MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA
DIPLOMOVÁ PRÁCE
BRNO 2014
MARKÉTA ČEGANOVÁ
Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav Technologie potravin
Ovlivnění plazmatické hladiny cholesterolu modelového organizmu polynenasycenými mastnými kyselinami n-3 Diplomová práce
Vedoucí práce: Prof. MVDr. Ing. Tomáš Komprda CSc.
Brno 2014
Vypracoval: Bc. Markéta Čeganová
Čestné prohlášení
Prohlašuji, že jsem práci:
Ovlivnění
plazmatické
hladiny
cholesterolu
modelového organizmu polynenasycenými mastnými kyselinami n-3 vypracoval/a samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s § 47b zákona č. 111/1998 Sb.,o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací.
Jsem si vědom/a, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle § 60 odst. 1 autorského zákona.
Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše.
V Brně dne:………………………..
…………………………………………………….. podpis
Poděkování Tímto bych chtěla poděkovat svému vedoucímu prof. MVDr. Ing. Tomáši Komprdovi, CSc. a Ing. Veronice Rozíkové za jejich pomoc a odborné vedení při zpracování mojí diplomové práce.
Abstrakt Cílem práce bylo posoudit vliv polynenasycených mastných kyselin, především DHA a EPA, v dietě na živočišný organismus, na hladinu celkového, HDL a LDL cholesterolu a triacylglycerolů v plazmě. Modelovými zvířaty byli potkani, kteří byli rozděleni do 3 skupin po 10 ks: Kontrolní skupina byla s přídavkem 6 % oleje ze světlice barvířské (n-6, světlice), první skupina s přídavkem 6 % rybího oleje (n-3: EPA, DHA; ryba) a druhá skupina s 6 % přídavkem oleje z řasy Schizochytrium (n-3: DHA; DHA). Po 40 dnech byla zvířata usmrcena dle náležitých předpisů. Z odebraných vzorků krve byly stanoveny krevní lipidy metodou spektrofotometrie. Stanovení polynenasycených mastných kyselin n-3 a n-6 bylo metodou plynové chromatografie v jaterní, svalové a tukové tkáni potkanů. Vlivem zvýšeného obsahu PUFA n-3 ve skupinách s přídavkem rybího oleje a s olejem z řasy Schizochytrium, byl snížen celkový a LDL cholesterol ve srovnání s hladinou u skupiny kontrolní. TAG byly sníženy pouze u skupiny s přídavkem oleje z řasy Schizochytrium ve srovnání s kontrolní skupinou. Klíčová slova: cholesterol, LDL cholesterol, HDL cholesterol, PUFA, n-3, TAG, DHA, EPA
Abstract: The aim of this thesis is to assess the influence of the polyunsaturated fatty acids, especially DHA and EPA in the diet on the animal organism in accordance to the levels of total HDL and LDL cholesterol and triglycerides in plasma. As experimental animals were used rats and they were divided into 3 groups of 10 pieces: control group with the addition of 6 % Carthamus tinctorius (n-6 flares), the group with the addition of 6 % fish oil (n-3: EPA, DHA fish) and the group with 6 % addition of oil from Schizochytrium (n-3: DHA, DHA). After 40 days the animals were putted to death according to relevant regulations. Blood lipids were obtained from blood samples by spectrophotometry. Value of polyunsaturated fatty acids of n-3 and n-6 was set by gas chromatography in the liver, muscle and adipose tissue. In accordance to the increase of content n-3 PUFA in group with fish oil and with oil from Schizochytrium, total and LDL cholesterol was reduced in comparison of samples in control group. In comparison to the control group were TAG reduced only in the group with addition of oil.
Key words: cholesterol, LDL cholesterol, HDL cholesterol, PUFA, n-3, TAG, DHA, EPA
Obsah 1
ÚVOD........................................................................................................... 10
2
CÍL PRÁCE .................................................................................................. 11
3 LITERÁRNÍ PŘEHLED .................................................................................... 12 3.1 Cholesterol .................................................................................................. 12 3.1.1 Biologické funkce cholesterolu ............................................................. 12 3.1.2 Syntéza cholesterolu ............................................................................. 14 3.1.3 Transport a metabolismus lipidů a cholesterolu ..................................... 16 3.2 Mastné kyseliny .......................................................................................... 18 3.2.1 Rozdělení mastných kyselin .................................................................. 20 3.2.2 Využití mastných kyselin ...................................................................... 21 3.2.1 Biochemické aspekty mastných kyselin ................................................ 23 3.3 Genová exprese ........................................................................................... 25 4. MATERIÁL A METODIKA ............................................................................ 27 4.1 Pokusná zvířata, podmínky chovu a krmné směsi ........................................ 27 4.2. Použité chemikálie ..................................................................................... 29 4.3. Použité přístroje ......................................................................................... 29 4.4 Odběr vzorků pro stanovení cholesterolu a mastných kyselin ...................... 30 4.5 Stanovení TAG, celkového cholesterolu a jeho jednotlivých frakcí ve vzorku. ................................................................................................................................ 32 4.6 Stanovení mastných kyselin......................................................................... 32 4.6.1 Příprava vzorku .................................................................................... 32 4.6.2 Extrakce tuku........................................................................................ 32 4.6.3 Derivatizace vzorku .............................................................................. 33 4.6.4 Měření vzorků tuku na plynovém chromatografu .................................. 34 4.6.5 Statistické vyhodnocení výsledků ......................................................... 34
5 VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUZE ................................................................... 35 5.1 Příjem krmiva a změny hmotnosti pokusných zvířat .................................... 35 5.2 Koncentrace celkového cholesterolu, HDL-cholesterolu a LDL-cholesterolu a TAG ........................................................................................................................ 35 5.3 Zastoupení jednotlivých mastných kyselin v jaterní tkáni ............................ 40 5.4 Zastoupení mastných kyselin ve svalovině................................................... 43 5.5 Zastoupení mastných kyselin v tuku ............................................................ 47 5.6 Korelace koncentrace MK ze všech tkání s celkovým cholesterolem, HDL cholesterolem, LDL cholesterolem a TAG .............................................................. 50 6 ZÁVĚR .............................................................................................................. 51 7 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY................................................................. 53
1 ÚVOD Polynenasycené mastné kyseliny řady n-3 jsou v dnešní době zájmu o výživu člověka velmi rozšířené a diskutované téma. Mezi tyto kyseliny řadíme především kyselinu eikosapentaenovou (EPA) a kyselinu dokosahexaenovou (DHA). Tyto kyseliny patří mezi nejúčinnější látky, které ovlivňují metabolizmus cholesterolu v těle člověka, dále jsou také důležité pro rozvoj mozku u plodu a novorozence a další kognitivní funkce v organizmu. Dietární zdroje těchto kyselin představují zejména rybí tuk, tučné ryby a mořští živočichové. Mnoha studiemi je prokázáno, že zvýšená konzumace PUFA příznivě ovlivňuje zastoupení plazmatických lipidů. V dnešní době, kdy více jak polovina světové populace trpí vyšší koncentrací cholesterolu, což má za následek více jak třetinu kardiovaskulárních problémů lidské populace, je zájem o tyto kyseliny zcela oprávněný. Ve skladbě stravy dnešní populace je nevyhovující množství přijímaného tuku, které překračuje asi o deset procent doporučený denní příjem. Také skladba přijímaného tuku není ideální, silně převažují nasycené mastné kyseliny. V České republice v roce 2000 bylo 53 % úmrtí způsobeno nemocemi oběhové soustavy. Na infarkt zemřelo v roce 2000 celkem 11 347 osob.
10
2 CÍL PRÁCE Cílem diplomové práce bylo nastudovat dostupnou recentní literaturu shrnující poznatky o vlivu kyseliny eikosapentaénové a dokosahexaénové na hladinu plazmatického cholesterolu. Prakticky se seznámit se stanovením mastných kyselin metodou plynové chromatografie a stanovením cholesterolu enzymatickými metodami. Podílet se na zajištění pokusného chovu vybraných modelových zvířat, na odběru vzorků jejich tkání k analýze a na vlastní analýze mastných kyselin a cholesterolu. Spolupodílet se na odběru vzorků mRNA vybraných tkání pokusných zvířat a seznámit se s měřením exprese příslušných genů metodou qRT-PCR. Získané výsledky vyhodnotit pomocí vhodných statistických metod a zpracovat obvyklou formou diplomové práce.
11
3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Cholesterol 3.1.1 Biologické funkce cholesterolu Cholesterol patří mezi doprovodné látky lipidů. Je transportován pomocí plazmatických lipoproteinů (Komprda, 2003). Strukturu lipoproteinu můžeme vidět na obrázku č. 1.
Obr. 1: Lipoprotein (Češka, 2012) Je tvořen jádry a hydroxylovou skupinou (Češka, 2012). Lipoproteidy jsou určeny k transportu lipidů a steroidů v krvi (Burdychová, 2009). Patří mezi nejdůležitější steroly v souvislosti s výživou člověka. Najdeme ho ve všech buňkách. Je součástí myelinových pochev u nervových buněk, podílí se na stavbě buněčných stěn (Komprda, 2003). V membráně jej nalezneme ve volné formě, kde významně ovlivňuje její vlastnosti, jako je deformabilita, fluidita, permeabilita a jiné (Stilwell a kol., 2007). V plazmě je ve formě esterů s kyselinou linolenovou a linolovou. Ve formě zásob je tvořen převážně estery s kyselinou olejovou (Češka, 2012). Ovlivňuje vlastnosti buněčné stěny. Dále se z něj v těle tvoří další důležité látky, jako jsou žlučové kyseliny, vitamín D a steroidní hormony kůry nadledvin a pohlavních žláz. Z uvedených vlastností je zřejmé, že cholesterol je pro náš život nezbytný (Komprda, 2003). Vzorec cholesterolu můžeme vidět na obrázku č. 2.
12
Obr. 2: Vzorec cholesterolu, zdroj:http://www.abc.net.au/health/library/stories/2006/08/03/1829380.htm Nesmíme však zapomenout na aterogenní účinek cholesterolu, který napomáhá rozvoji aterosklerózy, kdy dochází k ukládání tukových látek na stěně cév a vyvolání zánětlivého procesu, sekundárně se zde může ukládat vápník (Komprda, 2003). Vznik aterosklerózy můžeme vidět na obrázku č. 3.
Obr. 3: Vznik aterózy (Češka, 2012) Srdečně-cévní onemocnění se vyskytovala i v naší historii. Jsou-li LDL částice oxidované, jsou poškozené a organismus je proto považuje za cizorodé. Proto se stávají terčem pro buňky imunitního systému. Imunitní systém v daném místě vyvolá zánět, což je první příznak počátku vývoje aterosklerózy (Komprda, 2009). Tím dochází k zužování cévy až k ischemii v daném místě poškození (Komprda, 2003). Ovšem větší problém než nadbytečný příjem cholesterolu je přemíra energie a nadbytek nasycených tuků přijímaných v potravě (Komprda, 2009). Srdečně cévní onemocnění nejsou pro lidstvo žádnou novinkou. Sklerotické změny na spánkové tepně byly prokázány i u mumie Ramesse II. Ateroskleróza se vyskytovala v období starověkého Egypta pouze u
13
vysoko postavených jedinců, u běžných obyvatel nikoli. Tudíž je jasné, že tato onemocnění souvisí s určitým životním stylem (Arcimovičová, 2003). Pro sledování cholesterolu v krevní plazmě je důležitější sledovat jeho jednotlivé frakce, než vlastní hodnotu (Komprda, 2003). Jeho hladina v krevní plazmě by neměla překročit hodnotu 5,2 mmol/l, frakce LDL (low-density lipoprotein) hodnotu 3,3 mmol/l a HDL (high-density lipoprotein) by měl být vždy vyšší něž 0,9 mmol/l (Komprda, 2009). HDL-cholesterol je hodnocen jako pozitivní frakce, jelikož vede vázaný cholesterol z periferie do jater. LDL-cholesterol je hodnocen jako negativní frakce, jelikož vede vázaný cholesterol z jater do periferie. Pro částice LDL má stěžejní úlohu apolipoprotein B-100, který zastává úlohu ligandu s LDL receptorem. LDL částice přenáší až 70 % cholesterolu z celkového množství cholesterolu v krevní plazmě (Češka, 2012). Hlavní negativní vlastnost LDL částic je jejich vysoká náchylnost k oxidaci (Komprda, 2009). Oxidační produkty cholesterolu mají podstatně vyšší arterogenní účinky než samotný cholesterol (Komprda, 2009). Tyto produkty vznikají nevhodným skladováním potravin obsahujících cholesterol a příliš vysokou tepelnou úpravou (Komprda, 2003). Maximální doporučený denní příjem cholesterolu je 300 mg (Burdychová, 2009). Abychom co nejlépe zabránili oxidaci cholesterolu i mastných kyselin v organismu, je také nutné přijímat dostatečné množství antioxidantů, a to především vitamínu E (Komprda, 2009). 3.1.2 Syntéza cholesterolu Cholesterol mohou produkovat všechny buňky těla (kromě bezjaderných erytrocytů), ale největší produkce je v jaterních buňkách, nervové tkáni a u sliznic trávicího ústrojí (Burdychová, 2009). Z fyziologického hlediska dělíme cholesterol na exogenní, který je přijímán potravou a endogenní, který si tělo tvoří samo. Průměrný příjem exogenního cholesterolu v potravě ve střední Evropě se pohybuje kolem 340 mg/den. Jeho výskyt je striktně v potravinách živočišného původu. Jeho obsah v některých vybraných potravinách můžeme vidět v tabulce 1. (Komprda, 2009). Syntéza cholesterolu probíhá především v játrech, kde je tvořen z acetal-CoA za účasti enzymu β-hydroxy-β-methylglutaryl-CoA-reduktázy. Tento enzym zásadním způsobem redukuje produkci cholesterolu v organismu (Komprda, 2003). Produkce cholesterolu je složitý proces více
14
jak dvaceti chemických reakcí, zjednodušenou formu můžeme vidět na obrázku č. 4. (Češka, 2012).
Obr. 4: Zjednodušená syntéza cholesterolu (Češka, 2012). Obecně je hladina krevního cholesterolu regulována pomocí tří úrovní. První je resorpce, kde se uplatňují buněčné receptory střevní sliznice. Dále je to syntéza cholesterolu, která je řízena právě pomocí β-hydroxy-β-methyl-glutaryl-CoA-reduktázy. A nakonec krevní oběh, kde je rozhodující počet a funkční stav LDL-receptorů. (Komprda, 2003). Denní produkce cholesterolu v těle je 1,2 až 2g/den. Největší část této produkce spotřebují nadledvinky na syntézu steroidních hormonů (Burdychová, 2009). Obsah cholesterolu v některých vybraných potravinách můžeme sledovat v tabulce č. 1.
15
Tab. 1: Obsah cholesterolu ve vybraných potravinách (Komprda, 2003) Obsah cholesterolu
Potravina
(mg/100g)
Vnitřnosti
70-3500
Vaječný žloutek
1500
Máslo
350
Vejce
350
Ryby
40-150
Uzeniny
50-110
Sýry
30-100
Sádlo
90
Drůbeží maso
40-90
Hovězí maso
60-70
Vepřové maso
40-60
Mléko
12
3.1.3 Transport a metabolismus lipidů a cholesterolu Transport látek můžeme rozdělit do dvou metabolických drah, a to do dráhy exogenní, tedy transportu cholesterolu přijatého potravou a dráhy endogenní, která se týká transportu a metabolismu tuků tvořených organismem. Exogenní metabolická dráha začíná ve střevě, kde jsou tukové složky upraveny do podoby chylomiker, které se dostávají do lymfy a následně do krve (Komprda, 2003). Chylomikry jsou tvořeny z 90 % triacylglyceroly, cholesterolem a fosfolipidy. Z bílkovin je nejdůležitější apolipoprotein B-48. Množství vznikajících chylomiker je přímo úměrné množství tuku přijímaného v potravě (Češka, 2012). Z krevní plazmy jsou odstraňovány pomocí enzymu lipoproteinové lipázy (navázanou na heparansulfáty na povrchu cévního epitelu) a vytváří chylomikronové zbytky, které jsou vychytávány játry pomocí apolipoproteinu E. Po endocytóze jsou estery cholesterolu v lysozomech hydrolyzovány, a to pomocí kyselé lipázy. Během štěpení lipoproteinovou lipázou dochází k uvolnění diskontních částic obsahujících estery cholesterolu (Češka, 2012). 16
Část tvoří HDL, které pomocí lecitin-cholesterol-acetyltransferázy (LCAT) odstraňují přebytečný cholesterol z buněčných membrán a mění ho na estery cholesterolu. Produktem endogenní dráhy jsou VLDL (very low density lipoprotein), které jsou následně metabolizovány stejně jako chylomikra, ale jejich zbytky jsou LDL částice (Komprda, 2003). Endogenní i exogenní cyklus můžeme pozorovat na obrázku 5. a 6. (Češka, 2012).
Obr. 5: Exogenní cesta lipidového metabolizmu (Češka, 2012)
Obr. 6: Ednogenní cesta lipidového metabolizmu (Češka, 2012) Cholesterol je z těla vyloučen ve formě žlučových kyselin, velká část těchto kyselin podléhá enterohepatálnímu oběhu, kdy jsou tyto kyseliny uvolněny do tenkého střeva a
17
zpětně resorbovány. Ztráty cholesterolu a fosfolipidů stolicí jsou pro nás velmi důležité (Češka, 2012). 3.2 Mastné kyseliny Mastné kyseliny jsou nejdůležitější složkou lipidů. Všechny mastné kyseliny jsou zakončeny karboxylovou skupinou (-COOH). Díky hydrogenkarbonylovému řetězci je mastná kyselina (MK) rozpustná v organických rozpouštědlech, zatímco skupina – COOH je schopna odštěpovat vodíkové ionty (Burdychová, 2009). V plazmě se MK vyskytují ve formě esterů či volné. Plazmatické volné MK jsou transportovány v plazmě vázané na albumin. Čerpáme je ze dvou hlavních zdrojů. Hlavní zásoby jsou uchovávány v tukové tkáni ve formě triacylglycerolů. Po lipolýze dochází k jejich uvolnění a transportu do míst potřeby, jako zdroj energie při hladovění či fyzické zátěži. Druhý zdroj jsou lipoproteinové částice bohaté na triacylglyceroly (Češka, 2012). Přehled nejvýznamnějších mastných kyselin je zobrazen v tabulce č. 2 (Schneiderová, 2007).
18
Tab. 2: Mastné kyseliny (Schneidrová 2007) Systematický název
Triviální název
Chemický vzorec
Poloha a konfigurace vazeb
Nasycené mastné kyseliny (SFA) Kyselina tetradekanová
Kyselina myristová
C 14:0
-
Kyselina hexadekanová
Kyselina palmitová
C 16:0
-
Kyselina oktadekanová
Kyselina stearová
C 18:0
-
Mononenasycené mastné kyseliny (MUFA) Kyselina oktadecenová
Kyselina olejová
C 18:1n-9
6; trans
Kyselina oktadecenová
Kyselina elaidová
C 18:1n-9
9; cis
Kyselina eikosenová
Kyselina gadolejová
C 20:1n-11
11; trans
Kyselina eikosenová
Kyselina gondová
C 20:1n-9
9; cis
Kyselina dokosenová
Kyselina eruková
C 22:1n-9
13; cis
Kyselina dokosenová
Kyselina brassidova
C 22:1n-9
13; trans
Polynenasycené mastné kyseliny (PUFA) dienové Kyselina oktadekadienová
Kyselina linolová
C 18:2n-6
9,12; cis, cis
C 18:2n-3
12,15; cis, cis
Kyselina linoelaidová
C18:2n-6
9,12; trans, trans
Kyselina oktadekatrienová
Kyselina α-linolenová
C 18:3n-3
9,12,15; all-cis
Kyselina oktadekatrienová
Kyselina γ-linolenová
C 18:3n-6
6,9,12; all-cis
Kyselina eikosatrienová
Kyselinadihomo-γ-
C 18:3n-6
8,11,14; all-cis
C 20:4n-6
5,8,11,14; all-cis
C 20: 4n-3
8,11,14,17; all-cis
Kyselina adrenová
C 22:4n-6
7,10,13,16; all-cis
EPA
C20:5n-3
5,8,11,14,17; all-cis
C 22:5n-6
4,7,10,13,16; all-cis
Kyselina klupadonová
C22:5n-3
7,10,13,16,19; all-cis
DHA
C 22:6n-3
4,7,10,13,16,19; all-cis
Kyselina nisinová
C 24:6n-3
4,8,12,15,18,21; all-cis
Kyselina oktadekadienová Kyselina oktadekadienová trienové
linolenová tetraenové Kyselina eikosaterteenová
Kyselina arachidonová
Kyselina eikosateraenová Kyselina dokosatetraenová pentaenové Kyselina eikosapentaenová Kyselina dokosapentaenová Kyselina dokosapentaenová hexaenové Kyselina dokosahexaenová Kyselina tetrakosahexaenová
19
3.2.1 Rozdělení mastných kyselin Z hlediska výživy dělíme mastné kyseliny na tři skupiny: Nasycené SAFA (neobsahují dvojnou vazbu), tyto kyseliny zvyšují hladinu plazmatického cholesterolu, zvyšují hladinu sérového cholesterolu, zvyšují hladinu LDL, snižují hladinu HDL a zvyšují TAG (tryacylgrlyceroly). Jde především o kyselinu laurovou, kyselinu myristovou a kyselinu palmitovou. Neutrálně působí kyselina stearová. Mononenasycené (MUFA obsahují jednu dvojnou vazbu), tyto kyseliny snižují hladinu sérového cholesterolu (Komprda, 2003). Hlavním představitelem této skupiny je kyselina olejová, která se nejvíce vyskytuje v olivovém oleji. Vysoká konzumace olivového oleje ve středozemní oblasti, kde je také výskyt srdečně-cévních onemocnění nižší než v jiných oblastech světa. V těchto oblastech nahrazuje negativně působící tuky ve stravě, což především pozitivně ovlivňuje její účinek na snížení hladiny cholesterolu. Její účinek je však spíše spojen s tím, že je nahrazována místo negativně působících tuků (Komprda, 2009). Polynenasycené PUFA (obsahují dvě až šest dvojných vazeb), které jsou z hlediska výživy člověka posuzovány nejlépe. Nejvýznamnější je z hlediska fyziologie dělení PUFA do tří řad a to: n-3, n-6 a n-9. Číslovka nám označuje pořadí první dvojné vazby od methylenového konce molekuly. Příjem PUFA je doporučován v celkem vysokých denních příjmech, a to především ve formě kyseliny olejové a ryb (Komprda, 2003). Velice negativní účinek na organismus mají trans-mastné kyseliny. Třebaže mají stejný sumární chemický vzorec, mají zcela jiné vlastnosti, které se z hlediska hladiny sérového cholesterolu více podobají SAFA (Komprda, 2003). Dokonce je zjištěno, že konzumace
trans-mastných
kyselin
je
z hlediska
vzniku
kardio-vaskulárních
onemocnění mnohem vyšší, než při konzumaci nasycených mastných kyselin (Komprda, 2009). Nachází se v mikroorganismech, v semenech určitých rostlin a v malé míře vznikají v těle při β-oxidaci. V potravě je získáváme převážně v mléčném tuku se zastoupením 6-8 %. Ještě je můžeme nalézt v margarínech a výrobcích z margarínu, kde vznikají při záhřevu tuku obsahujícího PUFA nad teplotu 240°C (Burdychová, 2009). Výrobci margarínu si jsou vědomi negativních účinků těchto kyselin a dnešní margaríny neosahují větší množství trans-mastných kyselin, než je 20
v másle. Ovšem jiná situace je u výrobků, kde jsou margaríny používány skrytě (Komprda, 2009). Další významnou kyselinou je konjugovaná kyselina linolová (CLA). Tato kyselina vzniká přirozeně v bachoru přežvýkavce a nachází se výhradně v produktech z tuku těchto zvířat. Má příznivý vliv na organismus, je u ní prokázán vliv na omezení vzniku rakoviny, srdečně-cévních onemocnění a také posiluje imunitní systém člověka. Ovšem zjistit příjem této látky v dostatečné míře, aby se tyto účinky mohly projevit, je prozatím v podstatě nereálné (Komprda, 2009). 3.2.2 Využití mastných kyselin n-3 mastné kyseliny mohou být použíty jako prevence při revmatoidní artritídě i astmatu (Yates a kol., 2013). n-3 masné kyseliny mají pozitivní vliv na kardiovaskulární systém (Yates a kol.,2013). Je prokázána korelace příjmu PUFA v potravě s procentuálním zastoupením těchto kyselin v krevní plazmě (Chien a kol., 2013). Kombinace n-3 mastných kyselin s rostlinnými steroly a vitamíny skupiny B se mohou podílet na modulaci hladiny lipidů při hypercholesterolemii (Garaiova a kol., 2013). n-3 kyseliny v rybách mají vliv na snížené riziko infarktu myokardu, jsou nezbytné pro funkci mozku a nervů, zlepšují pozornost a náladu, chrání před arytmií, snižují zánětlivost a zlepšují citlivost tkání na hormony (Frej, 2004). Byl prokázán i pozitivní vliv n-3 mastných kyselin při rakovině prsu (Rovito a kol., 2013). Konzumace PUFA je také doporučena po transplantaci ledvin, kde příznivě působí na léčbu (Filler a kol., 2012). Je doporučeno konzumovat ryby bohaté na n-3 mastné kyseliny (Harris a kol., 2013) a to minimálně dvakrát týdně. Za vhodné ryby považujeme lososa, sardinku, sledě a makrelu, které obsahují asi 1-1,8 g n-3 na 100 g upraveného masa. V jiných mořských plodech, mušlích a korýších je obsah nižší, asi 0,5 g/ 100 g (Burdychová, 2009). Pro zisk PUFA z rybího oleje se mohou využít ryby: růžicha stříbřitá (Pagellus acarne), máčka skvrnitá (Scyliorhinus canicula), sardinka obecná (Sardina pilchardus), kranas evropský (Trachurus mediterraneus) a očnatec štíhlý (Boops boops), které mají v určitých ročních obdobích obsah EPA (kyselina eikosapentaenová) a DHA (kyselina dokosahexaenová) až 23 % z celkového množství mastných kyselin (Garcia-Moreno a kol., 2013). Bylo prokázáno, že u žen konzumace ryb dvakrát týdně snížila riziko nemocí srdce o 25 %, při konzumaci pětkrát týdně až o 64 % (Frej, 2004). Tyto mastné kyseliny se také využívají při prevenci i léčbě NAFLD (Non-alcoholic fatty liver 21
disease) (Rossmeisl a kol., 2014). Při zvýšené konzumaci PUFA také dochází k vyššímu fekálnímu vylučování žlučových kyselin (Chadli a kol., 2013). Zastoupení jednotlivých mastných kyselin ve vybraných tucích a olejích zobrazuje tabulka č. 2 (Komprda, 2009). Z rostlinných zdrojů n-3 můžeme jmenovat: avokádo, cizrna, fazole, jahody, lněné semínko, ječné otruby, pšeničné klíčky, špenát, kapusta a pórek (Frej, 2004). Dalším dobrým zdrojem n-3 mastných kyselin je krill oil, který má lepší stravitelnost a výtěžnost n-3 než rybí olej (Ramprasath a kol., 2013). V poslední době se vytváří i velké množství potravin obohacených o PUFA. Jde o zvýšení n-3 mastných kyselin v krmivu pro kuřata, krůty, pštrosy, prasata, kozy či krávy. Jako živočišný zdroj těchto kyselin se používá rybí olej, jako rostlinný zdroj lněný olej. Oba tyto zdroje dokáží zvednout hladinu n-3 mastných kyselin v živočišných produktech. Mezi tyto produkty můžeme řadit vejce, maso či mléko. Množství o jaké jde tímto způsobem zvednout množství n-3 mastných kyselin v produktech závisí na druhu doplňku krmiva. V tomto ohledu jsou úspěšnější doplňky z rybího oleje, velkou nevýhodou jsou jeho organoleptické vlastnosti (Moghadasian, 2008). Jedním z těchto produktů je mléko, kde byly pozorovány pozitivní výsledky s pacienty s vysokým rizikem kardiovaskulárních problémů, a to především snížení krevních lipidů zejména cholesterolu, TAG a LDL cholesterolu (Lopez-Huertas, 2010). Tab 3: Obsah mastných kyselin ve vybraných tucích a olejích (Komprda, 2003) Mastné kyseliny (% z veškerých mastných kyselin)
Druh tuku
Nasycené
Mononenasycené
Polynenasycené
Kokosový tuk
90
8
1-2
Mléčný tuk
50-70
25-40
5
Vepřové sádlo
25-70
40-70
4-18
Kuřecí sádlo
30
45
22
Kapří tuk
25
50
25
Olivový olej
8-25
55-85
4-20
Sójový olej
15
20
65
Slunečnicový olej
15
15-40
40-70
Lněný olej
10
20
70
Řepkový olej
5-10
50-75
20-40
22
Převažuje kyselina linolová Převažuje kyselina α-linolenová Kyselina linolová i α-linolenová
3.2.1 Biochemické aspekty mastných kyselin MK člověk přijímá v potravě většinou ve formě neutrálních lipidů či fosfolipidů. MK se uvolní pomocí hydrolýzy a jsou zakomponovány do micel za asistence solí žlučových kyselin. Lidský organismus je schopný při nedostatku příjmu z potravy většinu MK syntetizovat. MK, které není náš organismus schopen syntetizovat označujeme jako esenciální (Komprda, 2009). Mezi hlavní esenciální mastné kyseliny řadíme kyselinu linolovou (LA), která je výchozí
PUFA pro řady n-6. Mezi PUFA n-6 se řadí kyselina
arachidonová a α-linolenová (ALA), která je výchozí PUFA pro řadu n-3. Nejvýznamnější metabolit této řady je kyselina eikosapentaenová (EPA) a kyselina dokosahexaenová (DHA). Z těchto kyselin se další metabolity tvoří pomocí elongáz, které prodlužují molekulu MK a desaturáz, které zvyšují počet dvojných vazeb v MK. Konečným metabolitem obou řad jsou eikosanoidy, pod které řadíme prostaglandiny (PG), leukotrieny (LT) a tromboxany (TA). Eikosanoidy působí vasokonstrikčně či vasodiletačně a ovlivňují agregaci trombocytů. Z PUFA řady n-6 vznikají eikosanoidy řady 2, které působí prozánětlivě, vasokonstrikčně a způsobují agregaci trombocytů. Z PUFA n-3 vznikají eikosanoidy řady 3, které působí obráceně, tedy protizánětlivě, vasodiletačně a proti shlukování trombocytů (Komprda, 2003). PUFA n-3 tedy mají vliv na snížení rizika srdečně-cévních onemocnění (Dawczynski a kol., 2013). Jednoduché schéma metabolismu esenciálních mastných kyselin můžeme vidět na obrázku č.7 (Komprda, 2007).
23
Obr. 7: Schéma metabolismu esenciálních mastných kyselin (Komprda, 2012)
24
Pro správnou funkci organismu je nezbytností správný poměr těchto dvou výchozích PUFA v potravě (Komprda, 2003). Ideální poměr příjmu n-6 ku n-3 by měl být 1:1 (Laura a kol., 2013), ale odborníky doporučený příjem je 1:5. Zde nejde o ideální hodnotu, ale o kompromis, aby se snížil současný poměr příjmu těchto kyselin (Komprda, 2009). 3.3 Genová exprese Hlavním nositelem genetické informace je deoxyribonukleová kyselina, která je známá pod zkratkou DNA (Kočárek, 2008). Znalost chemické struktury DNA umožnila zkoumat mechanismy, kterými DNA řídí vznik bílkovin (Nečásek, 1997). Expresivita genu je jeho schopnost odrazit se ve fenotypu daného jedince. Expresivita závisí na genovém pozadí nebo na faktorech prostředí (Hruban, 2000). Jde o proces, při kterém z genů vznikají molekuly RNA (ribonukleová kyselina) a proteinů, které ovlivňují a určují fenotyp daného organismu (Snustad, 2009). Máme geny, které nám kódují buněčné složky, jež zajištují samotné provozní funkce buňky. Tyto geny jsou exprimovány neustále a nazývají se konstitutivní geny. Tyto geny mají provozní funkce jako tvorba rRNA (ribozomální RNA), tRNA (transferová RNA) a ribozomové proteiny. Ostatní geny jsou exprimovány pouze v případě potřeby jejich produktů pro růst buňky. Jsou to geny kódující enzymy metabolických drah, které jsou exprimovány pouze za přítomnosti substrátu daného enzymu. Jejich exprese je tedy inducibilní. Naproti tomu geny kódující enzymy anabolických drah bývají vypínány na základě přítomnosti koncového produktu dané dráhy. Jejich exprese je tedy represibilní (Snustad a kol., 2009). Hlavní úlohu v metabolizmu lipidů hrají játra. Ta se velice rychle přizpůsobují přijímanému tuku v potravě (Jump, 2008). Vliv n-3 mastných kyselin na mechanismy genové exprese je prokazatelný, ovšem je velice složitý a zahrnuje více procesů. Jako příklad lze uvést vliv na sterol-regulatory-element-binding protein (SREBPs) a PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor), které jsou velmi důležité při expresi genů řídících lipidovou homeostázu (Deckelbaum a kol., 2006). Byl prokázán vliv EPA a DHA na cyklooxygenázu COX-2 a lipogenázu 5-LOX a na signalizační dráhy pro transkripční faktory PPARα a SREBP a NF-kappa B (nukleární faktor kappa B). Tímto se sníží produkce prozánětlivých cytokinů a eikosanoidů (Komprda, 2012). Aktivací PPARα a následnou redukcí SREBP-2 dochází k celkovému snížení plazmatického cholesterolu (König a kol., 2007). 25
Je také prokázáno, že existuje spojitost mezi ženským hormonem progesteronem a n-3 mastnými kyselinami. Tento hormon zvyšuje biosyntézu n-3 mastných kyselin pomocí exprese genů regulujících mRNA pro tuto dráhu (Sibbons, 2014).
26
4. MATERIÁL A METODIKA 4.1 Pokusná zvířata, podmínky chovu a krmné směsi Pokus byl prováděn v experimentálním zařízení Ústavu výživy zvířat a pícninářství AF Mendelovy univerzity v Brně. Celý pokus probíhal dle zákona na ochranu zvířat proti týrání č. 246/1992 Sb. Jako experimentální model byl určen samec laboratorního potkana outbredního kmene Wistar albino. Tito potkani se zakoupili ve stáří 30 dnů z chovu společnosti BioTest s.r.o., Konárovice. Pokusná zvířata byla rozdělena do tří hmotnostně vyrovnaných skupin po deseti potkanech. Potkani byli umístěni do plastových boxů (53,5 x 32,5 x 30,5) po 5 kusech. Potkani byli do boxů rozdělování tak, aby byli v jednotlivých boxech hmotnostně vyrovnáni. Každý jedinec v boxu, byl jasně označen pro následnou identifikaci daného jedince. Počáteční živá hmotnost byla pro skupinu krmenou s přídavkem světlice barvířské 212,87 ± 26 g, pro KS krmenou rybím olejem 206,98 ± 23 g a pro skupinu krmenou DHA 210,44 ± 35 g. Denně byla zaznamenávána spotřeba krmiva, v týdenních intervalech byla zvířata vážena a barevně značena. V pokusné místnosti byla stálá teplota 23 ± 1°C, vlhkost vzduchu se pohybovala okolo 60 % a světelný režim byl nastaven 12 hodin tma a 12 hodin světlo o intenzitě 200 lx. Potkani byli krmeni kompletní krmnou směsí pro myši a potkany (MYPO) od firmy Biokron, do které bylo přimícháno 6 % oleje ze světlice barvířské (kontrolní skupina SvO) nebo 6 % rybího oleje (pokusná skupina RO) či 6 % extraktu z řasy Schizochytrium (pokusná skupina SchO). Krmivo po přidání oleje můžeme vidět na obrázku č. 8.
27
Obr. č. 8: Krmivo obohacené o DHA, autor: Marek Foltýn Zvířata byla napájena a krmena každý den ad libitum po dobu 42 dní. S vlastním přidáváním olejů se začalo ve věku 130 dní zvířete. Základní složení krmné směsi byla: pšenice, oves, pšeničné klíčky, sójová moučka, extrudovaná sója, kukuřice, sušené mléko, sušené syrovátky, sušené kvasnice, mletý vápenec, dihydrogenfosforečnan vápenatý, chlorid sodný, L-lyzin a premix vitamínů a minerálních látek. Experimentální krmné směsi byly vytvořeny smícháním základní směsi s přídavkem 6 % světlice barvířské pro negativní kontrolní skupinu, 6 % rybího oleje pro druhou skupinu a 6 % extraktu z řasy Schizochytrium pro třetí skupinu. Celkové zastoupení krmných směsí je zobrazeno tabulkou č. 3. Tab. 3: Obsah PUFA n-3 a n-6 v olejích přidávaných do krmiva potkanů. (v % z celkového množství MK). Mastná kyselina Linolová (n-6) α-Linolenová (n-3) Arachidonová (n6) EPA (n-3)
Olej z řasy Schizochytrium 5,9
9,5
Olej ze světlice barvířské 61,7
0,4
1,4
0,4
0,7
0,8
0,5
0,9
8,5
0,5
Rybí olej
DHA (n-3) 32,3 11,2 1,4 EPA (kyselina eikosapentaenová), DHA (kyselina dokosahexaenová)
28
4.2. Použité chemikálie hexan/2-propanol (HIP1) v poměru 3:2 a (HIP 2) poměru 7:2 roztok síranu sodného (66,6 g bezvodé soli na 1000 ml vody) bezvodý síran sodný vnitřní standard (C15:0, koncentrace 1 mg/ml v isooktanu, Supelco) BHT (butylhydroxytoluen, 1 % roztok v metanolu, Sigma) 0,5 M methanolátu sodného (1,15 g Na/ 100 ml metanolu) fluorid boritý (14 %) isooktan NaCl
4.3. Použité přístroje Injekční jehly jednorázové (Dispolab, Česká republika) Injekční stříkačky (Dispolab, Česká republika) Heparinové zkumavky (Vacutest, Itálie) Automatický analyzátor BS-200 (Mindray, Čína) Homogenizér FastPrep (Thermo Savant, USA) Zkumavky Eppendorf (Thermo Scientific, Velká Británie) Pipety Finnpipette F1 (Thermo Scientific, Velká Británie) Centrifuga Mikro 120 (Hettich, Tuttlingen, Německo) Spektrofotometr NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA) Thermocykler 7500 Real-Time PCR Systém (Applied Biosystems, USA) Sekvenátor ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA) Plynový chromatograf Fision GC 8000 series
29
4.4 Odběr vzorků pro stanovení cholesterolu a mastných kyselin Po ukončení pokusu, tedy po 42 dnech a po 12-ti hodinovém vylačnění byla pokusná zvířata uspána a následně usmrcena pomocí inhalace anestetika Isofluran. Následně jim byl pomocí punkcí do srdce odebrán vzorek krve do heparinových zkumavek (Dispolab). Odběr vzorku punkcí můžeme vidět na obrázku č. 9.
Obr. č. 9: Odběr vzorku krve, autor: Marek Foltýn Z těchto vzorků byla stanovena celková koncentrace TAG a cholesterolu a jednotlivé frakce cholesterolu. Následně byly odebrány vzorky jater, viscerálního tuku a svaloviny ze zadní končetiny. Odběr vzorku svaloviny můžeme vidět na obrázku č.10
Obr č. 10: Odběr vzorku svaloviny, autor: Marek Foltýn 30
Z každého pokusného zvířete byly odebrány dva vzorky z každé tkáně. Takto odebrané vzorky můžeme vidět na obrázku č. 11. Ze vzorků bylo stanoveno celkové zastoupení mastných kyselin v dané tkáni. Části vzorku jater se odebraly na genovou analýzu. Vzorek jater můžeme vidět na obrázku č. 12
Obr. 11: Odebrané vzorky tkání, autor: Marek Foltýn
Obr 12: Vzorek jater, autor: Marek Foltýn
31
4.5 Stanovení TAG, celkového cholesterolu a jeho jednotlivých frakcí ve vzorku. Stanovení TAG, celkového cholesterolu a jeho frakcí HDL a LDL z krevní plazmy probíhalo ihned po odebrání vzorků. Vzorky byly až do samotné analýzy uskladněny v termoboxu s ledem. Koncentrace daných složek byla stanovena enzymatickokolorimetrickou metodou na automatickém analyzátoru BS-200 (Co. Mindray, China). Přístroj je řízen softwarem BS-200 (Co. Mindray, China). V tomto přístroji jsou roztoky a vzorky umístěny na chlazeném disku, kde je teplota udržována na hodnotě 4 °C. Jednotlivé vzorky jsou automaticky pipetovány do plastových kyvet s optickou dráhou 0,5 cm. Inkubace probíhá v kyvetovém prostoru při 37 °C. Mezi jednotlivými vzorky jsou dávkovací jehly automaticky promývány destilovanou vodou.
4.6 Stanovení mastných kyselin 4.6.1 Příprava vzorku Ze vzorků tkáně jater, tuku a svaloviny byla pomocí lyofilizace odstraněna volná i vázaná voda. Jednotlivé vzorky tkání potkanů o hmotnosti pro svalovinu 15g, pro viscelární tuk 8 g a játra 15 g byly umístěny do hliníkových misek a rozkrájeny na kousky o velikosti 0,2 cm. Následně byly zmrazeny na teplotu -30 °C. Vlastní lyofilizace proběhla na přístroji Alpha 1-2 LO (Christ, Labicom, Česká republika). Nastavení hlavního programu lyofilizace pro tukovou a jaterní tkáň bylo na teplotu 45°C po dobu 24 hodin, dosušování probíhalo po dobu 3 hodin při teplotě – 50 °C a pod tlakem 4-7 Pa. Vzorky svalové tkáně byly sušeny při teplotě – 45 °C po dobu 30 hodin a dosušeny při – 50 °C po dobu 3 hodin při tlaku 4- 7 Pa. 4.6.2 Extrakce tuku Extrakce probíhala z 5 g pro všechny vzorky tkání potkanů. K jednotlivým vzorkům bylo přidáno 15 ml směsi rozpouštědel HIP1 (hexan/ 2-propanol v poměru 3:2). Tyto vzorky byly homogenizovány na desintegrátoru model D56 (HRIDorf. Německo). Následně se vzorky převedly do 150 ml Erlenmayerovy baňky a směs byla umístěna na 15 minut do ultrazvuku PS10000 (Notus-Powersonic, Vráble, Slovakia). Následně byly vzorky přefiltrovány přes Büchnerovu nálevku. Do filtrátu bylo přidáno 24 ml síranu sodného (66,6 g bezvodé soli na 1000 ml vody). Směs byla promíchávána po dobu 3 minut v dělící nálevce. Následně byla směs ponechána ustát, aby došlo k úplnému 32
oddělení hexanové vrstvy, která byla převedena do 50 ml odměrné baňky. Do vodné části bylo přidáno 10 ml HIP2 (hexan/2-propanol v poměru 7:2) a vodná část byla reextrahována. Druhá hexanová vrstva byla převedena k první vrstvě do 50 ml odměrné baňky. Odebraný vzorek hexanových vrstev byl převeden do 50 ml odběrné baňky a následně zfiltrován přes 0,5 g bezvodého síranu sodného do extrakční baňky. Rozpouštědlo bylo ze vzorku odpařeno na vakuové odparce (RV 05-ST 1P-B model, IKA Labrtechnik, Německo) při teplotě 40 °C. Zbytky rozpouštědla byly ze vzorku odstraněny pomocí dusíku. 4.6.3 Derivatizace vzorku Kvůli použití měření pomocí plynové chromatografie je nutné nejprve vzorky derivatizovat. Derivatizací dojde ke vzniku methylesterů mastných kyselin. Vzniklé estery karboxylových kyselin jsou těkavější než samotné mastné kyseliny, proto jsou pro stanovení plynovou chromatografií vhodnější. Methylestery byly připraveny bazicky katalizovanou reakcí, tedy reakcí kyseliny s metanolem v katalytickém prostředí vytvořeném Lewisovými kyselinami (BF3). Alikvot o hmotnosti 50 mg z extrahovaných lipidů jsme smíchali v 50 ml extrakční baňce se zábrusem a rovným dnem s 3 ml vnitřního standardu (C 15:0, koncentrace 1 mg/ml v isooktanu, Supelco), s 1 ml BHT (butylhydroxytoulen, 1 % roztok v metanolu, Sigma) pro prevenci oxidace mastných kyselin. Byly přidány 2 ml 0,5M methanolátu sodného (1,15 g Na/ 100 ml metanolu). Následně byla směs zahřívána pod zpětným chladičem ve vodní lázni při 60 ˚C po dobu 5 minut. Přes zpětný chladič byl přidán methanolický roztok fluoridu boritého (14 %, 2 ml) a směs se zahřívala dalších 5 minut. Následně byla směs odstavena a bylo přidáno 2 ml isooktanu. Poté byla směs důkladně protřepána po dobu 15 sekund. Po 1 minutě stání bylo přidáno 5ml nasyceného roztoku NaCl a směs opět důkladně protřepána (15 sekund). Po úplném vychladnutí došlo k oddělení organické vrstvy (5 ml), která byla odebrána do vialky pro následné stanovení v plynovém chromatografu.
33
4.6.4 Měření vzorků tuku na plynovém chromatografu Na určení zastoupení MK ze vzorků byl použit plynový chromatograf Fision GC 8000 series. Stanovení probíhalo na koloně Db-23 (60m x 0,25 mm x 0,25 μm Agilent Technologies J&W Scientific, USA). Injektor byl vyhříván na teplotu 260 °C, detektor (FID) byl vyhříván na teplotu 275 °C. Teplotní program byl nastaven na 150 °C s výdrží 1 min. Gradient byl 10 °C/ min. až do teploty 200 °C, kde byla zádrž 1 minuta a následně byl gradient 3 °C/ min do teploty 260 °C s výdrží po dobu 15 minut. Jako nosný plyn jsme použili dusík s průtokem 1 ml/min. a pod tlakem 145 kPa se splitem v poměru 60:1. Nástřik jsme zvolili 1 μl. Pro identifikaci FAME byl použit standard PUFA No. 2, 47015-U (Supelco, Bellefonte, USA). 4.6.5 Statistické vyhodnocení výsledků Vyhodnocení výsledků získaných stanovením mastných kyselin v jednotlivých vzorcích tukové, svalové a jaterní tkáně jsme provedli v programu Statistika 10 (StarSoft Inc., Tulsa, USA). Rozdíly byly posuzovány pomocí jednostupňového třídění analýzy rozptylu včetně testování kontrastů Tukeyovým testem.
34
5 VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUZE 5.1 Příjem krmiva a změny hmotnosti pokusných zvířat Příjem krmiva u pokusných zvířat probíhal dobře, průměrný příjem potravy pro skupinu SvO byl 23,80 g.den -1 pro skupinu RO 23,16 g.den-1 a pro skupinu SchO 23,27 g.den-1. Rozdíl mezi příjmy krmiva byl statisticky neprůkazný (p>0,05). U skupiny SchO byla pozorována větší agresivita při krmení. Přidáním olejů do krmiva nedošlo k výrazné změně hmotnosti potkanů ani konečné hmotnosti jater. Různé složení krmiv pro jednotlivé skupiny nemělo vliv na průměrný přírůstek potkanů po dobu trvání pokusu, který byl pro skupinu SvO 5,42 ± 0,5 g.den
-1
pro skupinu RO 5,32 ±
0,64 g.den-1 a pro skupinu SchO 5,47 ± 0,55 g.den-1. Konečná hmotnost pro skupinu SvO byla průměrně 429,48 g, pro skupinu RO 419,96 g a pro skupinu SchO 429,04 g.
5.2 Koncentrace celkového cholesterolu, HDL-cholesterolu a LDLcholesterolu a TAG Koncentrace celkového cholesterolu, HDL cholesterolu, LDL cholesterolu a TAG byla vypočítána z průměru deseti vzorků z každé skupiny. Tyto hodnoty jsou znázorněny v tabulce č. 4.
35
Tab. 4: Naměřené hodnoty koncentrací HDL cholesterolu, LDL cholesterolu, TAG a celkového cholesterolu.
Skupina
Označení vzorku
Cholesterol mmol/l
SvO SvO SvO SvO SvO SvO SvO SvO SvO SvO RO RO RO RO RO RO RO RO RO RO SchO SchO SchO SchO SchO SchO SchO SchO SchO SchO
1LP 1LZ 1RP 1RZ 1O 2LP 2LZ 2RP 2RZ 2O 3LP 3LZ 3RP 3RZ 3O 4LP 4LZ 4RP 4RZ 4O 5LP 5LZ 5RP 5RZ 5O 6LP 6LZ 6RP 6RZ 6O
1,32 1,59 1,46 1,25 1,15 1,35 1,51 1,21 1,22 1,42 0,90 1,09 1,01 1,08 1,00 0,89 0,91 1,02 0,97 0,98 1,05 0,97 0,90 0,92 1,02 0,94 1,12 1,00 0,81 1,08
HDL cholesterol mmol/l 0,44 0,45 0,39 0,41 0,33 0,35 0,48 0,34 0,36 0,44 0,26 0,31 0,34 0,35 0,33 0,30 0,31 0,34 0,32 0,30 0,35 0,32 0,30 0,31 0,32 0,31 0,32 0,33 0,27 0,30
LDL cholesterol mmol/l 0,72 0,85 0,92 0,83 0,84 0,88 0,98 0,82 0,85 0,87 0,62 0,73 0,65 0,70 0,65 0,58 0,59 0,66 0,64 0,67 0,69 0,64 0,59 0,60 0,64 0,59 0,75 0,65 0,54 0,75
TAG mmol/l 1,64 1,23 1,96 1,54 1,02 1,00 1,16 2,14 1,71 1,43 1,84 1,13 1,36 1,83 2,10 1,50 1,10 1,34 0,93 1,36 0,70 0,43 0,65 0,58 0,99 0,54 0,77 0,53 0,71 0,92
SvO- kontrolní skupina s přídavkem oleje světlice barvířské, RO- skupina s přídavkem rybího oleje, SchO-skupina s přídavkem oleje z řasy Schizochytrium , 1LP (1-číslo skupiny, L-levá, R-pravá, P-přední končetina, Z-zadní končetina, O-ocas); TAGtriacylglyceroly
36
Průměrná koncentrace celkového cholesterolu, TAG, HDL cholesterolu, LDL cholesterolu v krvi potkanů je znázorněna v grafu č. 1.
1,80
a
1,60 1,40
a
a
mmol/L
1,20 1,00
b b
SvO
a 0,80
b
b b
RO SchO
0,60
a
0,40
b b
0,20 0,00
cholesterol
HDL
LDL
TAG
Graf. 1: Obsah celkového cholesterolu, LDL cholesterolu, HDL cholesterolu a TAG v krvi potkanů. SvO – 60 g oleje světlice barvířské v 1 kg krmiva (kontrolní skupina), RO – 60 g rybího oleje v 1 kg krmiva; SchO – 60 g oleje z řasy Schizochytrium v 1 kg v krmivu. a, b– průměry označené různými písmeny se liší na hladině P < 0,05 (jednoduché třídění analýzy rozptylu, post hoc Tukeyův test, n=10) Očekávali jsme, že u skupin s přídavkem PUFA, tedy rybího oleje a oleje z řasy Schizochytrium dojde ke snížení koncentrace celkového cholesterolu, TAG a LDL cholesterolu. U hladiny HDL jsme předpokládali mírný nárůst, ke kterému nedošlo. Naopak došlo ke snížení HDL. Podle autorů König a kol. (2007) by mohl být cholesterol v plazmě snížen jako následek aktivace PPARα a redukci SREBP-2, což vede ke snížení biosyntézy cholesterolu. U daných transpkripčních faktorů jsou modulovány působením EPA a DHA (Takahashi, 2011). Tyto rozdíly mohly být
37
způsobeny nízkou koncentrací EPA a DHA, případně tím, že metabolizmus lipidů je ovlivněn ještě dalšími faktory, které nebyly sledovány. Snížení celkové hladiny cholesterolu (P˂0,05) se u obou skupin se zýšeným množstvím n-3 potvrdilo. U skupiny RO i SchO došlo ke snížení o 27 % ve srovnání s kontrolní skupinou. U koncentrace TAG došlo k výraznému snížení pouze u skupiny SchO (P˂0,05), a to o 54 %, což přesahuje polovinu hodnoty kontrolní skupiny SvO. U skupiny RO nastalo jen velmi malé snížení, a to jen o 2 %. Došlo také ke snížení LDL cholesterolu u obou skupin o 25 %. Ovšem nastalo také nežádoucí snížení HDL frakce cholesterolu oproti kontrolní skupině u skupiny RO o 21% a u skupiny DHA o 22 % v porovnání se skupinou SvO (P˂0,05). V našem pokusu byla naměřena hodnota cholesterolu pro skupinu RO 0,98 ± 0,068 mmol.l-1. V porovnání s jinými podobnými pokusy se námi naměřená hladina cholesterolu
pohybuje
v průměrných
hodnotách.
Přehled
hodnot
naměřeného
cholesterolu v podobných experimentech uvádí tabulka č. 6. Tab. 6 Hodota choesterolu ve studiích Zdroj
Hodnota mmol/l
Popovic a kol., 2012
0,54
Barross a kol, 2012
1,87
Ferramosca a kol., 2012
2,45
Rossmeisl a kol., 2014
2,60
Lu a kol., 2011
3,22
Koncentrace HDL-cholesterolu u pokusné skupiny RO byla 0,32 ± 0,026 mmol.l-1. V porovnání s jinými podobnými pracemi se námi naměřená hodnota pohybuje ve spodní hranici průměru. Hodnoty naměřené v jiných experimetech se však také často velmi liší. Přehled koncentrací nalezneme v tabulce č. 7. Snížení hodnoty HDL si vysvětlujeme tím, že stále ještě neznáme všechny mechanizmy homeostázy cholesterolu. Výsledky vlivu rybího oleje na hodnotu HDL cholesterolu je velmi rozporuplný i z hlediska jiných studií. V jiných studiích došlo i k výraznému poklesu HDL po suplementaci rybího oleje (Kamisako a kol., 2012 ; Takahashi, 2011). V jiných studií přidání rybího oleje nemělo na hladinu HDL vliv (Campioli a kol., 2012). A 38
máme i studie, ve kterých došlo po přidání rybího oleje do krmiva k nárůstu HDL cholesterolu (Popovic a kol., 2011). Tab 7. Hodnota HDL
Hodnota mmol/l
cholesterolu ve studiíchZdroj Popovic a kol., 2012
0,23
Campioli a kol, 2012
0,81
Hosomi a kol., 2013
1,08
Lu a kol., 2011
1,42
Rossmeisl a kol., 2014
1,91
Koncentrace LDL cholesterolu byla v našem pokusu 0,64 ± 0,045 mmol.l-1. Tato hodnota se také pohybuje v rámci průměru ve srovnání s jinými podobnými pracemi. Stejně jako ve frakci HDL se hodnoty v jednotlivých pracích velmi liší. Přehled těchto prací můžeme vidět v tabulce č. 8. Rozdíly ve výsledných hodnotách jednotlivých studií jsou jistě dány rozdílnou metodikou, která byla použita u jednotlivých pokusů. Jeden z příkladů může být rekalibrace přístrojů, které jsou určeny pro zpracování lidských vzorků. Tab. 8 Hodoty LDL cholesterolu ve studií. Zdroj
Hodnota mmol/l
Popovic a kol., 2012
0,17
Park a kol., 2009
0,49
Lu a kol., 2011
1,11
Ferramosa a kol., 2012
1,11
39
5.3 Zastoupení jednotlivých mastných kyselin v jaterní tkáni Koncentrace jednotlivých mastných kyselin je zobrazena v grafu č. 2.
Graf 2: Koncentrace jednotlivých MK v jaterní tkáni. SvO – 60 g oleje světlice barvířské v 1 kg krmiva (kontrolní skupina), RO – 60 g rybího oleje v 1 kg krmiva; SchO – 60 g oleje z řasy Schizochytrium v 1 kg v krmivu. a, b, c – průměry označené různými písmeny se liší na hladině P < 0,05 (jednoduché třídění analýzy rozptylu, post hoc Tukeyův test, n=10) Z grafu vyplývá, že kyselina palmitová se v jaterní tkáni nacházela v nejvyšší koncentraci z SAFA. Průměrná koncentrace ze všech tří skupin byla 888,74 mg/100 g. Tato hodnota představovala třetí největší průměrnou koncentraci v rámci MK v jaterní tkáni. Největší koncentraci měla ve skupině RO (1033,25 mg/100 g), následně ve skupině SchO (861,31 mg/100g) a nejnižší koncentraci měla ve skupině SvO (771,67 mg/100g). Poudyal a kol. (2013) došel k výsledku, že sledovaná skupina potkanů krmená kukuřičným škrobem s přídavkem oleje DHA, měla obsah kyseliny palmitové v kontrolní skupině 25,9 % což je nárůst (p˂0,05) o 25,87 % oproti kontrolní skupině (0,03 %). Představitel MUFA v našem pokusu, byla kyselina olejová, její průměrná koncentrace ze všech tří skupin byla 388,75 mg/100g. Její koncentrace ve skupině RO byla 499,53 mg/100g, ve skupině SchO (399,28 mg/100g), nejnižší koncentraci jsme naměřili v kontrolní skupině SvO (267,43 mg/100g). Ve studii Pavlovič a kol. (2012) došlo u sledované skupiny po suplementaci rybího oleje (45 mg EPA a 30 mg DHA), k nárůstu (p>0,05) obsahu kyseliny olejové o 17 % oproti kontrolní skupině. 40
V našem pokusu měla největší průměrnou koncentraci z PUFA v jaterní tkáni kyselina linolová (848,21 mg/100g). Vysoká zastoupení dané kyseliny byla stanovena i v ostatních podobných studiích (Pavlovič a kol. (2012), Poudyal a kol. (2013). V našem pokusu byla největší koncentrace kyseliny linolové, dle předpokladů, v kontrolní skupině SvO (1271,79 mg/100g), ve skupině RO byla koncentrace výrazně nižší (717,56 mg/100g). Nejnižší výskyt kyseliny linolové byl v kontrolní skupině SchO (555,29 mg/100g). Ve studii Pavlovič a kol. (2012), byla kyselina linolová více obsažena (p˂0,01) v pokusné skupině (2,9 %) oproti kontrolní skupině. V pokusu provedeném Poudyal a kol. (2013), došlo stejně jako v našem pokusu, k poklesu (p˂0,05) zastoupení kyseliny linolové ve sledované skupině o 17,7 % oproti kontrolní skupině. Kyselina arachidonová
měla v našem pokusu průměrnou koncentraci ze
všech tří skupin 680,94 mg/100g, což byla třetí nejvyšší průměrná koncentrace ze všech MK v játrech. Nejvyšší koncentraci měla v kontrolní skupině SvO (778,59 mg/100g), nižší pak ve skupině SchO (609,91 mg/100g) a nejnižší ve skupině RO (354,33 mg/100g). Vyšší zastoupení měla kyselina arachidonová také v práci Tamai a kol. (2007), kde v kontrolní skupině potkanů, krmených kukuřičným škrobem s přídavkem DHA oleje přímo do žaludku, byla naměřena hodnota 10 %, což je o 3,9 % nižší (p˂0,05) hodnota, než u kontrolní skupiny (13,9 %). V našem pokusu byla průměrná koncentrace ze všech tří skupin pro kyselinu DHA v jaterní tkáni 420,99 mg/100g.Nejvyšší koncentrace byla, dle předpokladů, ve skupině SchO (608,56 mg/100g), nižší koncentraci jsme naměřili ve skupině RO (571,20 mg/100g) a nejnižší koncentrace byla naměřena v kontrolní skupině SvO (83,22 mg/100g). V našem pokusu došlo k výraznému navýšení této kyseliny oproti kontrolní skupině. Ve studii Pavlovič a kol. (2012) došlo jen k velmi malému navýšení (p>0,05) kyseliny DHA u sledované skupiny s přídavkem rybího oleje (0,1 %), oproti kontrolní skupině. Ve studii Poudyal a kol. (2013) a Tamai a kol. (2007) došlo u kyseliny DHA také k výraznému navýšeni (p˂0,05) u sledované skupiny (přídavek DHA do krmiva), oproti kontrolní skupině. V našem pokusu měla kyselina EPA průměrnou koncentraci ze všech tří skupin (141,22 mg/100g). Nejvyšší koncentrace této kyseliny byla ve skupině RO (342,25 g/100g). Výrazně nižší koncentrace EPA byla naměřena ve skupině SchO (78,24 mg/100g). V kontrolní skupině SvO byla EPA v koncentraci pouze 3,17 mg/100g. V našem pokusu tedy došlo k celkovému navýšení EPA ve sledovaných skupinách. K navýšení (p˂0,05) EPA u sledovaných skupin oproti kontrolní skupině, došlo také ve studii Pavlovič a kol. 41
(2012). V našem pokusu byla průměrná koncentrace kyseliny α-linolenové ze všech tří skupin 18,50 mg/100g. Nejvyšší koncentrace této kyseliny byla naměřena ve skupině RO (28,50 mg/100g), ve skupině SchO byla naměřena koncentrace kyseliny αlinolenové 17,16 mg/100g. U kontrolní skupiny SvO jsme naměřili koncentraci 9,83 mg/100g. U kyseliny α-linolenové došlo ve studii Poudyal a kol. (2013) k poklesu (p˂0,05) ve sledované skupině o 7,5 %, oproti kontrolní skupině. V tabulce 10. jsou uvedeny koeficienty korelace MK stanovených v jaterní tkáni s hladinami
celkového
plazmatického
cholesterolu,
HDL-cholesterolu,
LDL
cholesterolu a TAG. Tyto hodnoty nám udávají vztah mezi obsahem dané mastné kyseliny s plazmatickými lipidy. Tab.
10:
Koeficienty
korelace
MK
v jaterní
tkáni
potkanů
s celkovým
plazmatickým cholesterolem, HDL cholesterolem, LDL cholesterolem a TAG
hodnoty v (mmol/l) Celkový plazmatický cholesterol HDL LDL TAG
myristová C14:0
palmitová C16:0
stearová C18:0
-0,396423
-0,478393
-0,399165
linolová C18:2n-6
linolenová C18:3n-3
-0,480318
0,709621
-0,526156
-0,348600
0,696329
-0,409016
-0,592686
0,608520
-0,588514
0,477908 eicosadienová arachidonová EPA C20:2 C20:4n-6 C20:5n-3
Celkový plazmatický cholesterol HDL LDL TAG
olejová C18:1
0,486024 DPA C22:5n-3
DHA C22:6n-3
0,856396
0,577225 -0,539180
-0,530635
-0,730801
0,773385
0,545155 -0,457485
-0,446690
-0,626129
0,809187
0,541232 -0,530226
-0,521932
-0,726442
0,422378
-0,381738
Koeficienty korelace lišící se na hladině P<0,01; n=10; DHA-kyselina dokosahexaenová, EPA-kyselina eikosapentaenová, DPA- kyselina dokosapentaenová, HDL- HDL cholesterol, LDL-LDL cholesterol, TAG-triacylglyceroly Pro jednotlivé kyseliny z SAFA by mělo být typické zvyšování celkového cholesterolu i TAG. Je velmi zajímavé, že v našem pokusu kyselina myristová i 42
kyselina palmitová byly v negativním vztahu (p˂0,01) k hladině LDL cholesterolu. Mezi kyselinou myristovou a hladinou celkového plazmatického cholesterolem je záporný vztah. Kyselina stearová by měla působit na TAG a hladinu cholesterolu neutrálně. V našem pokusu měla pozitivní vliv (p˂0,01) na hladinu TAG. I když jde jen o malé hodnoty, je překvapivé, že došlo spíše k redukci cholesterolu pomocí SAFA, než k jeho nárůstu. Kyselina olejová je v poslední době velmi diskutovaná kyselina. V některých studiích, byl prokázán vliv na snížení hladiny cholesterolu s nárůstem HDL části. U použití rybího oleje nám dochází spíše k redukci HDL cholesterolu, než k jeho nárůstu. V našem pokusu měla kyselina olejová negativní (p˂0,01) vztah s hladinou LDL, HDL a celkovou hladinu plazmatického cholesterolu. Mastné kyseliny řazené do PUFA by měly mít redukující vliv na hladinu celkového cholesterolu, LDL cholesterolu a TAG a podporující vliv na HDL cholesterol. Je zajímavé, že v našem pokusu měly spíše pozitivní vliv (p˂0,01) na hladinu TAG i celkového plazmatického cholesterolu. Toto tvrzení platí pro kyseliny linolovou a eikosadienovou. Kyselina α-linolenová, EPA, DPA měli negativní vliv(p˂0,01) na celkovou hladinu plazmatického cholesterolu. DHA měla negativní vztah se všechny sledovanými frakcemi (celkový plazmatický cholesterol, LDL, HDL i TAG).
5.4 Zastoupení mastných kyselin ve svalovině Koncentraci jednotlivých MK ve svalovině potkanů můžeme vidět v grafu 3.
43
Graf 3. Přehled MK obsažených ve svalové tkáni potkanů SvO – 60 g oleje světlice barvířské v 1 kg krmiva (kontrolní skupina), RO – 60 g rybího oleje v 1 kg krmiva; SchO – 60 g oleje z řasy Schizochytrium v 1 kg v krmivu. a, b, c – průměry označené různými písmeny se liší na hladině P < 0,05 (jednoduché třídění analýzy rozptylu, post hoc Tukeyův test, n=10)
Ze SAFA měla opět nejvyšší koncentraci kyselina palmitová, která měla průměrnou koncentraci ve všech třech skupinách 7,57 mg/100g. Nejvyšší koncentrace této kyseliny byla ve skupině SchO (8,89 mg/100g) nižší ve skupině RO (8,42 mg/100g) nejnižší koncentraci jsme naměřili v kontrolní skupině SvO (5,40 mg/100g). Ovšem ve studii Poudyal a kol. (2013), bylo stanoveno výrazně vyšší (p˂0,05) množství kyseliny palmitové ve sledované skupině (31,4 %) než v kontrolní skupině (0,6 %). Což byl zcela opačný výsledek než v našem pokusu. Pro kyselinu stearovou byla v našem pokusu naměřena průměrná koncentrace pro všechny tři skupiny 1,51 mg/100g. Koncentrace kyseliny stearové ve skupině RO byla (1,55 mg/100g), nižší koncentraci jsme naměřili pro skupiny SchO (1,52 mg/100g) a nejnižší koncentrace byla naměřena pro kontrolní skupinu SvO (1,47 mg/100g). Výraznější rozdíl, mezi kontrolní a sledovanou skupinou, byl naměřen i ve studii Poudyala kol. (2013), kde byla také zaznamenána vyšší hodnota (p˂0,05) kyseliny steartové u sledované skupiny (5,9 %) oproti kontrolní skupině (0,3 %). Skupinu MUFA máme v našem pokusu zastoupenou kyselinou olejovou. Tato kyselina měla třetí nejvyšší průměrnou koncentraci z MK ve svalovině. Průměrná koncentrace všech tří skupin je 6,38 mg/100g . Nejvyšší koncentrace byla naměřena ve skupině SchO (7,60 mg/100g). Z PUFA, i z celkového množství MK ve svalovině, měla nejvyšší průměrnou koncentraci kyselina linolová (10,36 mg/100g). Nejvyšší koncentrace byla naměřena u kontrolní skupiny SvO (14,13 mg/100g). Ve skupině RO byla naměřena koncentrace 8,7 mg/100g a nejnižší koncentrace byla naměřena ve skupině SchO (8,24 mg/100g). Ve studii Poudyal a kol. (2013), došlo stejně jako v naší práci, k poklesu (p˂0,05) kyseliny linolové ve sledované skupině (11,3 %) oproti kontrolní (36,6 %) ve svalovině potkanů. V našem pokusu měla druhou nevyšší průměrnou koncentraci, ze všech tří 44
skupin, pro PUFA kyselina DHA (2,58 mg/100g). Nejvyšší naměřená koncentrace této kyseliny byla ve skupině SchO (5,12 mg/100g). Výrazně nižší koncentraci jsme naměřili ve slupině RO (2,22 mg/100g). Ve skupině SvO byla koncentrace kyseliny DHA téměř zanedbatelná (0,39 mg/100g). Ve studii Poudyal a kol. (2013), došlo také k velkému nárůstu (p˂0,05) kyseliny DHA ve sledované skupině (9,4 %), oproti kontrolní skupině (0,3 %). V našem pokusu byla průměrná naměřená hodnota, ze všech tří skupin, pro kyselinu arachidonovou 0,98 mg/100g. Nevyšší koncentrace byla naměřena v kontrolní skupině SvO (1,18 mg/100g). Nižší koncentrace kyseliny arachidonové byla naměřena ve skupině SchO (1,15 mg/100g) a nejnižší ve skupině RO (0,62 mg/100g). Průměrná naměřená koncentrace, ze všech tří skupin, pro kyselinu αlinolenovou byla 0,34 mg/100g s nejvyšší naměřeno koncentrací ve skupině RO (0,47 mg/100g), následně ve skupině SchO (0,34 mg/100g) a koncentrace byla naměřena v kontrolní skupině SvO (0,22 mg/100g). Průměrná naměřená koncentrace ze všech tří skupin pro kyselinu EPA byla 0,26 mg/100g. Nejvyšší koncentrace této kyseliny byla naměřena ve skupině RO (0,59 mg/100g). Méně než poloviční koncentrace oproti skupině RO byla naměřena ve skupině SchO (0,60 mg/100g) a téměř zanedbatelná koncentrace kyseliny EPA byla naměřena pro kontrolní skupinu SvO (0,02 mg/100g). Korelace koncentrace jednotlivých MK obsažených ve svalovině s celkovou hladinou cholesterolu, HDL cholesterolem, LDL cholesterolem a TAG, můžeme vidět v tabulce č. 12.
45
Tab. 12: Koeficienty korelace MK ve svalové tkáni potkanů s celkovým plazmatickým cholesterolem, HDL cholesterolem, LDL cholesterolem a TAG
hodnoty v (mmol/l) Celkový plazmatický cholesterol HDL LDL TAG
myristová C14:0
palmitová C16:0
-0,711774
-0,522006
0,435808
-0,573152
-0,405803
0,397537
-0,729607
-0,522967
0,475019
-0,422778
-0,371147
-0,376265
EPA C20:5n-3
DPA C22:5n-3
-0,484452
-0,522255
-0,517902
-0,678047
-0,358831
-0,408587
-0,421874
-0,579864
-0,490263
-0,529131
-0,491729
-0,690736
linolenová C18:3n-3
Celkový plazmatický cholesterol HDL LDL TAG
Koeficienty
olejová C18:1
linolová C18:2n-6
DHA C22:6n-3
-0,699921
korelace
lišící
se
na
hladině
P<0,01;
n=10;
DHA-kyselina
dokosahexaenová, EPA-kyselina eikosapentaenová, DPA- kyselina dokosapentaenová, HDL- HDL cholesterol, LDL-LDL cholesterol, TAG-triacylglyceroly Je opět zajímavé, že koncentrace kyselin zastupující SAFA měly v našem pokusu negativní vliv (p˂0,01) na hladinu celkového cholesterolu i TAG. Toto tvrzení platí pro kyselinu palmitovou i myristovou. Ze skupiny MUFA zde máme kyselinu olejovou, která měla prokazatelně pozitivní vliv na snížení hladiny (p˂0,01) TAG. Ze skupiny PUFA měla nečekaný vliv kyselina linolová. Tato kyselina měla pozitivní vliv (p˂0,01) na TAG. Standardně se nám zde projevila kyselina α-linolenová, EPA, DPA a DHA které měly pozitivní vliv (p˂0,01) na celkovou hladinu plazmatického cholesterolu, HDL i LDL. Pozitivní vliv (p˂0,01) na hladinu TAG měla z PUFA pouze DHA.
46
5.5 Zastoupení mastných kyselin v tuku Koncentrace jednotlivých kyselin z tukové tkáně potkanů nám zobrazuje graf 4.
Graf 4. Poměry jednotlivých MK z tukové tkáně potkanů SvO – 60 g oleje světlice barvířské v 1 kg krmiva (kontrolní skupina), RO – 60 g rybího oleje v 1 kg krmiva; SchO – 60 g oleje z řasy Schizochytrium v 1 kg v krmivu. a, b, c – průměry označené různými písmeny se liší na hladině P < 0,05 (jednoduché třídění analýzy rozptylu, post hoc Tukeyův test, n=10) Z grafu vyplívá, že nejvyšší koncentraci ze všech tří skupin pro SAFA měla kyselina palmitová. Tato hodnota byla také třetí nejvyšší pro veškeré koncentrace MK v tuku. Nejvyšší koncentraci této kyseliny jsme naměřili pro skupinu SchO (166,62 mg/100g). Nižší koncentraci měla kyselina palmitová ve skupině FO (161,25 mg/100g) a nejnižší koncentrace byla naměřena v kontrolní skupině SvO 129,52 mg/100g. Kyselina stearová měla průměrnou koncentraci ze všech tři skupin 16,53 mg/100g. Ve skupině RO měla koncentraci 17,60 mg/100g ve skupině SchO 16,65 mg/100g a konečná nejnižší koncentrace byla naměřena pro kontrolní skupinu SvO 15,35 mg/100g. MUFA představuje kyselina olejová. Tato kyselina měla průměrnou koncentraci ze všech tří skupin 182,13 mg/100g. Nejvyšší koncentrace této kyseliny byla ve skupině RO
(208,15mg/100g)
nižší
koncentraci 47
jsme
naměřili
ve
skupině
SchO
(184,23 mg/100g)
a
nejnižší
koncentraci
jsme
naměřili
ve
skupině
SvO
(154,00 mg/100g). Nejvyšší průměrnou koncentraci ze všech tří skupin z MK pro tuk měla kyselina linolová (210,15 mg/100g). Nejvyšší koncentrace této kyseliny byla, dle očekávání, naměřena v kontrolní skupině SvO (276,39 mg/100g). Ve skupině RO byla naměřena koncentrace 179,28 mg/100g a pro skupinu SchO 174,76 mg/100g. Průměrná koncentrace ze všech tří skupin pro kyselinu DHA je 23,03 mg/100g.
Nejvyšší
koncentrace této kyseliny byla naměřena ve skupině SchO (55,47 mg/100g) výrazně nižší koncentrace byla naměřena ve skupině RO (15,54 mg/100g) a téměř zanedbatelná koncentrace byla naměřena v kontrolní skupině SvO (0,48 mg/100g). Kyselina arachidonová měla průměrnou koncentraci ze všech tří skupin 3,13 mg/100g. Nejvyšší koncentrace této kyseliny byla naměřena ve skupinách SchO a RO (3,51mg/100g). V kontrolní skupině
SvO byla naměřena koncentrace kyseliny arachidonové
2,37 mg/100g. Průměrná koncentrace ve všech třech skupinách byla pro kyselinu EPA 2,24 mg/100g. Nejvyšší koncentrace této kyseliny jsme naměřili ve skupině RO 2,84 mg/100g. Nižší koncentrace této kyseliny byla naměřena v kontrolní skupině SvO (2,20 mg/100g), nejnižší koncentrace byla neměřena ve skupině SchO (1,29mg/100g). Nejnižší průměrnou koncentraci ze všech tří skupin z MK obsažených v tukové tkáni potkanů měla kyselina α-linolenová (0,56 mg/100g). Její koncentraci jsme naměřili pouze ve skupině SchO (1,68 mg/100g) ve skupině SvO a RO se nevyskytovala. Korelaci koncentrace jednotlivých MK v tuku s celkovou hladinou cholesterolu, HDL cholesterolu, LDL cholesterolu a TAG nám zobrazuje tabulka č. 14.
48
Tab.
14:
Koeficienty
korelace
MK
tukové
v
tkáni
potkanů
s celkovým
plazmatickým cholesterolem, HDL cholesterolem, LDL cholesterolem a TAG hodnoty v (mmol/l) Celkový plazmatický cholesterol
HDL LDL TAG
myristová C14:0
palmitová C16:0
-0,797025
-0,591383
-0,704023
-0,499154
-0,826249
-0,653200
-0,381363
-0,364121
eicosadienová arachidonová C20:2 C20:4n-6 Celkový plazmatický cholesterol
HDL LDL TAG
0,529795
heptadecylová C17:0
olejová C18:1
-0,350590
-0,597470 0,780838 -0,518847 0,698969
-0,413859
EPA C20:5n-3
-0,359312
-0,350883
0,357254 DPA C22:5n-3
DHA C22:6n-3
-0,560543
-0,607982
-0,476841
-0,545440
-0,558627
-0,622376
0,429153
Koeficienty
korelace
lišící
se
na
-0,619560 0,755090
-0,334664
0,516338 0,518157
linolová C18:2n6
stearová C18:0
hladině
P<0,01;
-0,735200
n=10;
DHA-kyselina
dokosahexaenová, EPA-kyselina eikosapentaenová, DPA- kyselina dokosapentaenová, HDL- HDL cholesterol, LDL-LDL cholesterol, TAG-triacylglyceroly Z korelace vyplívá, že představitelé SAFA měly opět negativní vztah (p˂0,01) s hladinou celkového cholesterolu a TAG. Toto tvrzení platí pro kyselinu palmitovou a myristovou. Kyselina stearová, která by měla být neutrální, měla pozitivní vliv na hladinu (p˂0,01) celkové hladiny cholesterolu a LDL cholesterolu. Pro MUFA a kyselinu olejovou byly projevy standardní. Měla negativní vliv (p˂0,01) na hladiny TAG i celkového plazmatického cholesterolu. Z PUFA se nestandardně chovala kyselina linolová, která měla pozitivní vliv (p˂0,01) na hladinu plazmatického cholesterolu i TAG. Je velmi zajímavé, že v našem pokusu měla EPA pozitivní vliv na hladinu (p˂0,01) TAG. Pozitivní vliv (p˂0,01) na hladiny plazmatického cholesterolu měla kyselina arachidonová, DPA i DHA. DHA měla také negativní vliv (p˂0,01) na hladinu TAG.
49
5.6 Korelace koncentrace MK ze všech tkání s celkovým cholesterolem, HDL cholesterolem, LDL cholesterolem a TAG Korelaci MK ze všech tkání, tedy z tukové, svalové a jaterní tkáně potkanů, můžeme vidět v tabulce č. 15. Tab. 15: Koeficienty korelace MK ve všech sledovaných tkáních potkanů s celkovým plazmatickým cholesterolem, HDL cholesterolem, LDL cholesterolem a TAG
hodnoty v (mmol/l) Celkový plazmatický cholesterol HDL LDL
myristová C14:0
palmitová C16:0
-0,529537
heptadecylová C17:0
-0,464115
-0,614741 -0,610928
eicosadienová arachidonová C20:2 C20:4n-6
Celkový plazmatický cholesterol HDL LDL
Koeficienty
0,565740
0,539233
0,600580
0,613352
0,771508
0,679470
korelace
lišící
se
na
olejová C18:1
EPA C20:5n-3
DPA C22:5n-3
-0,804727 -0,729265
hladině
P<0,01;
n=30;
linolová C18:2n-6
0,642620
linolenová C18:3n-3
-0,759587
DHA C22:6n-3
-0,748163
DHA-kyselina
dokosahexaenová, EPA-kyselina eikosapentaenová, DPA- kyselina dokosapentaenová, HDL- HDL cholesterol, LDL-LDL cholesterol, TAG-triacylglyceroly Pokud vezmeme vliv MK ze všech sledovaných tkání, můžeme vidět, že SAFA měla pozitivní vliv (p˂0,01) na hladinu LDL cholesterolu. Představitel MUFA je zde sledovaná kyselina olejová. Kyselina olejová měla pozitivní vliv (p˂0,01) na hladinu LDL cholesterolu. Hlavním představitelem z PUFA pro řadu n-6 je kyselina linolová, která měla pozitivní vliv (p˂0,01) na hladinu celkového plazmatického cholesterolu. Pozitivní vliv (p˂0,01) na hladinu celkového plazmatického cholesterolu měly i kyseliny eikosadienová a arachidonová. Negativní vliv (p˂0,01) na hladinu LDL cholesterolu měla i kyselina EPA, DRA a DHA. 50
6 ZÁVĚR Tato diplomová práce byla zaměřena na sledování vlivu polynenasycených mastných kyselin na hladinu celkového cholesterolu, HDL cholesterolu, LDL cholesterolu a triacylglycerolů u potkanů. V teoretické části jsem se zaměřila na studium mastných kyselin, cholesterolu a jejich význam a hlavní funkce v těle. V další části byl přiblížen mechanizmus exprese genů pomocí mastných kyselin. Cílem této práce bylo potvrdit hypotézu pozitivního vlivu PUFA, a to převážně DHA a EPA, na snížení hladiny celkového cholesterolu a triacylglycerolů v krevním séru. Vliv PUFA byl zkoumán v experimentu, provedeném na potkanech, kteří byli krmeni standardní směsí s přídavkem rybího oleje a oleje z řasy Schyzochytrium kontrolní skupina olejem ze světlice barvířské. Tato hypotéza byla potvrzena. U obou sledovaných skupin (RO, SchO) došlo ke snížení (p˂0,05) celkové hadiny cholesterolu o 20 % oproti kontrolní skupině SvO. U obou sledovaných skupin došlo také ke snížení (p˂0,05) LDL cholesterolu ve skupině RO o 24 % a ve skupině SchO o 25 % oproti kontrolní skupině. Ke snížení (p˂0,05) TAG došlo pouze u skupiny s přídavkem oleje z řasy Schizochytrium, a to o 54 % ve srovnání s kontrolní skupinou SvO. Jako negativní výsledek hodnotíme snížení (p˂0,05) hladiny HDL cholesterolu u obou skupin o 20 % oproti kontrolní skupině SvO. Dále jsem se věnovala zastoupení jednotlivých MK v jaterní, svalové a tukové tkáni potkanů. Nejvyšší koncentraci ze všech tří tkání měla kyselina linolová. V jaterní tkáni měla druhou nejvyšší průměrnou koncentraci kyselina palmitová (888,74 mg/100g) a třetí nejvyšší průměrnou koncentraci měla kyselina arachidonová (580,94 mg/100g). Kyseliny stearová, linolová i eikosadienová měly v jaterní tkáni pozitivní vliv (p˂0,01) na hladinu TAG. Negativní vliv (p˂0,01) na hladinu celkového plazmatického cholesterolu v jaterní tkáni měly kyseliny α-linolenová, EPA, DPA a DHA. Kyselina DHA měla negativní vliv (p˂0,01) na hladinu všech frakcí v krevní plazmě (celkový cholesterol, LDL cholesterol, HDL cholesterol i TAG). Ve svalové tkáni měla druhou nejvyšší koncentraci kyselina palmitová (24,08 mg/100g) a třetí nejvyšší koncentraci kyselina olejová (20,33 mg/100g) Ve svalové tkáni měly ze SAFA negativní vliv (p˂0,01) na hladinu TAG i celkového plazmatického cholesterolu kyseliny myristová a palmitová. Kyselina olejová měla ve svalové tkáni 51
negativní vliv (p˂0,01) na hladinu TAG. Pozitivní vliv (p˂0,01) na hladinu celkového plazmatického cholesterolu měla kyselina linolová. Z PUFA měly pozitivní vliv (p˂0,01) na hladinu celkového plazmatického cholesterolu kyseliny α-linolenová, EPA, DPA a DHA. DHA měla negativní vliv (p˂0,01) na hladinu TAG ve svalové tkáni. V tukové tkáni měla druhou nejvyšší koncentraci kyseliny olejová (28,36 mg/100g) a třetí nejvyšší koncentraci kyselina palmitová (23,74 mg/100g) Opět měly kyseliny z řady SAFA , tedy kyseliny myristová a palmitová negativní vliv (p˂0,01) na hladinu TAG i celkového plazmatického cholesterolu. Kyseliny linolová a eikosadienová měly pozitivní vliv (p˂0,01) na hladinu celkového plazmatického cholesterolu. Kyseliny DPA a DHA měly negativní vliv (p˂0,01) na hladinu celkového plazmatického cholesterolu v případě DHA i na hladinu TAG. Pokud porovnáme účinky MK na hladiny krevních lipidů napříč sledovanými tkáněmi, můžeme říct, že negativní vliv (p˂0,01) na hladinu LDL cholesterolu mají kyseliny myristová, palmitová, heptadecylová, olejová, α-linolenová, EPA, DPA a DHA. Pozitivní vliv (p˂0,01) na hladinu celkového plazmatického cholesterolu mají kyselina eikosadienová a arachidonová. Z výsledků naší práce můžeme vyvodit, že doporučení konzumovat ryby z důvodů snížení celkového plazmatického cholesterolu je správný Ovšem pro snížení celkových TAG je lepší suplementace přímo DHA, jejíž cena je ale řádově vyšší.
52
7 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY
ARCIMOVIČOVÁ, Jana. Potraviny a byliny ke snížení cholesterolu. 1. vyd. Benešov u Prahy: START, 2003, 159 s. ISBN 80-86231-24-0 BARROS, Marcelo Paes, Douglas Popp MARIN, Anaysa Paola BOLIN, Rita DE CÁSSIA SANTOS MACEDO, Thais Regina CAMPOIO, Claudio FINETO, Beatriz Alves GUERRA, Tatiana Geraldo POLOTOW, Cristina VARDARIS, Rita MATTEI a Rosemari OTTON. Combined astaxanthin and fish oil supplementation improves glutathione-based redox balance in rat plasma and neutrophils. Chemico-Biological Interactions. 2012, vol. 197, issue 1, s. 58-67. DOI: 10.1016/j.cbi.2012.03.005. BERGE, Kjetil, Kathy MUSA-VELOSO, Melody HARWOOD, Nils HOEM, Lena BURRI, Karen A. LILLYCROP a Graham C. BURDGE. Krill oil supplementation lowers serum triglycerides without increasing low-density lipoprotein cholesterol in adults with borderline high or high triglyceride levels. Nutrition Research. 2014, vol. 34, issue 2, s. 126-133.
DOI:
10.1016/j.nutres.2013.12.003.
Dostupné
z:
http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0952327813002342 BURDYCHOVÁ, R. Preventivní výživa. 1. vyd. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 2009. 113 s. ISBN 978-80-7375-280-4 CAMPIOLI, Enrico, Cecilia RUSTICHELLI, Hirofumi AVALLONE, Seiji KANDA, Toshimasa NISHIYAMA, Munehiro YOSHIDA, Danni SHI, Anja JAESCHKE, James C. RUSSELL, Catherine J. FIELD, Spencer D. PROCTOR a Donna F. VINE. N-3 Dietary supplementation and lipid metabolism: Differences between vegetable- and fish-derived oils. Journal of Functional Foods. 2012, vol. 4, issue 1, s. 207-212. DOI: 10.1016/j.jff.2011.10.006.
Dostupné
z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1756464611001009 CAMPIOLI, Enrico, Cecilia RUSTICHELLI, Rossella AVALLONE, Ye WANG, Rabban MANGAT, Megan RUTH, Danni SHI, Anja JAESCHKE, James C. RUSSELL, Catherine J. FIELD, Spencer D. PROCTOR a Donna F. VINE. N-3 Dietary supplementation and lipid metabolism: Differences between vegetable- and fish-derived oils. Journal of Functional
53
Foods. 2012, vol. 4, issue 1, s. 207-212. DOI: 10.1016/j.jff.2011.10.006. Dostupné z:http://www.journals.cambridge.org/abstract_S0007114510005453 ČEŠKA, Richard. Cholesterol a ateroskleróza, léčba dyslipidémií. Vyd. 4., V Tritonu 2. Triton, 2012, 406 s. ISBN 978-807-3875-992 DAWCZYNSKI, Christine, Karen A. MASSEY, Christina NESS, Michael KIEHNTOPF, Stefanie STEPANOW, Matthias PLATZER, Michael GRÜN, Anna NICOLAOU. Randomized placebo-controlled intervention with n-3 LC-PUFA-supplemented yoghurt: Effects on circulating eicosanoids and cardiovascular risk factors. Clinical Nutrition. 2013, vol.
32,
issue
5,
s.
686-696.
DOI:
10.1016/j.clnu.2012.12.010.
Dostupné
z:
http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S026156141200283X DECKELBAUM, RJ, TS WORGALL a T SEO. N-3 fatty acids and gene expression. American Journal of Clinical Nutrition. 2006, s. 1520-1525. Dostupné z: Dostupný/é
také
z
http://apps.webofknowledge.com/full_record.do?product=WOS&search_mode=GeneralSea rch&qid=31&SID=Y27R84VEDMdp1Nvoxmy&page=1&doc=31# Fact File: Cholesterol. ABC: Healt and Welbeing [online]. 08/08/2013. 2013 [cit. 2014-0416]. Dostupné z:http://www.abc.net.au/health/library/stories/2006/08/03/1829380.htm FERRAMOSCA A., CONTE L., ZARA V. (2012) A krill oil supplemented diet reduces the activities of the mitochondrial tricarboxylate carrier and of the cytosolic lipogenic enzymes in rats. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, 96, 295-306 FILLER, Guido, Geneva WEIGLEIN, Mireille Tina GHARIB, Shelley CASIER, Hung-Ju LIN, Hsiu-Ching HSU, Yuan-The LEE a Ming-Fong CHEN. Ω3 fatty acids may reduce hyperlipidemia in pediatric renal transplant recipients: questionnaires and plasma biomarkers. Pediatric Transplantation. 2012, vol. 16, issue 8, s. 835-839. DOI: 10.1111/j.1399-3046.2012.01772.x. Dostupné z: http://www.biomedcentral.com/14712288/13/23 FREJ, David. Zdravé tuky omega: chrání před nemocemi srdce, rakovinou, cukrovkou a podporují hubnutí. Praha: EB, 2004, 166 s. ISBN 80-903234-1-3. GARAIOVA, Iveta, Jana MUCHOVÁ, Zuzana NAGYOVÁ, Csilla MIŠĽANOVÁ, Stanislav ORAVEC, Andrej DUKÁT, Duolao WANG, Sue F CHEN a Zdeňka 54
ĎURAČKOVÁ. Effect of a plant sterol, fish oil and B vitamin combination on cardiovascular risk factors in hypercholesterolemic children and adolescents: a pilot study. Nutrition Journal. 2013, vol. 12, issue 1, s. 7-. DOI: 10.1186/1475-2891-12-7. Dostupné z: http://www.nutritionj.com/content/12/1/7 GARCÍA-MORENO, Pedro J., Raúl PÉREZ-GÁLVEZ, Rocío MORALES-MEDINA, Antonio GUADIX, Emilia M. GUADIX, Andrej DUKÁT, Duolao WANG, Sue F PLUMMER a Zdeňka ĎURAČKOVÁ. Discarded species in the west Mediterranean sea as sources of omega-3 PUFA: a pilot study.European Journal of Lipid Science and Technology. 2013, vol. 115, issue 9, s. 982-989. DOI: 10.1002/ejlt.201300021. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1002/ejlt.201300021 HARRIS, William, Thomas DAYSPRING, Terrance ZCHUT, Peter JH JONES, Ondrej KUDA, Michal HENSLER, Kristina BARDOVA, Pavel FLACHS, Barbora STANKOVA, Marek VECKA, Eva TVRZICKA, Ales ZAK, Jaap KEIJER a Jan KOPECKY. Omega-3 Fatty
Acids
and
Cardiovascular
Disease:
New
Developments
and
Applications. Postgraduate Medicine. 2013, vol. 125, issue 6, s. 100-113. DOI: 10.3810/pgm.2013.11.2717.
Dostupné
z:
http://www.postgradmed.org/doi/10.3810/pgm.2013.11.2717 HOSOMI, Ryota, Kenji FUKUNAGA, Hirofumi ARAI, Seiji KANDA, Toshimasa NISHIYAMA, Munehiro YOSHIDA, Danni SHI, Anja JAESCHKE, James C. RUSSELL, Catherine J. FIELD, Spencer D. PROCTOR a Donna F. VINE. Effect of combination of dietary fish protein and fish oil on lipid metabolism in rats: Differences between vegetableand fish-derived oils. Journal of Food Science and Technology. 2013, vol. 50, issue 2, s. 207-212.
DOI:
10.1007/s13197-011-0343-y.
Dostupné
z:http://link.springer.com/10.1007/s13197-011-0343-y HRUBAN, Vojtěch a Ivan MAJZLÍK. Obecná genetika. 1.vyd. Praha: ČZU, 2000, 316 s. ISBN 80-213-0600-9 CHIEN, Kuo-Liong, Meei-Shyuan LEE, Yi-Tsen TSAI, Pey-Rong CHEN, Hung-Ju LIN, Hsiu-Ching HSU a Ming-Fong CHEN. A Taiwanese food frequency questionnaire correlates with plasma docosahexaenoic acid but not with plasma eicosapentaenoic acid levels: questionnaires and plasma biomarkers. BMC Medical Research Methodology. 2013,
55
vol.
13,
issue
1,
s.
23-.
DOI:
10.1186/1471-2288-13-23.
Dostupné
z:
http://www.biomedcentral.com/1471-2288/13/23 JUMP, Donald B. N-3 polyunsaturated fatty acid regulation of hepatic gene transcription. Current Opinion in Lipidology. 2008, vol. 19, issue 3, s. 242-247. DOI: 10.1097/MOL.0b013e3282ffaf6a KAMISAKO, Toshinori, Yuji TANAKA, Takanori IKEDA, Kazuo YAMAMOTO, Hiroshi OGAWA a Klaus EDER. Activation of PPARα lowers synthesis and concentration of cholesterol by reduction of nuclear SREBP-2. Hepatology Research. 2012, vol. 42, issue 3, s. 321-326. DOI: 10.1111/j.1872-034X.2011.00924.x. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1111/j.1872-034X.2011.00924.x KASBI CHADLI, Fatima, Hassane NAZIH, Michel KREMPF, Patrick NGUYEN, Khadija OUGUERRAM a Shree Ram SINGH. Omega 3 Fatty Acids Promote Macrophage Reverse Cholesterol Transport in Hamster Fed High Fat Diet. PLoS ONE. 2013-4-22, vol. 8, issue 4, e61109-.
DOI:
10.1371/journal.pone.0061109.
Dostupné
z:
http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0061109 KOČÁREK, Eduard. Genetika: obecná genetika a cytogenetika, molekulární biologie, biotechnologie, genomika. 2. vyd. Praha: Scientia, 2008, 211 s. ISBN 978-80-86960-36-4. KOMPRDA, T. Výživou ke zdraví. 1. vyd. Velké Bílovice: TeMi CZ, 2009. 110 s. ISBN 978-80-87156-41-4 KOMPRDA, T. Základy výživy člověka. 1. vyd. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 2003. 162 s. ISBN 978-80-7157-655-620072012 KOMPRDA, Tomáš, Karen A. MASSEY, Christina NESS, Michael KIEHNTOPF, Stefanie STEPANOW, Matthias PLATZER, Michael GRÜN, Anna NICOLAOU a Gerhard JAHREIS. Eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids as inflammation-modulating and lipid homeostasis influencing nutraceuticals: A review. Journal of Functional Foods. 2012, vol.
4,
issue
1,
s.
25-38.
DOI:
10.1016/j.jff.2011.10.008.
Dostupné
z:
http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S026156141200283X KÖNIG, Bettina, Alexander KOCH, Julia SPIELMANN, Christian HILGENFELD, Gabriele I. STANGL a Klaus EDER. Activation of PPARα lowers synthesis and concentration of cholesterol by reduction of nuclear SREBP-2. Biochemical Pharmacology. 2007, vol. 73, issue 4, s. 574-585. DOI: 10.1016/j.bcp.2006.10.027. 56
LAURA, Lluis, Nuria TALTAVULL, Rosa NOGUES, Monica MUNOZ-CORTES, Vanesa SANCHEZ-MARTOS, Marta ROMEU, Montse GIRALT, Eunice MOLINAR-TORIBIO, Josep Lluis TORRES, Jara PEREZ-JIMENEZ, Manuel PAZOS, Lucia MENDEZ, Jose M GALLARDO a Isabel MEDINA. Protective effect of the omega-3 polyunsaturated fatty acids: Eicosapentaenoic acid/Docosahexaenoic acid 1:1 ratio on cardiovascular disease risk markers in rats. LIPIDS IN HEALTH AND DISEASE. 2013, roč. 12, říjen, s. 12 ISSN: 1476-511X. LI, Dong-Mei, Da-Yong ZHOU, Bei-Wei ZHU, Ya-Li CHI, Li-Ming SUN, Xiu-Ping DONG, Lei QIN, Wei-Zhou QIAO a Yoshiyuki MURATA. Effects of krill oil intake on plasma cholesterol and glucose levels in rats fed a high-cholesterol diet. Journal of the Science of Food and Agriculture. 2013-08-30, vol. 93, issue 11, s. 2669-2675. DOI: 10.1002/jsfa.6072. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1002/jsfa.6072 LOPEZ-HUERTAS, Eduardo. Health effects of oleic acid and long chain omega-3 fatty acids (EPA and DHA) enriched milks. A review of intervention studies. Pharmacological Research. 2010, vol. 61, issue 3, s. 200-207. DOI: 10.1016/j.phrs.2009.10.007. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1043661809002680 LU, Jing, Faye BORTHWICK, Zahra HASSANALI, Ye WANG, Rabban MANGAT, Megan RUTH, Danni SHI, Anja JAESCHKE, James C. RUSSELL, Catherine J. FIELD, Spencer D. PROCTOR a Donna F. VINE. Effects of n–3 Supplementation on Plasma and Liver Phospholipid Fatty Acids Profile in Aged Wistar Rats: LA- cp rat model of the metabolic syndrome. British Journal of Nutrition. 2011, vol. 105, issue 11, s. 1572-1582. DOI:
10.1017/S0007114510005453.
Dostupné
z: http://www.journals.cambridge.org/abstract_S0007114510005453 MOGHADASIAN, Eduardo. Advances in Dietary Enrichment with N-3 Fatty Acids. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 2008-05-08, vol. 48, issue 5, s. 402410.
DOI:
10.1080/10408390701424303.
Dostupné
z:
http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/10408390701424303 NEČÁSEK, Jan. Genetika. 2.vyd. Praha: Scientia, 1997, 112 s. ISBN 80-85827-04-2. PARK, Seonhye, Yongsoon PARK, Rossella AVALLONE, Seiji KANDA, Toshimasa NISHIYAMA, Munehiro YOSHIDA, Danni SHI, Anja JAESCHKE, James C. RUSSELL, 57
Catherine J. FIELD, Spencer D. PROCTOR a Donna F. VINE. Effects of dietary fish oil and trans fat on rat aorta histopathology and cardiovascular risk markers: Differences between vegetable- and fish-derived oils. Nutrition Research and Practice. 2009, vol. 3, issue
2,
s.
DOI:
102-.
10.4162/nrp.2009.3.2.102.
Dostupné
z:http://synapse.koreamed.org/DOIx.php?id=10.4162/nrp.2009.3.2.102 POPOVIĆ, Marcelo Paes, Sunčica BOROZAN, Aleksandra ARSIĆ, Jasmina DEBELJAKMARTAČIĆ, Vesna VUČIĆ, Silvio DE LUKA, Ivan MILOVANOVIĆ, Aleksandar TRBOVIĆ, Maria GLIBETIĆ, Rita MATTEI a Rosemari OTTON. Effects of n–3 Supplementation on Plasma and Liver Phospholipid Fatty Acids Profile in Aged Wistar Rats. Croatica Chemica Acta. 2011, vol. 197, issue 1, s. 73-79. DOI: 10.5562/cca1751. Dostupné z:http://hrcak.srce.hr/file/103912 POUDYAL, Hemant, Sunil K. PANCHAL, Leigh C. WARD, Lindsay BROWN, Li-Ming SUN, Xiu-Ping DONG, Lei QIN, Wei-Zhou QIAO a Yoshiyuki MURATA. Effects of ALA, EPA and DHA in high-carbohydrate, high-fat diet-induced metabolic syndrome in rats. The Journal of Nutritional Biochemistry. 2013, vol. 24, issue 6, s. 1041-1052. DOI: 10.1016/j.jnutbio.2012.07.014.
Dostupné
z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0955286312002070 RAMPRASATH, Vanu R, Inbal EYAL, Sigalit ZCHUT, Peter JH JONES, Ondrej KUDA, Michal HENSLER, Kristina BARDOVA, Pavel FLACHS, Barbora STANKOVA, Marek VECKA, Eva TVRZICKA, Ales ZAK, Jaap KEIJER a Jan KOPECKY. Enhanced increase of omega-3 index in healthy individuals with response to 4-week n-3 fatty acid supplementation from krill oil versus fish oil. Lipids in Health and Disease. 2013, vol. 12, issue
1,
s.
178-.
DOI:
10.1186/1476-511X-12-178.
Dostupné
z:
http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1388198113002618 ROSSMEISL, Martin, Dasa MEDRIKOVA, Evert M. VAN SCHOTHORST, Jana PAVLISOVA, Ondrej KUDA, Michal HENSLER, Kristina BARDOVA, Pavel FLACHS, Barbora STANKOVA, Marek VECKA, Eva TVRZICKA, Ales ZAK, Jaap KEIJER a KOPECKY. Omega-3 phospholipids from fish suppress hepatic steatosis by integrated inhibition of biosynthetic pathways in dietary obese mice. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 2014, vol. 1841, issue 2, s. 267-278. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1388198113002618 58
ROVITO, Daniela, Cinzia GIORDANO, Donatella VIZZA, Pierluigi PLASTINA, Ines BARONE, Ivan CASABURI, Marilena LANZINO, Francesca DE AMICIS, Diego SISCI, Loredana MAURO, Saveria AQUILA, Stefania CATALANO, Daniela BONOFIGLIO a Sebastiano ANDÒ. Omega-3 PUFA ethanolamides DHEA and EPEA induce autophagy through PPARγ activation in MCF-7 breast cancer cells. Journal of Cellular Physiology. 2013, vol. 228, issue 6, s. 1314-1322. DOI: 10.1002/jcp.24288. SCHNEIDEROVÁ, Dana. Produkce drůbežího masa jako funkční potraviny s cíleným poměrem n-6 a n-3 polynenasycených mastných kyselin. Brno, 2007. Doktorská disertační práce. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně. Vedoucí práce Prof. Ing. Ladislav Zeman, CSc
SIBBONS, Charlene M., J. THOMAS BRENNA, Peter LAWRENCE, Samuel P. HOILE, Rebecca CLARKE-HARRIS, Karen A. LILLYCROP a Graham C. BURDGE. Dietary fat quality in regular fat diets has minor effects on biomarkers of inflammation in obese Zucker rats. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids (PLEFA). 2014, vol. 90, 2-3, s. 47-54. DOI: 10.1016/j.plefa.2013.12.006. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0952327813002342 SNUSTAD, D P. -- SIMMONS, M J. -- MATALOVÁ, A. a kol. Genetika. 1. vyd. Brno: Masarykova univerzita, 2009. 871 s. ISBN 978-80-210-4852-2 STILWELL
S. N., BIZOUARN T., JACKSON J. B., 1997: The reduction of
acetylpyridine adenine dinucleotide by NADH: is it signifiant reaction of protontranslocating transhydrogenase, or an artefact?, Biochemica et Biophysica Acta, 1320, s. 83 -94. TAKAHASHI Y. (2011) Soy protein and fish oil independently decrease serum lipidconcentrations but interactively reduce hepatic enzymatic activity and gene expressioninvolved in fatty acid synthesis in rats. Journal of Nutritional Science and Vitaminology, 57, 56-64. TAMAI, Tadakazu, Itsuki MUROTA, Kazuaki MARUYAMA, Takashi BABA, Tomoaki TOYAMA, Nami WATANABE, Naomi KUDO, Yoichi KAWASHIMA a Yoshiyuki
MURATA.
Effects
of
Supplemented 59
Diacylglycerol
Rich
in
Docosahexaenoic Acid on Serum Triacylglycerol in a Diet-Induced Hyperlipidemic Model of Rats Are Essentially Equivalent to Those of Triacylglycerol Rich in Docosahexaenoic Acid. Biological. 2007, vol. 30, issue 12, s. 2381-2388. DOI: 10.1248/bpb.30.2381.
Dostupné
z: http://joi.jlc.jst.go.jp/JST.JSTAGE/bpb/30.2381?from=CrossRef YATES, Clara M., Philip C. CALDER, G. ED RAINGER, Pierluigi PLASTINA, Ines BARONE, Ivan CASABURI, Marilena LANZINO, Francesca DE AMICIS, Diego SISCI, Loredana MAURO, Saveria AQUILA, Stefania CATALANO, Daniela BONOFIGLIO a Sebastiano ANDÒ. Pharmacology and therapeutics of omega-3 polyunsaturated fatty acids in chronic inflammatory disease. Pharmacology. 2014, vol. 141, issue 3, s. 272-282. DOI: 10.1016/j.pharmthera.2013.10.010. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0163725813002155
60
