MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA
DIPLOMOVÁ PRÁCE
BRNO 2013
Bc. MARKÉTA VALOVÁ
Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav Technologie potravin
Vliv polynenasycených mastných kyselin na homeostázu cholesterolu Diplomová práce
Vedoucí práce: Ing. Gabriela Zorníková, Ph.D.
Vypracovala: Bc. Markéta Valová
Brno 2013
PROHLÁŠENÍ
Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Vliv polynenasycených mastných kyselin na homeostázu cholesterolu vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucí diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.
dne ………………………….. podpis ……………………….
PODĚKOVÁNÍ
Ráda bych na tomto místě poděkovala všem, kteří přispěli k úspěšnému dokončení této diplomové práce. Zejména Ing. Gabriele Zorníkové, Ph.D., za cenné rady a všestrannou spolupráci, Mgr. Zuzaně Vykoukalové, Ph.D., za pomoc při přípravě vzorků a při analýzách, Ing. Ondreji Škultétymu, za celkovou pomoc při řešení diplomové práce a Ing. Jiřímu Sochorovi, Ph.D., za pomoc při chemických analýzách. Také bych chtěla poděkovat Interní grantové agentuře MENDELU za finanční podporu při řešení této diplomové práce (Vliv krmných aditiv pro hospodářská zvířata na jejich užitkovost a kvalitu potravinářských produktů, TP 2/2011). Díky patří také mé rodině a přátelům, za podporu během celého studia.
VLIV POLYNENASYCENÝCH MASTNÝCH KYSELIN NA HOMEOSTÁZU CHOLESTEROLU
ABSTRAKT
Cílem této práce bylo potvrdit hypotézu o příznivém vlivu EPA a DHA na zastoupení plazmatických lipidů. Tyto polynenasycené mastné kyseliny mohou snižovat plasma cholesterol díky zvýšení exprese genu Insig-1 a zároveň snížením exprese genů kódujících HMG-CoA-R a LDL-R. Tato hypotéza byla testována na pokusných zvířatech (Rattus norvegicus) krmených standardní krmnou směsí s přídavkem 3 % rybího tuku (lososový olej). Exprese genu Insig-1 v játrech pokusných zvířat, krmených krmivem s přídavkem lososového oleje, byla 730 % (P < 0,05) oproti kontrole. Avšak na rozdíl od hypotézy, exprese genu HMG-CoA-R byla 165 % (P > 0,05) a exprese genu pro LDL-R byla 210 % (P > 0,05) oproti kontrole. Nicméně bylo prokázáno (P < 0,05), že rybí tuk v dietě u pokusných potkanů snižuje plazmový cholesterol o 10 % (z počáteční hodnoty 1,19 mmol.l-1 na konečnou hodnotu 1,07 mmol.l-1). Závěrem našeho pokusu bylo částečné potvrzení předpokládané hypotézy, ale zároveň jsme zjistili, že metabolismus lipidů v plazmě je ovlivěn jiným mechanismem než jsme předpokládali.
Klíčová slova Dokosahexaenová kyselina, Eikosapentaenová kyselina, Real-time PCR, Exprese, Cholesterol
THE
INFLUENCE
OF
POLYUNSATURATED
FATTY
ACIDS
ON
CHOLESTEROL HOMEOSTASIS
ABSTRACT
The aim of this work was to validate the hypothesis of a positive influence of EPA and DHA on the proportion of plasmatic lipids. These polyunsaturated fatty acids can decrease the plasma cholesterol due to the increase in expression of the gene Insig-1 together with the decrease in expression of the genes coding HMG-CoA-R and LDL-R. This hypothesis had been tested on experimental animals (Rattus norvegicus) that were fed with a standard feeding mixture, with the addition of 3 % fish oil (salmon oil). The expression of the gene Insig-1 in animals livers that had been fed with the feed with the additon of salmon oil was 730 % (P < 0,05) compared to the control. However, on the contrary to the hypothesis, the expression of the gene HMG-CoA-R was 165 % (P > 0,05) and the expression of the gene for LDL-R was 210 % (P > 0,05) compared to the control. Nevertheless, it was proved (P < 0,05) that the fish oil used for the diet of the experimental rats decreased the plasma cholesterol by 10 % (from the initial value 1,19 mmol.l-1 to the finally value 1,07 mmol.l-1). The conclusion of our experiment was confirmation of the presumptive hypothesis, but we also discovered the fact that the metabolism of lipids in plasma is influenced by another unexpected mechanism.
Keywords Docosahexaenoic acid, Eicosapentaenoic acid, real-time PCR, Expression, Cholesterol
OBSAH
1 ÚVOD .....................................................................................................................14 2 CÍL PRÁCE............................................................................................................15 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED .......................................................................................16 3. 1 LIPIDY ...............................................................................................................16 3. 1. 1 Základní rozdělení lipidů...........................................................................16 3. 1. 2 Biologické funkce lipidů ...........................................................................17 3. 2 DOPROVODNÉ LÁTKY LIPIDŮ – CHOLESTEROL .....................................................18 3. 2. 1 Biologická funkce cholesterolu .................................................................18 3. 2. 2 Biosyntéza cholesterolu.............................................................................18 3. 2. 3 Transport cholesterolu v lidském těle ........................................................21 3. 3 MASTNÉ KYSELINY ............................................................................................22 3. 3. 1 Nasycené mastné kyseliny.........................................................................24 3. 3. 2 Mononenasycené mastné kyseliny.............................................................25 3. 3. 3 Polynenasycené mastné kyseliny...............................................................26 3. 4 LIPOPROTEINY ...................................................................................................28 3. 5 METABOLISMUS LIPIDŮ A MK ............................................................................30 3. 5. 1 Genová exprese.........................................................................................30 3. 5. 1. 1 PPAR ....................................................................................................31 3. 5. 1. 2 SREBP..................................................................................................33 3. 5. 1. 3 Vliv DHA na homeostázu cholesterolu..................................................35 3. 6 METODY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE PRO DETEKCI A KVANTIFIKACI GENOVÉ EXPRESE ................................................................................................................................37 3. 6. 1 Reverzně-transkripční PCR .......................................................................37 3. 6. 2 Real-time PCR ..........................................................................................39 3. 6. 3 Metody pro hodnocení relativní kvantifikace.............................................43 4 MATERIÁL A METODIKA .................................................................................44 4. 1 POKUSNÁ ZVÍŘATA, PODMÍNKY CHOVU A KRMNÉ SMĚSI ......................................44 4. 2 POUŽITÉ CHEMIKÁLIE .........................................................................................46 4. 3 POUŽITÉ PŘÍSTROJE ............................................................................................47 4. 4 ODBĚR VZORKŮ KRVE PRO STANOVENÍ CHOLESTEROLU .......................................47 4. 5 STANOVENÍ CELKOVÉHO CHOLESTEROLU, HDL-CHOLESTEROLU, LDLCHOLESTEROLU A TAG ............................................................................................48 4. 6 ODBĚR VZORKŮ TKÁNÍ PRO ANALÝZU GENOVÉ EXPRESE......................................48 4. 7 IZOLACE RNA ...................................................................................................49
4. 8 KONTROLA KVALITY IZOLOVANÉ RNA...............................................................50 4. 9 REVERZNÍ TRANSKRIPCE ....................................................................................51 4. 10 REAL-TIME PCR ..............................................................................................51 4. 10. 1 Ověření a návrh primerů pro real-time PCR ............................................51 4. 10. 2 Stanovení efektivity reakce .....................................................................53 4. 10. 3 Relativní kvantifikace .............................................................................53 4. 10. 4 Vyhodnocení relativní kvantifikace .........................................................54 4. 10. 5 Statistické vyhodnocení...........................................................................54 5 VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUZE .......................................................................55 5. 1 PŘÍJEM KRMIVA A HMOTNOST POKUSNÝCH ZVÍŘAT..............................................55 5. 2. KONCENTRACE CELKOVÉHO CHOLESTEROLU, HDL-CHOLESTEROLU, LDLCHOLESTEROLU A TAG ............................................................................................56 5. 3 KONTROLA KVALITY A KVANTITY IZOLOVANÉ RNA ...........................................61 5. 4 REAL-TIME PCR ................................................................................................64 5. 4. 1 Ověření a návrh primerů pro real-time PCR ..............................................64 5. 4. 2 Analýza genové exprese pomocí real-time PCR ........................................69 5. 4. 2. 1 β-aktin...................................................................................................70 5. 4. 2. 2 HMG-CoA-R ........................................................................................70 5. 4. 2. 3 SREBP-2...............................................................................................72 5. 4. 2. 4 PPARα ..................................................................................................74 5. 4. 2. 5 LDL-R ..................................................................................................76 5. 4. 2. 6 Insig-1...................................................................................................78 5. 5 SHRNUTÍ VÝSLEDKŮ ...........................................................................................80 6 ZÁVĚR ...................................................................................................................84 7 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ...................................................................85 8 SEZNAM POUŽITÝCH INTERNETOVÝCH ZDROJŮ ....................................96 9 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ....................................................................97 10 PŘÍLOHY .............................................................................................................99
SEZNAM TABULEK
Tab. 1 Zdroje cholesterolu v dietě................................................................................21 Tab. 2 Přehled nasycených MK ...................................................................................25 Tab. 3 Lipoproteiny plasmy.........................................................................................29 Tab. 4 Funkce, lokalizace a ligandy jednotlivých PPAR ..............................................31 Tab. 5 Celkové složení krmných směsí........................................................................45 Tab. 6 Zastoupení jednotlivých mastných kyselin a jejich příjem v krmné dávce .........46 Tab. 7 Složení pufru pro elektroforézu.........................................................................50 Tab. 8 Seznam primerů, sekvence, číslo referenční sekvence, délka PCR produktu a teplota annealingu................................................................................................52 Tab. 9 Hodnoty celkového cholesterolu, HDL-cholesterolu, LDL-cholesterolu a TAG 56 Tab. 10 Zjištěné hodnoty koncentrace izolované RNA [ng.μl-1], absorbance (při 260 a 280 nm) a čistoty (A260/A280 a A260/A230) u vzorků skupiny PALMA .........62 Tab. 11 Zjištěné hodnoty koncentrace izolované RNA [ng.μl-1], absorbance (při 260 a 280 nm) a čistoty (A260/A280 a A260/A230) u vzorků skupiny MYPO ...........63 Tab. 12 Zjištěné hodnoty koncentrace izolované RNA [ng.μl-1], absorbance (při 260 a 280 nm) a čistoty (A260/A280 a A260/A230) u vzorků skupiny LOSOS ..........64 Tab. 13 Analýza hladiny exprese genu HMG-CoA-R [%] ............................................71 Tab. 14 Analýza hladiny exprese genu SREBP-2 [%] ..................................................74 Tab. 15 Analýza hladiny exprese genu PPARα [%] .....................................................76 Tab. 16 Analýza hladiny exprese genu LDL-R [%] ......................................................77 Tab. 17 Analýza hladiny exprese genu Insig-1 [%]......................................................79 Tab. 18 Analýza hladiny exprese genů: Insig, HMG-CoA-R, LDL-R [%] .....................81 Tab. 19 Analýza hladiny exprese genů: PPARα, SREBP-2 [%]....................................82
SEZNAM OBRÁZKŮ
Obr. 1 Vzorec volného cholesterolu.............................................................................19 Obr. 2 Vzorec esterifikovaného cholesterolu ...............................................................20 Obr. 3 Vstřebávání cholesterolu v tenkém střevě .........................................................22 Obr. 4 Znázornění dvojího číslování uhlíků .................................................................24 Obr. 5 Zjednodušené schéma metabolizmu esenciálních MK.......................................27 Obr. 6 Schéma lipoproteinové částice ..........................................................................29 Obr. 7 Mechanismus fungování PPAR.........................................................................32 Obr. 8 Regulace syntézy cholesterolu pomocí SREBP .................................................34 Obr. 9 Vliv DHA na homeostázu cholesterolu .............................................................36 Obr. 10 Detekce a amplifikace RNA pomocí reverzně-transkripční PCR .....................38 Obr. 11 Syntéza dvojřetězcových cDNA z molekul mRNA .........................................39 Obr. 12 Hodnoty celkového cholesterolu, HDL-cholesterolu, LDL-cholesterolu a TAG ............................................................................................................................57 Obr. 13 Kontrola kvality izolované RNA ze vzorků jater (skupina PALMA) ...............61 Obr. 14 Melting křivky PCR fragmentu genu β-aktin při teplotě annealingu 60 ºC ......65 Obr. 15 Melting křivky PCR fragmentu genu HMG-CoA-R při teplotě annealingu 60 ºC ............................................................................................................................65 Obr. 16 Melting křivky PCR fragmentu genu SREBP-2 při teplotě annealingu 60 ºC...66 Obr. 17 Melting křivky PCR fragmentu genu SREBP-2 při teplotě annealingu 65 ºC...66 Obr. 18 Melting křivky PCR fragmentu genu PPARα při teplotě annealingu 65 ºC ......67 Obr. 19 Melting křivky PCR fragmentu genu LDL-R při teplotě annealingu 65 ºC.......68 Obr. 20 Melting křivky PCR fragmentu genu Insig-1 při teplotě annealingu 65 ºC ......68 Obr. 21 Melting křivky PCR fragmentu genu Insig při teplotě annealingu 60 ºC..........69 Obr. 22 Standardní křivka (A) a amplifikační křivka (B) pro gen β-aktin.....................70 Obr. 23 Standardní křivka (A) a amplifikační křivka (B) pro gen HMG-CoA-R ...........71 Obr. 24 Analýza hladiny exprese genu HMG-CoA-R ...................................................72 Obr. 25 Standardní křivka (A) a amplifikační křivka (B) pro gen SREBP-2 .................72 Obr. 26 Analýza hladiny exprese genu SREBP-2. ........................................................74 Obr. 27 Standardní křivka (A) a amplifikační křivka (B) pro gen PPARα ....................75 Obr. 28 Analýza hladiny exprese genu PPARα ............................................................76 Obr. 29 Standardní křivka (A) a amplifikační křivka (B) pro gen LDL-R .....................77
Obr. 30 Analýza hladiny exprese genu LDL-R.............................................................78 Obr. 31 Standardní křivka (A) a amplifikační křivka (B) pro gen Insig-1.....................78 Obr. 32 Analýza hladiny exprese genu Insig-1.............................................................80 Obr. 33 Analýza hladiny exprese genů Insig-1, HMG-CoA-R a LDL-R........................81 Obr. 34 Analýza hladiny exprese genů PPARα a SREBP-2 ..........................................83
SEZNAM PŘÍLOH
Příloha 1 Biosyntéza cholesterolu ................................................................................99 Příloha 2 Doporučené hodnoty lipidů v krevním séru ................................................100 Příloha 3 Amplifikační křivka ...................................................................................101
1 ÚVOD Lipidy patří mezi základní složky ve výživě člověka a lidský organismus nemůže existovat bez jejich příjmu. Mají značný fyziologický význam, který bude popsán v následujícím textu. Ve své práci se zabývám problematikou moderního vědního oboru – nutrigenomiky. Jedná se o vědní obor, který se zabývá vztahem mezi celkovou genetickou informací (genomem, transkriptomem) a individuální reakcí na látky, které člověk přijímá v potravě. V konečném důsledku se jedná o ovlivnění genové exprese pomocí nutrientů z potravy. Přestože se jedná o poměrně nový vědní obor, základy této problematiky byly známy již v období starověku. Dokazuje to Hippokratův citát: „Nechť je tvé jídlo tvým lékem a tvůj lék nechť je tvým jídlem.“ Zaměřila jsem se především na možnost ovlivnění homeostázy cholesterolu složením dietárních lipidů. Mezi nejúčinnější látky, které ovlivňují metabolismus cholesterolu, patří např. polynenasycené mastné kyseliny, zejm. PUFA n-3. Dietární zdroje těchto látek představují především rybí tuk, tučné ryby a mořští živočichové. Je prokázáno, že zvýšená konzumace ryb a mořských plodů příznivě ovlivňuje zastoupení plazmatických lipidů.
14
2 CÍL PRÁCE Cílem diplomové práce je nastudovat literaturu o lipidech a mastných kyselinách, jejich výskytu v potravinách a fyziologické funkci v organismu, dále nastudovat literaturu o metodách molekulární biologie pro detekci a kvantifikaci genové exprese a prostudovat problematiku vlivu mastných kyselin na genovou expresi. Z těchto poznatků sestavit literární rešerši. V druhé fázi je nutné praktické zvládnutí pokusů na laboratorních zvířatech, následné zpracování vzorků dle zvolené metodiky a na závěr statistické vyhodnocení získaných výsledků. Cílem práce je potvrdit hypotézu o příznivém vlivu EPA a DHA na zastoupení plazmatických lipidů a zjistit, které z genů (Insig-1, HMG-CoA-R, LDL-R, PPARα a SREBP-2), resp. jejich exprese, ovlivňují metabolismus cholesterolu u potkanů.
15
3 LITERÁRNÍ PŘEHLED
3. 1 Lipidy Lipidy (z řeckého lipos = tučný), spolu se sacharidy a proteiny, patří mezi základní složky ve výživě člověka (Holeček, 2006). Jsou to přírodní látky rostlinného i živočišného původu, které se vyskytují jak v kapalné, tak i v pevné formě. Z chemického hlediska se jedná o estery vyšších karboxylových kyselin, které mohou být nasycené nebo nenasycené (Fahy et al., 2009). Lipidy jsou z funkčního i chemického hlediska velmi různorodé látky, ale mají společnou charakteristickou vlastnost – hydrofóbnost. Jsou tedy nerozpustné ve vodě, ale dobře rozpustné v nepolárních rozpouštědlech (Ganong, 2005). Lipidy jsou energeticky velmi bohaté (1g tuku obsahuje 39 kJ = 9,3 kcal), a proto v živých organismech velice často slouží jako zdroj a zásobárna energie. Význam lipidů je však mnohostranný (Keresteš, 2011). Pro adekvátní vstřebávání vitaminů rozpustných v tucích (zejm. vitamin A a E) je doporučován příjem tuků minimálně 10–15 % z celkového energetického příjmu (Béder, 2005). Denní příjem lipidů by neměl přesáhnout 30–35 % z celkového energetického příjmu. V Evropě (kromě Finska, Norska, Itálie a Portugalska) je průměrný příjem tuku vyšší než 35 % z celkového energetického příjmu. Vysoký příjem dietárního tuku je spojován s vyšším rizikem obezity. Podle některých epidemiologických studií bylo zjištěno, že vysoký příjem tuku je spojován s vyšším výskytem rakoviny, zejm. prsu, vaječníků, prostaty a tlustého střeva (Sobotka, 2011). Tuky mají významný vliv ve vztahu výživy a zdraví člověka, a to jak pozitivní, tak negativní. Záleží především na množství a složení přijatého tuku. Složení MK přijatého tuku má významnou úlohu v prevenci řady onemocnění (zejm. onemocnění srdce a cév). Současné výzkumy prokázaly, že složení MK má významnější roli, než množství přijatého cholesterolu (Dostálová, 2012).
3. 1. 1 Základní rozdělení lipidů Na základě tzv. Bloorovy klasifikace se lipidy podle nejjednoduššího schématu rozdělují na jednoduché a složené (Kraml, 2008).
16
Jednoduché lipidy (homolipidy) Jednoduché lipidy jsou estery mastných kyselin s alkoholy. Rozdělují se na tuky a vosky podle chemického složení. Tuky jsou estery mastných kyselin s trojmocným alkoholem glycerolem. Vosky jsou estery, které obsahují jeden vyšší jednosytný alkohol a jeden acyl mastné kyseliny (Murray, 2002).
Složené lipidy (heterolipidy) Heterolipidy jsou látky, které obsahují ve své molekule část lipidové a část nelipidové povahy. Mezi heterolipidy řadíme fosfolipidy, glykolipidy a lipoproteiny. Fosfolipidy obsahují MK, alkohol a zbytek kyseliny fosforečné. Kromě toho mohou obsahovat
i
dusíkaté
báze
a
další
skupiny.
Fosfolipidy
se
dále
dělí
na glycerolfosfolipidy (je-li alkoholem glycerol) a sfingofosfolipidy (je-li alkoholem sfingosin). Glykolipidy obsahují MK, sfingosin a sacharidovou složku (Murray, 2002).
3. 1. 2 Biologické funkce lipidů Nejdůležitější funkcí lipidů pro všechny živé organismy je to, že lipidy představují nejbohatší energetický zdroj, a tím hlavní zásobní formu energie v organismu (Holeček, 2006). Důležitá energetická rezerva v podobě triacylglycerolů je uložena v adipocytech. Odtud mohou být podle potřeb organismu mobilizovány v podobě volných MK, které jsou následně oxidovány v mitochondriích příslušných tkání (Kraml, 2008). Lipidy jsou nezbytnou složkou buněčných membrán u všech živých organismů (Soška, 2001). V buňce můžeme rozlišit cytoplazmatickou membránu, která odděluje samotnou buňku od okolního prostředí a endomembránový systém, který zahrnuje membrány uvnitř buněk. Buněčná membrána se skládá z fosfolipidové dvojvrstvy a proteinů. Ze složení buněčné membrány vychází její unikátní vlastnosti, jako je fluidita (polotekutost), amfipatický charakter (obsahuje hydrofobní i hydrofilní vrstvu) nebo semipermeabilita čili polopropustnost (Heijne, 2008). U člověka mají lipidy nezastupitelnou úlohu v mechanické, tepelné a elektrické izolaci organismu. Jedná se především o podkožní tuk a o tukový obal některých orgánů. Účastní se procesu termoregulace organismu (Beňo, 2008). Lipidy mají celou řadu dalších životně důležitých funkcí. Jsou výchozí látkou při syntéze steroidních hormonů a prostaglandinů. Transportní formy lipidů (lipoproteiny)
17
představují hlavní způsob transportu řady látek (Holeček, 2006). Lipidy jsou součástí buněčné signalizace. Steroidy, eikosanoidy a některé fosfolipidy slouží jako signální molekuly tím, že vykonávají funkci hormonů, mediátorů nebo tzv. druhých messengerů (Kraml, 2008). Ve střevě usnadňují vstřebávání vitamínů rozpustných v tucích (Svačina a kol., 2008a). Nelze opomenout ani důležitou úlohu lipidů v senzorické analýze potravin. Lipidy se podílejí na specifické chuti potravin (Jarošová a kol., 2004).
3. 2 Doprovodné látky lipidů – cholesterol Mezi doprovodné látky lipidů se většinou řadí eikosanoidy (prostaglandiny, prostacykliny, tromboxany, leukotrieny) a isoprenoidy (cholesterol, steroidy, vitamíny A, D, E, K, ubichinon) (Ganong, 2005). Pro tuto práci z nich bude nejdůležitější cholesterol, a proto se o něm zmíním podrobněji.
3. 2. 1 Biologická funkce cholesterolu Cholesterol představuje důležitou molekulu v živočišném organismu (Lubanda, Vecka, 2009). Je to látka nezbytná pro správnou funkci buněčných membrán, tvorbu žlučových kyselin, steroidních hormonů a vitamínu D (Lecerf, Lorgeril, 2011). Cholesterol je jednou ze základních strukturálních komponent lipoproteinů (Holeček, 2006). V nervových tkáních je cholesterol součástí myelinových pochev. Cholesterol je nezbytný pro správný růst organismu i pro obnovu tkání (Komprda, 2006). Je však důležité si uvědomit, že přestože je cholesterol pro život nezbytný, může působit také velmi negativně. Hypercholesterolémie (vysoká hladina cholesterolu), zvláště nadbytek LDL frakce, je dnes považován za hlavní příčinu aterosklerózy. Ateroskleróza je onemocnění, které je v rozvinutých zemích jednou z hlavních příčin mortality v populaci (Lubanda, Vecka, 2009).
3. 2. 2 Biosyntéza cholesterolu Z hlediska fyziologie výživy člověka rozlišujeme cholesterol exogenní (přijímaný potravou) a endogenní (syntetizovaný vlastním organismem člověka) (Lecerf, Lorgeril, 2011). Denní potřeba cholesterolu v lidském organismu je asi 1g. Toto množství by mohlo být teoreticky produkováno endogenně, ale při smíšené stravě pochází asi jen
18
polovina cholesterolu z vlastní syntézy a zbytek je dodán dietou. (Langmeier a kol., 2009). Endogenní syntéza cholesterolu probíhá v každé živočišné buňce (s výjimkou bezjaderných erytrocytů), nejvíce však v hepatocytech, v nervové tkáni a enterocytech (Soška, 2001). Za fyziologických podmínek existují mechanismy, které regulují endogenní syntézu cholesterolu a udržují tak hladinu plazmatického cholesterolu v normě (Soccio, Breslow, 2004). Biosyntéza cholesterolu probíhá především v játrech. Všech 27 uhlíků molekuly cholesterolu pochází od acetyl-CoA, který je výchozí molekulou pro biosyntézu cholesterolu (Goedeke, Fernández-Hernando, 2012) Klíčový enzym, který reguluje syntézu
cholesterolu
je
β-hydroxy- β-metyl-glutaryl-CoA-reduktáza
(HMG-CoA
reduktáza). Při zvýšení příjmu dietárního cholesterolu se automaticky sníží endogenní syntéza a naopak (Komprda, 2006). Podrobné schéma biosyntézy cholesterolu je uvedeno v příloze 1. Cholesterol existuje v organismu ve dvou formách: volný (Obr. 1) a esterifikovaný (Obr. 2). Volný cholesterol se skládá ze čtyř uhlovodíkových kruhů a postranního osmiuhlíkového řetězce. Neobsazená OH skupina volného cholesterolu umožňuje jeho interakci s vodou, proto je částečně hydrofilní. Esterifikovaný cholesterol má stejnou strukturu jako cholesterol volný, ale na místě OH skupiny volného cholesterolu je navázána mastná kyselina. Esterifikovaný cholesterol je díky této vazbě zcela hydrofobní (Soška, 2001).
Obr. 1 Vzorec volného cholesterolu (www1)
19
Obr. 2 Vzorec esterifikovaného cholesterolu (www2)
V potravě se vyskytuje cholesterol pouze v potravinách živočišného původu (Lecerf, Lorgeril, 2011). Průměrný denní příjem cholesterolu v průmyslových zemích je cca 500 mg.den-1. Odbornými společnostmi je však doporučováno snížit příjem cholesterolu na 300 mg.den-1 (American Heart Association Nutrition Committee, 2006) nebo dokonce 200 mg.den-1 (Kraml, 2008). Zdroje cholesterolu v dietě znázorňuje tabulka 1.
20
Tab. 1 Zdroje cholesterolu v dietě (zpracováno podle www3) Obsah cholesterolu Běžná hmotnost 1
Obsah cholesterolu
(mg) na 100 g
Potravina
porce (g)
(mg) na porci
potraviny
Kuřecí maso, vnitřnosti
145
641
442
Krocan
145
419
289
Hovězí játra, droby
85
324
381
Vepřové ledviny
85
323
380
Vejce celé syrové
58
245
422
Vejce - žloutek
16,6
205
1235
Sýr, Ricotta
246
125
51
Plnotučné mléko
246
125
51
Ořechový koláč
122
106
87
Libové vepřové maso
85
103
121
Šunka - průměr
56,7
32
56
Máslo
14,2
31
218
Sýr čedar
28,35
30
106
Vanilková zmrzlina
66
29
44
Uzeniny
28,35
24
85
Sýr Mozarella
28,35
15
53
Sýr Parmazán
5
4
80
3. 2. 3 Transport cholesterolu v lidském těle V trávicím
traktu
jsou
lipidy
emulgovány
účinkem
žlučových
kyselin
a hydrolyzovány působením lipolytických enzymů pankreatické šťávy (Langmeier a kol., 2009). Natrávená směs lipidů se žlučovými kyselinami vytváří ve střední části tenkého střeva, jejunu, směsné micely o průměru 3–10 μm. Tyto směsné micely se při styku
s kartáčovým
lemem
enterocytů
postupně
rozpadají
a dostávají
se do bezprostřední blízkosti enterocytů. Cholesterol je translokován přes membránu enterocytu pomocí receptoru, který se nazývá protein podobný Niemannovu-Pickovu proteinu 1 (Lubanda, Vecka, 2009).
21
Obr. 3 Vstřebávání cholesterolu v tenkém střevě (Kraml, 2008)
NPC1L1 - Niemann-Pick C1 like-1 transportér ACAT – acyl-CoA cholesterolacyltransferáza ABCG5/G8 – ATP binding cassette G5/G8
3. 3 Mastné kyseliny Jako mastné kyseliny se v biochemii označují biosynteticky vytvořené alifatické monokarboxylové kyseliny, mohou být nasycené nebo nenasycené, většinou se sudým počtem (4-30) uhlíkových atomů a s možnými substituenty v bočním řetězci (Keresteš, 2011). Mastné kyseliny lze rozdělovat podle různých kritérií – například podle délky řetězce nebo nasycení (Svačina, Bretšnajdrová, 2008b). V současnosti existuje mnoho studií, které potvrzují významný vliv MK, zejm. MUFA a PUFA na modulaci genové exprese. Tímto dochází k ovlivňování celého lipidového metabolismu organismu (Afman, Müller, 2012). Volné MK jsou jedním ze základních energetických substrátů. MK jsou syntetizovány především v játrech a uloženy jsou ve formě triglyceridů jako zásobní forma energie. Po uvolnění z tukové tkáně jsou v krvi transportovány ve vazbě na albumin (Soška, 2001). Mastné kyseliny člověk přijímá v potravě většinou vázané v neutrálních lipidech (triacylglycerolech) nebo fosfolipidech. Organismus člověka je schopen syntetizovat MK také de novo z acetylkoenzymu A postupným prodlužováním řetězce o dvouuhlíkaté zbytky. Některé MK ale není schopen lidský organismus syntetizovat a musíme je přijímat v potravě. Nazývají se esenciální mastné kyseliny (Komprda, 2007).
22
Pro tuto práci budou stěžejní fyziologické účinky MK na hladinu sérového cholesterolu. Hladinu sérového cholesterolu zvyšují (a působí tedy nepříznivě) SFA, zejm. kys. laurová (C 12:0), myristová (C 14:0) a palmitová (C 16:0). Kyselina stearová (C 18:0) působí v tomto smyslu neutrálně. Dále hladinu sérového cholesterolu zvyšují trans-nenasycené MK. Naopak hladinu sérového cholesterolu snižují MUFA a PUFA (Komprda, 2007).
Rozdělení mastných kyselin podle délky řetězce
s krátkým řetězcem - méně než 6 atomů uhlíku
se středně dlouhým řetězcem - 6 až 12 atomů uhlíku
s dlouhým řetězcem - 14 až 20 atomů uhlíku
s velmi dlouhým řetězcem - více než 20 atomů uhlíku
Rozdělení mastných kyselin podle nasycení
Nasycené - Saturated fatty acid = SFA - v jejich molekule není žádná dvojná vazba
Mononenasycené - Monounsaturated fatty acid = MUFA - v jejich molekule se nachází jedna dvojná vazba
Polynenasycené - Polyunsaturated fatty acid = PUFA - v jejich molekule se nachází dvě až šest dvojných vazeb
Mastné kyseliny, které se vyskytují v přírodě, jsou karboxylové kyseliny s nerozvětveným řetězcem, které obsahují většinou sudý počet (2-24) uhlíkových atomů (Mourek a kol., 2007). Mastné kyseliny mají amfipatickou strukturu – mají hydrofobní (uhlíkový) řetězec i hydrofilní (karboxylová skupina) část. Čím je MK delší, tím se více projevují její hydrofobní vlastnosti a tím méně je rozpustná ve vodě (Holeček, 2006). MK jsou přítomné ve všech organismech, a to zejména v podobě esterů s glycerolem, cholesterolem nebo sfingosinem. Malé množství MK se vyskytuje v neesterifikované formě jako tzv. volné mastné kyseliny (Ganong, 2005). Kromě triviálních názvů se užívá v názvosloví MK i označení číslicemi a řeckými písmeny, tzn. x : y (x = počet uhlíků a y = počet dvojných vazeb). U nenasycených MK vyznačujeme i polohu dvojných vazeb. V tomto lze vycházet buď od uhlíku karboxylové skupiny (označovaného jako uhlík č. 1), nebo od opačného konce řetězce,
23
tzn. od uhlíku krajní methylové skupiny. Určujeme-li polohu dvojné vazby od karboxylové skupiny, použijeme řecké písmeno Δ (delta), za kterým následují číslice označující uhlík, ze kterého dvojná vazba vychází. Pokud označujeme polohu od uhlíku krajní methylové skupiny, užijeme řeckého písmene ω (omega), za kterým následuje číslice uhlíku dvojné vazby, počítáno od uhlíku krajní methylové skupiny (uhlík ω1) (Kraml, 2008). Příklad dvojího způsobu označení je znázorněn na obrázku 4.
CH3 CH2 CH2 CH2 CH2 CH = CH CH2 CH = CH CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 COO18
17 16 15 14 13
12 11 10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
Linolová kyselina Δ9,12; 18:2
Karboxylový uhlík CH3 CH2 CH2 CH2 CH2 CH = CH CH2 CH = CH CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 COO-
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18
Linolová kyselina ω6,9; 18:2
Číslování z opačného konce než karboxylový uhlík
Obr. 4 Znázornění dvojího číslování uhlíků (Kraml, 2008) 3. 3. 1 Nasycené mastné kyseliny Přehled nasycených MK (saturated fatty acids, SFA), jejich chemickou zkratku a výskyt v přírodě ukazuje tabulka 2. Zdrojem SFA v potravě člověka jsou především potraviny živočišného původu (Svačina, Bretšnajdrová, 2008b).
24
Tab. 2 Přehled nasycených MK (Kraml, 2008) Triviální název
Počet uhlíků Zkratka
Výskyt
K. octová
C2
2:0
K. propionová
C3
3:0
K. máselná
C4
4:0
K. valerová
C5
5:0
K. kapronová
C6
6:0
K. kaprylová
C8
8:0
K. kaprinová
C10
10:0
zvl. v tucích rostlinného původu, ale i v másle
K. laurová
C12
12:0
kokosový olej, bobkový list, vorvaňovina
K. myristová
C14
14:0
kokosový olej, muškát
K. palmitová
C16
16:0
K. stearová
C18
18:0
hojně ve všech živočišných i rostlinných tucích
K. arachová
C20
20:0
podzemnicový olej
K. behanová
C22
22:0
semena rostlin
K. lignocerová
C24
24:0
podzemnicový olej
produkty trávení sacharidů v bachoru přežvýkavců a v tlustém střevě člověka produkty trávení sacharidů v bachoru přežvýkavců, částečně v másle a jiných tucích
3. 3. 2 Mononenasycené mastné kyseliny Mononenasycené MK (monounsaturated fatty acids, MUFA) obsahují ve své molekule pouze jednu dvojnou vazbu (Ganong, 2005). Bohatým zdrojem MUFA je např. olej z řepky olejné, dále olivový, slunečnicový nebo konopný olej. Všechny tyto oleje jsou za normálních podmínek tekuté. MUFA přítomné v potravě mají dvojnou vazbu
lokalizovanou na 7., resp. 9. uhlíku z methylového konce (Svačina,
Bretšnajdrová, 2008b).
Nejdůležitější zástupci jsou: Kys. olejová
n-9 18:1
Kys. myristolenová n-7 14:1 Kys. palmiolejová
n-7 16:1
Kys. eikosanová
n-9 20:1
Kys. eruková
n-9 22:1
25
3. 3. 3 Polynenasycené mastné kyseliny Polynenasycené MK (polyunsaturated fatty acids, PUFA) obsahují ve své molekule více než dvě dvojné vazby. Ve výživě člověka se řadí k nejvýznamnějším a nejprospěšnějším MK. Byl prokázán pozitivní účinek PUFA na lidské zdraví, a to především
v oblasti
kardiovaskulárního
systému,
vývoje
mozku
u plodu
a u novorozenců, demence a kognitivních funkcí (Komprda, 2012). Mezi PUFA se řadí i esenciální MK, tj. takové, které si lidský organismus nedokáže sám syntetizovat a musí být tedy přijímány v potravě (Keresteš, 2011). Pro člověka jsou esenciální dvě MK, a to kys. linolová (LA) a kys. α-linolenová (LNA). LA je výchozím metabolitem PUFA řady n-6, LNA je výchozím metabolitem PUFA řady n-3 (Komprda, Zelenka, 2006). Z LA resp. LNA je lidský organismus schopen dále syntetizovat další potřebné metabolity v rámci obou řad, a to pomocí enzymů desaturáz (zvyšují počet dvojných vazeb) a elongáz (prodlužují molekulu MK). Ve výživě člověka je velmi důležitý vyvážený poměr příjmu MK řady n-6 a n-3 v potravě. Doporučená hodnota poměru n-6/n-3 je 5. Tato hodnota není ale skutečně optimální, jedná se pouze o kompromis mezi skutečně ideální hodnotou 1 a hodnotou, která je v současnosti běžná v rámci stravy západního typu (hodnota 10-20) (Komprda, 2007). Fyziologicky nejvýznamnějším metabolitem LA je kys. arachidonová (C 20:4 n-6). Fyziologicky nejvýznamnějším metabolitem LNA je kys. eikosapentaenová (EPA, C 20:5 n-3) a kys. dokosahexaenová (DHA, C 22:6 n-3) (Poudyal et al., 2011). Konečnými metabolity obou řad PUFA jsou tzv. eikosanoidy (cyklické struktury s dvaceti uhlíky), které mají velmi důležité fyziologické vlastnosti. Do skupiny eikosanoidů patří mimo jiné prostaglandiny (PG), tvořené v trombocytech, leukotrieny (LT), tvořené v endotelových buňkách a tromboxany (TA), vznikající v leukocytech. Uvedené
eikosanoidy
jsou
látky
vasoaktivní
(působí
vasokonstrikčně
nebo
vasodilatačně) a dále působí na agregaci trombocytů. Eikosanoidy pocházející z řady n-3 mají velice rozdílné fyziologické účinky než ty, které pocházejí z řady n-6 (Das, 2006). Zjednodušené schéma metabolismu esenciálních MK popisuje obrázek 5. Z uvedeného přehledu je patrné, že PUFA mají výrazný vliv na činnost a funkční stav cév, resp. ovlivňují proces aterogeneze a v konečném důsledku možný vznik SCO. Z PUFA n-6 vznikají eikosanoidy řady 2, které působí prozánětlivě, vasokonstrikčně a způsobují agregaci trombocytů. Z PUFA n-3 vznikají eikosanoidy řady 3, které působí právě opačně, tzn. protizánětlivě, vasodilatačně a působí proti shlukování trombocytů (Wall et al., 2010). V konečném důsledku tedy můžeme konstatovat, že PUFA n-3 26
snižují
riziko
vzniku
SCO
(infarktu
myokardu,
mozkové
příhody
apod.),
tzv. autoimunitních onemocnění (artritida, psoriáza) a rakoviny. Pokud jsou PUFA n-6 přijímány v nadbytku působí v daném smyslu právě opačně, tedy rizika daných onemocnění zvyšují (Komprda, 2007). Mastné kyseliny řady n-6 (zejm. LA) se vyskytují ve slunečnicovém nebo sójovém oleji. Mastné kyseliny řady n-3 mají dva hlavní zdroje – rostlinné a živočišné. Mezi rostlinné zdroje patří především řepkový a lněný olej (obsahující ALA) (Boháčová, 2012) a mezi živočišné zdroje se řadí ryby (především tučné), rybí tuk a mořské plody, které obsahují EPA a DHA (Larsen et al., 2011)
Obr. 5 Zjednodušené schéma metabolizmu esenciálních MK (Komprda; 2007) 27
Výzkum v Lázních Jeseník byl zaměřen na účinek jogurtu, který byl obohacen polynenasycenými MK řady n-3. U obézních pacientek byla nasazena redukční dieta (6000 kJ.den-1), byla zařazena individuální pohybová aktivita a byl jim podáván 1 jogurt denně. Jogurt byl obohacen PUFA v dávce 790 mg, z toho EPA + DHA v dávce 620 mg. U kontrolní skupiny byl podáván jogurt stejného složení bez přídavku PUFA. V průběhu podávání jogurtů obohacených PUFA denně po dobu 3 týdnů současně s redukční dietou bylo zjištěno průkazné zvýšení hladiny HDL (Kunešová, 2011). Hlavní roli v udržení a zlepšení zdravotního stavu populace se v současnosti jeví snížení hladiny LDL, zvýšení hladiny HDL a zlepšení celkového lipidového profilu. Tohoto lze podle mnoha studií (Harland, 2012; Lecker et al., 2011; Schulze, 2012) docílit i bez farmakologické léčby, pomocí vhodných potravin. Mezi velmi vhodné potraviny, resp. účinné látky se řadí zejm. rostlinné stanoly a steroly, sójový protein, beta-glukany, ořechy, rostlinné oleje, potraviny bohaté na vlákninu a v neposlední řadě také rybí tuk (Harland, 2012; Lecker et al., 2011; Schulze, 2012). Příznivý vliv složek rybího oleje, především EPA a DHA, na snížení rizika kardiovaskulárních onemocnění, zlepšení dyslipidémie, prevenci rakoviny, snížení rizika ischemické choroby srdeční nebo snížení hypertenze byl publikován již mnohokrát (Given, Gibbs, 2008; Prato, Biandolino, 2012; Simopoulos, 2002; Sidhu, 2003).
3. 4 Lipoproteiny Potravou přijatý tuk a lipidy syntetizované játry a tukovou tkání se musí transportovat do různých tkání a orgánů, aby zde mohly být využity nebo uloženy. Lipidy jsou látky hydrofobní, a proto nemohou být samostatně transportovány ve vodném prostředí (krevní plasma). Nepolární lipidy (TAG a estery cholesterolu) se vážou na polární (amfipatické) lipidy (fosfolipidy a cholesterol) a proteiny, takže vznikají lipoproteiny (LP) mísitelné s vodou (Koolman, Röhm, 2012). Schematické znázornění lipoproteinové částice je na obrázku 6. Optimální zastoupení jednotlivých lipoproteinů, cholesterolu a TAG je uvedeno v příloze 2.
28
Obr. 6 Schéma lipoproteinové částice (www4)
Rozeznáváme čtyři základní skupiny lipoproteinů, které jsou fyziologicky důležité. Jsou to chylomikrony, které pocházejí ze střevní resorpce triacylglycerolů. Lipoproteiny o velmi nízké hustotě (VLDL, very low density lipoproteins), které jsou jaterního původu a exportují TAG. Lipoproteiny o nízké hustotě (LDL, low density lipoproteins) a lipoproteiny o vysoké hustotě (HDL, high-density lipoproteins) se účastní metabolismu
VLDL
a
chylomikronů
a
také
v cholesterolovém
transportu.
Triacylglycerol je v chylomikronech a VLDL převažujícím lipidem, zatímco cholesterol a fosfolipidy jsou převládajícími lipidy v LDL resp. v HDL (Murray, 2002). Přehled složení lipoproteinů v plasmě člověka uvádí tabulka 3. Tab. 3 Lipoproteiny plasmy (Češka, 1999) Třída
Chylomikrony
VLDL
IDL
LDL
HDL
Hustota (g/ml)
< 0,94
1,006
1,019
1,063
> 1,21
Velikost (nm)
75-1200
28-75
32
22
7-10
Cholesterol (%)
3
17
41
59
38-43
Triglyceridy (%)
88
56
32
7
6-7
Fosfolipidy (%)
9
19
27
28
41-42
Proteiny (%)
1-2
10
18
25
40-55
29
3. 5 Metabolismus lipidů a MK Regulace lipidového a lipoproteinového metabolismu je řízena řadou genů. Modulací exprese těchto genů se organismus adaptuje na změny aktuální energetické potřeby (Afman, Müller, 2012). Exprese genů, které zásadním způsobem kontrolují a řídí lipidový metabolismus, je řízena nukleárními receptory (Kaput, Rodriguez, 2004). Navázáním příslušných ligandů se aktivují nukleární receptory, váží se na cílové geny, a tak umožňují jejich transkripci. Hlavními transkripčními faktory je skupina PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor) a skupina SREBP (sterol regulátory element-binding protein). Dalšími transkripčními faktory jsou HNF-4α (hepatic nuclear factor
4α)
a
LXR
(liver
X
receptor)
(Jump,
2004).
Mastné
kyseliny,
zejm. polynenasycené mastné kyseliny působí jako významné nutrientové ligandy pro PPAR a SREBP (Nakamura et al., 2004).
3. 5. 1 Genová exprese Molekuly DNA obsahují informaci k ovládání aktivit buněk a k řízení vývoje, fungování a chování organismů, které tyto buňky obsahují. Tato informace je zakódována v sekvencích nukleotidů uvnitř molekul DNA tvořících genom. Strukturou a funkcí celých genomů se zabývá podobor genetiky, který se nazývá genomika (Snustad, Simmons, 2009). Relativně novými podobory genetiky jsou nutrigenetika a nutrigenomika, které mají velký budoucí potenciál, jak pro genetiku a související obory, tak i pro dietologii a související obory (Ferguson, Barnett, 2012). Nutrigenetika je vědní obor, který se zabývá vlivem jednotlivých genetických polymorfizmů na reakci jedince na látky přijímané v potravě. Nutrigenomika je vědní obor, který se zabývá vztahem mezi celkovou genetickou informací (genomem, transkriptomem) a individuální reakcí na látky přijímané v potravě (Šeda, Šedová, 2005). Nutrigenomika využívá technologie genomiky k tomu, aby odhalila, jak složky potravy mohou ovlivňovat genovou expresi a celkový metabolismus organismu (Afman, Müller, 2012).
30
3. 5. 1. 1 PPAR
PPAR
(peroxisome
proliferator
activated
receptors;
receptory aktivované
peroxizomovými proliferátory) jsou nukleární transkripční faktory, které patří do velké skupiny steroidních receptorů (Das, 2006). Původně byly objeveny u hlodavců jako regulátory proliferace peroxisomů, odtud pochází jejich název. Tato skutečnost ovšem nemá s metabolismem lipidů žádnou přímou souvislost (Haluzík, Svačina, 2005). Rozlišujeme 3 typy: PPAR-α, PPAR-δ (někdy označované PPAR-β/δ) a PPAR-γ. Přestože jsou si navzájem velmi podobné, mají rozdílné biologické funkce a jinou lokalizaci (Charoensuksai, Xu, 2010). Funkce, lokalizace a ligandy jednotlivých PPAR zobrazuje tabulka 4.
Tab. 4 Funkce, lokalizace a ligandy jednotlivých PPAR (Kraml, 2008)
Nukleární TF
Lokalizace
Přirozené Syntetické ligandy
ligandy
játra, kosterní sval, PPAR-α
myokard, ledvina, monocyty/makrofágy
Funkce Zvýšení vychytávání MK a
MK
fibráty
(v cévní stěně)
oxidace MK Snížení hladin TAG Zvýšení hladin HDL Snížení tvorby malých LDL Zvýšení oxidace MK
PPARβ/δ
většina tkání
Snížení hladin TAG ?
MK
Zvýšení hladin HDL ? Snížení tvorby malých LDL ? Zvýšení ukládání MK v tukové
tuková tkáň, kosterní
tkáni
sval, PPAR-γ
monocyty/makrofágy
MK
thiazolidindiony
(v cévní stěně), kolon
Zvýšení diferenciace adipocytů Snížení glykémie Zvýšení inzulínové senzitivity Zvýšení hladin HDL ? Snížení hladin TAG ?
31
Mechanismus fungování PPAR lze zjednodušeně popsat v několika krocích (schéma na obrázku 7). Ligand (např. DHA) prochází cytoplasmatickou membránou a naváže se na PPAR. Tímto dochází ke konformační změně a aktivaci PPAR. PPAR spolu s RXR (retinoid X receptor) vytváří heterodimerní komplex a přechází do buněčného
jádra.
Tento
komplex
PPAR/RXR
se
následně
váže
přímo
na rozpoznávací sekvenci na řetězci DNA, tzv. PPAR responsive element. PPAR responsive element se skládá ze dvou přímo se opakujících nukleotidových sekvencí AGGTCA.
Výsledkem
celého
procesu
je
exprese
cílového
genu
(Nakamura et al., 2004).
Obr. 7 Mechanismus fungování PPAR (zpracováno podle Komprdy, 2012 a Nakamury, 2004)
MK (dále také eikosanoidy) jsou považovány za endogenní ligandy všech typů PPAR. SFA, MUFA a PUFA s rozdílnou délkou řetězce mají různou afinitu k jednotlivým PPAR, všechny MK mají však největší afinitu k PPAR-α (Haluzík, Svačina, 2005). Obecně lze konstatovat, že všechny typy PPAR více váží PUFA ω3 a ω6 s 18-22 uhlíky než MUFA nebo SFA (Nakamura et al., 2004).
32
3. 5. 1. 2 SREBP
SREBP (Sterol regulatory element-binding proteins) jsou skupina nukleárních transkripčních faktorů, které zásadním způsobem regulují expresi genů zúčastněných v syntéze MK, TAG, fosfolipidů a cholesterolu. Zatím byly popsány 3 typy: SREBP 1a, SREBP 1c a SREBP 2 (Müller-Wieland, 2002). SREBP 1c preferenčně aktivuje syntézu TAG a fosfolipidů. SREBP 1a a SREBP 2 aktivují geny pro syntézu a transport cholesterolu (Nakamura et al., 2004). Cholesterol a další steroly, ale i MUFA a PUFA, jsou přirozenými inhibitory působení SREBP. Neváží se ale na ně jako ligandy (jako je tomu např. u PPAR), ale regulují jejich dostupnost pro jejich následný účinek v jádře (Worgall et al., 2002). Všechny SREBP jsou syntetizovány jako inaktivní transkripční prekurzory uložené v endoplazmatickém retikulu (ER). Proteolytickými enzymy jsou odštěpovány z membrán Golgiho komplexu a jako aktivní TF migrují do jádra (Soccio, Breslow, 2004). V jádře se váží na specifickou část promotorové oblasti cílového genu – sterol response element SRE (Dif et al., 2006). SREBP je v ER vázán na dva proteiny – SCAP (SREBP-cleavage activating protein) a INSIG 1 (Insulin-induced gene 1 protein). Je-li v buňce dostatek cholesterolu, SREBP zůstává navázán na proteiny. Při poklesu hladiny intracelulárního cholesterolu se INSIG 1 uvolní z komplexu SREBP-SCAP. Tímto je umožněna migrace komplexu SREBPSCAP z ER do Golgiho komplexu (pomocí transportního proteinu COP II). V Golgiho komplexu působí na SREBP dvě proteasy – S1P a S2P (site 1 protease, resp. site 2 protease). Jejich působením dochází k odštěpení SREBP od SCAP a jako dimer je transportován do jádra (pomocí přenašeče Importin β). V jádře se dimer SREBP váže na SRE řady genů, a umožňuje tak jejich transkripci. Jedná se především o gen pro HMG-Co-A-reduktasu a gen pro LDL receptor (Kraml, 2008). Celý proces je velmi složitý
a zahrnuje
mnoho
mezikroků.
Zjednodušené
na obrázku 8.
33
schéma
je
znázorněno
Obr. 8 Regulace syntézy cholesterolu pomocí SREBP (zpracováno podle Kramla, 2008 a Komprdy, 2012)
pSREBP
prekurzorová forma SREBP
SREBP
sterol regulatory element-binding proteins
SCAP
SREBP-cleavage activating protein (protein aktivující štěpení SREBP)
INSIG 1
Insulin-induced gene 1 protein (insulinem stimulovaný gen)
ER
endoplazmatické retikulum
S1P
protéza štěpící prekurzorovou formu SREBP (site-1 protease)
S2P
protéza štěpící prekurzorovou formu SREBP (site-2 protease)
34
3. 5. 1. 3 Vliv DHA na homeostázu cholesterolu
Jak již bylo řečeno výše, EPA (C 20:5 n-3) a DHA (C 22:6 n-3) jsou fyziologicky nejvýznamnější metabolity kyseliny α-linolenové. Je průkazně potvrzeno, že PUFA n-3 (zejm. EPA a DHA) snižují riziko ischemické choroby srdeční, snižují krevní tlak, snižují riziko vzniku některých typů rakoviny (Mateos, Lewandowski, Su, 2012), působí preventivně proti kardiovaskulárním onemocněním (Prato, Biandolino, 2012; Poudyal et al., 2011), pozitivně ovlivňují koncentraci TAG a pozitivně působí na metabolický syndrom (Huertas-Lopez, 2012). DHA ovlivňuje homeostázu cholesterolu složitým procesem, který obsahuje mnoho mezikroků, a může mít ve výsledku dva protichůdné vlivy. Zjednodušené schéma ukazuje obrázek 9. DHA se přesouvá přes plazmatickou membránu do jádra buňky a působí aktivaci transkripčních faktorů PPAR a SREBP. Tímto dochází k iniciaci transkripce dvou genů – gen pro HMG-CoA-R (3-hydroxy-3-metylglutaryl koenzym A reduktáza) a gen pro LDL-R (LDL-receptor). HMG-CoA-R je klíčový enzym syntézy cholesterolu, určuje rychlost syntézy cholesterolu a ovlivňuje celý metabolismus cholesterolu v organismu. LDL-receptor (pro lipoproteiny nízké hustoty) má obrovský význam pro přenos lipidických frakcí z krevního oběhu do buněk. DHA také stimuluje fosforylaci kináz, čímž dochází k fosforylaci zbylé části SREBP. Vazba fosforylované formy SREBP na DNA je inhibována. Tímto mechanismem dochází k inhibici enzymu HMG-CoA-R, důsledkem toho je snížení koncentrace cholesterolu v krevním oběhu. Naproti tomu dochází také k inhibici genu pro LDL-receptor, tím je potlačena syntéza dané bílkoviny a sníží se množství LDL-receptoru. Výsledkem je snížení vstupu cholesterolu do buňky (Komprda, 2012). Zde se střetávají dva protichůdné vlivy: HMG-CoA-R způsobuje snížení koncentrace cholesterolu v krvi, ale LDL-R způsobuje zvýšení koncentrace cholesterolu v krvi. Důsledkem tohoto mechanismu je hypotéza, že PUFA n-3
snižuje
hladinu
plazmatického
mechanizmům může dojít i k opaku (Sato, 2010).
35
cholesterolu,
ale
kvůli těmto
Obr. 9 Vliv DHA na homeostázu cholesterolu (zpracováno podle Komprdy, 2012 a Sato, 2010)
1) DHA přímo aktivuje PPARα 2) DHA vytěsňuje cholesterol z plazmatické membrány 3) DHA stimuluje fosforylaci kináz 4) aktivovaný PPARα aktivuje gen Insig 5) zvýšení množství proteinu INSIG v membráně endoplazmatického retikula 6) SREBP-2 je zadržen v membráně endoplazmatického retikula 7) snížení množství aktivní formy SREBP-2 8) zbylá část SREBP-2 je fosforylována 9) inhibice vazby fosforylované formy SREBP-2 na DNA
36
3. 6 Metody molekulární biologie pro detekci a kvantifikaci genové exprese Vliv výživy na lidské zdraví je dnes prokázaný. Avšak až nedávný rozvoj biochemických a molekulárně biologických metod umožnil detailnější objasnění mechanismů působení jednotlivých složek potravy (Šeda, Šedová, 2004). Pomocí analýzy transkriptomu, proteomu a metabolomu je nám schopna nutriční genomika poskytnout koncepci individualizované výživy. Personalizovaná výživa respektuje nejen kvantitativní a kvalitativní potřeby jedince a jeho aktuální zdravotní stav, ale i genetické dispozice jedince. Hlavním cílem tohoto relativně nového oboru je zabránit vzniku některých onemocnění, jako je obezita, hypertenze nebo diabetes mellitus 2. typu (Kaput, Rodriguez, 2004). Většina metabolických pochodů v lidském těle je katalyzována bílkovinnými enzymy. Sekvence AMK všech proteinů je kódována DNA. Aby bylo možné vytvoření funkčních enzymů (i všech ostatních bílkovin) je potřeba převést informaci zakódovanou v DNA do proteinů. Proces exprese genů lze rozdělit do dvou hlavních fází: transkripce a translace (plus další fáze jako jsou posttranskripční a posttranslační úpravy). Metody analýzy genové exprese můžeme nejjednodušeji rozdělit na dvě skupiny: studium transkripce a studium translace (Pritchard, Korf; 2007). V současnosti dochází k neustálému vývoji nových metod, které se využívají ke studiu genové exprese. Jedna z nejpoužívanějších technik molekulární biologie je dnes polymerázová řetězová reakce (PCR = polymerase chain reaction). Polymerázová řetězová reakce byla objevena v roce 1985 Kary B. Mullisem, který za tento objev dostal v roce 1993 Nobelovu cenu (Brown, 2007). PCR napodobuje replikaci in vivo, jedná se tedy o techniku, která selektivně amplifikuje úsek nukleové kyseliny in vitro. (Mazura a kol., 2001) V této práci se zaměřím na dvě modifikované metody PCR: reverzně transkripční PCR a real-time PCR.
3. 6. 1 Reverzně-transkripční PCR Reverzně-transkripční PCR je metoda určená k amplifikaci molekul RNA (Obr. 10 a Obr. 11). RNA nemůže sloužit jako templát pro PCR, a proto je nutné izolovanou RNA nejdříve převést na cDNA zpětnou (reverzní) transkriptázou. Od toho je odvozen název této metody (Šmarda a kol., 2010). Enzym reverzní transkriptáza katalyzuje
37
syntézu řetězců DNA, které jsou komplementární k templátům RNA. Výsledné řetězce DNA se mohou převést na dvojřetězcovou DNA pomocí několika různých metod. Jedná se například o metodu s použitím druhého primeru a tepelně stabilní Taq DNApolymerázy. Výsledné molekuly DNA se následně amplifikují při standardní PCR (Snustad et al., 2009).
Obr. 10 Detekce a amplifikace RNA pomocí reverzně-transkripční PCR (Snustad et al., 2009)
38
Obr. 11 Syntéza dvojřetězcových cDNA z molekul mRNA (Snustad et al., 2009)
Citlivost této metody je velmi vysoká, a tak umožňuje detekci specifické mRNA v jediné buňce. Hlavní výhoda této metody spočívá v možnosti detekce takových molekul
mRNA,
které se
v buňce
vyskytují
ve
velmi
nízkých
hladinách
(Šmarda a kol., 2010).
3. 6. 2 Real-time PCR Real-time PCR je metoda molekulární biologie, která je založena na principu klasické PCR. Při klasické PCR je obvykle amplifikovaný produkt detekován pomocí gelové elektroforézy až po ukončené PCR reakce (Šmarda a kol., 2010). Při metodě real-time PCR je produkt detekován a měřen po každém proběhnutém cykle, což
39
umožňuje detekci produktu a zároveň kvantifikaci předvoleného množství templátu. Velkou výhodou této metody je to, že odpadá potřeba gelové elektroforézy. Při realtime PCR je možné pracovat také s RNA, potom se tato metoda nazývá real-time RT PCR. Tato metoda je používána především na expresní analýzy, při kterých je díky vysoké citlivosti a lehkému provedení ideální metodou pro detekci a kvantifikaci mRNA (Leong et al., 2007; Bustin, 2000). Detekce PCR produktu v průběhu reakce je umožněna přidáním fluorescenční barvy do reakční směsi. Množství PCR produktu je přímo úměrné měřené fluorescenci. Reakce probíhá ve speciálním cykleru, který po každém cykle měří fluorescenci a údaje zaznamenává. Tyto údaje jsou poté zpracovány softwarem, který sestrojí graf křivky amplifikační reakce, kde na ose x leží počty jednotlivých cyklů a na ose y naměřená fluorescence. Křivka amplifikační reakce (Příloha 3) má dvě fáze – exponenciální a neexponenciální. V exponenciální fázi se v každém cyklu množství PCR produktu zdvojnásobí. V neexponenciální fázi došlo k vyčerpání některého z komponentů reakce, a proto se množství PCR produktu dále nezvyšuje. Na počátku reakce je fluorescence nízká a nedekovatelná. V průběhu reakce se postupně zvyšuje množství PCR produktu, čímž se zvyšuje i měřená fluorescence. Právě ten cyklus, ve kterém se nahromadilo dostatečné množství PCR produktu, aby byla fluorescence detekovatelná, se nazývá treshold cycle (CT). Hodnoty treashold cyklu jsou pro jednotlivé vzorky různé a závisí od počátečního množství teplátu. Čím vyšší je množství templátu, tím méně cyklů stačí k dosažení detekovatelné fluorescence a tím nižší hodnotu CT má daný vzorek. (Bustin, 2000) Pro ověření spolehlivosti reakce slouží standardní (kalibrační) křivka. Pro sestrojení standardní křivky je potřeba provést reakci s ředící řadou templátu. Standardní křivka se sestrojí vynesením logaritmu množství templátu (nebo ředícího faktoru), proti hodnotě CT pro dané ředění. Standardní křivka je většinou sestrojena pomocí softwaru, který vypočítá i korelační koeficient. Korelační koeficient nás informuje o tom, jaká je variabilita mezi replikacemi a zda je amplifikace stejně efektivní pro různé počáteční koncentrace templátu. Korelační koeficient nám také ukazuje chybu při ředění a při pipetování. Optimální hodnota korelačního koeficientu je ≥ 0,990 (Dorak, 2006). PCR produkty je možné ověřit analýzou křivky tání (melt-curve analysis). Po ukončení PCR reakce je postupně zvyšována teplota a zároveň je měřená fluorescence. S rostoucí teplotou dochází k denaturaci PCR produktů, čímž klesá fluorescence. Změna fluorescence je vnesena do grafu jako funkce změny teploty. Jednotlivé vrcholy křivky 40
představují PCR produkty, charakteristické svou teplotou tání (Tm). Tato analýza nám umožňuje odhalit nespecifické amplifikace i bez gelové elektorforézy (Dorak, 2006). Existují dva základní typy chemických přístupů využívaných v real-time PCR: přidání nespecifických interkalačních fluorescenčních látek, např. SYBR Green, YOPRO-1, etidium bromid do reakční směsi (Mackay et al., 2002) nebo použití sekvenčně specifických primerů a prób, např. TaqMan, molecular beacons, scorpions primer (Bustin, 2000). Nenavázaný SYBR Green I vykuzuje nízkou fluorescenci.
Má schopnost se
nespecificky navázat na DNA, což vede ke značnému zvýšení fluorescence. V PCR reakci se váže na nově vznikající dvojvláknové úseky při extenzi primerů, a tím dochází k zvýšení fluorescenčního signálu, který je měřený po každé extenzi. Vzhledem k nespecifické vazbě na DNA dochází k začlenění i do nespecifických PCR produktů nebo do dikérů, které mohou vznikat spojením primerů. Tímto může dojít k nepřesnostem a zkreslení výsledků. Nespecifické produkty se dají detekovat analýzou křivky tání (Bustin, 2004). Výhodou nespecifických fluorescenčních barviv je nízká cena a jednoduchost práce. Při vhodném návrhu pokusu a optimalizaci PCR reakce je možno dosáhnout výsledků srovnatelných
s TaqMan,
který
většinou
zajišťuje
vyšší
specificitu
reakce
(Ponchel et al., 2003). Jednou z nevýhod tohoto postupu je to, že není možné tento postup využít při multiplex reakci (reakce s několika páry primerů v jedné zkumavce), protože není možné odlišit fluorescenční signál jednotlivých amplikonů ve zkumavce (Bustin, 2004). Při použití značených oligonukleotidů a prób se využívá schopnost fluorescenčně rezonančního přenosu energie (FRET) mezi fluorofórem a zhášečem, popř. jiný princip zhášení fluorescence. FRET je spektroskopický proces přenosu energie mezi dvěmi molekulami vzdálenými až 100 Å (Mackay et al., 2002). Tento postup se používá, aby zabránil fluorescenci próby nebo značeného oligonukleotidu před jejich specifickým navázáním při amplifikaci produktu. Nejpoužívanější technologií je TaqMan, která využívá značenou sondu. TaqMan, vyžaduje kromě sekvenčně specifických primerů také přítomnost sekvenčně specifické TaqMan próby, která na svém 5´ konci nese fluorescenční reportérovou molekulu a na 3´ konci zhášač fluorescence. Intaktní próba nevykazuje žádnou fluorescenci, kvůli blízkosti reportéru a zhášeče. Při annealingu hybridizuje próba na cílovou sekvenci ve směru extenze nového řetězce. 5'-3' exonukleázová aktivita DNA-polymerázy odštěpí při extenzi primeru reportérovou 41
molekulu, ta se uvolní v blízkosti zhášeče a následně dojde k uvolnění fluorescence, která je detekovaná (Bustin, 2000). Výhodou použití značených sond je vysoká specificita reakce. Mezi nevýhody patří složitější design prób a s tím spojená finanční náročnost. Jak už bylo uvedeno, hlavní předností real-time PCR je možnost stanovení počátečního množství templátu. Je možné použít absolutní nebo relativní kvantifikaci templátové DNA. Absolutní kvantifikace udává přesné množství templátu na začátku reakce v daných jednotkách (μg, copy number), často přepočítané na množství tkáně nebo počet buněk. Relativní kvantifikace zaznamenává změny v expresi genu (v množství templátu) mezi vzorky a vyjadřuje je v poměru k množství jiné DNA, která slouží jako standard nebo referenční gen. Kvantifikace je tedy raletivní – udává množství templátu vzhledem k množství templátu v jiném vzorku. Pro relativní i absolutní kvantifikaci je vyvinuto několik matematických metod pro zpracování dat (Bustin, 2000; Pfaffl, 2001). Spektrum technologií real-time PCR umožňuje použití této metody v nejrůznějších aplikacích a oborech. Nejvíce rozšířené je použití real-time PCR v molekulární diagnostice, např. při detekci a kvantifikaci lidských virů (herpes simplex virus, virus lidského cytomegaloviru), rostlinných virů nebo plísní a bakteriálních patogenů (Mackay et al., 2002; Mason et al., 2008; Webster et al., 2004; Brouwer et al., 2003). Real-time PCR slouží také k detekci a stanovení obsahu geneticky modifikovaných organismů ve vzorcích potravin (Hernández et al., 2001; Mäde et al., 2006) a na stanovení alergenů v potravinách (Hupfer et al., 2007; Pafundo et al., 2009; Wu et al., 2010). Díky možnosti kvantifikovat počáteční množství templátu je real-time PCR často využívána při studiu exprese genů. Vzhledem k širokému využití této metody se dá v budoucnosti předpokládat velký rozvoj technologie real-time PCR. V současnosti se objevují systémy umožňující real-time PCR na mikročipu o velikosti mikroskopového krycího sklíčka (Mumford et al., 2006). Další nově vyvíjená metoda je real-time PCR na mikročipu, kde je množství amplifikované DNA po každém cyklu detekované měřením elektrochemického signálu (Yeung et al., 2008).
42
3. 6. 3 Metody pro hodnocení relativní kvantifikace Nejběžnější metodou pro výpočet relativní kvantifikace je 2-ΔΔCT (Livak et al., 2001; APPLIED BIOSYSTEMS, 2001; Vanguilder et al., 2008). Tato metoda je závislá na dvou předpokladech. Zaprvé, že reakce probíhá se 100% účinností, tzn., že se v každém cyklu množství kopií zdvojnásobí. Druhým předpokladem je existence genů, které jsou exprimované na konstantní úrovni mezi vzorky. Tyto endogenní kontroly se potom používají pro korekci jakéhokoliv rozdílu v množství RNA při reverzní transkripci. Volba endogenní kontroly je nevyhnutelná pro plné využití kvantifikačního potenciálu. Normalizace k referenčnímu genu slouží pro interní kontrolu chyb v realtime PCR. Normalizace využívá endogenní kontroly – referenčního genu (tzv. housekeepingu). Hodnota exprese referenčních genů by měla být podobná u všech vzorků ve studii, měla by být odolná vůči podmínkám experimentu a procházet všemi kroky amplifikace se stejnou kinetikou jako cílový gen (Vanguilder et al., 2008; Huggett et al., 2005).
2 CT 2
( CT cíl . gen CT ref . gen ) vzorek ( CT cíl . gen CT ref . gen ) kalibrator
Vzhledem k tomu, že mnoho PCR reakcí nevykazuje ideální efektivitu (přítomnost inhibitorů, variabilita nukleotidů atd.), je vhodné stanovit efektivitu reakce a její hodnotu zahrnout do výpočtu (Postollec et al., 2011). Alternativní metoda zohledňuje skutečnou efektivitu reakce stanovenou podle standardních křivek, které jsou výsledkem amplifikací sériově ředěného vzorku (Bustin, 2002). Vzorec pro výpočet expresního poměru zahrnujícího korekci na efektivitu (E) uvádí Pfaffl (2001).
Použité zkratky: E cílový gen
efektivita reakce (stanovená podle standardních křivek) pro cílový gen
E referenční gen
efektivita reakce (stanovená podle standardních křivek) pro referenční gen
ΔcT(kalibrator-vzorek)
rozdíl CT hodnot mezi kalibrátorem a vzorkem 43
4 MATERIÁL A METODIKA
4. 1 Pokusná zvířata, podmínky chovu a krmné směsi Pokus byl proveden v experimentálním zařízení Ústavu výživy zvířat a pícninářství AF Mendelovy univerzity v Brně. Celý pokus probíhal v souladu se Zákonem na ochranu zvířat proti týrání č. 246/1992 Sb. Jako experimentální model pro tento pokus byl zvolen laboratorní potkan (Rattus norvegicus). Byli použiti dospělí samci (stáří 56 dnů) laboratorního potkana outbredního kmene Wistar albino z SPF chovu společnosti Bio Test, Konárovice, s.r.o., Česká republika. Pokusná zvířata (n=30) byla náhodně rozdělena na 3 hmotnostně vyrovnané pokusné skupiny po 10 potkanech. Potkani byli ustájeni v plastových boxech (53,5 x 32,5 x 30,5 cm) po 5 kusech. Při rozdělování zvířat do boxů byla brána v úvahu hmotnostní vyrovnanost v každém boxu. Jedinci v plastovém boxu byli barevně označeni pro identifikaci jedince. Počáteční živá hmotnost potkanů byla 368 ± 4 g pro kontrolní skupinu (MYPO), 366 ± 4 g pro experimentální skupinu krmenou KS s přídavkem lososového oleje (LOSOS) a 373 ± 4 g pro negativní kontrolní skupinu, krmenou KS s přídavkem palmového tuku (PALMA). Denně byla kontrolována spotřeba krmiva a v týdenním intervalu byla zvířata vážena a barevně značena. Pokus probíhal 48 dní. V pokusné laboratoři byla stálá teplota 23 ± 1°C, vlhkost vzduchu 60 % a světelný režim 12 hodin světlo a 12 hodin tma o maximální intenzitě 200 lx. Základním krmivem byla kompletní krmná směs pro myši a potkany (Biokron, Blučina, Česká republika), u dalších skupin bylo přimícháno 3 % palmového tuku (ASO, Česká republika), resp. 3 % lososového oleje (ARCO Feed, Česká republika). Krmné směsi i zdravotně nezávadnou vodu dostávali pokusní potkani ad libitum. Základní krmná směs byla složena z pšenice, ovsa, pšeničných klíčků, sójové moučky, extrudované sóji, kukuřice, sušeného mléka, sušené syrovátky, sušených kvasnic, mletého vápence, dihydrogenfosforečnanu vápenatého, chloridu sodného, Llyzinu a premixu vitamínů a minerálních látek. Experimentální dieta byla vytvořena smícháním pošrotované standardní krmné směsi a 3 % lososového oleje. Třetí krmivo, které bylo vytvořeno smícháním standardní krmné směsi s 3 % palmového tuku, sloužilo jako negativní kontrola. Standardní krmná směs byla obohacena adekvátním množstvím kukuřičného škrobu pro vyrovnání energetických hodnot krmiv a označena jako kontrola (MYPO). Celkové složení krmných směsí je zobrazeno v Tab. 5.
44
Zastoupení jednotlivých mastných kyselin a jejich příjem v krmné dávce jsou zobrazeny v Tab. 6.
Tab. 5 Celkové složení krmných směsí Krmivo
Složení
Složky (g.kg-1)
Živiny (g.kg-1)
M
L
P
Základní krmná směs
933
970
970
Kukuřičný škrob
67
0
0
Lososový olej
0
30
0
Palmový tuk
0
0
30
Hrubý protein
219
228
228
Tuk
25
56
56
Hrubá vláknina
47
49
49
Bezdusíkaté látky
709
667
667
15,2
15,2
15,2
Metabolizovatelná energie (MJ.kg-1)
M - MYPO - kontrolní krmivo (standardní krmná směs) L - LOSOS - experimentální krmivo (3% lososového oleje) P - PALMA - negativní kontrolní krmivo (3% palmového tuku)
45
Tab. 6 Zastoupení jednotlivých mastných kyselin a jejich příjem v krmné dávce
Mastná
Příjem
Obsah v krmné dávce
(mg.kg-1 živé hmotnosti.den-1)
(% ze sumy MK)
kyselina
[průměr ± směrodatná odchylka]
M
L
P
M
L
P
C 14:0
2,9
3,8
1,5
41 ± 2
65 ± 2
30 ± 1
C 16:0
22,1
15,2
33,8
373 ± 17
311 ± 10
766 ± 30
C 18:0
5,1
4,2
4,7
49 ± 4
73 ± 2
103 ± 4
C 18:1 n-9
25,9
35,0
38,2
440 ± 20
739 ± 25
866 ± 34
C 18:2 n-6
40,4
27,9
20,5
691 ± 32
585 ± 19
465 ± 19
C 18:3 n-3
3,6
4,8
1,3
54 ± 2
84 ± 3
30 ± 1
C 20:5 n-3
0,0
2,9
0,0
0±0
45 ± 2
0±0
C 22:5 n-3
0,0
2,0
0,0
0±0
26 ± 1
0±0
C 22:6 n-3
0,0
4,2
0,0
0±0
73 ± 2
0±0
M - MYPO - kontrolní krmivo (standardní krmná směs) L - LOSOS - experimentální krmivo (3 % lososového oleje) P - PALMA - negativní kontrolní krmivo (3 % palmového tuku)
4. 2 Použité chemikálie Palmový tuk (ASO, Česká republika) Lososový olej (ARCO Feed, Česká republika) Isofluran (Chiesi, Nicholas Piramal India Ltd., Londýn, Velká Británie) RNAlater (QIAGEN, Hilden, Německo) RNeasa Lipid Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Německo) QIAzol Lysis Reagent (QIAGEN, Hilden, Německo) Chloroform (SIGMA-ALDRICH, Inc., St. Louis, USA) Etanol (Riedel-de Haën, Německo) Pufr RPE (QIAGEN, Hilden, Německo) Pufr RW1 (QIAGEN, Hilden, Německo) FA pufr (Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Německo)
46
Agaróza SERVA for DNA electrophoresis (Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Německo) Etidium bromid (Top-Bio, Česká republika) Formaldehyd (SIGMA-ALDRICH, Inc., St. Louis, USA) Omniscript Reverse Transcription Kit (QIAGEN, Hilden, Německo) RT pufr (QIAGEN, Hilden, Německo) dNTP mix (QIAGEN, Hilden, Německo) oligo dT (QIAGEN, Hilden, Německo) Inhibitor RNáz (Carl Roth GmbH, Mexiko) Ultra H2O (Top-Bio, Česká republika) RNA-free H2O (QIAGEN, Hilden, Německo) AmpErase® Uracil N-glycosylase (Applied Biosystems, Warrington, Velká Británie) Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, Velká Británie) BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA)
4. 3 Použité přístroje Injekční jehly jednorázové (Dispolab, Česká republika) Injekční stříkačky (Dispolab, Česká republika) Heparinové zkumavky (Vacutest, Itálie) Automatický analyzátor BS-200 (Mindray, Čína) Homogenizér FastPrep (Thermo Savant, USA) Zkumavky Eppendorf (Thermo Scientific, Velká Británie) Pipety Finnpipette F1 (Thermo Scientific, Velká Británie) Centrifuga Mikro 120 (Hettich, Tuttlingen, Německo) Spektrofotometr NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA) Thermocykler 7500 Real-Time PCR Systém (Applied Biosystems, USA) Sekvenátor ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)
4. 4 Odběr vzorků krve pro stanovení cholesterolu Po ukončení pokusu, po 48 dnech, po 12-ti hodinovém půstu byla pokusná zvířata uvedena do narkózy pomocí inhalačního anestetika Isofluran (Chiesi, Nicholas Piramal
47
India Ltd., Londýn, Velká Británie). Pokusným zvířatům byl odebrán vzorek krve do heparinových zkumavek (Vacutest, Itálie) punkcí ze srdce. Z těchto vzorků byla stanovena koncentrace celkového cholesterolu, HDL-cholesterolu, LDL-cholesterolu a TAG.
4. 5 Stanovení celkového cholesterolu, HDL-cholesterolu, LDLcholesterolu a TAG Stanovení celkového cholesterolu, HDL-cholesterolu, LDL-cholesterolu a TAG probíhalo na ústavu Chemie a biochemie, MENDELU, pod vedením Ing. Jiřího Sochora, Ph.D. Koncentrace
celkového
cholesterolu
(TC),
HDL-cholesterolu
(HDL-C)
a triacylglycerolů (TAG) byla stanovena enzymaticko-kolorimetrickou metodou na automatickém analyzátoru BS-200 (Mindray, Čína) za použití komerčního protokolu (Greiner Diagnostics GmbH, Německo). LDL-cholesterol nebyl stanoven přímo, ale jeho koncentrace byla vypočítána podle Friedewalda et al. (1972): LDL-C = TC – HDL-C – TAG/5
Zkratky použité ve vzorci: LDL-C
LDL-cholesterol
HDL-C
HDL-cholesterol
TC
celkový cholesterol
TAG
triacylglyceroly
Veškeré hodnoty ve vzorci jsou v mmol.l-1
4. 6 Odběr vzorků tkání pro analýzu genové exprese Následovala pitva pokusných zvířat, při které byly odebrány vzorky jater pro analýzu genové exprese. Tkáně odebrané pro izolaci RNA (játra) byly okamžitě po odebrání ponořeny do 1,5 ml zkumavek s 1 ml reagentu RNAlater (QIAGEN, Hilden, Německo). Velikost odebraných tkání byla maximálně 0,5 cm. Vzorky byly uloženy přes noc při 4°C, aby RNAlater penetroval do vzorku. Následně byly zmraženy při teplotě -20°C. Před samotnou izolací mRNA byly vzorky vyjmuty z RNAlateru, byly
48
rychle zbaveny přebytečného roztoku pomocí papírového ubrousku a následně byla provedena izolace RNA.
4. 7 Izolace RNA RNA byla izolovaná ze vzorků jater (30 mg) pomocí RNeasy Lipid Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Německo) dle protokolu výrobce. Postup byl následující: Do 2 ml zkumavky se skleněnými kuličkami (0,2 ml malých + 0,2 ml velkých skleněných kuliček) se přidal 1 ml QIAzol Lysis Reagent (QIAGEN, Hilden, Německo) a 30 mg tkáně jater, nakrájené na kousky a směs se homogenizovala 2x10 s při stupni 6 ve FastPrepu (Thermo Savant, USA). Mezi jednotlivými kroky byla směs chlazená (aby nedegradovala RNA) a následně centrifugována 5 min./12000 rpm při 4 °C. Vzniklý lyzát se přepipetoval do čisté 1,5 ml zkumavky (Thermo Scientific, Velká Británie) a nechal se stát 5 minut při pokojové teplotě (15-25 °C). K lyzátu se přidalo 200 μl chloroformu (SIGMA-ALDRICH, Inc., St. Louis, USA), směs se důkladně protřepala (15 s) a nechala se stát 2-3 minuty při pokojové teplotě. Směs se zcentrifugovala 15 min./13000 rpm při 4 °C a následně se vzniklá horní fáze přepipetovala do čisté 1,5 ml zkumavky, přidalo se k ní stejné množství 70% etanolu (asi 400–450 μl) a směs se zhomogenizovala. Ze směsi se přeneslo max. 700 μl do kolonky umístěné
ve zkumavce.
Kolonka
se zkumavkou se zcentrifugovala
15 s/10000 rpm při pokojové teplotě a odpad ze zkumavky se odstranil. Zbylá směs se znovu napipetovala do kolonky jako v předcházejícím kroku a po centrifugaci se odpad odstranil. Do kolonky se napipetovalo 700 μl pufru RW1 (QIAGEN, Hilden, Německo) a proběhla centrifugace 15 s/10000 rpm, po které se odpad odstranil. Do kolonky se napipetovalo 500 μl pufru RPE (QIAGEN, Hilden, Německo) a proběhla centrifugace 15 s/10000 rpm po které se odpad odstranil. Do kolonky se znovu napipetovalo 500 μl pufru RPE a proběhla centrifugace 2 min./10000 rpm po které se odpad znovu odstranil. Kolonka se následně vložila do čisté 2 ml sběrné zkumavky a dodatečně se zcentrifugovala 1 min./13000 rpm. Po centrifugaci se kolonka přeložila do čisté 1,5 ml zkumavky a napipetovalo se do ní 30-50 μl RNA-free vody (QIAGEN, Hilden, Německo). Kolonka se zkumavkou se zcentifugovala 1 min./10000 rpm a odpad se odstranil. Do kolonky se napipetovalo znovu 30-50 μl RNA-free vody a kolonka se zkumavkou se zcentifugovala 1 min./10000 rpm, odpad se odstranil.
49
Následně se ověřila kvalita izolace RNA pomocí elektroforézy a změřila se koncentrace RNA na NanoDropu 2000 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA).
4. 8 Kontrola kvality izolované RNA Kvalita izolované RNA byla ověřena na 1,2% RNA gelu. Postup přípravy gelu (20 ml) byl následující: Do Erlenmeyerovy baňky bylo pomocí hodinového sklíčka naváženo 0,24 g agarózy, přidáno 2 ml 10x FA pufru a následně přidáno 18 ml destilované vody. Byla použita agaróza SERVA for DNA electrophoresis (Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Německo). Následně byla směs důkladně promíchána, rozvařena (aby se agar rozpustil), ochlazena na 65 ºC a bylo přidáno 4,8 μl etidium bromidu (Top-Bio, Česká republika) (0,5 mg/ml) a 0,36 ml formaldehydu (SIGMA-ALDRICH, Inc., St. Louis, USA) (12,3 M). Připravená směs byla nalita do vaničky a nechala se ztuhnout v digestoři. Po stuhnutí byla ponechána 30 minut v nádobě na elektroforézu spolu s 1x FA pufrem (Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Německo). Elektroforéza probíhala v 1x FA pufru při napětí 4 V.cm-1. Složení pufru je zaznačeno v Tab. 7. Množství nanášeného vzorku bylo 4 μl. Před nanesením byl vzorek smíchán s 5x RNA nanášecím pufrem, inkubován 3-5 minut při 65 ºC, následně zchlazen a nanesen na gel. Postup přípravy RNA gelu a nanášecího pufru je uvedený v Omniscript® Reverse Transcription Handbook (QIAGEN, Hilden, Německo). Koncentrace izolované RNA byla měřena spektrofotometrem NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA). Část izolované RNA byla ihned použita na reverzní transkripci, zbytek izolátu byl uchováván při – 80 ºC.
Tab. 7 Složení pufru pro elektroforézu složka/objem pufru
1000 ml 500 ml
150 ml
10 x FA pufr
100 ml
50 ml
15 ml
formaldehyd
20 ml
10 ml
3 ml
destilovaná voda
880 ml
440 ml
132 ml
50
4. 9 Reverzní transkripce Reverzní transkripce RNA byla provedena
pomocí Omniscript
Reverse
Transcription Kitu (QIAGEN, Hilden, Německo) a oligo dT primerů komplementárních k poly-A3´konci na mRNA. Aby bylo získáno dostatečné množství cDNA pro následující analýzy, pro každý vzorek bylo připraveno 3 x 20 μl reakční směsi podle protokolu výrobce:
Složení reakční směsi: Celkový objem:
20 μl - H2O (ad 20 μl) - 2 μl 10x RT pufr (QIAGEN, Hilden, Německo) - 2 μl dNTP mix (QIAGEN, Hilden, Německo) - 2 μl oligo dT (10 μM) (QIAGEN, Hilden, Německo) - 1 μl inhibitor RNáz (10 U.μl-1) (QIAGEN, Hilden, Německo) - 1 μl Omniscript Reverse Transcriptase (QIAGEN, Hilden, Německo) - 1 μg RNA
Reakční směs byla připravována na ledu a vzorky RNA byly na ledu také rozmrazovány, kvůli degradaci. Reakční směs byla homogenizována (ne však déle než 5 sekund) a inkubována 60 minut při 37ºC. Výsledná cDNA byla uchovávána při -20°C.
4. 10 Real-time PCR Nasledující analýzy byly uskutečněné na přístroji 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
4. 10. 1 Ověření a návrh primerů pro real-time PCR Primery pro real-time PCR byly navrhované na základě dostupných referenčních sekvencí a odborných publikací. (König et al., 2007; Castro et al., 2011). Primery, jejichž sekvence neprocházely přes intron se nedaly použít. Proto byly navrhnuté znovu a nejsou součástí uvedených publikací. Jedná se o primery
51
Insig1_2A + 2B, LDL_2A + 2B, PPARα_2A, β-aktin_2B. Získaná cDNA byla použitá nejprve pro ověření primerů pro real-time PCR. Specificita vzniklých produktů byla ověřená pomocí disociační křivky za následujícího teplotního profilu: 95ºC/15s; 60ºC/1min; 95ºC/30s; 60ºC/30s.
Identita každého fragmentu byla navíc ověřená
elektroforézou a sekvenováním PCR produktu s využitím BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitu a sekvenátoru ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Seznam primerů, sekvence, číslo referenční sekvence, délka PCR produktu a teplota annealingu (publikovaná, zjištěná) jsou uvedené v Tab. 8. Primery byly syntetizovány společností KRD (Česká republika).
Tab. 8 Seznam primerů, sekvence, číslo referenční sekvence, délka PCR produktu a teplota annealingu
Název
Referenční sekvence
Sekvence 5´- 3´
NM_02239 2.1 NM_02239 2.1
Insig1_2A
TCTTCCCGGACGAGGTGATAG
Insig1_2B
AGCTGCACATTATTGGCGAAAT
HMG-CoAR_1A
AAGGGGCGTGCAAAGACAATC
BC064654. 1
ACACGGCACGGAAAGAACCATAGT
BC064654. 1
HMG-CoAR_1B
NM_17576 2.2 NM_17576 2.2
LDL_2A
GGACAAGTCGGACGAGGAGAA
LDL_2B
AGCTGATGCACTCCCCACTGT
SREBP2_1A
ATCGGCCCACACTCACGCTCCTC
BC101902. 1
GGCCGCATCCCTCGCACTG
BC101902. 1
SREBP2_1B PPARα_2A
NM_01319 6.1 NM_01319 6.1 NM_03114 4.2 NM_03114 4.2
AGAGGAGAGTTCCGGAAG
PPARα_1B
GCCTTGTCCCCACATATTCG
β-aktin_1A
AGAGGGAAATCGTGCGTGAC
β-aktin_2B
GTTTCATGGATGCCACAGGATT
52
PCR (bp)
Ta publikovaná
(ºC)
Ta zjištěná (reálná)
(ºC)
229
-
65
408
57
60
206
-
65
312
65
65
201
65
117
65 65
217
60 -
4. 10. 2 Stanovení efektivity reakce Efektivita reakce byla stanovena pomocí standardní křivky. Standardní křivky byly získány dekadickým ředěním vstupní cDNA. Ředění bylo provedeno od 1x až po 10 000x. Při sestavení kalibrační křivky byla zahrnuta také negativní kontrola.
Teplotní profil reakce: - počáteční denaturace 10 minut/95 ºC - 50 x (95ºC/15s;60ºC/1min) nebo 50 x (95ºC/15s;65ºC/30s;60ºC/30s) Hodnoty efektivit jednotlivých reakcí a lineárních koeficientů determinace R2 byly vygenerované v programu 7500 Software v2.0.3 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
4. 10. 3 Relativní kvantifikace Reakční směs byla připravena pro všechny vzorky najednou, a to v dvojitém opakování. Byla zahrnuta také negativní kontrola.
Složení reakční směsi: Celkový objem:
20 μl - 8,4 μl ultra H2O (Top-Bio, Česká republika) - 0,4 μl mix primerů (0,2 μl primer A + 0,2 μl primer B), (koncentrace 10 pmol/μl) (KRD, Praha, Česká republika) - 0,2 μl AmpErase® Uracil N-glycosylase (Applied Biosystems, Warrington, Velká Británie) - 10 μl Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, Velká Británie) - 1 μl cDNA
Teplotní profil reakce: -
počáteční denaturace 10 minut/95 ºC
-
40 x (95ºC/15s;60ºC/1min) nebo 40 x (95ºC/15s;65ºC/30s;60ºC/30s)
53
Všechny amplifikace PCR produktů v reálném čase byly provedeny na přístroji 7500 Real-time System (Applied Biosystems, USA), za stejných teplotních podmínek, lišila se pouze teplota annealingu jednotlivých primerů.
4. 10. 4 Vyhodnocení relativní kvantifikace Genová exprese byla vypočítaná pomocí programu REST 2009 (Relative Expression Software Tool v 2.0.13) a podle návodu autora Pfaffl et al. (2002), dle následujícího vzorce:
Použité zkratky: E cílový gen
efektivita reakce (stanovená podle standardních křivek) pro cílový gen
E referenční gen
efektivita reakce (stanovená podle standardních křivek) pro referenční gen
ΔcT(kalibrator-vzorek)
rozdíl CT hodnot
Jako referenční gen byl použit β-aktin, u kterého byla exprese porovnávána vzhledem k cílovému genu.
4. 10. 5 Statistické vyhodnocení Výsledky analýzy genové exprese byly zpracovány pomocí tabulek a grafů v programu
Excel
2003
(Microsoft)
a
statisticky
vyhodnoceny
v programu
STATISTICA 10 (StatSoft Inc., Tulsa, USA). Při statistickém vyhodnocování byla použita metoda analýzy rozptylu a Tukeyův test.
54
5 VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUZE
5. 1 Příjem krmiva a hmotnost pokusných zvířat Průměrný denní příjem krmiva se nelišil u jednotlivých pokusných skupin (P > 0,05). Průměrný denní příjem krmiva byl u skupiny MYPO 25 ± 2 g.den-1, u skupiny LOSOS 23 ± 1 g.den-1 a u skupiny PALMA 24 ± 2 g.den-1. Různé složení krmných směsí nemělo průkazný vliv (P > 0,05) ani na průměrný denní přírustek u pokusných zvířat, který činil 2,99 ± 0,19 g u skupiny MYPO, 3,01 ± 0,12 g u skupiny LOSOS a 3,25 ± 0,19 g u skupiny PALMA. Rozdílné složení krmných směsí rovněž nemělo průkazný vliv (P > 0,05) na konečnou živou hmotnost pokusných zvířat, která činila 512 ± 13 g u skupiny MYPO, 511 ± 9 g u skupiny LOSOS a 529 ± 11 g u skupiny PALMA. Neočekávali jsme rozdíly v příjmu krmiva u jednotlivých skupin, což se nám potvrdilo. Také jsme předpokládali, že průměrný denní přírustek u pokusných zvířat bude u všech skupin stejný, vzhledem k tomu, že všechny KS měly stejný obsah metabolizovatelné energie (Tab. 5) Neočekávali jsme ani rozdíly v konečné živé hmotnosti pokusných zvířat, protože dávka KS byla u všech pokusných skupin stejná a stejná také v průběhu celého pokusu. Ve studiích podle Yamazaki et al. (2011) a Campioli et al. (2012) nebyl prokázán žádný vliv přídavku rybího tuku v dietě u pokusných zvířat ani na denní přírustek hmotnosti ani na konečnou živou hmotnost pokusných zvířat. Naopak v pokusu Lu et al. (2011) došlo ke snížení konečné živé hmotnosti u pokusných zvířat, které dostávaly krmivo s přídavkem rybího tuku. Kromě toho, přídavek rybího tuku do diety může mít pozitivní vliv na obezitu u obézních myší (Arai, 2009a). Příjem rybího tuku u pokusné skupiny v našem pokusu (1,57 g.kg-1 tělesné hmotnosti.den-1) byl mírně vyšší než v experimentu Yamazaki et al. (2011), kde činil 1 g.kg-1 tělesné hmotnosti.den-1. Příjem EPA a DHA souhrnně (23 + 37 = 60 mg.den-1) byl v pokusné skupině v našem pokusu podstatně nižší ve srovnání s pokusem Lu et al. (2011), kde byla použita celková dávka EPA a DHA 169 mg.den-1. Ale v experimentu Popovic' et al. (2011) bylo použito 75 mg.den-1, což je množství srovnatelné s tím, jaké bylo použito v našem pokusu. V pokusu podle Rai, Bhaskar, Baskaran (2013) byla pokusným zvířatům podávána krmná směs s přídavkem rybího tuku, který byl získán z odpadu při zpracování ryb. Zastoupení EPA a DHA v krmných směsích bylo 1,25 %, 2,50 % a 5,0 %. Ve studii podle Eritslanda et al. (1994) byl zkoumán vliv n-3 PUFA na hladinu sérových lipidů
55
u skupiny nediabetických pacientů, kteří trpěli mírně zvýšenou hladinou TAG a byli před koronárním bypassem. Vyšetření probíhalo před operací a 6 měsíců po operaci. Pokusná skupina pacientů dostávala 3,4 g EPA a DHA za den.
5. 2. Koncentrace celkového cholesterolu, HDL-cholesterolu, LDLcholesterolu a TAG Koncentrace celkového cholesterolu, HDL-cholesterolu, LDL-cholesterolu a TAG jsou zobrazeny v Tab. 9 a na Obr. 12. Přídavek lososového oleje v KS snížil hladinu celkového cholesterolu o 10 % a HDL cholesterolu o 12 % (P < 0,05), v porovnání s kontrolní skupinou. Naopak přídavek palmového tuku zvýšil hladinu celkového cholesterolu o 5 % a HDL cholesterolu o 2 % v porovnání s kontrolní skupinou (P > 0,05). Frakce LDL se zvýšila u obou pokusných skupin. Hodnota se u skupiny s přídavkem lososového oleje do KS zvýšila o 3 % a u skupiny krmené KS s přídavkem palmového tuku se zvýšila o 9 % v porovnání s kontrolní skupinou (P > 0,05). Hodnoty TAG byly u skupiny s přídavkem lososového oleje do KS snížené o 25 % v porovnání s kontrolní skupinou a u skupiny s přídavkem palmového tuku do KS byly zvýšené o 50 % v porovnání s kontrolní skupinou (P < 0,05). V Tab. 9 jsou uvedeny hodnoty cholesterolu, HDL-cholesterolu, LDL-cholesterolu a TAG u 3 pokusných skupin vč. střední chyby průměru. Jsou zde také uvedeny hodnoty snížení nebo zvýšení dané frakce (v %) u pokusné skupiny (LOSOS, PALMA) vůči kontrole (MYPO).
Tab. 9 Hodnoty celkového cholesterolu, HDL-cholesterolu, LDL-cholesterolu a TAG Průměr
Kontrola
Losos (KxL)
Palma (KxP)
1,19
1,07 (- 10 %)
1,25 (+ 5 %)
HDL [mmol.l ]
0,85
0,75 (- 12 %)
0,87 (+ 2 %)
LDL [mmol.l-1]
0,34
0,35 (+ 3 %)
0,37 (+ 9 %)
TAG [mmol.l-1]
1,25
0,94 (- 25 %)
1,88 (+ 50 %)
Kontrola
Losos
Palma
Cholesterol [mmol.l-1]
0,059
0,042
0,033
HDL [mmol.l-1]
0,039
0,031
0,015
LDL [mmol.l ]
0,022
0,024
0,019
TAG [mmol.l-1]
0,080
0,072
0,181
Cholesterol [mmol.l-1] -1
Střední chyba průměru
-1
56
-1
Obsah v krevní plazmě (mmol.l )
2,50 c 2,00 1,50
b
a
b
b b
1,00
a
b
Kontrola Losos Palma
a a
0,50
a
a
0,00 Cholesterol
HDL
LDL
TAG
Obr. 12 Hodnoty celkového cholesterolu, HDL-cholesterolu, LDL-cholesterolu a TAG
Očekávali jsme, že přídavkem lososového oleje do KS dojde ke snížení koncentrace celkového
cholesterolu,
snížení
koncentrace
TAG,
zvýšení
koncentrace
HDL-cholesterolu a snížení koncentrace LDL-cholesterolu. Snížení koncentrace celkového cholesterolu se v našem pokusu potvrdilo (- 10 %). Potvrdila se nám také hypotéza o snížení koncentrace TAG (- 25 %). Avšak namísto očekávaného zvýšení koncentrace HDL cholesterolu, se tato frakce snížila (- 12 %). Také jsme nepotvrdili předpokládané snížení koncentrace LDL-cholesterolu. Tato frakce se v našem pokusu zvýšila (+ 3 %). Přídavek palmového tuku do KS nám sloužil jako negativní kontrola. Předpokládali jsme zvýšení koncentrace celkového cholesterolu, zvýšení koncentrace TAG, snížení koncentrace HDL-cholesterolu a zvýšení koncentrace LDL-cholesterolu. Zvýšení koncentrace celkového cholesterolu (+ 5 %), zvýšení koncentrace TAG (+ 50 %) a zvýšení koncentrace LDL-cholesterolu (+ 9 %) se v našem pokusu potvrdilo. Ale namísto očekávaného snížení koncentrace HDL-cholesterolu se tato frakce zvýšila (+ 2 %). Tyto odchylky od námi předpokládaných faktů mohly být způsobeny např. tím, že pokusným zvířatům byla podávána KS s přídavkem lososového oleje (jakožto bahatého zdroje EPA a DHA), ale nikoliv čisté účinné látky. Dalším důvodem mohla být příliš nízká dávka EPA a DHA. V neposlední řadě mohlo být důvodem to, že metabolismus lipidů v krevní plazmě je ovlivněn jiným mechanizmem, než jsme předpokládali.
57
Koncentrace celkového cholesterolu u pokusné skupiny (LOSOS) byla u našeho experimentu v průměru v porovnání s hodnotami naměřenými u podobných pokusů. V našem pokusu byla průměrná hodnota celkového cholesterolu u pokusné skupiny (LOSOS) 1,07 ± 0,042 mmol.l-1. Následující přehled ukazuje hodnoty celkového cholesterolu u různých experimentů, založených na obdobných principech: Lu et al. (2011)
3,22 mmol.l-1
Ferramosca et al. (2012)
2,45 mmol.l-1
Xiao et al. (2012)
2,36 mmol.l-1
Campioli et al. (2012)
2,04 mmol.l-1
Yamazaki et al. (2011)
1,01 mmol.l-1
Takahashi (2011)
0,98 mmol.l-1
Popovic' et al. (2011)
0,54 mmol.l-1
Koncentrace HDL-cholesterolu u pokusné skupiny (LOSOS) byla u našeho experimentu v průměru v porovnání s hodnotami naměřenými u podobných pokusů. V našem pokusu byla průměrná hodnota HDL-cholesterolu u pokusné skupiny (LOSOS)
0,75 ± 0,031 mmol.l-1.
Následující
přehled
ukazuje
hodnoty
HDL-
cholesterolu u různých experimentů, založených na obdobných principech: Xiao et al. (2012)
1,84 mmol.l-1
Campioli et al. (2012)
0,81 mmol.l-1
Popovic' et al. (2011)
0,23 mmol.l-1
Zjištěné koncentrace LDL-cholesterolu byly v různých experimentech velmi rozdílné. Ferramosca et al. (2012) uvádí hodnotu 1,11 mmol.l-1, naproti tomu, Popovic' et al. (2011) uvádí hodnotu pouze 0,17 mmol.l-1 . V našem experimentu jsme dosáhli koncentrace LDL-cholesterolu v plazmě 0,35 ± 0,024 mmol.l-1, což se dá označit za průměrnou hodnotu vzhledem k podobným experimentům. Při srovnávání různých experimentů je vždy nutné brát v úvahu rozdílné metodiky, které byly použity u jednotlivých pokusů. Jedná se například o přímé stanovení cholesterolu, HDL, LDL a TAG nebo o rekalibraci komerčních přístrojů určených pro zpracovávání lidských vzorků pro vzorky potkanů. Přídavek lososového oleje do KS v dietě u potkanů v našem pokusu snížil celkový cholesterol. Podobné výsledky, jakých jsme dosáhli v naší studii, byly publikovány i ve
58
většině nedávných studií (Ferramosca et al., 2012; Lu et al., 2011; Campioli et al., 2012; Takahashi, 2011; Xiao et al., 2012). Avšak v experimentu Campioli et al. (2012), a Yamazaki et al. (2011) autoři neshledali rozdíly v koncentraci celkového cholesterolu mezi pokusnou skupinou potkanů (krmených lososovým olejem) a mezi skupinou kontrolní. Možným důvodem v případě experimentu Yamazaki et al. (2011) by mohl být nízký příjem rybího tuku (1 g na kg živé hmotnosti a den). Ale v našem pokusu byl příjem rybího tuku jen nepatrně vyšší (1,57 g na kg živé hmotnosti a den) než v experimentu Yamazaki et al. (2011). Podle Königa et al. (2007) je snížení plasmatického cholesterolu způsobeno aktivací PPARα a následnou redukcí SREBP-2. Tyto dva mechanismy v konečném důsledku vedou ke snížení syntézy cholesterolu. Dalším vysvětlením redukce plasmatického cholesterolu u potkanů krmených krmivem, které bylo obohaceno rybím olejem, je hypotéza, že rybí tuk usnadňuje sekreci cholesterolu do žlučových kyselin v játrech. Toto je umožněno díky regulaci transportérů cholesterolu (Takahashi, 2011). Sugiyama et al. (2008) došel k závěru, že mechanismus homeostázy cholesterolu a hypocholesterolemický mechanismus účinku EPA nejsou zatím zcela přesně objasněny. Navíc bylo zjištěno, že pokles celkového cholesterolu v experimentech založených na hypotéze, ze které jsme vycházeli i v našem pokusu, nemusí být založen pouze na příjmu PUFA n-3, ale také například na různé kvalitě mikroživin. V experimentu Xiao et al. (2012) hodnotili vliv za studena lisovaného lněného oleje a rafinovaného lněného oleje na koncentraci plazmatického cholesterolu. Skupina pokusných potkanů, která byla krmená KS obohacenou za studena lisovaným lněným olejem dosáhla snížení koncentrace plazmatického cholesterolu oproti skupině potkanů, kteří byli krmeni KS s rafinovaným lněným olejem. Ramprasath et al. (2012) došel k závěru, že dieta bohatá na PUFA má vliv na snížení hladiny plazmatického cholesterolu (v tomto případě u člověka), bez ohledu na změny v syntéze nebo absorbování cholesterolu. Tyto informace souhlasí s námi zjištěnými daty, a to především s tím, že konzumace rybího tuku vede k regulaci exprese genů pro LDL receptory a HMG-CoA-R. Ve studii podle Eritslanda et al. (1994) byl zkoumán vliv n-3 PUFA na hladinu sérových lipidů u skupiny nediabetických pacientů, kteří trpěli mírně zvýšenou hladinou TAG a byli před koronárním bypassem. Vyšetření probíhalo před operací a 6 měsíců po operaci. Pokusná skupina pacientů dostávala 3,4 g EPA a DHA za den. 59
Po 6 měsících byl pokles TAG u pokusné skupiny (-33,2 %) průkazně vyšší než u skupiny kontrolní (-11,1 %). V koncentracích celkového cholesterolu, HDL a LDL cholesterolu nebyl zaznamenán průkazný rozdíl mezi pokusnými skupinami. Vzhledem k tomu, že LDL-cholesterol byl v našem experimentu pouze vypočítán podle vzorce a v podobných experimentech není přesně uveden způsob stanovení této frakce, v diskuzi je popsána pouze frakce HDL-cholesterolu. Stručně řečeno, výsledky experimentů, které sledovaly vliv rybího tuku na koncentraci HDL-cholesterolu u hlodavců, jsou nejednoznačné a rozporuplné. Snížení HDL-cholesterolu u skupiny potkanů, kteří byli krmeni KS s přídavkem rybího tuku ve srovnání s oběma dalšími testovanými skupinami (KONTROLA a PALMA) v našem pokusu, souhlasí s údaji zjištěnými ve studii Takahashi (2011). Tato studie uvádí výrazné snížení HDL-cholesterolu z hodnoty 1,56 mmol.l-1 (skupina potkanů, která byla krmena KS s přídavkem palmového tuku) na hodnotu 0,58 mmol.l-1 (skupina potkanů, která byla krmena KS s přídavkem rybího oleje). Podobných výsledků bylo dosaženo také ve studii Kamisako et al. (2012), která srovnávala vliv sojového oleje a rybího oleje na hladinu HDL-cholesterolu. Výsledkem bylo, že přídavek rybího tuku do krmiva snížil HDL-cholesterol z hodnoty 1,50 mmol.l-1 na hodnotu 0,56 mmol.l-1. Na druhé straně Campioli et al. (2012) a Yamazaki et al. (2011) neshledali žádný průkazný rozdíl v koncentraci HDL-cholesterolu u potkanů krmených KS s přídavkem rybího tuku a u kontrolní skupiny potkanů. Ale Popovic' et al. (2011) a Xiao et al. (2012) uvádějí zvýšení koncentrace HDL-cholesterolu u potkanů krmených KS s přídavkem rybího tuku. Nezanedbatelné rozdíly jsou také v mezidruhovém srovnání. Zvýšení HDLcholesterolu v důsledku příjmu EPA a DHA vyplývá z mnoha klinických studií (Jacobson et al., 2012). Zhang et al. (2009) uvádí, že pro pokusy tohoto charakteru je vhodnější použít jako modelový organismus křečka namísto potkana. Je tomu tak zejména kvůli podobnému mechanismu syntézy a vylučování cholesterolu jako u člověka. Pokud jde o hypotézu, kterou jsme testovali v našem experimentu (EPA a DHA zvyšuje expresi genu Insig-1 v játrech potkanů, což vede k potlačení genu HMG-CoA-R a genu LDL-R, což v důsledku snižuje koncentraci cholesterolu), potvrdili jsme pouze první a poslední krok. Proto lze říci, že princip účinku rybího oleje na snížení hladiny plazmatického cholesterolu je alespoň částečně založený na námi testovaných mechanismech. Nicméně, nejednoznačné výsledky naší studie jsou často v souladu 60
s protichůdnými
výsledky
mnoha
současných
studií.
Přesný
mechanismus
hypocholesterolemického účinku EPA a DHA jak u hlodavců, tak u lidí není stále zcela přesně objasněn.
5. 3 Kontrola kvality a kvantity izolované RNA Izolovaná rRNA měla předpokládanou kvalitu a na gelu (Obr. 13) se dala rozeznat malá podjednotka 18S, která představuje spodní fragment o délce cca 1900 bp a velká podjednotka 28S, která představuje horní fragment o délce cca 4700 bp.
Obr. 13 Kontrola kvality izolované RNA ze vzorků jater (skupina PALMA) 1,2 % RNA gel + EtBr, 4µl RNAladder, 4µl RNA
Kontrola kvality a kvantity izolované RNA probíhala pomocí spektrofotometru NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA). Poměr absorbancí A260/A280 určuje čistotu vzorků a jeho hodnota by se měla pohybovat okolo hodnoty 1,8. Nižší hodnoty signalizují znečištění izolovaných nukleových kyselin proteiny. Poměr absorbancí A260/A230 určuje čistotu vzorků a hodnoty nižší než 1,8 signalizují znečištění izolovaných nukleových kyselin fenolem.
61
Téměř všechny vzorky ze skupiny P (negativní kontrolní skupina; PALMA) měly dostatečnou koncentraci, vhodný poměr A260/A280 a A260/A230 (Tab. 10). Pouze vzorky číslo PJ4 a PJ7 měly nízký poměr A260/A230 (0,71 a 1,54). Snížená kvalita izolace u těchto dvou vzorků mohla být způsobena zbytkem lyzačních roztoků a pufrů, které pravděpodobně nebyly v dostatečné míře odstraněny a mohly působit jako inhibitory real-time PCR reakce. Nízká kvalita vzorků PJ4 a PJ7 by pravděpodobně negativně ovlivnila průběh reakce, a proto se při vyhodnocování exprese tyto vzorky ze sledovaného souboru skupiny P vyřadily. Ostatní vzorky měly poměr A260/A280 v rozmezí 1,96 až 2,07, což odpovídá požadované kvalitě izolované RNA. Poměr A260/A230 byl u ostatních vzorků v rozmezí 2,02 až 2,21, což také splňuje požadavky na kvalitu izolované RNA. Tab. 10 Zjištěné hodnoty koncentrace izolované RNA [ng.μl-1], absorbance (při 260 a 280 nm) a čistoty (A260/A280 a A260/A230) u vzorků skupiny PALMA A260/
A260/
A280
A230
6,296
1,96
2,05
25,73
12,53
2,05
2,2
996
24,9
12,08
2,06
2,12
PJ4
168,1
4,201
2,147
1,96
0,71
PJ5
417,7
10,44
5,114
2,04
2,08
PJ6
1620,3
40,51
19,61
2,07
2,21
PJ7
341,3
8,532
4,218
2,02
1,54
PJ8
1044,8
26,12
12,81
2,04
2,19
PJ9
1158,4
28,96
14,11
2,05
2,02
PJ10
1077,7
26,94
13,13
2,05
2,09
č.vz.
c [ng.μl-1]
A260
A280
PJ1
493,1
12,33
PJ2
1029,3
PJ3
Téměř všechny vzorky ze skupiny M (kontrolní skupina; MYPO) měly dostatečnou koncentraci, vhodný poměr A260/A280 a A260/A230 (Tab. 11). Pouze vzorek číslo MJ3 měl nízký poměr A260/A230 (jen 1,43). Snížená kvalita izolace u tohoto vzorku mohla být způsobena zbytkem lyzačních roztoků a pufrů, které pravděpodobně nebyly v dostatečné míře odstraněny a mohly by působit jako inhibitory real-time PCR reakce. Z podobného důvodu jako u předcházejícich vzorků (PJ4 a PJ7) se proto při
62
vyhodnocování exprese ze sledovaného souboru skupiny M tento vzorek vyřadil. Ostatní vzorky měly poměr A260/A280 v rozmezí 2,12 až 2,14, což odpovídá požadované kvalitě izolované RNA. Poměr A260/A230 byl u ostatních vzorků v rozmezí 2,18 až 2,24, což také splňuje požadavky na kvalitu izolované RNA. Tab. 11 Zjištěné hodnoty koncentrace izolované RNA [ng.μl-1], absorbance (při 260 a 280 nm) a čistoty (A260/A280 a A260/A230) u vzorků skupiny MYPO A260/
A260/
A280
A230
20,83
2,14
2,2
31,7
14,91
2,13
2,22
905
22,63
10,85
2,09
1,43
MJ4
1450
36,25
17,04
2,13
2,22
MJ5
1489,9
37,25
17,42
2,14
2,23
MJ6
2093,7
52,34
24,73
2,12
2,18
MJ7
1529,8
38,25
18,01
2,12
2,23
MJ8
1299,9
32,5
15,26
2,13
2,22
MJ9
1566,5
39,16
18,32
2,14
2,22
MJ10
955,9
23,9
11,26
2,12
2,24
č.vz.
c [ng.μl-1]
A260
A280
MJ1
1783,5
44,59
MJ2
1268,1
MJ3
Všechny vzorky ze skupiny L (pokusná skupina, LOSOS) měly dostatečnou koncentraci, vhodný poměr A260/A280 a A260/A230 (Tab. 12). Proto se při vyhodnocování exprese braly v úvahu všechny vzorky. Poměr A260/A280 byl v rozmezí 2,02 až 2,08, což odpovídá požadované kvalitě izolované RNA. Poměr A260/A230 byl v rozmezí 2,02 až 2,27, což také splňuje požadavky na kvalitu izolované RNA.
63
Tab. 12 Zjištěné hodnoty koncentrace izolované RNA [ng.μl-1], absorbance (při 260 a 280 nm) a čistoty (A260/A280 a A260/A230) u vzorků skupiny LOSOS A260/
A260/
A280
A230
24,6
2,07
2,23
16,8
8,31
2,02
2,27
1348,6
33,7
16,3
2,07
2,23
LJ4
805,3
20,1
9,84
2,05
2,22
LJ5
1763
44,1
21,3
2,07
2,02
LJ6
1812,9
45,3
21,9
2,07
2,22
LJ7
2372,7
59,3
28,2
2,1
2,23
LJ8
1821,4
45,5
22,1
2,06
2,18
LJ9
1862,8
46,6
22,6
2,06
2,23
LJ10
1578,7
39,5
19
2,08
2,24
č.vz.
c [ng.μl-1]
A260
A280
LJ1
2039,3
51
LJ2
672,9
LJ3
5. 4 Real-time PCR 5. 4. 1 Ověření a návrh primerů pro real-time PCR Specificita primerů byla ověřena pomocí disociační křivky, tzv. melting křivky. Zjišťovala se teplota tání (Tm) a výsledkem jsou křivky, jejichž vrcholy, tzv. píky, určují specificitu. Pokud se vytvoří jeden pík, jedná se o specifický produkt. Obsahuje-li křivka dva a více píků, znamená to, že došlo k amplifikaci nějakého nespecifického produktu. Tímto postupem jsme ověřili specificitu primerů a optimalizovali jsme teploty annealingu. U každého genu jsou uvedené melting křivky pro vzorek a pro porovnání i melting křivka negativní kontroly (použita byla destilovaná voda). U všech uvedených melting křivek je na ose y nanesená derivovaná hodnota trendu, tzn. množství vzniklého produktu a na ose x teplota v ºC na které je vyznačená teplota tání (Tm).
β-aktin Specificita primerů pro gen β-aktin při teplotě annealingu primerů 60 ºC je uvedená na Obr. 14. Teplota tání fragmentu u vzorku má hodnotu 83,37 ºC. Vznikl pouze jeden vrchol, což znamená, že se jedná o specifický produkt. Proto byla zvolená teplota
64
annealingu (60 ºC) použitá při stanovení efektivity reakce a při analýze relativní kvantifikace.
(A)
(B)
Obr. 14 Melting křivky PCR fragmentu genu β-aktin při teplotě annealingu 60 ºC (A) vzorek z jater, (B) negativní kontrola
HMG-CoA-R Specificita primerů pro gen HMG-CoA-R při teplotě annealingu primerů 60 ºC je uvedená na Obr. 15. Teplota tání fragmentu u vzorku má hodnotu 82,19 ºC. Na melting křivce vznikl pouze jeden vrchol, což znamená, že jde o specifický produkt. Proto byla zvolená teplota annealingu (60 ºC) použitá při stanovení efektivity reakce a při analýze relativní kvantifikace.
(A)
(B)
Obr. 15 Melting křivky PCR fragmentu genu HMG-CoA-R při teplotě annealingu 60 ºC (A) vzorek z jater, (B) negativní kontrola
65
SREBP-2 Specificita primerů pro gen SREBP-2 při teplotě annealingu primerů 60 ºC a 65 ºC je uvedená na Obr. 16 a 17. Při teplotě annealingu 60 ºC vznikalo více píků, které signalizovaly nespecificitu. Teplota annealingu se upravila na 65 ºC, při které vznikl jeden vrchol a tím pádem byla tato teplota (65 ºC) použitá při stanovení efektivity reakce a při analýze relativní kvantifikace. Teplota tání fragmentu u vzorku má hodnotu 86,46 ºC.
(A)
(B)
Obr. 16 Melting křivky PCR fragmentu genu SREBP-2 při teplotě annealingu 60 ºC (A) vzorek z jater, (B) negativní kontrola
(A)
(B)
Obr. 17 Melting křivky PCR fragmentu genu SREBP-2 při teplotě annealingu 65 ºC (A) vzorek z jater, (B) negativní kontrola
66
PPARα Specificita primerů pro gen PPARα při teplotě annealingu primerů 65 ºC je uvedená na obrázku 18. Teplota tání fragmentu u vzorku má hodnotu 81,88 ºC. Na melting křivce vznikl pouze jeden vrchol, což znamená, že jde o specifický produkt. Proto byla zvolená teplota annealingu (65 ºC) použitá při stanovení efektivity reakce a při analýze relativní kvantifikace.
(A)
(B)
Obr. 18 Melting křivky PCR fragmentu genu PPARα při teplotě annealingu 65 ºC (A) vzorek z jater, (B) negativní kontrola
LDL-R Specificita primerů pro gen LDL-R při teplotě annealingu primerů 65 ºC je uvedená na obrázku 19. Teplota tání fragmentu u vzorku má hodnotu 83,89 ºC. Na melting křivce vznikl pouze jeden vrchol, což znamená, že jde o specifický produkt. Proto byla zvolená teplota annealingu (65 ºC) použitá při stanovení efektivity reakce a při analýze relativní kvantifikace.
67
(A)
(B)
Obr. 19 Melting křivky PCR fragmentu genu LDL-R při teplotě annealingu 65 ºC (A) vzorek z jater, (B) negativní kontrola
Insig-1 Specificita primerů pro gen Insig-1 při teplotě annealingu primerů 60 ºC a 65 ºC je uvedená na obrázcích 20 a 21. Při teplotě annealingu 60 ºC vznikalo více píků, což signalizovalo nespecificitu. Teplota annealingu se upravila na 65 ºC, při které vznikl jeden vrchol a tím pádem byla tato teplota (65 ºC) použita při stanovení efektivity reakce a při analýze relativní kvantifikace. Teplota tání fragmentu u vzorku má hodnotu 83,74 ºC.
(A)
(B)
Obr. 20 Melting křivky PCR fragmentu genu Insig-1 při teplotě annealingu 65 ºC (A) vzorek z jater, (B) negativní kontrola
68
(A)
(B)
Obr. 21 Melting křivky PCR fragmentu genu Insig při teplotě annealingu 60 ºC (A) vzorek z jater, (B) negativní kontrola
5. 4. 2 Analýza genové exprese pomocí real-time PCR Jako první byla u sledovaných genů zjišťována efektivita reakce, jejichž hodnoty byly určované ze standardních křivek, získaných dekadickým ředěním vstupní cDNA. Získané hodnoty se používaly při vyhodnocování expresí jednotlivých genů. Standardní křivky pro jednotlivé geny jsou uvedené v následujících kapitolách. Při všech uvedených standardních křivkách je na ose y nanesená hodnota CT, tzn. cyklus, ve kterém došlo k signifikantnímu zvýšení fluorescence a na ose x je uvedená kvantita, tzn. množství vzniklého produktu. Ke každému genu jsou uvedené i amplifikační křivky, které slouží na názorné ukázání průběhu amplifikace jednotlivých produktů při použitých ředěních. Jednotlivé křivky by měly být od sebe konstantně vzdálené, podle stupně zředění vstupního vzorku RNA. Vyhodnocení relativní kvantifikace, tzn. analýzy exprese jednotlivých genů je zpracováno ve formě grafů, ve kterých jsou uvedené hladiny expresí genů zkoumaných skupin (PALMA a LOSOS) oproti kontrolní skupině (MYPO).
69
5. 4. 2. 1 β-aktin
β-aktin byl vybrán jako referenční, tzv. housekeepingový gen, protože se ukázalo, že jeho exprese byla konstantní. Potvrdilo se, že β-aktin je odolný vůči podmínkám experimentu a prochází všemi kroky amplifikace se stejnou kinetikou jako cílový gen.
Stanovení efektivity reakce Efektivita reakce při amplifikaci fragmentu genu β-aktin v reálném čase byla 96,94 %, hodnota lineárního koeficientu determinace R2, vyjadřujícího opakovatelnost reakce byla 0,999. (Obr. 22).
(A)
(B)
Obr. 22 Standardní křivka (A) a amplifikační křivka (B) pro gen β-aktin
5. 4. 2. 2 HMG-CoA-R
Stanovení efektivity reakce Efektivita reakce při amplifikaci fragmentu genu HMG-CoA-R v reálném čase byla 82,70 %, hodnota lineárního koeficientu determinace R2, vyjadřujícího opakovatelnost reakce byla 0,981. (Obr. 23).
70
(A)
(B)
Obr. 23 Standardní křivka (A) a amplifikační křivka (B) pro gen HMG-CoA-R
Relativní kvantifikace Relativní exprese genu HMG-CoA-R v játrech u potkanů krmených KS s přídavkem lososového oleje, resp. s přídavkem palmového tuku byla 165 %, resp. 150 % oproti expresi tohoto genu v játrech u kontrolní skupiny (Tab. 13 a Obr. 24). Rozdíly jsou však zanedbatelné (P > 0,05) v důsledku velké variability CT hodnot v rámci obou dvou testovaných skupin potkanů. Naše výsledky nesouhlasí s údaji, které zjistili v experimentu Arai et al., (2009a), kde byla exprese genu HMG-CoA-R snížena působením EPA/DHA. Neshodují se ani s výsledky zjištěnými v experimentu, při kterém byl do krmiva přidaný olej z ryby Brevoortia tyrannus (Arai et al., 2009b), ani s výsledky u kterých byl do krmiva přidaný lososový olej (Hirako et al., 2010), nebo přidaná samotná EPA (Sugyiama et al., 2008).
Tab. 13 Analýza hladiny exprese genu HMG-CoA-R [%] Průměr
Kontrola Losos
Palma
HMG-CoA-R
100,00
150,00
Střední chyba průměru
Kontrola Losos
Palma
HMG-CoA-R
1
54
165,00
47
71
Genová exprese relatívní ke kontrole (%)
250,00
a
a
200,00 150,00
Kontrola Losos Palma
100,00 50,00 165,00
150,00
0,00
HMG-CoA-R
Obr. 24 Analýza hladiny exprese genu HMG-CoA-R Pozn.: Chybové úsečky reprezentují střední chybu průměru.
5. 4. 2. 3 SREBP-2
Stanovení efektivity reakce Efektivita reakce při amplifikaci fragmentu genu SREBP-2 v reálném čase byla 102,61 %, hodnota lineárního koeficientu determinace R2 vyjadřujícího opakovatelnost reakce byla 0,998 (Obr. 25).
(A)
(B)
Obr. 25 Standardní křivka (A) a amplifikační křivka (B) pro gen SREBP-2
72
Relativní kvantifikace Relativní exprese genu SREBP-2 v játrech u potkanů, kteří byli krmeni KS s přídavkem lososového oleje, resp. palmového tuku byla 57 %, resp. 75 % oproti expresi tohoto genu v játrech u kontrolní skupiny (Tab. 14 a Obr. 26). Rozdíly jsou však zanedbatelné (P > 0,05) v důsledku velké variability CT hodnot v rámci obou dvou testovaných skupin potkanů. V experimentu Caputo et al. (2010) autoři uvádějí, že účinek EPA/DHA na SREBP1c není zprostředkovaný přes PPARα. Na druhé straně, Fernandez-Alvarez et al. (2011) uvádí, že heterodiméry PPAR/RXR aktivují SREBP-1c promotor a PPARα výrazně zvyšuje expresi genu SREBP v játrech potkanů. I když exprese genu SREBP-2 v játrech u potkanů krmených lososovým olejem byla v našem experimentu méně než 60 % oproti kontrole, rozdíly nebyly statisticky významné. Podobné výsledky zjistil v experimentu i Hirako et al. (2010). V tomto pokuse nebyla ovlivněna exprese genu SREBP-2 u myší krmených lososovým olejem. Arai et al. (2009a) a Arai et al. (2009b) taktéž zaznamenal pokles exprese genu SREBP-2 u myší krmených EPA/DHA. Podobně byla snížena exprese genu SREBP-1c a SREBP-1 v játrech u potkanů krmených lososovým olejem (Takahashi, 2011) a u potkanů krmených PUFA n-3 (Lu et al., 2011) a protein SREBP-2 v této studii kvantifikovaný nebyl, podobně jako tomu bylo i při experimentech Arai et al. (2009a), Arai et al. (2009b) a Hirako et al. (2010). Sugiyama et al. (2008), který taktéž nezaznamenal žádný vliv DHA na expresi genu SREBP-2 u myší, naopak pozoroval sníženou dávku proteinů SREBP-2. Autoři v tomto experimentu přiznali svoji neúspěšnou identifikaci klíčových molekul, které mají vliv na expresi genu SREBP-2 a navrhli post-transkripční potlačení exprese genu SREBP-2 působením EPA v přítomnosti PPARα. Lu et al. (2011) zaznamenal ve svém experimentu pokles množství proteinu SREBP-1. Důležitou úlohu hraje však koncentrace, Caputo et al. (2010) zaznamenali pokles exprese genu SREBP-1 a následně i proteinu SREBP-1 v lidském hepatomu při koncentraci 50 μM, avšak poloviční koncentrace (25 μM) nezpůsobila žádné snížení.
73
Tab. 14 Analýza hladiny exprese genu SREBP-2 [%] Průměr
Kontrola Losos
SREBP-2 Střední chyba průměru
100
57
75
Kontrola Losos
SREBP-2
1
Palma
18
Palma 19
Genová exprese relativní ke kontrole (%)
120
a
100 80
a Kontrola
60
Losos Palma
40 20 57
75
0 SREBP-2
Obr. 26 Analýza hladiny exprese genu SREBP-2. Pozn.: Chybové úsečky reprezentují střední chybu průměru
5. 4. 2. 4 PPARα
Stanovení efektivity reakce Efektivita reakce při amplifikaci fragmentu genu PPARα v reálném čase byla 91,16 %, hodnota lineárního koeficientu determinace R2 vyjadřujícího opakovatelnost reakce byla 0,982. (Obr. 27).
74
(A)
(B)
Obr. 27 Standardní křivka (A) a amplifikační křivka (B) pro gen PPARα
Relativní kvantifikace Relativní exprese genu PPARα v játrech u potkanů krmených KS obohacenou o lososový olej, resp. palmový tuk byla 47 %, resp. 78 % oproti expresi tohoto genu v játrech u kontrolní skupiny (Tab. 15 a Obr. 28). Rozdíly jsou však zanedbatelné (P > 0,05) v důsledku velké variability CT hodnot v rámci obou dvou testovaných skupin potkanů. Naše výsledky potvrzuje i Sugiyama et al. (2008) experimentem na myších krmených EPA. Naopak exprese genu PPARα u pokusné skupiny potkanů krmených krmivem obohaceným o PUFA n-3 v experimentu Lu et al. (2011) byla nezměněná. Podle Takahashi (2011), jsou PUFA n-3 schopné vázat se přímo na PPARα a stimulovat tak jeho činnost. Avšak, Takahashi (2011) uvádí zvýšené množství PPARα mRNA u potkanů , kteří byli krmeni KS s přídavkem lososového oleje v porovnání s potkany, kteří byli krmeni KS s přídavkem palmového tuku, což nekoresponduje s výsledky našeho experimentu. Hirako et al. (2010) zjistili, že genová exprese PPARα u myší krmených krmivem s přídavkem lososového oleje je o 175 % vyšší než při kontrole, což taktéž nekoresponduje s našimi výsledky.
75
Tab. 15 Analýza hladiny exprese genu PPARα [%] Průměr
Kontrola Losos
Palma
PPARα
100
78
Střední chyba průměru
Kontrola Losos
Palma
PPARα
1
21
47
25
Genová exprese relativní ke kontrole (%)
120
a
100 80
a Kontrola
60
Losos Palma
40 20 47
78
0
PPARα
Obr. 28 Analýza hladiny exprese genu PPARα Pozn.: Chybové úsečky reprezentují střední chybu průměru.
5. 4. 2. 5 LDL-R Stanovení efektivity reakce Efektivita reakce při amplifikaci fragmentu genu LDL-R v reálném čase byla 86,47 %, hodnota lineárního koeficientu determinace R2 vyjadřujícího opakovatelnost reakce byla 0,978 (Obr. 29).
76
(A)
(B)
Obr. 29 Standardní křivka (A) a amplifikační křivka (B) pro gen LDL-R
Relativní kvantifikace
Relativní exprese genu LDL-R v játrech u potkanů, kteří byli krmeni KS s přídavkem lososového oleje, resp. palmového tuku byla 210 %, resp. 233 % oproti expresi tohoto genu v játrech u kontrolní skupiny (Tab. 16 a Obr. 30). Rozdíly jsou však zanedbatelné (P > 0,05) v důsledku velké variability CT hodnot v rámci obou dvou testovaných skupin potkanů. V experimentu vědců Arai et al. (2009b), u kterého byl do krmiva přidaný olej z ryby Brevoortia tyrannus, se taktéž jako nám nepodařilo snížit hladinu exprese genu LDL-R, ale naopak v tom stejném experimentu se při použití krmiva s přídavkem tuňákového oleje (DHA) podařilo snížit expresi genu LDL-R.
Tab. 16 Analýza hladiny exprese genu LDL-R [%] Průměr LDL-R Střední chyba průměru LDL-R
Kontrola Losos 100,00
Palma
210,00
233,00
Kontrola Losos
Palma
1
56
57
77
Genová exprese relativní ke kontrole (%)
350,00 300,00
a a
250,00 200,00
Kontrola Losos
150,00
Palma
100,00 50,00 210,00
233,00
0,00 LDL-R
Obr. 30 Analýza hladiny exprese genu LDL-R Pozn.: Chybové úsečky reprezentují střední chybu průměru.
5. 4. 2. 6 Insig-1
Stanovení efektivity reakce Efektivita reakce při amplifikaci fragmentu genu Insig-1 v reálném čase byla 94,21 %, hodnota lineárního koeficientu determinace R2 vyjadřujícího opakovatelnost reakce byla 0,986 (Obr. 31).
(A)
(B)
Obr. 31 Standardní křivka (A) a amplifikační křivka (B) pro gen Insig-1
78
Relativní kvantifikace
Relativní exprese genu Insig-1 v játrech potkanů krmených krmivem s přídavkem 3 % lososového oleje byla o 731 % vyšší než exprese a tohoto genu u kontrolní skupiny (P < 0,05) (Tab. 17 a Obr. 32). Relativní exprese genu Insig-1 v játrech u potkanů, kteří byli krmeni KS s přídavkem palmového tuku byla 222% oproti expresi tohoto genu v játrech u kontrolní skupiny (Tab. 17 a Obr. 32). Regulace exprese genu Insig-1 lososovým olejem v našem experimentu souhlasí s výsledky Konig et al. (2007), ve kterém zjistili taktéž zvýšenou expresi tohoto genu u potkanů po aktivaci PPARα. Podobné výsledky uvádí ve svém experimentu i Botolin et al. (2006), který testoval u potkanů vliv DHA na expresi genu Insig-1 v hepatocytech. Na druhé straně nedávné experimenty (Arai et al., 2009a; Arai et al., 2009b; Hirako et al., 2010), které testovaly vliv lososového oleje na genovou expresi u myší, uvádějí sníženou expresi genu Insig-1.
Tab. 17 Analýza hladiny exprese genu Insig-1 [%] Průměr
Kontrola Losos
Palma
Insig-1
100,00
222,00
Střední chyba průměru
Kontrola Losos
Palma
Insig-1
1
92
731,00
313
79
Genová exprese relativní ke kontrole (%)
1200,00
b 1000,00 800,00 Kontrola 600,00
Losos Palma
400,00
a
200,00 731,00
222,00
0,00
Insig-1
Obr. 32 Analýza hladiny exprese genu Insig-1 Pozn.: Chybové úsečky reprezentují střední chybu průměru.
5. 5 Shrnutí výsledků Koncentrace celkového cholesterolu, HDL-cholesterolu, LDL-cholesterolu a TAG jsou zobrazeny v Tab. 9 a na Obr. 12. Přídavek lososového oleje v KS snížil hladinu celkového cholesterolu o 10 % a HDL cholesterolu o 12 %, v porovnání s kontrolní skupinou. Naopak přídavek palmového tuku zvýšil hladinu celkového cholesterolu o 5 % a HDL cholesterolu o 2 % v porovnání s kontrolní skupinou. Frakce LDL se zvýšila u obou pokusných skupin. Hodnota se u skupiny s přídavkem lososového oleje do KS zvýšila o 3 % a u skupiny krmené KS s přídavkem palmového tuku se zvýšila o 9 % v porovnání s kontrolní skupinou. Hodnoty TAG byly u skupiny s přídavkem lososového oleje do KS snížené o 25 % v porovnání s kontrolní skupinou a u skupiny s přídavkem palmového tuku do KS byly zvýšené o 50 % v porovnání s kontrolní skupinou. Předpokládanou hypotézu se nám podařilo potvrdit jen částečně. Relativní exprese genu Insig-1 v játrech potkanů, kteří byli krmeni KS s přídavkem 3 % lososového oleje byla o 730 % vyšší než exprese tohoto genu u kontrolní skupiny (P < 0,05). Avšak předpoklad, že zvýšení exprese genu Insig-1 bude vést ke snížení expresí genů HMG-CoA-R a LDL-R nebyl potvrzený (Tab. 18 a Obr. 33). Vyjádření exprese genů HMG-CoA-R a LDL-R v játrech u potkanů krmených lososovým olejem 80
byl 165 % a 210 % oproti expresi těchto genů v játrech u kontrolní skupiny. Rozdíly jsou však opět zanedbatelné (P > 0,05) v důsledku velké variability CT hodnot v rámci každé testované skupiny potkanů.
Tab. 18 Analýza hladiny exprese genů: Insig, HMG-CoA-R, LDL-R [%] Průměr
Kontrola
Losos
Palma
Insig-1
100,00
731,00
222,00
HMG-CoA-R
100,00
165,00
150,00
LDL-R
100,00
210,00
233,00
Kontrola
Losos
Palma
Insig-1
1
313
92
HMG-CoA-R
1
47
54
LDL-R
1
56
57
Střední chyba průměru
Genová exprese relativní ke kontrole (%)
1200,00 b 1000,00
800,00 Kontrola Losos Palma
600,00
400,00
a
a a
a
a
200,00 731 222
165 150
210 233
0,00 Insig-1
HMG-CoA-R
LDL-R
Obr. 33 Analýza hladiny exprese genů Insig-1, HMG-CoA-R a LDL-R Pozn.: Chybové úsečky reprezentují střední chybu průměru.
81
Bohužel, naše hypotéza, že EPA a DHA dokáží snižovat plazma cholesterol přes zvýšení exprese genu Insig-1 a zároveň snížením exprese genů HMG-CoA reduktázy a LDL-R se nepotvrdila. Jak je uvedeno na Obr. 33, gen Insig-1 měl sice zvýšenou expresi, ale na druhé straně exprese genů HMG-CoA reduktázy a LDL-R se nesnížila, ale naopak se mírně zvýšila. Tyto geny mají pravděpodobně ovlivněnou expresi na úrovni mRNA, a proto má význam sledování jejich exprese na úrovni mRNA. Relativní exprese genů, které kódují PPARα a SREBP-2 v játrech u potkanů, kteří byli krmeni KS s přídavkem lososového oleje (Tab. 19 a Obr. 34), byla 47 % a 57 % v porovnaní s kontrolou, avšak vzhledem k velké variabilitě CT hodnot, byly tyto rozdíly nevýznamné (P > 0,05).
Tab. 19 Analýza hladiny exprese genů: PPARα, SREBP-2 [%] Průměr PPARα
Kontrola
Losos
Palma
100
47
78
SREBP-2
100
57
75
Kontrola
Losos
Palma
1
25
21
1
18
19
Střední chyba průměru PPARα SREBP-2
82
Genová exprese relativní ke kontrole (%)
120 a
100 80
a a
a
Kontrola Losos Palma
60 40 20 47
78
57
75
0 PPARα
SREBP-2
Obr. 34 Analýza hladiny exprese genů PPARα a SREBP-2 Pozn.: Chybové úsečky reprezentují střední chybu průměru.
Tyto geny mají pravděpodobně ovlivněnou expresi až na úrovni proteinů, a proto nemá význam sledování jejich exprese na úrovni mRNA. Závěrem našich výsledků je částečné potvrzení předpokládané hypotézy. Zjistili jsme však, že metabolismus lipidů v plazmě je ovlivněn jiným mechanizmem, než jsme předpokládali. Daná problematika vyžaduje další studium a další experimenty, ve kterých by byla upravena metodika. Navrhovala bych např. podávání čistých účinných látek (EPA a DHA) místo lososového oleje, zvýšení denní dávky EPA a DHA nebo změněný poměr těchto PUFA.
83
6 ZÁVĚR Tato diplomová práce byla zaměřena na problematiku vlivu polynenasycených mastných kyselin na expresi genů, které ovlivňují metabolismus cholesterolu u potkanů. V teoretické části jsem se zaměřila na studium lipidů a mastných kyselin, jejich rozdělení, biologické funkce a význam ve výživě člověka. Dále jsem se zaměřila na cholesterol a jeho biologické funkce. V další části byl popsán vliv nutrietů na expresi genů a byly charakterizovány základní metody molekulární biologie, které jsou využívány pro detekci a kvantifikaci genové exprese. V praktické části diplomové práce byla sledována exprese genů Insig-1, HMG-CoA-R, LDL-R, PPARα a SREBP-2, která byla porovnávána s referenčním genem β-aktin a vyhodnocená jako relativní exprese. Cílem naší práce bylo potvrdit hypotézu o příznivém vlivu EPA a DHA na zastoupení plazmatických lipidů a ovlivnění exprese cílových genů. EPA a DHA mohou snižovat plazmový cholesterol prostřednictvím zvýšení exprese genu Insig-1 a zároveň snížením exprese genů kódujícich HMG-CoA-R a LDL-R. Naše hypotéza byla testovaná na pokusných zvířatech (Rattus norvegicus) krmených standardní krmnou směsí s přídavkem 3 % rybího tuku (lososový olej). Exprese genu Insig-1 v játrech pokusných zvířat, krmených KS s přídavkem lososového oleje, byla 730 % (P < 0,05) oproti kontrole, což potvrzuje první část hypotézy. Avšak část hypotézy, která uvádí snížení exprese genů HMG-CoA-R a LDL-R potvrzená nebyla. V našich výsledcích byla naopak jejich exprese zvýšená, a to konkrétně u genu HMG-CoA-R byla exprese zvýšená o 165 % (P > 0,05) oproti kontrole a u genu LDL-R byla exprese zvýšená o 210 % (P > 0,05) oproti kontrole. Každopádně bylo průkazně dokázáno (P < 0,05), že rybí tuk, konkrétně lososový olej, přidaný do krmiva v množství 1,57 g na kg živé hmotnosti a den, snižuje plazmový cholesterol o 10 % z počáteční hodnoty 1,19 mmol.l-1 na konečnou hodnotu 1,07 mmol.l-1. V závěru našeho experimentu můžeme konstatovat, že jsme částečně potvrdili předpokládané hypotézy, přestože jsme zjistili, že metabolismus lipidů v plazmě je ovlivněn jiným mechanizmem, než jsme předpokládali. Daná problematika vyžaduje další studium a další experimenty, ve kterých by byla např. zvýšená denní dávka EPA a DHA nebo by byl změněn poměr těchto PUFA.
84
7 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY AFMAN L. A., MÜLLER M. (2012). Human nutrigenomics of gene regulation by dietary fatty acids. Progress in Lipid Research, 51, 63-70.
AMERICAN HEART ASSOCIATION NUTRITION COMMITTEE (2006) Diet and Lifestyle recommendation revision 2006: a scientific statement from the American Heart Association Nutrition Commitee. Circulation, 114, 82-96.
ARAI T., KIM H. J., CHIBA H., MATSUMOTO A. (2009a) Anti-obesity effect of fish oil and fish oil fenofibrate combination in female KK mice. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis, 16, 674-683.
ARAI T., KIM H. J., CHIBA H., MATSUMOTO A. (2009b) Interaction of fenofibrate and fish oil in relation to lipid metabolism in mice. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis 16, 283-291.
BÉDER I., BABINSKÁ K., BÉDEROVÁ A., BUKOVSK I., GABAŠOVÁ E., HÁJEK J.,
KITTOVÁ
M.,
KURTANSKÝ
A.,
MICHALÍK
D.,
OKKELOVÁ
J.,
OSTATNÍKOVÁ D., SLEZÁKOVÁ O., VÁŽAN R. (2005). Fyziológia člověka. 1. vyd. Univerzita Komenského Bratislava, Bratislava, 312 s, ISBN 80-223-2028-5.
BEŇO I. (2008). Náuka o výžive. 2. vyd. Martin: Osveta. 157 s, ISBN 978-80-8063294-6.
BOHÁČOVÁ V. (2012). Průzkum jasně prokázal: Jíme špatné tuky. Výživa a potraviny, 2, 41-42.
BROUWER M., LIEVENS B., VAN HEMELRIJCK W. et al. (2003). Quantification of disease progression of several microbial pathogens on Arabidopsis thaliana using realtime fluorescence PCR. FEMS Microbiology Letters, 228, 241-248.
85
BROWN T. A. (2007). Klonování genů a analýza DNA. 5. vyd., Univerzita Palackého v Olomouci, Olomouc, 389 s, ISBN 978-80-244-1719-6.
BUSTIN S. A. (2000). Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology, 25, 169-193.
BUSTIN S. A. (2002) Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. Journal of Molecular Endocrinology, 29, 23–29.
CAMPIOLI
E.,
RUSTICHELLI
C.,
AVALLONE
R.
(2012)
N-3
dietary
supplementation and lipid metabolism: differences between vegetable- and fish-derived oils. Journal of Functional Foods, 4, 207-212.
CASTRO M. C., MASSA M. L., ZOTTO H. D., GAGLIARDINO J. J., FRANCINI F. (2011) Rat liver uncoupling protein 2: Changes induced by a fructose-rich diet. Journal of Life Sciences. 89, 609-614.
ČEŠKA R. (1999). Cholesterol a ateroskleróza. 2. vyd. Praha: Maxdorf. 226 s, ISBN 80-85800-95-0.
DAS U. (2006). Essentials fatty acids – A review. Current Pharmaceutical Biotechnology, 7, 467-482.
DIF N., EUTHINE V., GOLET E., LAVICE M., VIDAL H., LEFAI E. (2006). Insulin activates human sterol-regulatory-element-binding protein-1 c (SREBP 1c) promoter through SRE motifs. Biochemical Journal, 400, 179-188.
DORAK M. T. (2006). Real-time PCR. FEBS Letters, 215, 150-154
DOSTÁLOVÁ J., DOLEŽAL M., ŠÍPKOVÁ A. (2012). Složení mastných kyselin roztíratelných tuků, směsných roztíratelných tuků a másel na současném českém trhu. Výživa a potraviny, 3, 71-73.
86
ERITSLAND J., SELJEFLOT I., ABDELNOOR M., ARNESEN H., TORJESEN P. A., (1994) Long-term effects of n-3 FA on serum lipids and glycemic control. Scandinavian Journal of Clinical & Laboratory Investigation, 54, 273-280
FAHY E., SUBRAMANIAM S., MURPHY R., NISHIJIMA M., RAETZ C., SHIMIZU T., SPENER F., VAN MEER G., WAKELAM M. and DENNIS E. A. (2009). Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids. Journal of Lipid Research, 50, 9–14.
FERRAMOSCA A., CONTE L., ZARA V. (2012) A krill oil supplemented diet reduces the activities of the mitochondrial tricarboxylate carrier and of the cytosolic lipogenic enzymes in rats. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, 96, 295-306.
FERGUSON L. R., BARNETT M. P. G. (2012). Research in nutrigenomics and potential applications to practise. Nutrition and Dietetics, 69, 198-202.
FRIEDEWALD W. T., LEVY R. I., FREDRICKSON D. S. (1972). Estimation of the concentration of low density lipoprotein cholesterol in plasma, without use of the preparative ultracentrifuge. Clinical Chemistry 18, 499-502.
GANONG W. F. (2005). Přehled lékařské fyziologie. 20. vyd., Praha: Galén. 890 s, ISBN 80-7262-311-7.
GOEDEKE L., FERNÁNDEZ-HERNANDO C. (2012). Regulation of cholesterol homeostasis. Cellular and Molecular Life Science, 69, 915-930.
GIVENS D. I., GIBBS R. A. (2008). Current intakes of EPA and DHA in European populations and the potential of animal-derived foods to increase them. Proceedings of the Nutrition Society, 67, 273-280.
HALUZÍK M., SVAČINA Š. (2005). Metabolický syndrom a nukleární receptory – PPAR. 1. vyd. Praha: GRADA Publishing. 136 s. ISBN 978-80-247-6246-3.
87
HARA A., RADIN N. S. (1978). Lipid extraction of tissues with a low-toxicity solvent. Analytical Biochemistry, 90, 420-426.
HARLAND J. I. (2012). Food combinations for cholesterol lowering. Nutrition Research Reviews, 25, 249-266.
HEIJNE V. G. (2008). Membranes: reading between the lines. Current Opinion in Structural Biology, 18, 403-405.
HERNÁNDEZ M., RÍO A., ESTEVE T. (2001). A rapeseed – specific gene, AcetylCoA carboxylase, can be used as a reference for qualitative and real-time quantitative PCR detection of transgenes from mixed food samples. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 49, 3622-3627.
HOLEČEK M. (2006). Regulace metabolizmu cukrů, tuků, bílkovin a aminokyselin. 1. vyd. Praha: GRADA Publishing. 288 s, ISBN 80-247-1562-7.
HUERTAS-LOPEZ E. (2012). The effect of EPA and DHA on metabolic syndrome patiens: a systematic review of randomised controlled trials. British Journal of Nutrition, 107, 185-194.
HUGGETT J., DHEDA K., BUSTIN S., ZUMLA A. (2005) Real-time RT-PCR normalisation; strategies and considerations. Genes and Immunity, 6, 279–284.
HUPFER CH., WAIBLINGER H. U., BUSCH U. (2007) Development and validation of a real-time PCR detection method for celery in food. European Food Research and Technolology, 225, 329-335.
CHALUPOVÁ P. (2013) Analýza exprese genu pro rust a vývoj svaloviny u prasat, studium variability genu IL19 a jeho asociace s užitkovými znaky, Dizertační práce, Brno: MENDELU. 134 s.
CHAROENSUKSAI P., XU W. (2010). PPARs in rhythmic metabolic regulation and implications in health and disease. PPAR Research, 2010, 9. 88
JAROŠOVÁ A., KINCLOVÁ V., TREMLOVÁ B. (2004). Senzorická analýza potravin. Veterinářství, 6, 362-364.
JUMP D. B. (2004). Fatty acids regulation of gene transcription. Clinical Laboratory Science, 41, 41-78.
KAPUT J., RODRIGUEZ R. L. (2004). Nutritional genomics: the next frontier in the postgenomic era. Physiological Genomics. 16, 166-177.
KERESTEŠ J., BÍREŠ J., EBRINGER L., ĎURAČKOVÁ Z., ČÁRSKY J., HORÁKOVÁ K., GREIFOVÁ M., SEKRETÁR S., STARUCH L., VALŠÍKOVÁ M., HRIČOVSKÝ I., GOLIAN J., LAGIN L., TRAKOVICKÁ A., CHLEBO P., ZÁLEŠÁKOVÁ J., FATRCOVÁ K., DANIŠKA J., MAČEK J., HARNADOVÁ Z., TOTH Z., HERIAN K., KOVÁČ M., DLOUHÝ P., MALA P., KOPÁČEK J., GAŽÁROVÁ M., KAJABA I. (2011). Zdravie a výživa ľudí. 1. vyd. Bratislava: Nika. 1040 s, ISBN: 978-80-88969-57-0.
KOMPRDA T. (2006). Cholesterol a jeho oxidační produkty v potravinách. Veterinářství. 56, 121-125.
KOMPRDA T. (2007). Základy výživy člověka. 2. vyd. Brno: MENDELU. 164 s, ISBN 978-80-7157-655-6.
KOMPRDA T. (2012). Eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids as inflammationmodulating and lipid homeostasis influencing nutraceuticals: A review. Journal of Functional Foods, 4, 25-38.
KOMPRDA T., ZELENKA J. (2006) Arachidonic acid and long-chain n-3 polyunsaturated fatty acids in chicken and turkey meat in relation to dietary fat sources. World´s Poultry Science Journal. 62, 272.
KOOLMAN J., RÖHM K. H. (2012). Barevný atlas biochemie. 4. vyd. Praha: GRADA Publishing. 512 s, ISBN 978-80-247-2977-0.
89
KÖNIG B., KOCH A., SPIELMANN J., HILGENFELD C., STANGL G. I., EDER K. (2007) Activation of PPARα lowers synthesis and concentration of cholesterol by reduction of nuclear SREBP-2. Biochemical Pharmacology, 73, 574-585.
KRAML P. (2008). Hyperlipoproteinémie v klinické praxi. 1. vyd. Praha: TIGIS. 128 s. ISBN 987-80-903750-5-5.
KUNEŠOVÁ M., DRBOHLAV J., ROUBAL P., GOJOVÁ M., TVRZICKÁ E., HLAVATÝ P., HAINER V., HLAVATÁ K. (2011). Účinek jogurtu obohaceného polynenasycenými mastnými kyselinami řady n-3 v redukčním režimu u obézních žen. Výživa a potraviny, 6, 156-157.
LANGMEIER M., KITTNAR O., MAREŠOVÁ D., POKORNÝ J. (2009). Základy lékařské fyziologie. 1. vyd. Praha: GRADA Publishing. 320s. ISBN 978-80-247-2526-0
LARSEN R., EILERTSEN K.-E., ELVEVOLL E. O. (2011). Health benefits of marine foods and ingredients. Biotechnology Advances, 29, 508-518.
LECERF J. M., LORGERIL M. (2011). Dietary cholesterol: from physiology to cardiovascular risk. British Journal of Nutrition,106, 6-14.
LECKER J. L., MATTHAN N. R., BILLHEIMER J. T., RADER D. J., LIECHTENSTEIN A. H. (2011). Changes in Cholesterol Homeostasis Modify the Response of F1B hamsters to Dietary Very Long Chain n-3 and n-6 Polyunsaturated Fatty Acids. Lipids in Health and Disease, 10, 186
LEONG D. T., GUPTA A., BAI H. F., et al. (2007). Absolute quantification of gene expression in biomaterials research using real-time PCR. Biomaterials, 28, 203-210.
LIVAK K. J., SCHMITTGEN T. D. (2001) Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods, 25, 405–408.
LUBANDA H., VECKA M. (2009). Cholesterol – přítel či nepřítel?. Chemické Listy, 103, 40-51. 90
LU J., BORTHWICK F., HASSANALI Z., WANG Y., MANGAT R., RUTH M., SHI D., JAESCHKE A., RUSSEL J. C., FIELD C. J., PROCTOR S. D., VINE D. F. (2011). Chronic dietary n-3 PUFA intervention improves dislipidaemia and subsequent cardiovascular complications in the JSR:LA-cp rat model of the metabolic syndrome. British Journal of Nutrition, 105, 1572-1582.
MACKAY I. M., ARDEN K. E., NITSCHE A. (2002). Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Research, 30, 1292-1305.
MASON G., CACIAGLI P., ACCOTTO R. P. (2008). Real-time PCR for the quantitation of Tomato yellow leaf curl Sardinia virus in tomato plants and in Bemisia tabaci. Journal of Virological Methods, 147, 283-289.
MATEOS H. T., LEWANDOWSKI P. A., SU X. Q. (2012). The effect of replacing dietary fish oil with canola oil on fatty acid composition and expression of desaturase and elongase genes in Jade Tiger hybrid abalone. Food Chemistry, 131, 1217-1222;
MAZURA I., MICHALOVÁ K., BRDIČKA R., MÁCHA J. (2001). Speciální metody molekulární biologie. Univerzita Karlova v Praze – nakladatelství Karolinum, Praha, 311 s. ISBN 80-246-0258-X
MÄDE D., DEGNER CH., GROHMANN L. (2006). Detection of genetically modified rice: a construct-specific real-time PCR method based on DNA sequences from transgenic Bt rice. European Food Research and Technology, 224, 271-278.
MOUREK J., NEDBALOVÁ M., ŠMÍDOVÁ L., MYDLILOVÁ A. (2007). Mastné kyseliny omega-3, 1. vyd. Praha: Triton. 174 s. ISBN 978-80-7254-917-7.
MÜLLER-WIELAND D., KOTZKA J. (2002). SREBP 1: gene regulatory key to syndrome X?. Annals of the New York Academy of Sciences, 967, 19-27.
MUMFORD R., BOONHAM N., TOMLINSON J. et al. (2006). Advances in molecular phytodiagnostics – new solutions for old problems. European Journal of Plant Pathology, 116, 1-19. 91
MURRAY R. K., GRANNER D. K., MAYES P. A., RODWELL V. W. (2002). Harperova biochemie. 4. vyd. Praha: Nakladatelství H&H. 871 s. ISBN 80-7319-013-3.
NAKAMURA M. T., CHEON Y., LI Y., NARA T. Y. (2004). Mechanisms of regulation of gene expression by fatty acids. Lipids, 39, 1077-1083 PAFUNDO S., GULLI M., NELSON M. (2009). SYBR®GreenER™ Real-Time PCR to detect almond in traces in processed food. Food Chemistry, 116, 811-815.
PFAFFL M. W. (2001). A new mathematical model for relative quantification in realtime RTPCR. Nucleic Acids Research, 29, 2002-2007.
PFAFFL M. W., HORGAN G. W., DEMPFLE L. (2002). Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Research, 9, 36-39.
PONCHEL F., TOOMES C., BRANSFIELD K. (2003). Real-time PCR based on SYBR-Green I fluorescence: An alternative to the TaqMan assay for a relative quantification of gene rearrangements, gene amplifications and micro gene deletions. BMC Biotechnology, 18, 1-13.
POPOVIC’ T., BOROZAN S., ARSIC’ A., DEBELJAK-MARTAČIC’ J., VUČIC V., DE LUKA S., MILOVANOVIC’ I., TRBOVIC’ A., GLIBETIC’ M. (2011) Effects of n-3 supplementation on plasma and liver phospholipid fatty acids profile in aged Wistar rats. Croatica Chemica Acta, 84, 73-79.
POSTOLLEC F., FALENTIN H., PAVAN S., COMBRISSON J., SOHIER D. (2011) Recent advances in quantitative PCR (qPCR) applications in food microbiology. Food Microbiology, 28, 848–861.
POUDYAL H., PANCHAL S. K., DIWAN V., BROWN L. (2011). Omega-3 fatty acids and metabolit syndrome: Effects and emerging mechanisms of action. Progress in Lipid Research, 50, 372-387.
92
PRATO E., BIANDOLINO F. (2012). Total lipid content and fatty acid composition of commercially important fish species from the Mediterranean, Mar Grande Sea. Food Chemistry, 131, 1233-1239.
PRITCHARD D. J., KORF B. R. (2007). Základy lékařské genetiky. Praha: Galén 182 s. ISBN: 978-80-7262-449-2
RAI A. K., BHASKAR N., BASKARAN V. (2013). Bioefficacy of EPA-DHA from lipids recovered from fish processing wastes through biotechnological approaches. Food Chemistry, 136, 80-86
SATO R. (2010). Sterol metabolism and SREBP activation. Archives of Biochemistry and Biophysics, 501, 177-181.
SIDHU K. S. (2003). Health benefits and potential risks related to consumption of fish or fish oil. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 38, 336-344
SIMOPOULOS A. P. (2002). Omega-3 fatty acids in inflammation and autoimmune diseases. Journal of American College Nutrition, 21, 495-505
SCHULZE M. B. (2012). Ernährung bei diabetischer Dyslipidämie; Der diabetologe, 8, 556-561.
SNUSTAD D. P., SIMMONS M. J. (2009). Genetika. 1. vyd. Brno: Masarykova univerzita. 894 s. ISBN 978-80-210-4852-2.
SOBOTKA L. (2011). Basics in Clinical Nutrition. 1. vyd. Praha: Galén. 500 s. ISBN 978-80-7262-821-6.
SOCCIO R. E., BRESLOW J. L. (2004). Intracellular cholesterol transport. Arterioscler Tromb Vasc Biol, 24, 1150-1160.
SOŠKA V. (2001). Poruchy metabolizmu lipidů. 1. vyd. Praha: GRADA Publishing. 180 s. ISBN 80-247-0234-7. 93
SVAČINA Š.,
BRETŠNAJDROVÁ A.,
HOLECÁTOVÁ I,
HORÁČEK J.,
KOVÁŘOVÁ K., KREUZBERGOVÁ J., MÜLLEROVÁ D., PEISKEROVÁ M., RUŠAVÝ Z., SULKOVÁ S., ŠMAHELOVÁ A. (2008a). Klinická dietologie. 1. vyd. Praha: GRADA Publishing. 381 s. ISSN 978-80-247-2256-6.
SVAČINA Š., BRETŠNAJDROVÁ A. (2008b). Dietologický slovník. 1. vyd. Praha TRITON. 271 s. ISBN 978-80-7387-062-1
ŠEDA O., ŠEDOVÁ L. (2004). Nutriční genomika. Časopis Lékařů Českých, 676-678.
ŠEDA O., ŠEDOVÁ L. (2005). Farmakogenomika a nutrigenomika: komplexní interakce genů s prostředím. Klinická Farmakologie a Farmacie, 19, 116-120
ŠMARDA J., DOŠKAŘ J., PANTŮČEK R., RŮŽIČKOVÁ V., KOPTÍKOVÁ J. (2010). Metody molekulární biologie. 1. vyd. Brno: Masarykova univerzita. 194 s. ISBN 978-80-210-3841-7.
TAKAHASHI Y. (2011) Soy protein and fish oil independently decrease serum lipid concentrations but interactively reduce hepatic enzymatic activity and gene expression involved in fatty acid synthesis in rats. Journal of Nutritional Science and Vitaminology, 57, 56-64.
VANGUILDER H. D., VRANA K. E., FREEMAN W. M. (2008) Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis. BioTechniques, 44, 619–626.
WALL R., ROSS R. P., FITZGERALD G. F., STANTON C. (2010). Fatty acids from fish: the anti-inflammatory potential of long-chain omega-3 fatty acids. Nutrition Reviews, 68, 280-289.
WEBSTER C. G., WILIE S. J., JONES M. G. K. (2004). Diagnosis of plant viral pathogens. Current Science, 86, 1604-1607.
WORGALL T. S., JOHNSON R. A., SEO T., GIERENS H., DECKELBAUM R. J. (2002). Unsaturated fatty acid-mediated decreases in sterol regulatory element mediated 94
gene transcription are linked to cellular sphingolipid metabolism. Journal of Biological Chemistry, 277, 3878-3885.
WU Y., CHEN Y., WANG B., (2010). SYBR Green Real-Time PCR used to detect celery in food. Journal of AOAC international, 93, 1530-1536.
XIAO Y., QIANCHUN G., JIQU X., FENGHONG G., QINGDE H., ZHIHUA Y., (2012). Effects of cold-pressed and vitamin E-enriched flaxseed oils on lipid profile and antioxidant status in high-fat fed rats. European Journal of Lipid Science and Technology, 114, 461-468.
YEUNG S. S. W., LEE T. M. H., HSING I. (2008). Electrochemistry-based real-time PCR on a microchip. Analytical Chemistry, 80, 363-368.
YAMAZAKI R. K., BRITO G. A. P., COELHO I., PEQUITTO D. C. T., YAMAGUCHI A. A., BORGHETTI G., SCHIESSEL D. L., KRYCZYK M., MACHADO J., ROCHA R. E. R., AIKAWA J., IAGHER F., NALIWAKO K., TANHOFFER R. A., NUNES N. A., FERNANDES L.C. (2011). Low fish oil intake improves insulin sensitivity, lipid profile and muscle metabolism on insulin resistant MSG-obese rats. Lipids in Health and Disease, 10, 66.
95
8 SEZNAM POUŽITÝCH INTERNETOVÝCH ZDROJŮ www1
SOŠKA V. (2013). Encyklopedie laboratorní medicíny [online cit. 3. 12. 2012]. Dostupné na: http://oldweb.izip.cz/ds3/hypertext/SVAAK.htm
www2
SOŠKA V. (2013). Encyklopedie laboratorní medicíny [online cit. 3. 12. 2012]. Dostupné na: http://oldweb.izip.cz/ds3/hypertext/SVAAL.htm
www3
UNITED
STATES
DEPARTMENT
OF
AGRICULTURE
(2013).
Agricultural Research Service [online cit. 26. 1. 2013]. Dostupné na: http://www.ars.usda.gov/services/docs.htm?docid=8964 www4
KING M. (2013). The Medici Biochemistry Page [online cit. 24. 2. 2013]. Dostupné na: http://themedicalbiochemistrypage.org/
www5
APPLIED BIOSYSTEMS (2001). User Bulletin #2, ABI PRISM 7700 Sequence Detection System – Relative quantitation of gene expression [online cit. 1. 3. 2013]. Dostupné na: http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_suppor t/documents/generaldocuments/cms_040980.pdf.
96
9 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK %
procento
°C
stupeň Celsia
µm
mikrometr
ABCG5/G8 – ATP
binding cassette G5/G8
ACAT
acyl-CoA cholesterolacyltransferáza
AF
Agronomická fakulta
bp
páry bazí (base pairs)
c
koncentrace
cDNA
komplementární DNA (complementary DNA)
CT
cyklus, ve kterém fluorescence vzorku protne stanovený fluorescenční práh (treshold cycle)
DHA
kyselina dokosahexaenová
DNA
deoxyribonucleic acid = deoxyribonukleová kyselina
dsDNA
dvoušroubovice DNA (double-stranded DNA)
E
efektivita, resp. efektivita PCR (efficiency)
EPA
kyselina eikosapentaenová
ER
endoplazmatické retikulum
ERK
kináza aktivovaná mimobuněčným signálem
g
gram
GSK
glykogensyntázakináza
HDL
lipoprotein o vysoké hustotě (high density lipoprotein)
HMG-CoA-R
3-hydroxy-3-metylglutaryl koenzym A reduktáza
INSIG 1
Insulin-induced gene 1 protein
INSIG
proteinový produkt genu Insig
kcal
kilokalorie
kJ
kilojoule
l
litr
LA
kyselina linolová
LDL
lipoprotein o nízké hustotě (low density lipoprotein)
LDL-R
receptor lipoproteinů nízké hustoty
LNA
kyselina α-linolenová
97
LP
lipoproteiny
LT
leukotrieny
MENDELU
Mendelova univerzita
mg
miligram
MK
mastné kyseliny
ml
mililitr
mmol
milimol
MUFA
mononenasycené mastné kyseliny
nm
nanometr
NPC1L1
Niemann-Pick C1 like-1 transportér
oligo-dT
oligo-deoxytymin
PCR
polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction)
PG
prostaglandiny
PKA
proteinkináza A
PPAR
peroxisome proliferator activated receptor (receptory aktivované peroxizomovými proliferátory)
PUFA
polynenasycené mastné kyseliny
RNA
ribonucleic acid = ribonukleová kyselina
rpm
otáčky za minútu (Revolutions per minute)
rRNA
ribozomální RNA
RT-PCR
reverzně transkripční PCR (reverse transcription PCR)
RXR
retinoid X receptor
SCAP
SREBP-cleavage activating protein (protein aktivující štěpení SREBP)
SCO
srdečně-cévní onemocnění
SFA
nasycené mastné kyseliny
SRE
sterol response element
SREBP
sterol response element-binding protein
TA
tromboxany
TAG
triacylglycerol
Taq
Thermus aquaticus
TF
transkripční faktor
Tm
teplota tání (melting temperature)
VLDL
lipoprotein o velmi nízké hustotě (very low density lipoprotein) 98
10 PŘÍLOHY Příloha 1 Biosyntéza cholesterolu (Murray; 2002)
99
Příloha 2 Doporučené hodnoty lipidů v krevním séru (Béder; 2005) Celkový cholesterol
Norma do 5,0 mmol/l Hraniční 5,0 – 6,5 mmol/l Zvýšená > 6,5 mmol/l
LDL-cholesterol
Norma do 3,5 mmol/l
HDL-cholesterol
Norma- muži > 1,2 mmol/l Norma- ženy > 1,4 mmol/l
TAG
Norma do 1,9 mmol/l Zvýšená > 2,3 mmol/l
Rizikové indexy
Chol.:HDL = 4 (muži); 3,5 (ženy TAG:HDL = 1 LDL:HDL = 3
100
Příloha 3 Amplifikační křivka a) Plato fáze b) Lineární fáze c) Exponenciální fáze d) Background e) Baseline (APPLIED BIOSYSTEMS, 2004)
101
