCARI, Lactoferrin and lysozyme in duodeno-jejunal biopsies from infants with celiac-disease. Pathol. Res. Pract.1983, 178(2): 111-111.

BARUT, M., A. PODGORNIK, et al., Convective Interaction Media short monolithic columns: Enabling chromatographic supports for the separation and purification of large biomolecules. J. Sep. Sci.2005, 28(15): 1876-1892.

BEDDEK, A. J. and A. B. SCHRYVERS, The lactoferrin receptor complex in gram negative bacteria. Biometals.2010, 23(3): 377-386.

BONILLA, C. A., Human mixed saliva protein concentration. J. Dent. Res.1972, 51(2): 664-&.

BOXER, L. A., T. D. COATES, et al., Lactoferrin deficiency associated with altered granulocyte function New England Journal of Medicine.1982, 307(7): 404-410.

37

BRADFORD, M. M., Rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing principle of protein-dye binding Analytical Biochemistry.1976, 72(1-2): 248-254.

BRANOVIC, K., G. LATTNER, et al., Very fast analysis of impurities in immunoglobulin concentrates using conjoint liquid chromatography on short monolithic disks. J. Immunol. Methods.2002, 271(1-2): 47-58.

BROCK, J. H., The physiology of lactoferrin. Biochemistry and Cell Biology-Biochimie Et Biologie Cellulaire.2002, 80(1): 1-6.

BROUWER, C., M. RAHMAN, et al., Discovery and development of a synthetic peptide derived from lactoferrin for clinical use. Peptides.2011, 32(9): 1953-1963.

BUGIANESI, R., M. SERAFINI, et al., High-performance liquid chromatography with coulometric electrode array detector for the determination of quercetin levels in cells of the immune system. Analytical Biochemistry.2000, 284(2): 296-300.

BUSZEWSKI, B., M. SZUMSKI, et al., Migration of bacteria through a monolith. Journal of Chromatography A.2009, 1216(33): 6146-6150.

CARLSSON, N., A. BORDE, et al., Quantification of protein concentration by the Bradford method in the presence of pharmaceutical polymers. Analytical Biochemistry.2011, 411(1): 116-121.

CARLSSON, N., A. BORDE, et al., Quantification of protein concentration by the Bradford method in the presence of pharmaceutical polymers. Anal. Biochem.2011, 411(1): 116-121.

CASTAGNOLA, M., P. M. PICCIOTTI, et al., Potential applications of human saliva as diagnostic fluid. Acta Otorhinolaryngol. Ital.2011, 31(6): 347-357.

CAUSON, R., Validation of chromatographic methods in biomedical analysis Viewpoint and discussion. J. Chromatogr. B.1997, 689(1): 175-180.

38

COMPTON, S. J. and C. G. JONES, Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay Analytical Biochemistry.1985, 151(2): 369-374.

CONESA, C., M. CALVO, et al., Recombinant human lactoferrin: A valuable protein for pharmaceutical products and functional foods. Biotechnology Advances.2010, 28(6): 831-838.

DA SILVA, A. S. and M. FALKENBERG, Analytical interference of quinolone antibiotics and quinine derived drugs on urinary protein determined by reagent strips and the pyrogallol red-molybdate protein assay. Clinical Biochemistry.2011, 44(12): 1000-1004.

DINH, N. P., Q. M. CAM, et al., Functionallization of epoxy-based monoliths for ion exchange chromatography of proteins. Journal of Separation Science.2009, 32(15-16): 2556-2564.

DRACKOVA, M., I. BORKOVCOVA, et al., Determination of Lactoferrin in Goat Milk by HPLC Method. Czech Journal of Food Sciences.2009, 27: S102-S104.

DRACKOVA, M., I. BORKOVCOVA, et al., Determination of Lactoferrin in Goat Milk by HPLC Method. Czech. J. Food Sci.2009, 27: S102-S104.

FIELD, A. and J. FIELD, Melamine and cyanuric acid do not interfere with Bradford and Ninhydrin assays for protein determination. Food Chem.2010, 121(3): 912-917.

FIELD, A. and J. FIELD, Melamine and cyanuric acid do not interfere with Bradford and Ninhydrin assays for protein determination. Food Chemistry.2010, 121(3): 912917.

FINE, D. H., D. FURGANG, et al., Lactoferrin iron levels are reduced in saliva of patients with localized aggressive periodontitis. Journal of Periodontology.2002, 73(6): 624-630.

FINE, K. D., F. OGUNJI, et al., Utility of a rapid fecal latex agglutination test detecting the neutrophil protein, lactoferrin, for diagnosing inflammatory causes of chronic diarrhea. Am. J. Gastroenterol.1998, 93(8): 1300-1305. 39

FIORINA, J. C., I. AIMONE-GASTIN, et al., Total urinary protein assays: pyrogallol red versus coomassie blue. Annales De Biologie Clinique.2001, 59(2): 187-192.

GLIMVALL, P., C. WICKSTROM, et al., Elevated levels of salivary lactoferrin, a marker for chronic periodontitis? Journal of Periodontal Research.2012, 47(5): 655660.

GRANGE, P. A., A. G. MARCELIN, et al., Characterization of lactoferrin recognized by Kaposi sarcoma associated herpes virus 8, in human saliva. Journal of Investigative Dermatology.2004, 123(6): A99-A99.

GUTIERREZ-AGUIRRE, I., M. BANJAC, et al., Concentrating rotaviruses from water samples using monolithic chromatographic supports. Journal of Chromatography A.2009, 1216(13): 2700-2704.

HAGHIGHAT, N. and I. AL-HASHIMI, The status of lactoferrin and total iron binding capacity of human parotid saliva in Sjogren's syndrome. Clinical and Experimental Rheumatology.2003, 21(4): 485-488.

HUMPHREY, S. P. and R. T. WILLIAMSON, A review of saliva: Normal composition, flow, and function. Journal of Prosthetic Dentistry.2001, 85(2): 162-169.

HUTCHENS, T. W., J. F. HENRY, et al., Purification and characterization of intact lactoferrin found in the urine of human milk-fed preterm infants Clinical Chemistry.1989, 35(9): 1928-1933.

HYNEK, R., High-performance liquid-chromatography of proteins Chemicke Listy.1995, 89(2): 93-99.

CHEN, X., H. D. TOLLEY, et al., Polymeric cation-exchange monolithic columns containing phosphoric acid functional groups for capillary liquid chromatography of peptides and proteins. Journal of Chromatography A.2010, 1217(24): 3844-3854.

40

INOUE, M., J. YAMADA, et al., Immunohistochemical localization of lactoferrin in bovine exocrine glands Tissue & Cell.1993, 25(5): 791-797.

IVANCIC-JELECKI, J., M. BRGLES, et al., Isolation of cell-free DNA from plasma by chromatography on short monolithic columns and quantification of non-apoptotic fragments by real-time polymerase chain reaction. Journal of Chromatography A.2009, 1216(13): 2717-2724.

JENTSCH, H., Y. SIEVERT, et al., Lactoferrin and other markers from gingival crevicular fluid and saliva before and after periodontal treatment. J. Clin. Periodontol.2004, 31(7): 511-514.

JENTSCH, H., Y. SIEVERT, et al., Lactoferrin and other markers from gingival crevicular fluid and saliva before and after periodontal treatment. Journal of Clinical Periodontology.2004, 31(7): 511-514.

JENZANO, J., Z. LEGETTE, et al., Determination of protein-concentration in human parotid and submandibular saliva. Faseb Journal.1994, 8(4): A389-A389.

KAITO, M., M. IWASA, et al., Effect of lactoferrin in patients with chronic hepatitis C: Combination therapy with interferon and ribavirin. Journal of Gastroenterology and Hepatology.2007, 22(11): 1894-1897.

KIM, U. J. and S. KUGA, Ion-exchange chromatography by dicarboxyl cellulose gel. Journal of Chromatography A.2001, 919(1): 29-37.

KIRSTILA, V., M. LENANDERLUMIKARI, et al., Effects of oral hygiene products containing lactoperoxidase, lysozyme, and lactoferrin on the composition of whole saliva and on subjective oral symptoms in patients with xerostomia. Acta Odontologica Scandinavica.1996, 54(6): 391-397.

KOMINE, K., T. KUROISHI, et al., Cleaved inflammatory lactoferrin peptides in parotid saliva of periodontitis patients. Molecular Immunology.2007, 44(7): 1498-1508.

41

KOZU, T., G. IINUMA, et al., Effect of Orally Administered Bovine Lactoferrin on the Growth of Adenomatous Colorectal Polyps in a Randomized, Placebo-Controlled Clinical Trial. Cancer Prevention Research.2009, 2(11): 975-983.

KRENKOVA, J., A. GARGANO, et al., High binding capacity surface grafted monolithic columns for cation exchange chromatography of proteins and peptides. Journal of Chromatography A.2009, 1216(40): 6824-6830.

KRIEG, R. C., Y. DONG, et al., Protein quantification and its tolerance for different interfering reagents using the BCA-method with regard to 2D SDS PAGE. Journal of Biochemical and Biophysical Methods.2005, 65(1): 13-19.

KRIZKOVA, S., V. HRDINOVA, et al., Chip-based CE for avidin determination in transgenic tobacco and its comparison with square-wave voltammetry and standard gel electrophoresis. Chromatographia.2008, 67: S75-S81.

KUKACKA, J., O. ZITKA, et al., A new tool for distinguishing of different structural forms of lactoferrin. Faseb J.2007, 21(5): A635-A635.

LANGHORST, J. and J. BOONE, Fecal lactoferrin as a noninvasive biomarker in inflammatory bowel diseases Drugs of Today.2012, 48(2): 149-161.

LEVAY, P. F. and M. VILJOEN, Lactoferrin - a general review. Haematologica.1995, 80(3): 252-267.

LEVIN, R. and R. W. BRAUER, The biuret reaction for the determination of proteins an improved reagent and its application Journal of Laboratory and Clinical Medicine.1951, 38(3): 474-480.

LONG, G. L. and J. D. WINEFORDNER, Limit of detection. Anal. Chem.1983, 55(7): A712-A724.

LONNERDAL, B. and S. IYER, Lactoferrin - molecular structure and bilogical function. Annual Review of Nutrition.1995, 15: 93-110.

42

LOPEZ, S. A., E. B. NONNECKE, et al., The lactoferrin receptor is differentially expressed across several human epithelial cell types. Faseb Journal.2012, 26.

MAACKS, S., H. Z. YUAN, et al., Development and evaluation of luminescence-based sandwich assay for plasma lactoferrin as a marker for sepsis and bacterial-infections in pediatric medicine Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence.1989, 3(4): 221-226.

MAFFEI, F. A., R. P. HEINE, et al., Levels of antimicrobial molecules defensin and lactoferrin are elevated in the cerebrospinal fluid of children with meningitis. Pediatrics.1999, 103(5): 987-992.

MARTIN, M. M., D. C. ROCKHOLM, et al., Effects of surfactants, pH and certain cations on precipitation of proteins by tannins. Journal of Chemical Ecology.1985, 11(4): 485-494.

MIHELIC, I., M. KRAJNC, et al., Kinetic model of a methacrylate-based monolith polymerization. Ind. Eng. Chem. Res.2001, 40(16): 3495-3501.

NAIDU, A. S., Activated lactoferrin - A new approach to meat safety. Food Technology.2002, 56(3): 40-45.

NAKAJIMA, K., M. NAKAMURA, et al., Possible involvement of prolactin in the synthesis of lactoferrin in bovine mammary epithelial cells. Bioscience Biotechnology and Biochemistry.2008, 72(4): 1103-1106.

NAKAO, K., I. IMOTO, et al., Relation of lactoferrin levels in gastric mucosa with Helicobacter pylori infection and with the degree of gastric inflammation. American Journal of Gastroenterology.1997, 92(6): 1005-1011.

NG, P. K. and T. YOSHITAKE, Purification of lactoferrin using hydroxyapatite. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences.2010, 878(13-14): 976-980.

OHNISHI, S. T. and J. K. BARR, Simplified method of quantitating protein using biuret and phenol reagents. Anal. Biochem.1978, 86(1): 193-200. 43

OTSUKI, K., K. YAKUWA, et al., Recombinant human lactoferrin suppresses premature cervical ripening. American Journal of Obstetrics and Gynecology.2005, 193(6): S58-S58.

OZSAN, H. G., M. PEHLIVAN, et al., High lactoferrin levels in disseminated intravascular coagulation and its possible negative role in coagulation. Thrombosis Research.2000, 98(1): 111-114.

PALERMO, C., M. MUSCARELLA, et al., A multiresidual method based on ionexchange chromatography with conductivity detection for the determination of biogenic amines in food and beverages. Analytical and Bioanalytical Chemistry.2013, 405(2-3): 1015-1023.

PALMANO, K. P. and D. F. ELGAR, Detection and quantitation of lactoferrin in bovine whey samples by reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene. Journal of Chromatography A.2002, 947(2): 307-311.

PETERSON, G. L., Simplification of protein assay method of Lowry et al - Which is more generally applicable Analytical Biochemistry.1977, 83(2): 346-356.

PONT, F., B. LUCIANI, et al., Characterization of phosphoantigens by highperformance anion-exchange chromatography electrospray ionization ion trap mass spectrometry and nanoelectrospray ionization ion trap mass spectrometry. Analytical Chemistry.2001, 73(15): 3562-3569.

POWELL, M. J. and J. E. OGDEN, Nucleotide-sequence of human lactoferrin cDNA. Nucleic Acids Research.1990, 18(13): 4013-4013.

PTACEK, P., Capillary electroseparation methods. Chemicke Listy.1991, 85(5): 515525.

PUPKOVA, V. I. and L. M. PRASOLOVA, Pyrogallol red technique is an alternative to routine urinary protein-determining methods. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika.2007, (6): 17-21.

44

PUPKOVA, V. I. and L. M. PRASOLOVA, Pyrogallol red technique is an alternative to routine urinary protein-determining methods. Klin. Lab. Diagnost.2007, (6): 17-21.

RAVINDRAN, G. and W. L. BRYDEN, Tryptophan determination in proteins and feedstuffs by ion exchange chromatography. Food Chemistry.2005, 89(2): 309-314.

REGOECZI, E. (1997). Observations on the metabolism and cellular interactions of lactoferrin. Totowa, Humana Press Inc.

REY, M. W., S. L. WOLOSHUK, et al., Complete nucletotide-sequence of human mammary-gland lactoferrin Nucleic Acids Research.1990, 18(17): 5288-5288.

RUDNEY, J. D., K. L. HICKEY, et al., Cumulative correlations of lysozyme, lactoferrin, peroxidase, S-IgA, amylase, and total protein concentrations with adherence of oral viridans streptococci to microplates coated with human saliva. Journal of Dental Research.1999, 78(3): 759-768.

RUDNEY, J. D. and Q. T. SMITH, Relationships between levels of lysozyme, lactoferrin, salivary peroxidase, and secretory immunoglobulin-a in stimulated parotidsaliva. Infect. Immun.1985, 49(3): 469-475.

SALMON, V., D. LEGRAND, et al., Characterization of human lactoferrin produced in the Baculovirus expression system. Protein Expression and Purification.1997, 9(2): 203-210.

SEEVARATNAM, R., B. P. PATEL, et al., Comparison of Total Protein Concentration in Skeletal Muscle as Measured by the Bradford and Lowry Assays. J. Biochem.2009, 145(6): 791-797.

SEEVARATNAM, R., B. P. PATEL, et al., Comparison of Total Protein Concentration in Skeletal Muscle as Measured by the Bradford and Lowry Assays. Journal of Biochemistry.2009, 145(6): 791-797.

SCHENKELS, L., E. C. I. VEERMAN, et al., Biochemical composition of human saliva in relation to toher mucosal fluids Critical Reviews in Oral Biology and Medicine.1995, 6(2): 161-175. 45

SILVA, A. S. and M. FALKENBERG, Analytical interference of quinolone antibiotics and quinine derived drugs on urinary protein determined by reagent strips and the pyrogallol red-molybdate protein assay. Clin. Biochem.2011, 44(12): 1000-1004.

SMALL, H., T. S. STEVENS, et al., Novel ion-exchange chromatogprahic method using conductimetric detectin Analytical Chemistry.1975, 47(11): 1801-1809.

SOCHOR, J., M. RYVOLOVA, et al., Fully Automated Spectrometric Protocols for Determination of Antioxidant Activity: Advantages and Disadvantages. Molecules.2010, 15(12): 8618-8640.

SOLLID, L. M., Coeliac disease: Dissecting a complex inflammatory disorder. Nat. Rev. Immunol.2002, 2(9): 647-655.

SOUSA, A., D. BICHO, et al., Performance of a non-grafted monolithic support for purification of supercoiled plasmid DNA. Journal of Chromatography A.2011, 1218(13): 1701-1706.

STABY, A., J. NIELSEN, et al. (2009). Advances in Resins for Ion-Exchange Chromatography. Advances in Chromatography, Vol 47. E. Grushka and N. Grinberg. Boca Raton, Crc Press-Taylor & Francis Group. 47: 193-245.

STACHOWIAK, T. B., T. ROHR, et al., Fabrication of porous polymer monoliths covalently attached to the walls of channels in plastic microdevices. Electrophoresis.2003, 24(21): 3689-3693.

SUKHAREV, A. Y., T. N. YERMOLAYEVA, et al., Immunochemical studies of salivary lactoferrin. Klin. Lab.Diag.2009, 2009(4): 38-39.

SYKES, J. A. C., M. J. THOMAS, et al., Plasma lactoferrin levels in pregnancy and cystic-fibrosis. Clin. Chim. Acta.1982, 122(3): 385-393.

SYKES, J. A. C., M. J. THOMAS, et al., Plasma lactoferrin levels in pregnancy and cystit-fibrosis. Clinica Chimica Acta.1982, 122(3): 385-393. 46

SYKORA, D., F. SVEC, et al., Separation of oligonucleotides on novel monolithic columns with ion-exchange functional surfaces. Journal of Chromatography A.1999, 852(1): 297-304.

TAKAHASHI, M., T. HIRANO, et al., Separation of small inorganic anions using methacrylate-based anion-exchange monolithic column prepared by low temperature UV photo-polymerization. Journal of Chromatography A.2012, 1232: 123-127.

TENG, C. T., W. GLADWELL, et al., Lactoferrin gene expression is estrogen responsive in human and rhesus monkey endometrium. Molecular Human Reproduction.2002, 8(1): 58-67.

TIAINEN, P., G. PER-ERIK, et al., Superporous agarose anion exchangers for plasmid isolation. Journal of Chromatography A.2007, 1138(1-2): 84-94.

TSUDA, H., K. FUKAMACHI, et al., Prevention of carcinogenesis and cancer metastasis by bovine lactoferrin. Proceedings of the Japan Academy Series B-Physical and Biological Sciences.2006, 82(7): 208-215.

TURSI, A., W. ELISEI, et al., Effect of lactoferrin supplementation on the effectiveness and tolerability of a 7-day quadruple therapy after failure of a first attempt to cure Helicobacter pylori infection. Medical Science Monitor.2007, 13(4): CR187-CR190.

UCHIDA, T., S. DOSAKO, et al., Sequential separation of lactoferrin, lactoperoxidase, and secretory component by sulfate-linked ion-exchange chromatography. Milchwissenschaft-Milk Science International.2003, 58(9-10): 482-486.

UMUHUMUZA, L. C., Effect of Bovine Lactoferrin and Casein Peptide Powder on Microbial Growth and Glucose Utilization by Microorganisms in Pork Meat During Storage at 4oC. Pakistan Journal of Nutrition. 2011.

VAN DER STRATE, B. W. A., L. BELJAARS, et al., Antiviral activities of lactoferrin. Antiviral Research.2001, 52(3): 225-239.

47

VAN DER STRATE, B. W. A., M. C. HARMSEN, et al., Plasma lactoferrin levels are decreased in end-stage AIDS patients. Viral Immunology.1999, 12(3): 197-203.

VERHEUL, M. and S. ROEFS, Structure of particulate whey protein gels: Effect of NaCl concentration, pH, heating temperature, and protein composition. J. Agric. Food Chem.1998, 46(12): 4909-4916.

VIANI, R. M., T. J. GUTTEBERG, et al., Lactoferrin inhibits HIV-1 replication in vitro and exhibits synergy when combined with zidovudine. Aids.1999, 13(10): 1273-1274.

VIDIC, J., A. PODGORNIK, et al., Chemical and chromatographic stability of methacrylate-based monolithic columns. Journal of Chromatography A.2007, 1144(1): 63-71.

WARD, P. P., E. PAZ, et al., Multifunctional roles of lactoferrin: a critical overview. Cellular and Molecular Life Sciences.2005, 62(22): 2540-2548.

WOLMAN, F. J., D. GONZALEZ MAGLIO, et al., One-step lactoferrin purification from bovine whey and colostrum by affinity membrane chromatography. Journal of Membrane Science.2007, 288(1-2): 132-138.

YANG, J.-Y., T.-I. CHIEN, et al., Heparin interference in the cerebrospinal fluid protein assay measured with a pyrogallol red-molybdate complex. Clinica Chimica Acta.2009, 408(1-2): 75-78.

YANG, J. Y., T. I. CHIEN, et al., Heparin interference in the cerebrospinal fluid protein assay measured with a pyrogallol red-molybdate complex. Clin. Chim. Acta.2009, 408(1-2): 75-78.

YE, X. Y., S. YOSHIDA, et al., Isolation of lactoperoxidase, lactoferrin, alphalactalbumin, beta-lactoglobulin B and beta-lactoglobulin A from bovine rennet whey using ion exchange chromatography. International Journal of Biochemistry & Cell Biology.2000, 32(11-12): 1143-1150.

48

YOSHISE, R. E., M. MATSUMOTO, et al., Profiles of bovine lactoferrin in the gastrointestinal tracts of rats as observed by ELISA, Western blotting and SELDIaffinity MS. Milchwiss.-Milk Sci. Int.2007, 62(4): 446-450.

YU, L. L., Q. H. SHI, et al., Effect of dextran layer on protein uptake to dextran-grafted adsorbents for ion-exchange and mixed-mode chromatography. Journal of Separation Science.2011, 34(21): 2950-2959.

ZITKA, O., A. HORNA, et al., Study of structural changes of lactoferrin using flow injection analysis with electrochemical detection on glassy carbon electrode. Acta Chim. Slov.2007, 54(1): 68-73.

ZITKA, O., S. KRIZKOVA, et al., Utilizing Automated Chip Electrophoresis for Study of Lactoferrin and Matrix Metalloproteinases. Chem. Listy.2010, 104(3): 197-201.

ZITKA, O., S. KRIZKOVA, et al., Utilizing Automated Chip Electrophoresis for Study of Lactoferrin and Matrix Metalloproteinases. Chemicke Listy.2010, 104(3): 197-201.

ZITKA, O., S. KRIZKOVA, et al., Microfluidic tool coupled with electrochemical assay for detection of lactoferrin isolated by antibody modified paramagnetic beads. Electrophoresis.2013, in press.

ZOR, T. and Z. SELIGER, Linearization of the bradford protein assay increases its sensitivity: Theoretical and experimental studies. Analytical Biochemistry.1996, 236(2): 302-308.

49

8 SEZNAM ZKRATEK Detektor diodového pole (diode-array detector) Iontově-výměnná kapalinová chromatografie (ion-exchange liquid chromatography) DNA Deoxyribonukleová kyselina (deoxyribonucleic acid) BCA Bicinchoninová metoda (bicinchoninic acid assay) ELISA Enzymově značená imunoanalýza (enzyme-linked immunosorbent assay) MFA Mobilní fáze A MFB Mobilní fáze B SDS-PAGE Polyakrylamidová gelová elektroforéza (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) PBS Fosfátový roztok s přídavkem NaCl (phosphate buffered saline) DAD IELC

50

9 SEZNAM OBRÁZKŮ Obrázek 1:. ...................................................................................................................... 12 Obrázek 2: ....................................................................................................................... 14 Obrázek 3: ....................................................................................................................... 15 Obrázek 4: ....................................................................................................................... 18 Obrázek 5: ....................................................................................................................... 27 Obrázek 6: ....................................................................................................................... 28 Obrázek 7: ....................................................................................................................... 29 Obrázek 8: ....................................................................................................................... 30 Obrázek 9: ....................................................................................................................... 31 Obrázek 10: ..................................................................................................................... 33 Obrázek 11:. .................................................................................................................... 35

51

10 SEZNAM TABULEK Tabulka 1: Fotometrické stanovení proteinů. ................................................................. 32 Tabulka 2: Analýza vzorků slin. ..................................................................................... 34

52