MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE

MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA

DIPLOMOVÁ PRÁCE

BRNO 2014

BC. MARTIN KUČÍREK

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat

Polymorfismus v genu DGAT1 ve vztahu k marblingu u skotu Diplomová práce

Vedoucí práce: Prof. RNDr. Aleš Knoll, Ph.D.

Vypracoval: Bc. Martin Kučírek

Brno 2014

Čestné prohlášení

Prohlašuji, že jsem práci: Polymorfismus v genu DGAT1 ve vztahu k marblingu u skotu vypracoval samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s § 47b zákona č. 111/1998 Sb.,o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací.

Jsem si vědom, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle § 60 odst. 1 autorského zákona.

Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Brně dne:………………………..

…………………………………………………….. podpis

PODĚKOVÁNÍ

Na tomto místě bych rád poděkoval svému školiteli prof. RNDr. Aleši Knollovi, Ph.D. za věnovaný čas a cenné rady. Dále mé poděkování patří doc. Ing. Tomáši Urbanovi, Ph.D. za pomoc se statistickým vyhodnocením výsledků mé práce, Mgr. Zuzaně Vykoukalové, Ph.D. za odborné rady v laboratoři a Ing. Elišce Dračkové za zpracování vzorků do databáze. Také bych rád poděkoval Ing. Elišce Horecké, Ing. Čeňku Horeckému a Bc. Ing. Ondreji Škultétymu za jejich rady a pomoc v laboratoři. Práce byla podporována projektem NAZV č. QI91A055 (Stanovení asociací mezi genotypy pro gen leptin a jejich využití ke standardizaci tržní jakosti a zvyšování parametrů kvality masné produkce skotu s kombinovanou užitkovostí). Tato práce vznikla v rámci CEITEC - Středoevropského technologického institutu s pomocí výzkumné infrastruktury financované projektem CZ.1.05/1.1.00/02.0068 z Evropského fondu regionálního rozvoje.

ABSTRAKT Intramuskulární tuk vyskytující se ve svalu skotu je předpokladem kvalitního hovězího masa. Mramorování (marbling) má vliv na šťavnatost, křehkost a chuť masa. Selekce skotu na vyšší marbling s sebou přináší zvýšenou křehkost masa. Ta je ovlivněna celou řadou faktorů, mezi něž řadíme genetické pozadí, věk, výživu, pohlaví a také plemennou příslušnost zvířete. Cílem práce je provedení asociační analýzy dinukleotidového polymorfismu v genu DGAT1 (diacylglycerol acyltransferáza 1) s parametry kvality hovězího masa (intramuskulární tuk a marbling). Součástí práce je zpracování literatury k tématu asociací kandidátních genů, současný stav problematiky, význam a metody studia, geny ovlivňující ukládání a metabolismus intramuskulárního tuků u skotu. Dále role enzymu DGAT1 v biosyntéze triacylglycerolů a jeho fyziologická funkce (energetický metabolismus, metabolismus glukózy, lipoproteinů, vztah k ukládání tuku a obezitě). Ve studii byl nalezen signifikantní rozdíl v příspěvku alel na obsah IMT v mase testovaného vzorku skotu. Nicméně efekt alely Q je opačný než se očekával dle odborné literatury. Klíčová slova: skot, kvalita masa, marbling, DGAT1

ABSTRACT: Intramuscular fat occurring in the muscle of cattle is supposed to be prerequisite for high-quality beef. Marbling has effect on juiciness, tenderness and flavor of the meat. Selection of cattle at higher marbling score brings increased meat tenderness. It is influenced by many factors, among which we classify genetic background, age of animal, nutrition, sex and pedigree of animal. The aim is to perform association analysis beetween

dinucleotide

polymorphism

in

the

gene

DGAT1

(diacylglycerol

acyltransferase 1) and the marbling score. Part of thesis is elaboration of literature, present state of the problem, genes affecting metabolism of intramuscular fat in cattle, the role of the enzyme DGAT1 in the biosynthesis of triacylglycerols and its physiological function (energy metabolism, glucose metabolism, relation to fat accumulation and obesity). In this study a singificant difference of allelic contribution to intermuscular fat content in tested samples was found. Nevertheless, effect of Q allele was reverse than observed in similar studies. Key words: cattle, quality of meat, marbling, DGAT1

OBSAH 1 ÚVOD ............................................................................................................................ 9 2 CÍL PRÁCE................................................................................................................ 10 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED .......................................................................................... 11 3.1 Kvalita hovězího masa .......................................................................................... 11 3.2 Obecná charakteristika marblingu......................................................................... 13 3.2.1 Makroskopický pohled na marbling ............................................................... 13 3.2.2 Mikroskopický pohled na marbling................................................................ 14 3.2.3 Fyziologické hledisko marblingu ................................................................... 15 3.2.4 Signalizace spojená s marblingem .................................................................. 15 3.3 Energetický metabolismus .................................................................................... 17 3.4 Geny asociované s masnou produkcí .................................................................... 19 3.5 Geny asociované s marblingem ............................................................................ 21 3.5.1 FABP 4 ........................................................................................................... 21 3.5.2 TG ................................................................................................................... 22 3.5.3 Leptin .............................................................................................................. 23 3.5.4 DGAT1 ........................................................................................................... 25 3.5.4.1 Polymorfismus K232A v genu DGAT1 ................................................... 26 4 MATERIÁL A METODIKA .................................................................................... 29 4.1 Materiál ................................................................................................................. 29 4.1.1 Analyzované vzorky ....................................................................................... 29 4.1.2 Použité přístroje .............................................................................................. 29 4.1.3 Použité roztoky a další materiál ..................................................................... 29 4.2 Metodika ............................................................................................................... 30 4.2.1 PCR................................................................................................................. 30 4.2.2 RFLP............................................................................................................... 31

4.2.3 Agarózová elektroforéza ................................................................................ 32 4.2.4 Sekvenování ................................................................................................... 33 4.2.5 Popis chemických analýz ............................................................................... 34 4.3 Matematicko-statistické zpracování dat ................................................................ 36 4.3.1 Výpočet frekvencí alel a genotypů ................................................................. 36 4.3.2 Hodnocení genetické rovnováhy dle Hardy-Weinbergova zákona ................ 37 4.3.3 Asociační analýza ........................................................................................... 38 5 VÝSLEDKY A DISKUZE ........................................................................................ 39 5.1 PCR ....................................................................................................................... 39 5.2 RFLP ..................................................................................................................... 40 5.3 Sekvenování .......................................................................................................... 41 5.4 Matematicko-statistické vyhodnocení ................................................................... 43 5.4.1 Výpočet frekvencí alel a genotypů ................................................................. 43 5.4.2 Test genetické rovnováhy populace dle Hardy-Weinbergova zákona ........... 45 5.4.3 Asociační analýza ........................................................................................... 46 6 ZÁVĚR ....................................................................................................................... 50 7 LITERATURA ........................................................................................................... 51 8 SEZNAM ZKRATEK ............................................................................................... 59 9 SEZNAM OBRÁZKŮ ............................................................................................... 61 10 SEZNAM TABULEK .............................................................................................. 63

1 ÚVOD Kvantitativní znaky (QT z anglického quantitative traits) jsou velmi významné pro hospodářství a mají nepopiratelný ekonomický význam. Tyto znaky se dají měřit, jsou vyjádřeny číselnou hodnotou, často bývají ovlivněny vnějším prostředím, mají kontinuální průběh, bývají vyobrazeny Gaussovou křivkou. Znaky jsou kódovány geny malého účinku, tzv. minor geny. Mezi kvantitativní znaky například řadíme množství tuku, mléka, plodnost, míru osvalení. Novodobé

molekulární

techniky umožnily

přesné

vyhledávání

lokusů

kvantitativních znaků. Využívají se metody chromozomových map, které se sestavují na základě příbuznosti organismů a na základě polymorfismů délky restrikčních fragmentů (RFLP). Jedná se o metodu využívající specifity restrikčních enzymů a Southernova přenosu. Takto byly zjištěny QT lokusy na konkrétních chromozomech laboratorních a zemědělských zvířat. Mezi sledovanými znaky jsou například podíl tuku u prasat, mléčná užitkovost a podíl uloženého intramuskulárního tuku u skotu. Ve své práci se věnuji tématu marblingu (mramorování) hovězího masa. Mramorované maso obsahuje různé množství intramuskulárního tuku, které vytváří uvnitř masa charakteristické tukové žilky. Obsah intramuskulárního tuku v kosterním svalstvu u skotu je dán geneticky. Plemena angus, shorthorn a wagyū jsou známa svým vysokým marbling skóre.

9

2 CÍL PRÁCE Cílem práce je provedení asociační analýzy dinukleotidového polymorfismu v genu DGAT1 (diacylglycerol acyltransferáza 1) ve vztahu k parametrům kvality hovězího masa. Do analýzy bude zahrnut soubor býků studovaných na kvalitu masa (260 vzorků). Bude provedeno určení genotypů genu DGAT1 restrikční endonukleázou u daného souboru býků a bude vytvořena databáze. Následně proběhne statistické vyhodnocení asociace mezi ukazateli kvality hovězího masa a zjištěnými genotypy (pomocí softwaru SAS). Součásti práce bude zpracování literatury k tématu asociací kandidátních genů, současný stav problematiky, význam a metody studia, geny ovlivňující ukládání a metabolismus intramuskulárního tuků u skotu. Dále popsání role enzymu DGAT1 v biosyntéze triacylglycerolů a jeho fyziologická funkce ve vztahu k energetickému metabolismu, metabolismu glukózy, lipoproteinů, ukládání tuku a obezitě.

10

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Kvalita hovězího masa Charakteristiky kvality masa mohou být obecně rozděleny na tři kategorie fyzikální (pH, barva, vaznost), chemické (obsah sušiny, bílkovin, tuku) a senzorické (vůně, chuť, křehkost). Tyto charakteristiky masa jsou zásadně ovlivněny mnohými faktory zahrnujícími zootechnické vlastnosti zvířete - věk, pohlaví, anatomické rysy, typ masa, dále krmení a technologické parametry chovu (Huidobro et al., 2003). Dalšími důležitými faktory jsou zátěž, strava, množství intramuskulárního tuku, vlastnosti chovu zvířete před porážkou (Adegoke et al., 2005). Bylo prokázáno, že plemena skotu, chovaná pro masnou užitkovost (blonde d'aquitaine a limousin) mají nižší hodnoty obsahu kolagenu v syrovém a uvařeném mase oproti plemenům, která jsou chovaná pro mléčnou výrobu, jako jsou plemena holštýnského skotu (Monson et al., 2004). Je známo, že později dospívající plemena chovaná pro masnou užitkovost (belgické modré, limousin a blonde d'aquitaine) mají vyšší objem svalových vláken a menší zásobou tuku než je tomu u skotu chovaného pro mléčnou užitkovost anebo dříve dospívajících masných plemen (angus a japonský černý skot) (Chambaz et al., 2003). Monson et al. (2004) uvedli, že jsou rozdíly i v textuře masa, která s věkem zvířete ubývá. Stres zvířete před porážkou může mít nežádoucí vliv na měkkost, barvu, pevnost a suchost masa. Podmínky životního prostředí, které způsobují stres u zvířete, jsou extrémy tepla, vlhka, světla, hluku, únavy, hladu, žízně a pohybu. Po porážce a vykrvení zvířete se hromadí kyselina mléčná v jatečně upraveném těle. To způsobuje pokles pH, což má neblahý vliv na kvalitu masa. Maso by mělo být udržováno při teplotě 15 - 16°C. Správné způsoby chlazení jatečného masa zlepšují jeho měkkost a chuť (Adegoke et al., 2005). Kromě podmínek porážky a technologických aspektů kvality života zvířete je charakteristika masa přímo závislá na biologii svalu živého zvířete. Ta je regulována genetickými, nutričními a biologickými faktory. Genetické faktory mají zásadní význam, protože genetické zlepšení je trvalé, kumulativní a dědí se na další generaci. 11

Genetické faktory mohou být demonstrovány srovnáváním různých plemen skotu nebo různých genotypů u příslušníků stejného plemene. Vlastnosti masa, které jsou regulovány genetickými faktory, jsou množství a rozložení intramuskulárního tuku, ovlivňující chuť a nezávadnost masa. Dále vlastnosti pojivových tkání a svalových vláken, ovlivňující tuhost a měkkost masa (Hocquette et al., 2006). Žádoucí vlastnosti kvality masa u spotřebitele zahrnují smyslové a vizuální vlastnosti. Dále také nezávadnost, čistotu masa a dobré podmínky produkčního systému. Důležité vizuální vlastnosti zahrnují barvu, texturu masa, množství a rozložení tuku, absenci nadbytku vody v balení. Spokojenost zákazníka s uvařeným masem je ovlivněna tím, jak měkké maso je. Také jeho chuť, vůně a šťavnatost jsou pro zákazníka důležité (Warner et al., 2010). Konzument hovězího masa řadí měkkost jako nejdůležitější charakteristiku masa, dále v pořadí důlěžitosti je chuť, vůně a šťavnatost. Autoři však dodávají, že záleží na původu zákazníka. Jednotlivé odchylky v národnosti jsou patrné (Watson et al., 2008). Kvalita masa může být vnímána různě mezi zeměmi, producenty, zpracovateli, prodejci a spotřebiteli. V některých případech je prezentovaná kvalita masa odrazem zákazníkovy spokojenosti, v jiných zahrnuje technologické parametry. Celkové posouzení kvality masa je komplikováno tím, že existuje velké množství znaků, které lze stanovit a hodnocení se provádí na omezeném počtu vzorků (Boukha et al., 2011).

12

3.2 Obecná charakteristika marblingu Intramuskulární tuk vyskytující se ve svalu je předpokladem kvalitního hovězího masa. Mramorování má vliv na šťavnatost, křehkost a chuť masa. Selekce skotu na vyšší marbling s sebou přináší zvýšenou křehkost masa. Ta je ovlivněna celou řadou faktorů, mezi něž řadíme genetické pozadí, věk, výživu, pohlaví a také plemennou příslušnost zvířete (Wang et al., 2009). Vysokou mírou mramorování příčně pruhovaného svalstva je znám zejména japonský černý skot. Vysoký stupeň marblingu je charakterizován zvýšeným počtem a velikostí intramuskulárních tukových buněk (Gotoh et al., 2009). 3.2.1 Makroskopický pohled na marbling Mezi mramorované maso nezahrnujeme to, které se vykazuje podkožním anebo intermuskulárním tukem, ale pouze to s vysokým podílem intramuskulárního tuku. Mramorovaná tkáň může být hodnocena vizuálně nebo změřena použitím obrázkových analyzujících systémů. Systémy jsou založeny na rozeznávání barvy masa, rozdílnosti mezi tučnou a libovou tkání. Vizuálně můžeme také hodnotit množství mramorované části oproti té libové. Maso mající větší množství viditelného intramuskulárního tuku je kvalitněji ohodnoceno. Pokud mramorovaná tkáň přesahuje více jak 50 % masa, mluvíme pak o vysokém stupni marblingu. Systémy hodnotící maso zahrnující subjektivní ohodnocení marblingu dvanácti stupni jsou často využívány v Japonsku, Austrálii a USA (Wang et al., 2009). Existuje velká variabilita v rozložení mramorované tkáně mezi jednotlivými zvířaty. V extrémních případech maso jednoho zvířete může mít jemné, rovnoměrně roztroušené tukové bílé skvrny nebo pruhy. Zatímco maso jiného zvířete pak může mít silné, hluboké pruhy tukové tkáně, které se propojují s intermuskulárním tukem (Harper and Pethick, 2001). Obrázek 1 zobrazuje stupně marblingu u hovězího masa.

13

Obrázek 1: Znázornění stupňů marblingu u hovězího masa. BMS zkratka pro Beef marbling standards (Standarty hovězího marblingu), (zdroj: http://ieatishootipost.sg/2010/02/shabu-shabu-gen-theres-wagyu-and-then.html, upraveno).

3.2.2 Mikroskopický pohled na marbling Mramorované maso tvoří tuková tkáň, která je tvořena adipocyty (tukovými buňkami). Ty jsou zakotveny v matrix pojivové tkáně a vyskytují se poblíž krevní kapilární sítě. Tuk mramorované tkáně se odlišuje od jiných tukových tkání (podkožních, intermuskulárních) interfascikulárním (mezisvazkovým) uložením ve svalu. Adipocyty marblingu jsou kulaté buňky s průměrem mezi 40 - 90 μm. Tukové buňky mramorovaného masa jsou výrazně menší než buňky jiných tukových tkání. Zatím není jasné, jestli se rozdíl v buněčné velikosti odráží v rozdílných vlastnostech masa. Marblingové adipocyty se vyskytují ve shlucích nebo ostrůvcích. Pokud se 14

ostrůvky skládají z 10 až 15 buněk, jsou rozlišitelné makroskopicky. Pokud jsou ostrůvky adipocytů tvořeny stovkami buněk, často se vyskytují poblíž kapilární sítě (Harper and Pethick, 2001).

3.2.3 Fyziologické hledisko marblingu Není příliš jasné, jaké fyziologické výhody zvíře získá, pokud obsahuje mramorovanou tkáň. Tukové buňky vyvíjející se uvnitř svalu nejsou běžným jevem, vyskytujícím se u vyšších savců. Marblingové adipocyty mechanicky nesouvisí s tukovými zásobami, které například napomáhají medvědům přečkat hibernaci. Anebo tukovými zásobami, které se vyskytují u migrujících ptáků. Neexistuje ani důkaz, který by podporoval hypotézu, že by mramorovaný tuk poskytoval teplotní výhodu zvířeti. S vývojem vnitrosvalového tuku se můžeme setkat u patologických jevů. Existují nádory a nemoci, které zapříčiňují vznik tukové tkáně ve svalech. U poškozených svalových vláken dochází k náhradě za tuk. Ovšem z histologického hlediska je tento tuk odlišný od tuku mramorované tkáně (Harper and Pethick, 2001). Teorie Occamovy břitvy nás nutí přijmout nejjednodušší vysvětlení vzniku marblingu. Mramorování by nijak nezvýhodňovalo dané zvíře. Existoval by tedy silný evoluční tlak proti tomuto jevu. Marbling se náhodně vyvinul u jednotlivé linie skotu a díky hospodářské selekci, jev udržujeme mezi vybranými plemeny (Kaupe et al., 2007). 3.2.4 Signalizace spojená s marblingem Intenzivní genetická selekce zvířat pro zvýšení libového masa dramaticky snížila obsah intramuskulárního tuku, došlo tak i k poklesu kvality masa. Tuk je hlavním faktorem ovlivňujícím chuť masa. Porozumění mechanizmu adipogeneze (tvorby tukových buněk) je nepostradatelné pro objasnění vzniku marblingu u kosterního svalstva skotu. Svalové i tukové buňky kosterního svalstva vznikají z mezenchymálních multipotentních kmenových buněk během časného embryonálního a neonatálního vývoje. Během stárnutí zvířete kmenových buněk ubývá. Většina mezenchymálních 15

kmenových buněk se přeměňuje ve svalové buňky. Malé množství kmenových buněk se diferencuje v buňky tukové, které jsou základem intramuskulárního tuku (Du et al., 2010). Genetické, nutriční a environmentální faktory ovlivňují klíčové signální dráhy, které regulují adipogenezi u kosterního svalstva (Harper and Pethick, 2004). Mezi regulační mechanizmy ovlivňující tvorbu tukových buněk patří zejména signální dráhy Hedgehog, Wnt/β-katenin, signální dráha zprostředkovaná morfogenetickými proteiny (BMP) a také AMP aktivovaná protein kináza (Du et al., 2010). Obrázek 2 zobrazuje faktory působící na adipogenezi.

Obrázek 2: Tukové buňky vznikající (procesem adipogeneze) z multipotentních buněk kosterního svalstva jsou regulovány komplexem signálních drah. Faktory jako jsou výživa a vliv genetického pozadí ovlivňují tvorbu tukových buněk změnami těchto drah (Du et al., 2010, upraveno).

16

3.3 Energetický metabolismus Výskyt obezity se zvyšuje po celém světě spolu s komplikacemi spojených s obezitou, jako je diabetes typu 2, jaterní steatóza a kardiovaskulární onemocnění. Primární defekt u obezity je nadměrné hromadění triacylglycerolu (TAG) v bílé tukové tkáni, kosterním svalstvu, játrech a jiných tkáních. Nahromadění triacylglycerolu v bílé tukové tkáni je asociováno s výskytem větších adipocytů, zánětlivých reakcí a se změnami ve vylučování adipokinů (Fruhbeck et al., 2001). Adipokiny (adipocytokiny) jsou proteiny sekretovány tukovou tkání. Jedná se o metabolicky aktivní látky, které se účastní mnohých funkcí, reakce imunitního systému, tvorby zánětu, výdeje energie. Změny v adipokinech, tvořených v bílé tukové tkáni, mohou přispět k chorobným procesům jiných tkání, jako jsou např. rezistence na inzulin v kosterním svalstvu a jaterní steatóza. Mechanismy, které omezují hromadění triacylglycerolů a podporují tvorbu prospěšných metabolických látek, mají z klinického hlediska velký význam (Streeper et al., 2006). V bílé tukové tkáni a většině savčích buněk je poslední krok v biosyntéze triacylglycerolů, spojování acyl-CoA a diacylglycerolu esterovou vazbou, katalyzováno enzymem diacylglycerol-acyltransferázou (DGAT). U savců byly identifikovány dva DGAT enzymy. Porucha exprese genu DGAT2 u myší vyvolává úbytek triacyglycerolů a u homozygotních potomků dochází k časné postnatální letalitě (Stone et al., 2004). DGAT1 je zvýšeně exprimován ve tkáních, které syntetizují a uskladňují triacylglycerol. Narušení exprese DGAT1 u životaschopných myší má pleiotropní účinek na fenotyp. DGAT1 deficientní myši mají mírně sníženou tvorbu triacylglycerolu v tkáních a jsou rezistentní k dietou indukované obezitě (Smith et al., 2000). Dietou indukovaná obezita je metoda, kdy jsou pokusná zvířata týdny krmena stravou s vysokým obsahem tuku a cukru. Ve výsledku jsou zvířata obézní, hyperglykemická a mají narušenou toleranci ke glukóze. Zkoumají se tak genetické a fyziologické mechanismy obezity, zejména diabetu typu 2 (Wang and Liao, 2012). Myši jsou rezistentní k obezitě díky zvýšenému výdeji energie. Příčinou je nárůst termogeneze (produkce tepla) a fyzické aktivity. DGAT1 deficientní myši se vykazují zvýšenou senzitivitou na inzulin a leptin. Látky, tvořené bílou tukovou tkání 17

a účastnící se metabolismu, podléhají u deficientních myší řadě změn. Látka adiponektin zvyšuje oxidaci mastných kyselin a posiluje citlivost na inzulin. Studie odhalují, že adiponektin je zodpovědný za normální průběh metabolismu glukózy, lipidů a energie. Výsledky naznačují, že farmakologická inhibice genu DGAT1 by mohla být úspěšným krokem k léčení obezity u lidí a inzulinové rezistence asociované s nízkou hladinou

adiponektinu (Streeper et al., 2006).

Monoacylglycerol

acyltransferáza

(MGAT) a diacylglycerol acyltransferáza (DGAT) hrají základní roli v metabolismu monoacylglycerolu

(MAG),

diacylglycerolu

(DAG)

a triacylglycerolu

(TAG).

Mono/di/tri-acylglyceroly se účastní celé řady fyziologických funkcí, jako je vstřebávání tuků ve střevě, syntéza lipoproteinů, tvorba tukové tkáně, signální transdukce pocitu sytosti. Enzymy MGAT a DGAT jsou důležité v regulaci energetické homeostázy a citlivosti na inzulin. V důsledku toho by selektivní inhibice MGAT a DGAT mohla poskytnout novou léčbu obezity a podobných metabolických problémů (Shi and Cheng, 2009). Aktivita enzymu DGAT a jiných enzymů jsou dány polymorfismy genů pro tyto enzymy, z toho důvodu má genetické pozadí zvířete zásadní vliv na složení a kvalitu masa. Obrázek 3 zobrazuje zapojení enzymů DGAT a MGAT do regulace energetické homeostázy.

Obrázek 3: Enzymy monoacylglycerol acyltransferáza a diacylglycerol acyltransferáza 18

jsou součástí několika signálních drah, které regulují energetickou homeostázu. MGAT a DGAT mají významnou roli v energetickém metabolismu, který reguluje pocit sytosti v mozku (zprostředkováno monoacylglycerolem), vstřebávání tuků ve střevě (formou triacylglycerolu), syntézu fosfolipidů a sekreci lipoproteinu o nízké hustotě v játrech (prostřednictvím di-/tri- acylglycerolu), ukládání tuku v adipocytech (v podobě triacylglycerolu) a sensitivitu na inzulin v kosterním svalstvu (zprostředkováno diacylglycerolem), (Shi and Cheng, 2009, upraveno).

3.4 Geny asociované s masnou produkcí Kandidátní geny jsou vybírány na základě vztahu mezi fyziologickými a biochemickými procesy a vlastnostmi produkce, které jsou testovány jako lokusy kvantitativních znaků (QTL). Asociační analýza je způsob, jak zjistit genetický základ znaků produkce. Vývoj molekulární biologie a statistických metod umožnil lokalizovat geny, které jsou zodpovědné za zájmové znaky zvířete. Díky asociační analýze byly identifikovány kandidátní geny u skotu, prasat a jiných užitkových zvířat. Jsou to geny melanocortin 4 receptor (MC4R), myogenin, myostatine, homogentisate 1,2dioxygenase (HGD), thyroglobulin (TG), calcium channel voltage-dependent alpha 2/delta subunit 1 (CACNA2D1), adipose fatty acid binding protein 4 (FABP 4), leptin (LEP), calpastatin (CAST), stearoyl-CoA desaturase (SCD1) a fat mass and obesity associated genes (FTO) (Yuan et al., 2013).

CAST Kalcium dependentní proteinázový systém calpain/calpastatin je spojován s proteolýzou myofibrilárních proteinů během post mortem skladování jatečných těl skotu. Calpain je zodpovědný za rozpad myofibrilárních proteinů. Tento proces bývá spojován se zvýšenou křehkostí masa. Calpastatin inhibuje aktivitu calpainu, reguluje tak post mortem proteolýzu. Zvýšená post mortem aktivita CAST koreluje se sníženou měkkostí masa (Pringle et al., 1995). Schenkel et al. (2006) uvádí SNP alely C genu CAST, který je asociován se zvýšenou měkkostí masa v oblasti LM (longissimus muscle) u jatečného těla.

19

MC4R Melanokortinový receptor 4 (MCR4) paří mezi transmembránové G-proteiny, je exprimován v hypothalamu. MC4R protein reguluje působení inzulinu. Mnoho mutací v MC4R genu koreluje s obezitou, výdejem energie a hladinou triacylglycerolů v těle. Jednonukleotidové polymorfismy genu MC4R jsou asociovány s rychlostí růstu u skotu (Liu et al., 2010).

Myostatin Myostatin patří do rodiny transformujících růstových faktorů β (TGF-β) a je specifickým negativním regulátorem vývoje kosterního svalstva. Myostatin je považován za důležitý faktor myogeneze (Shibata et al., 2006). McPherron et al. (1997) využili myši s nefunkčním genem pro myostatin a zjistili, že hraje důležitou roli v regulaci tvorby kosterního svalstva. Přirozená mutace myostatinu u skotu je asociována s fenotypem dvojitého osvalení (Grobet et al., 1997).

SCD1 Stearoyl koenzym A desaturáza-1 (SCD1) je enzym katalyzující desaturaci nasycených kyselin na mononenasycené mastné kyseliny (MUFAs - monounsaturated fatty acids). Polymorfismy v genu SCD1 jsou spojovány se složením mastných kyselin, ukládáním intramuskulárního tuku a zbarvením hovězího masa (Li et al., 2013).

20

3.5 Geny asociované s marblingem Mramorování u skotu je kvantitativní vlastností, která je regulována interakcemi mezi mnoha QTL a okolním prostředím. Jsou prováděny četné studie na nalezení genetických

markerů

asociovaných

s marblingovým

fenotypem.

K nalezení

kandidátních genů pro intramuskulární tuk se využívá tradiční QTL analýzy. Studují se geny: fatty acid binding protein 4 (FABP 4) (Michal et al., 2006), thyroglobulin (TG) (Wood et al., 2006), růstový hormon 1 (GH1) (Taylor et al., 1998), leptin (LEP) (Buchanan et al., 2003) a diacylglycerol acyltransferáza 1 (DGAT1) (Thaller et al., 2003). Pro identifikaci dalších kandidátních genů asociovaných s marblingovým fenotypem se využívá mikročipové analýzy a studia diferenciální exprese genů na základě transkriptomu (Wang et al., 2009).

3.5.1 FABP 4 Bovinní gen FABP 4 je lokalizován na 14. chromozomu na lokusu s označením BOS_13990 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/281759). Obrázky 4 a 5 zobrazují organizaci a lokalizaci bovinního genu FABP 4.

Obrázek 4: Znázornění lokalizace bovinního genu FAPB 4 (zdroj: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/281759). Adipocytární protein vázající mastné kyseliny (AFABP, gen FABP 4) je protein o velikosti 14,4 kDa, který je členem rodiny FABP proteinů, schopných vázat mastné kyseliny a eikosanoidy (Stejskal et al., 2006). Protein FABP 4 je cytoplazmatický protein, který je exprimován v tukové tkáni a váže dlouhý řetězec mastných kyselin a jiné hydrofobické ligandy. Hlavní funkcí je vychytávání, transport a přeměna mastných kyselin. Protein FABP4 je nezbytný pro regulaci lipidů a udržení glukózové 21

homeostázy prostřednictvím PPARs (peroxisome proliferator-activated receptors receptory peroxizómů aktivovaných proliferatory), které se nachází v buněčném jádru. Proteiny FABP 4 a FABP 5 byly určeny jako kandidátní geny obezity (Michal et al., 2006). AFABP byl lokalizován v cytosolu zralých adipocytů a makrofágů a je považován za regulátor produkce zánětlivých cytokinů a regulátor akumulace esterů cholesterolu (Stejskal et al., 2006). Michal et al. (2006) uvádí polymorfismy genu FABP 4, které se signifikantně podílejí na zvýšeném mramorování masa a tloušťce podkožního tuku v F2 populaci, vzniklé křížením plemene wagyu a limousin.

Obrázek 5: Struktura bovinního genu FABP 4 (zdroj: Ensembl:ENSBTAG00000037526).

3.5.2 TG Bovinní gen thyroglobulin (TG) je lokalizován na dlouhém raménku 14. chromosomu, přesněji: 14q12-q15 (zdroj: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/280706). Obrázky 6 a 7 zobrazují organizaci a lokalizaci bovinního genu TG.

Obrázek 6: Znázornění lokalizace bovinního genu TG (zdroj: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/280706).

22

Thyroglobulin je glykoproteinový hormon, syntetizován folikulárními buňkami štítné žlázy. Thyroglobulin je prekurzorem pro thrijodthyronin (T3) a tetrajodthytonin (T4) (Fortes et al., 2009). Thyroidní hormony hrají důležitou roli v regulaci metabolismu, ovlivňují růst a diferenciaci tukových buněk (Hou et al., 2011). Studie ukazují, že polymorfismy v bovinním TG genu mají vliv na tloušťku podkožního tuku a na procento tuku obsaženého v mléce. Alely genu TG jsou také asociovány s ukládáním tuku a mramorovaným fenotypem u skotu (Fortes et al., 2009). Barendse (1999) objevil polymorfismus TG genu v 5´UTR oblasti, který koreluje s fenotypem marblingu. Polymorfismus může být použit k testování a následné selekci zvířat na marbling. Mears et al. (2001) uvedli, že geny pro T3 a T4 jsou spojovány s marblingem u japonského černého skotu. Hou et al. (2011) identifikovali 6 nových jednonukleotidových polymorfismů v 3´UTR oblasti genu TG. SNP asociační analýza objevila polymorfismy: T354C, G392A, A430G a T433G. Všechny čtyři jsou asociovány se zvýšeným marbling skóre a proto mohou být použity jako selekční markery.

Obrázek 7: Struktura bovinního genu TG (zdroj: Ensembl:ENSBTAG00000007823).

3.5.3 Leptin Gen pro leptin se u skotu nachází na 4. chromosomu, na lokusu 4q32. Je dlouhý 16,735 kb a obsahuje 3 exony. Gen kóduje 167 aminokyselin (Giblin et al., 2010). Obrázky 8 a 9 zobrazují organizaci a lokalizaci bovinního genu LEP.

23

Obrázek 8: Znázornění lokalizace bovinního genu leptinu (zdroj: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/280836).

Leptin je peptidový hormon, který je syntetizován a vylučován zejména bílými adipocyty. Leptin přispívá k regulaci nadměrné tělesné hmotnosti, příjmu potravy a výdeji energie (Pannier et al., 2009). Leptin funguje také jako lipostatický signál, který ovlivňuje energetický metabolismus celého těla (Nkrumah et al., 2005). Gen pro leptin je také nazýván genem obezity. Jednonukleotidové polymorfismy genu pro leptin jsou asociovány s hladinou intramuskulárního tuku u skotu (Pannier et al., 2009). Studie in vivo naznačují, že leptin může přímo regulovat energetický metabolismus v periferních tkáních. Zároveň může působit jako antagonista inzulinu v tukové a svalové tkáni. Jeho fyziologické vlastnosti podporují tezi, že leptin je silným kandidátním genem pro obsah tuku u jatečného těla skotu (Buchanan et al., 2002). Zvířata s genotypem TT (C/T substituce detekovaná na 528 pozici regionu promotoru pro leptin u skotu) se projevují 9% - 13% nárůstem marbling skóre v porovnání s genotypy CC a CT (Nkrumah et al., 2005).

Obrázek 9: Struktura bovinního genu leptinu (zdroj: Ensembl:ENSBTAG00000014911).

24

3.5.4 DGAT1 Gen DGAT1 (diacylglycerol acyltransferáza 1) je umístěn na 14. chromozomu, v oblasti bohaté na mléčné a masné QTL (Winter et al., 2002). Je velký 8,6 kb a obsahuje 17 exonů a 16 intronů. Exony jsou velké v průměru 121,8 bp (rozpětí 42 436 bp). První dva introny jsou dlouhé 3,6 a 1,9 kb a zbývajících 14 intronů je průměrně velkých 92,4 bp (rozpětí 70 - 215 bp). Všechny introny podléhají pravidlu GT-AG. Kódující oblast genu DGAT1 je z 89,5% shodná u lidí a skotu. Pořadí AMK v proteinu DGAT1 je shodné z 92,5% (Grisart et al., 2002). Obrázek 10 zobrazuje lokalizaci bovinního genu DGAT1.

Obrázek 10: Znázornění lokalizace bovinního genu DGAT1 (zdroj: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/282609). Enzym DGAT1 (diacylglycerol O-acyltransferáza 1) katalyzuje poslední krok v syntéze triacylglycerolů (TAG) (Thaller et al., 2003). Triacylglyceroly jsou hlavními zdroji energie u eukaryot. TAG také slouží jako rezervoáry mastných kyselin pro syntézu biomembrán a vedou k obezitě v důsledku nadměrného hromadění tukové tkáně (Cao, 2011). Zvýšená tvorba TAG je asociována s vyšším procentem obsažených lipidů v mléce (Thaller et al., 2003). Protein DGAT1 hraje klíčovou roli v metabolismu buněčných glycerolipidů (Weiss et al., 1960). Enzym DGAT1 katalyzuje přeměnu diacylglycerolu (DAG) a acylCoA v triacylglycerol (Wang et al., 2007). DGAT1 se také podílí na syntéze enzymu thyroglobulin. DGAT1 a TG jsou nezbytné v procesu ukládání živočišného tuku (Cui et al., 2011). Diacylglycerol acyltransferáza je funkčním a pozičním kandidátním genem pro obsah tuku v mléce. Myši mající nefunkční gen DGAT1 nebyly schopny laktace z důvodu nedostatečné syntézy triacylglycerolů (Smith et al., 2000). 25

3.5.4.1 Polymorfismus K232A v genu DGAT1

Polymorfismus K232A je lokalizovaný v 8. exonu genu DGAT1, konkrétně v pozici 10 433 a 10 434 bp. Jedná se o dinukleotidovou záměnu AA za GC, důsledkem toho dochází k náhradě aminokyseliny lyzin (K) za alanin (A) (Nowacka-Woszuk et al., 2008). V literatuře se setkáme s různým značením alel polymorfismu K232A. Mnohdy je alela kódující lyzin označována také jako DGAT1K, K anebo alela Q. Alela kódující alanin bývá označována také jako DGAT1A, A anebo q. Substituce má vliv na plemennou hodnotu. Dinukleotidový polymorfismus K232A je asociován s vlastnostmi produkce mléka. Lyzin kódující alela DGAT1K je asociována se zvýšeným obsahem tuku v mléce oproti alele kódující alanin (NowackaWoszuk et al., 2008). Winter et al. (2002) uvádí, že zvýšený obsah tuku v mléce u různých plemen skotu je asociován s lyzinem na pozici 232 - proteinu, který je kódován bovinním genem DGAT1. Přítomnost alaninu na této pozici souvisí s nižším obsahem tuku v mléce. Ke stejným závěrům ve své studii došli i Grisart et al. (2002). Podle Kaupe et al. (2007) alela kódující alanin (DGAT1A) může mít negativní efekt na procento nepřeběhlých plemenic a následně na délku reproduktivního života. Szyda a Komisarek (2007) uvádí, že polymorfismus K232A má mnohem větší aditivní účinek na mléko, tuk a proteinové výnosy oproti jiným polymorfismům než se očekávalo. Thaller et al. (2003) ve své studii tvrdí, že alela K (DGAT1K ) má pozitivní vliv na obsah intramuskulárního tuku u plemen charolais a holštýn. Domnívají se také, že výskyt lyzinu v pozici 232 - proteinu DGAT1 bude studován v budoucnu i u jiných druhů savců. Výskyt lyzinu v dané pozici posiluje vazbu acyl-CoA oproti alele kódující alanin. Obrázek 11 zobrazuje organizaci bovinního genu DGAT1.

26

Obrázek 11: Struktura bovinního genu DGAT1 zdroj: Ensembl:ENSBTAG00000026356). Winter et al. (2002) se také zmiňují o tom, že na základě výsledků analýzy haplotypu je lyzinová varianta alely původní. Tuto teorii podpořili i Kaupe et al. (2004), kteří došli ve své studii ke stejným výsledkům. Substituce v polymorfismu K232A se zřejmě objevila po oddělení plemen linií Bos indicus a Bos taurus (Kaupe et al., 2004). K takovéto divergenci došlo před více než 200 000 lety (Loftus et al., 1994). Kaupe et al. (2004) identifikovali 1 748 jedinců u 38 různých plemen Bos taurus a Bos indicus ze 13 zemí a pěti kontinentů. Uvedli, že dochází k divergenci v četnosti alel mezi Bos taurus a Bos indicus. Zjistili, že došlo k úplné fixaci alely DGAT1A (q) u některých plemen Bos taurus (belgické modré, gelbvieh, hereford, pinzgavský skot a slovinský syrmian) a k úplné fixaci alely DGAT1K (Q) u plemene Bos indicus (nellore). Plemena Bos taurus se projevují nižší frekvencí alely DGAT1K (Q). Nejmenší četnost alely Q byla nalezena u plemen pezzata rossa a piemontese (frekvence alely Q okolo 1 %). Loftus et al. (1999) ve své studií tvrdí, že alela DGAT1A byla nalezena i u afrického plemene n’dama stejně tak jako u evropské linie Bos taurus. Naznačovalo by to, že polymorfismus K232A se objevil po divergenci linii Bos taurus a Bos indicus, ale před rozdělením linie Bos taurus do jednotlivých plemen. Předpokládá se totiž, že plemeno n´dama bylo domestikováno samostatně, odděleně od evropských plemen Bos taurus. Obrázek 12 zobrazuje rozložení frekvencí alel u 38 plemen.

27

Obrázek 12: Znázornění distribuce alely DGA1TA a DGAT1K u plemen Bos taurus a Bos indicus (Kaupe et al., 2004). Po domestikaci divokého skotu se objevila zvýšená selekce na alelu DGAT1A u ušlechtilých, evropských plemen z důvodu vyšších požadavků na objem mléka. Substituce v polymorfismu K232A zapříčinila nižší energetický výdej, což podporovalo vyšší fertilitu krávy. I u nedomestikovaných aurochů, kde alela DGAT1A vznikla, byla upřednostňována přírodním výběrem (Lucy et al. 1992). Před více než 200 lety se začal klást důraz na zvýšený obsah tuku v mléce, jako zdroje energie v lidské výživě. Proto existuje zvýšený selekční tlak pro tuto vlastnost u černo-bílých severoevropských plemen skotu chovaných pro mléčnou produkci (Kaupe et al., 2004). Plemena Bos taurus určená na mléčnou produkci se prokazují vyšší frekvencí alely DGAT1 K. U plemen jersey a německého anglera je vyšší frekvence alely DGAT1K zapříčiněná konstantní dlouhotrvající selekcí na zvýšený tuk v mléce. U plemene jersey byla nalezena relativní frekvence alely DGAT1K 0,69 a u novozelandské jersey 0,88 (Spelman et al., 2002). Centra domestikace linií Bos taurus a Bos indicus byla od sebe ve velké blízkosti, kterou dokázal neolitický lid překonat migrací. Proto nemůže být vyloučen kontakt mezi liniemi Bos indicus a Bos taurus. Předpokládá se, že tímto způsobem se objevila alela DGAT1A, která vznikla u evropských plemen, u zástupců Bos indicus (Kaupe et al., 2004). 28

4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Materiál 4.1.1 Analyzované vzorky Vzorky DNA, které jsem ve své práci analyzoval, byly získány na Ústavu morfologie, fyziologie a genetiky zvířat, Agronomické fakulty, Mendelovy Univerzity v Brně. Soubor činil celkem 260 vzorků DNA izolovaných z krve a pocházejících od býků plemene český strakatý skot. 4.1.2 Použité přístroje Automatický termální cykler PTC-200 Peltier Thermal Cycler (MJ Research) Automatický termální cykler GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) Centrifuga Mikro 20 (Hettich Zentrifugen) Centrifuga Mikro 120 (Hettich Zentrifugen) Electronic UV Transilluminator (Ultra LŪM) Fotoaparát Powershot G6 (Canon) UltraCam - Digital Imaging (Ultra-Lum) Váha Scaltec SBA 41 (Denver Instrument) Votrex Bio Vortex V1 (Biosan) Sekvenátor 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Hitachi) Termostat BE 200 (Memmert GmbH) Třepačka Vortex Genie 2 (Scientific Industries)

4.1.3 Použité roztoky a další materiál Použité roztoky a jiný materiál jsou pro větší názornost uváděny vždy u příslušných metod.

29

4.2 Metodika Metodika a postup práce byly převzaty z práce Thaller et al. (2003). Návrhy primerů byly převzaty z dizertační práce Bartoňová (2012). 4.2.1 PCR Roztoky-PCR reakční směs: Tabulka 1: Složení reakční směsi pro PCR reakci Složka

Výsledné množství 1,25 µl

Pufr pro LA polymerázu (včetně 2,5 mM Mg2+) dNTP mix

0,25 µl

Přímý primer (BT-DGAT1 2A)

0,25 µl

Zpětný primer (BT-DGAT1 2B)

0,25 µl

DMSO

0,625 µl

LA polymeráza dH2O

0,1 µl doplněno do 11,5 µl

Celkové množství

11,5 µl

Pracovní postup: 1. PCR reakční směs byla připravena na ledu dle tabulky 1 a řádně promíchána. 2. Reakční směs byla rozpipetována po 11,5 µl do mikrozkumavek. 3. K 11,5 µl reakční směsi byl přidán 1 μl testované DNA, obsah mikrozkumavky byl zvortexován. 4. PCR reakce byla provedena v automatickém termálním cykleru (PTC-200 Peltier Thermal Cycler, MJ Research).

30

Pro průběh amplifikace byly zvoleny následující podmínky: 95°C/5 min.; 35 cyklů (95°C/30s, 62°C/30s; 68°C/30s); 68°C/7 min.; 4°C /∞. Délka amplifikovaného fragmentu byla 254 bp. 5. Část PCR produktu byl nanesen na 3% agarózový gel (viz. 4.2.3. Agarózová elektroforéza) pro ověření průběhu PCR. Zbytek produktu byl uchován při 4°C. Návrhy primerů byly převzaty z dizertační práce Bartoňové (2012): Přímý: Zpětný:

(5´- TAG GTC AGG TTG TCG GGG TA - 3´) (5´- CCA TCC TCT TCC TCA AGC TG - 3´)

4.2.2 RFLP Roztoky- RFLP reakční směs: Tabulka 2: Složení reakční směsi pro RFLP reakci Složka

Výsledné množství

Pufr pro restrikční endonukleázu

1,5 μl

RE AciI (10 U/μl)

0,1 μl

dH2O

doplněno do 10 μl

Celkové množství

10 μl

Pracovní postup: 1. RFLP reakční směs byla připravena dle tabulky 2. 2. Reakční směs byla rozpipetována po 10 µl do mikrozkumavek. 3. K 10 µl reakční směsi bylo přidáno 5 μl testované DNA, obsah mikrozkumavky byl zvortexován. 4. Reakční směs byla přes noc inkubována v termostatu BE 200 (Memmert GmbH) na konstantních 37°C. 5. Po ukončení inkubace byly vzorky nanášeny na 3% agarózový gel.

31

4.2.3 Agarózová elektroforéza Roztoky: 1x TBE pufr (Sigma-Aldrich Corp.) Agarose SERVA Premium (SERVA Electrophoresis GmbH) Marker M50, GeneRulerTM 50 bp DNA Ladder o rozsahu: 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 GelStar (LONZA Ltd.) Ethidium bromid Nanášecí pufr: 40% sacharóza, 0,25% bromfenolová modř v 1x TE pufru Pracovní postup: 1. 1,8 g agarózy bylo rozvařeno v 60 ml 1x TBE pufru v mikrovlnné troubě. 2. Za občasného míchání byl roztok ponechán při pokojové teplotě, aby zchladl na cca 60°C. 3. Do roztoku bylo přidáno 6 µl 10 000x koncentrovaného barviva GelStar nebo 12 µl etidium bromidu. 4. Roztok by nalit do vaničky a byly zasunuty hřebínky. Gel polymerizoval 20 minut. 5. Vanička s gelem byla přesunuta do elektroforetické aparatury naplněné 1x TBE pufrem, do jamek bylo nanášeno vhodné množství vzorků smíchaných s 1,5 µl nanášecího pufru. 6. Souběžně se vzorky byl nanesen DNA M50 hmotnostní marker pro určení velikosti PCR a RFLP fragmentů. 6. Elektroforéza probíhala v 1x TBE pufru při napětí 4V/cm po dobu 20 – 35 minut. 7. Po separaci byly vzorky vizualizovány Electronic UV Transilluminator (Ultra LŪM). Jako záznamové zařízení byl použit fotoaparát Canon Power Shot G6.

32

4.2.4 Sekvenování Roztoky: Sekvenční reakční směs BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1 (Life Technologies Corp.). Tabulka 3: Složení sekvenační směsi Složka

Výsledné množství

Reakční sekvenační mix

0,5 μl

Sekvenační pufr

1,75 μl

Přímý primer (BT-DGAT1 2A)

0,16 μl

PCR produkt

0,5 μl doplněno do 10 μl

dH2O Celkové množství

10 μl

BigDye XTerminator Purification Kit (Life Technologies Corp.)

Postup: 1. Byla připravena sekvenační směs dle tabulky 3. 2. Amplifikace templátu probíhala v termálním cykleru GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems). Podmínky amplifikace byly zvoleny následující: 95°C/1 min.; 25 cyklů (96°C/10s, 50°C/5s; 60°C/4min); 4°C /∞. 3. Po amplifikaci byla sekvenační směs purifikována pomocí BigDye XTerminator Purification Kit (Life Technologies Corp.) dle přiloženého protokolu. 4. Ze směsi byly odstraněny terminátory třepáním na třepačce Vortex Genie 2 (Scientific Industries) po dobu 30 min. 5. Vzorky byly analyzovány pomocí automatického sekvenátoru 3500 Genetic Analyzer (Hitachi Applied Biosystems). Pro vyhodnocení výsledků sekvence byl využit Sequence Scanner Software v1.0. 33

4.2.5 Popis chemických analýz Vyhotovení chemických analýz a zpracování vzorků provedla Ing. Eliška Dračková v biotechnologické laboratoři.

Stanovení obsahu sušiny v mase (%) Sušina byla stanovena vysoušením homogenizovaného vzorku masa o hmotnosti 5 g do konstantní hmotnosti. Vzorek byl smíchán s mořským pískem, vysušeným při 105°C po dvě hodiny. Poté byl vzorek spolu s mořským pískem předsoušen čtyři hodiny při 60°C a poté byl sušen šest hodin při 105°C do konstantní hmotnosti. Vzorek po vychladnutí v exsikátoru byl zvážen. Z rozdílu hmotnosti vzorku po vysušení a původní navážky byl vypočítán obsah sušiny. Stanovení obsahu intramuskulárního tuku v mase (%) Obsah tuku byl zjištěn extrakční metodou podle Soxhleta. Vzorek z předchozího stanovení sušiny byl extrahován s diethyletherem po dobu 6 hodin. Po extrakci byl v digestoři ze vzorku odpařen zbytkový ether a poté se hodinu sušil při 105°C. Obsah tuku byl zjištěn rozdílem mezi váhou vzorku před analýzou a hmotností vzorku po provedené

analýze.

Tuky

jsou

látky rozpustné

v etheru

etylnatém,

xylenu

a tetrachlormetanu. Stanovení celkového obsahu proteinů v mase (%) Obsah dusíku byl stanoven metodou dle Kjeldahla. Tato metoda se skládá ze tří částí: mineralizace, kdy je dusík převeden na roztok síranu amonného, destilace, která umožňuje přeměnu soli amoniaku na amoniak a titrace slabou kyselinou sírovou. Zjištěný obsah dusíku byl přepočten na obsah bílkovin: N × 6,25. Stanovení obsahu popelovin (%) Při stanovení obsahu popelovin se 1 - 2 g masa postupně spalovali v muflové peci při teplotě 550 - 600°C po dobu 8 hodin. Po vychladnutí v exsikátoru byl vzorek zvážen a zjištěn obsah popelovin.

34

Stanovení obsahu vaznosti vody masa (%) Dva gramy homogenizovaného vzorku masa na filtračním papíře Whatman č. 2 byl vložen mezi dvě skleněné destičky, které byly zatíženy 500 g závažím po dobu 5 min. Poté byl vzorek opět zvážen a hmotnostní úbytek vody po vylisování masa vyjadřoval procentuální vaznost vody. Stanovení svalových pigmentů masa (mg.g-1) Ke stanovení svalových pigmentů bylo využito metody dle Hornseye. K 10 g homogenizovaného vzorku masa byl přidán okyselený roztok acetonu, poté byla provedena filtrace a následně byla zjištěna absorbance na spektrofotometru. Jako standard sloužil okyselený roztok acetonu. Celkový obsah barevných pigmentů byl stanoven v miligramech kyselého hematinu a faktorem 0,026, který byl převeden na miligramy myoglobinu v 1 g svaloviny. Stanovení pH48 masa Hodnota pH byla zjištěna 48 hodin po porážce zvířete. Hodnota pH je definována jako záporný dekadický logaritmus vodíkových iontů. Byla zjištěna pomocí pH metru WTW se dvěma elektrodami, kdy jedna měřila teplotu a druhá pH. Stanovení remise masa (%) Na hodnoceném vzorku masa byl provedený rovný řez na svalová vlákna těsně před měřením. Měření bylo provedeno ve středu plátku fotokolorimetrem Spekol 11, při vlnové délce 522 nm.

35

4.3 Matematicko-statistické zpracování dat 4.3.1 Výpočet frekvencí alel a genotypů

Tabulka 4: Výpočet frekvencí genotypů (zdroj: http://user.mendelu.cz/urban/vsg3/pop/popul3b.html) Genotypy

Absolutní frekvence

AA

D

Aa

H

aa

R

Součet

D +H + R = N

Relativní frekvence

d+h+r=1

Tabulka 5: Výpočet frekvencí alel (zdroj: http://user.mendelu.cz/urban/vsg3/pop/popul3b.html) Alely

Absolutní frekvence

A

P = 2D + H

a

Q = 2R + H

Součet

P + Q = 2N

Pozn.:

Relativní frekvence

p+q=1

D, H, R = absolutní frekvence genotypů d, h, r = relativní frekvence genotypů P, Q = absolutní frekvence alel p, q = relativní frekvence alel N = absolutní frekvence všech jedinců

36

4.3.2 Hodnocení genetické rovnováhy dle Hardy-Weinbergova zákona Rovnovážný stav zjištěných frekvencí genotypů byl posouzen dle HardyWeinbergova zákona, platí: 1 = p2 + 2pq + q2 Na vyhodnocení byl použit statistický test dobré shody - χ2 (chí kvadrát) test:

Kde platí, že: P

pozorovaná četnost genotypů

O

očekávaná četnost genotypů

Σ

suma

α

hladina významnosti

n–p–1

výpočet stupně volnosti

37

4.3.3 Asociační analýza Asociační analýza byla provedena pomocí programu SAS v8.2 (SAS Institute Inc.). Jako pevné efekty byly určeny: efekt genotypu, efekt roku porážky a efekt chovu. Mezi náhodné efekty byly zahrnuty: efekt otce a efekt plemene. K vyhodnocení asociační analýzy byla navržena rovnice:

yijklmn = μ + DGAT1i + rokj + chovk + otl + plemm + eijklm Kde platí, že: yijklmn

sledovaný znak

μ

odhadovaný průměr sledovaného znaku

DGAT1i

pevný efekt i-tého genotypu genu

rokj

pevný efekt roku porážky

chovk

pevný efekt chovu

otl

náhodný efekt otce

plemm

náhodný efekt plemena

eijklm

náhodná chyba každého pozorování

38

5 VÝSLEDKY A DISKUZE 5.1 PCR Polymorfismus K232A genu DGAT1 byl amplifikován pomocí metody PCR. Gen DGAT1 se vyskytuje na 14. bovinním chromozomu a amplifikovaný polymorfismus se nachází v 8. exonu genu DGAT1. Zmnožený fragment byl o délce 254 bp. Pro ověření si amplifikovaného PCR produktu byla využita horizontální agarózová elektroforéza. Obrázky 13 a 14 zobrazují namnožené fragmenty jednotlivých vzorků. Je patrný rozdíl v použití vizualizačního barviva GelStar, které je senzitivnější, a ethiduim bromidu.

Obrázek 13: Amplifikovaný úsek DNA, gen DGAT1. Fragmenty jsou naneseny na 3% agarózový gel, jako vizualizační barvivo byl použit GelStar.

Obrázek 14: Amplifikovaný úsek DNA, gen DGAT1. Fragmenty jsou naneseny na 3% agarózový gel, jako vizualizační barvivo byl použit ethidium bromid.

39

5.2 RFLP Amplifikovaný produkt PCR reakce byl štěpen restrikční endonukleázou AciI. Metodou RFLP vznikly fragmenty o délce 161 bp, 53 bp, 30 bp, 10 bp pro alelu q (GC) a fragmenty 161, 83, 10 pro alelu Q (AA). Teoretickou vizualizaci štěpení zobrazuje obrázek 15.

Obrázek 15: Vizualizace štěpení RE AciI polymorfismu K232A genu DGAT1. Pro vyhodnocení genotypů vzorků byla využita horizontální agarózová elektroforéza. Výsledek metody RFLP je vyobrazen na obrázcích 16 a 17. Je patrné, že genotypy Qq a QQ se na agarózovém gelu nedají rozeznat. Proto bylo dále využito metody sekvenování (viz. 5.3 Sekvenování). V obrázku 16 snadno odlišíme vzorky 55 a 58, sekvenování ověřilo, že se jedná o genotyp Qq. Zbylé vzorky bylo možné identifikovat na základě metody RFLP, jedná se o genotypy qq.

Obrázek 16: Štěpený PCR produkt (gen DGAT1) restrikční endonukleázou AciI. 40

Obrázek 17: Štěpený PCR produkt (gen DGAT1) restrikční endonukleázou AciI. Genotypy QQ a Qq nelze na základě metody RFLP rozlišit. Pro větší názornost jsou zvýrazněny.

5.3 Sekvenování Z důvodů nerozpoznání genotypů QQ a Qq bylo využito metody sekvenování PCR produktů. Obrázky 18, 19 a 20 zobrazují výstupy ze sekvenátoru.

Obrázek 18: Ukázka homozygota QQ (AA/AA) v genu DGAT1.

41

Obrázek 19: Ukázka heterozygota Qq (AA/GC) v genu DGAT1. Písmeno R značí, že se jedná o purinovou bázi (možnost výskytu báze A/G), písmeno M značí, že se jedná o aminoskupinu (možnost výskytu báze A/C).

Obrázek 20: Ukázka homozygota qq (GC/GC) v genu DGAT1.

42

5.4 Matematicko-statistické vyhodnocení 5.4.1 Výpočet frekvencí alel a genotypů Celková populace obsahovala 260 zkoumaných jedinců. U všech byl stanoven genotyp. Určení absolutních a relativních frekvencí genotypů a alel bylo provedeno dle tabulek v kapitole 4.5 Matematicko-statistické zpracování dat.

Tabulka 6: Frekvence genotypů genu DGAT1 Alely

Absolutní frekvence

Relativní frekvence

Q

40

0,0777

q

480

0,9231

Součet

560

p+q=1

Tabulka 7: Frekvence alel genu DGAT1 Genotypy

Absolutní frekvence

Relativní frekvence

QQ

3

0,0115

Qq

34

0,1307

qq

223

0,8576

Součet

260

1

Ve zkoumané populaci byl nejvíce zastoupen genotyp qq s 223 jedinci. Heterozygotní stav Qq byl detekován u 34 jedinců. Nejméně četný byl genotyp QQ, který byl zastoupen pouze 3 jedinci. Frekvence genotypů je QQ 1,15 %, Qq 13,07 % a qq 85,76 %. Početnější alelou v populaci je alela q s četností 92,31 %. Alela Q má četnost 7,69 %.

43

V kapitole (3.6.4.1 Polymorfismus K232A v genu DGAT1) se zmiňuji o tom, že distribuce alely Q a q je rozdílná u linií Bos indicus a Bos taurus. Kaupe et al. (2004) pozorovali u plemen česká červinka četnost alely Q 14 % a u německého simmentála 6 % (jedná se o podobné plemeno skotu jako je v mém pozorování: český strakatý skot). Souza et al. (2010) zkoumali soubor 357 jalovic indického plemene nellore. Frekvence genotypu QQ byla 94 %, Qq 5 % a qq pouhé 1 %. Distribuce alely Q byla 97 % a alely q 3 %. Cardoso et al. (2011) studovali 349 krav plemene girolando (kříženec mezi plemenem qir zástupcem Bos indicus a holštýnským skotem). Frekvence genotypu QQ byla 27 %, Qq 54 % a qq 27 %. Distribuce alely Q byla 54 % a alely q 46 %. Jelikož se jedná o plemeno vzniklé křížením Bos indicus a Bos taurus, pozorujeme vysoký výskyt heterozygotů pro polymorfismus K232A v genu DGAT1. Obě studie tak potvrdili výsledky Kaupe et al. (2004), kteří pozorovali vyšší frekvenci alely Q u linie Bos indicus. Anton et al. (2011) identifikovali 173 jedinců plemene červený angus. Frekvence genotypů pozorovaného vzorku byla QQ 5,2 %, Qq 27,75 % a qq 67,05 %. Frekvence alely Q byla tedy vyšší než u mého pozorování, které uvádím výše ve své práci. Li et al. (2013) uvedli ve své studii pozorování 243 býků pěti plemen. Soubor vzorků činil 43 kusů plemene angus, 109 jedinců plemene charolais, 35 kusů limousin a 21 býků plemene simmentál. Pozorovali u nich četnosti alely q 81 % (angus), 89 % (charolais), 100 % (hereford), 94 % (limousin) a 100 % (simmentál). Distribuce alely q v celém pozorování byla 91 %. Bartoňová (2012) ve své dizertační práci testovala 152 kusů dojnic českého strakatého skotu. Pozorovala 95,4 % jedinců s genotypem qq, 4,6 % jedinců s genotypem Qq a žádného homozygota QQ. Frekvence alely q byla 97,7 % a alely Q 2,3 %. Horecký (2013) ve své diplomové práci testoval 77 jedinců plemen highland a galloway. Frekvence genotypů pozorovaného vzorku byla qq 93,5 %, Qq 6,5 % a žádného jedince s genotypem QQ. Frekvence alely q byla 97,7 % a alely Q 2,3 %. Oba autoři uvádějí ve svých pracích nižší distribuci alely Q, než v mém testovaném vzorku skotu. Lešková et al. (2013) pozorovali 57 jedinců slovenského strakatého skotu. Metodou PCR-RFLP identifikovali 45 homozygotů qq (AA, varianta kódující alanin), 10 heterozygotů Qq (AK, varianta kódujíci alanin i lyzin) a 2 homozygoty QQ (KK, varianta kódující lyzin). Frekvence alel byly spočteny u alely q na 87,7 % a u alely Q na 12,3 %. 44

Všechny výše zmíněné studie potvrzují trend v distribuci alel polymorfismu K232A v genu DGAT1 zjištěný Kaupe et al. (2004). Plemena skotu Bos taurus se projevují mnohonásobně vyšší frekvencí alely q. Poznatky výše uvedených autorů se shodují s mým pozorováním.

5.4.2 Test genetické rovnováhy populace dle Hardy-Weinbergova zákona

Tabulka 8: Stanovení genetické rovnováhy dle Hardy-Weinbergova zákona QQ

Qq

qq

Součet

PA

3

34

223

260

OR

0,006

0,142

0,852

1

OA

1,57

36,88

221,55

260

χ2

1,302

0,225

0,009

1,536

Pozn.: PA = pozorované absolutní frekvence genotypů, OR = očekávané relativní frekvence genotypů, OA = očekávané absolutní frekvence genotypů

Tabulka 9: Porovnání vypočítaných hodnot χ2 testu s tabulkovými hodnotami (zdroj: http://user.mendelu.cz/urban/vsg3/pop/popul4b.html) Hladina významnosti

Tabulková hodnota pro 1 Vypočítaná hodnota χ2 stupeň volnosti

0,01

6,64

1,536

0,05

3,84

1,536

Výpočet stupně volnosti (df) pro gen se třemi genotypy a dvěma alelami je: df = počet znaků – počet kategorií – 1 df = n – p – 1 df = 3 – 1 – 1 = 1 45

Pro analyzovaný gen DGAT1 a danou populaci byl určen stupeň volnosti 1. Vypočtené hodnoty χ2-testu byly porovnány s tabulkovými hodnotami pro stupeň volnosti 1. Získaná hodnoty χ2 byly nižší pro obě hladiny významnosti (0,01 a 0,05). Bylo tedy zjištěno, že testovaný soubor zvířat je v Hardy-Weinbergově rovnováze.

5.4.3 Asociační analýza

V tabulce 10 jsou uvedeny počty kusů, průměrné hodnoty, směrodatné odchylky, střední kvadratické odchylky (rozptyl), minimální a maximální hodnoty analyzovaných znaků. Tabulka 10: Popisná analýza hodnocených znaků σ

σ2

MIN

MAX

25,3

1,64

1,28

21,84

32,27

260

2,09

1,91

1,38

0,26

11,35

Bílkoviny (%)

260

21,18

0,59

0,77

17,04

22,72

N-látky (%)

260

3,39

0,02

0,12

2,73

3,64

Popeloviny (%)

260

1,08

0,003

0,05

0,83

1,24

Vaznost

260

81,02

15,53

3,94

73,11

95,7

Barva

260

3,86

0,57

0,76

2,03

6,4

pH

260

7,77

1169,27

34,19

5,41

557

Remise

260

4,4

2,22

1,49

1,4

10,1

Znak

n

Průměr

Sušina (%)

260

IMT (%)

Pozn.: n = počet kusů; σ = směrodatná odchylka; σ2 = rozptyl; MIN = minimální hodnota; MAX = maximální hodnota; IMT = intramuskulární tuk

46

V tabulce 11 jsou uvedeny účinky polymorfismu K232A v genu DGAT1 na znaky kvality masa. Tabulka 11: Vliv genotypu DGAT1 na sledované znaky Genotyp polymorfismu (K232A) genu DGAT1 QQ (n=3)

Qq (n=34)

qq (n=223)

LSM ± SE

LSM ± SE

LSM ± SE

Sušina (%)

26,38 ± 0,75

25,74 ± 0,42

26,13 ± 0,37

IMT (%)

4,17 ± 0,73

2,74 ± 0,41

N-látky (%)

3,29 ± 0,07

Popeloviny (%)

Znak

Průkaznost

QQQq

QQ-qq

Qq-qq

0,348

0,703

0,093

3,44 ± 0,37

0,033

0,261

0,002

3,38 ± 0,04

3,35 ± 0,04

0,18

0,423

0,084

0,99 ± 0,02

1,04 ± 0,01

1,03 ± 0,01

0,087

0,167

0,238

Vaznost

83,46 ± 2,32

84,17 ± 1,35

83,55 ± 1,21

0,731

0,967

0,403

Barva

4,98 ± 0,41

4,1 ±0,23

4,18 ± 0,21

0,019

0,029

0,544

pH

11,09 ± 16,6

11,02 ± 16,6

11,04 ± 16,6

0,724

0,77

0,842

Remise

3,692 ± 0,91

3,451 ± 0,52

3,874 ± 0,46

0,769

0,821

0,15

Pozn.: n = počet kusů; LSM ± SE = Least squares means ± standard error (metoda nejmenších čtverců ± standartní chyba); IMT = intramuskulární tuk, podtržené hodnoty udávají statisticky významný vliv genotypu na znak Ve studii byla pozorována průkazná asociace mezi genotypy QQ-Qq a Qq-qq a obsahem intramuskulárního tuku. Rozdíl mezi genotypy QQ-Qq (p = 0,033) je statisticky průkazný (p < 0,05). Rozdíl mezi genotypy Qq-qq se blíží vysoké průkaznosti (p = 0,002). Nicméně tyto výsledky nelze interpretovat jako pozitivní efekt alely Q k množství IMT. Metodou nejmenších čtverců byly vypočteny hodnoty LSM ± SE u QQ 4,17 ± 0,73; Qq 2,74 ± 0,41 a qq 3,44 ± 0,37. Naměřená hodnota u QQ je sice nejvyšší (jak se očekávalo dle výsledků studií níže uvedených autorů), ale byla spočtena pouze u 3 jedinců s genotypem QQ. Očekávalo se tedy, že hodnota LSM ± SE bude 47

u heterozygota Qq prostřední a nejmenší bude pozorována u qq. Jenže genotyp qq má vyšší hodnotu LSM ± SE (3,44 ± 0,37) než heterozygot Qq 2,74 ± 0,41. Pokud bychom tedy do výpočtu nezahrnuly genotypy QQ kvůli malému počtu jedinců v pozorovaném vzorku, tak dle výpočtů vyplývá, že alela Q snižuje obsah IMT v mase skotu testovaného souboru. Rozdílnost ve výsledcích oproti níže uvedeným autorům může být způsobena

rozdílností

environmentálních

podmínek

chovu.

Databáze

jedinců

pozorovaného vzorku byla celkem z 5 různých chovů. Rozdílné parametry chovů by však měly být očištěny pevným efektem chovu v rovnici asociační analýzy (viz. 4.6.3 Asociační analýza). Rozdílnost ve výsledcích by také mohla být způsobena nízkým počtem jedinců QQ (3 kusy) a heterozygotů Qq (34 kusů) oproti zbylým jedincům qq, kterých bylo 223 kusů. Výše v práci se zmiňuji, že obsah IMT v mase je vlastností, která je podmíněna polygenně. Vliv okolního prostředí je veliký na daný fenotyp. Obsah IMT v mase je také ovlivněn plemennou příslušností zvířete. Databáze jedinců sice obsahovala pouze český strakatý skot, ale ne 100% čistý. Mnohá zvířata byla hybridy mezi českým strakatým skotem a plemeny červeným holštýnským, černostrakatým holštýnským nebo ayrshire. Rozdílné environmentální podmínky, výkrm zvířat a plemenná příslušnost jsou faktory, které mohly ovlivnit celkový statistický výpočet. Souza et al. (2010) se zmiňují, že existuje mnoho studií, které pozorovaly účinek polymorfismu K232A v genu DGAT1 na složení mléka u mléčného skotu. V závěru studie uvádí, že alela DGAT1K (Q) souvisí s větším obsahem tuku v mléce. Mnoho studií se také zabývalo asociací polymorfismu K232A s jatečnými vlastnostmi hovězího masa. Některým autorům z níže uvedených se nepodařila prokázat asociace s obsahem IMT u zjištěných genotypů. Závěry jiných, které uvádím níže, ukazují patrný vliv polymorfismu v tomto lokusu na IMT. Horecký (2013) ve své diplomové práci vyřadil z asociační analýzy vliv genu DGAT1 (polymorfismus K232A). Jelikož populace skotu, kterou zkoumal, byla minimálně polymorfní. Aviles et al. (2013) studovali populaci 286 kříženců plemen charolais a limousin. Nezjistili žádný rozdíl v distribuci IMT mezi genotypy. Casas et al. (2005) také nenalezli žádnou asociaci mezi polymorfismem K232A a vlastnostmi jatečného těla u bráhmanského plemene (Bos indicus) ve své studii. 48

Tyto výsledky kontrastují se zjištěním Thaller et al. (2003). Thaller et al. (2003) pozorovali signifikantní efekt alely DGAT1K (Q) na obsah intramuskulárního tuku u musculus semitendinosus (pološlašitý sval, sval zadní končetiny) u plemen holštýnského skotu a charolais. Homozygoti QQ u zvířat plemene holštýn měli významně více intramuskulárního tuku v m. semitendinosus a m. longissimus dorsi (zadní pilovitý sval dolní, zádový sval) než heterozygoti Qq nebo homozygoti qq (s variantou alel kódující alanin). Li et al. (2013) ve své studii uvedli, že fenotypová korelace mezi obsahem IMT a marbling skóre je 0,77 (p < 0,05). Polymorfismus K232A a SNP CAPN1 podle jejich zjištění jsou asociovány s obsahem IMT a hladinou naměřeného marbling skóre. Li et al. (2013) testovali soubor 96 jedinců plemene charloais. Genotyp KA (Qq) byl asociován s vyšším marbling skóre. Metodou nejmenších čtverců pozorovali hodnoty u heterozygotů KA (Qq) 2,20 ± 0,10, zatímco jedinci s genotypem AA (qq) dosahovali hodnot 1,95 ± 0,05 (p < 0,05). Jejich studie tak potvrdila pozitivní vliv alely K (Q) na mramorovaný fenotyp.

49

6 ZÁVĚR Mramorování masa je významným ukazatelem celkové kvality masa, zároveň je spojováno s vysokou cenou. Fenotyp marblingu je ovlivňován mnoha faktory nutričními, genetickými a faktory spojenými s chovem a porážkou zvířete. Studie týkající se vlivu jednotlivých faktorů na marbling ještě nepopsaly tento fenomén kompletně a výzkumníci neustále přicházejí s novými dílčími závěry. V poslední době jsou studie zaměřeny zejména na charakterizaci SNP spojených s marblingem a zároveň na přesnější, automatizované hodnotící systémy kvality masa. Rozvoj analýzy a znalostí jevu marbling souvisí hlavně s ekonomickým přínosem. Velkými producenty skotu s vysokým marbling skóre jsou Austrálie, USA a Japonsko. Zejména v Japonsku je mramorované maso velmi ceněné. Kompletní porozumění marblingu vyžaduje další detailní studie. V této studii se podařilo najít signifikantně významný rozdíl mezi genotypy v obsahu IMT u masa. Nicméně efekt alely je opačný, jak by se očekávalo. Autoři Aviles et al. (2013) a Casas et al. (2005) ve svých studiích nepotvrdili rozdílný vliv alel na obsah IMT. Výsledky mé studie kontrastují se zjištěním Thaller et al. (2003) a Li et al. (2013). Tito autoři potvrdili efekt alely Q ve vztahu na zvýšení obsahu IMT v mase skotu. Z jejich závěrů se dá říci, že alela Q je klíčová pro vyšší marbling skóre a v neposlední řadě pro dědivost vysokého marbling skóre do dalších generací. Tato studie však významnost alely Q nepotvrdila. Obsah IMT v mase je podmíněn polygenně. Vliv okolního prostředí a plemenné příslušnosti zvířete na mramorovaný fenotyp je velký. Je tedy možné, že proto studie neprokázala vliv alely Q polymorfismu K232A v genu DGAT1 vliv na obsah IMT v mase.

50

7 LITERATURA Adegoke G. O. and Falade K. O., (2005), Quality of meat, Journal of Food, Agriculture & Environment, (1) : 87-90 Anton I., Kovács K., Holló G., Farkas V., Lehel L., Hajda Z. and Zsolnai A., (2011), Effect of leptin, DGAT1 and TG gene polymorphism on the intramuscular fat of angus cattle in Hungary, Livestock Science, 135:300–30 Avilés C., Polvillo O., Peña F., Juárez M., Martínez A. L. and Molina A., (2013),Associations between DGAT1, FABP4, LEP, RORC, and SCD1 gene polymorphisms and fat deposition in Spanish commercial beef, J Anim Sci., 91(10):4571-4577

Barendse W. J., (1999), Assesing lipid metabolism, Int.Pat.Appl., PCT/AU98/00882 Bartoňová P., (2012), DNA markery kvality mléka pro inovace postupů genetického zlepšování skotu, Disertační práce, Mendelu Brno, 117 str.

Boukha A., Bonfatti V., Cecchinato A., Albera A., Gallo L., Carnier P. and Bittante G., (2011), Genetic parameters of carcass and meat quality traits of double muscled Piemontese cattle, Meat Science, 89: 84–90

Buchanan F. C., Fitzsimmon C. J., Van Kessel A. G., Thue T. D., Winkelman D. C. and Schmutz S. M., (2002), Association of a missense mutation in the bovine leptin gene with carcass fat content and leptin mRNA levels, Genet. Sel. Evol., 34: 105-116

Buchanan F. C., Van Kessel A. G., Waldner C., Christensen D. A., Laarveld B. and Schmutz S. M., (2003), Hot Topic: An Association Between a leptin Single Nucleotide Polymorphism and Milk and Protein Yield, Journal of Dairy Science, 86: 3164–3166.

Cao H., (2011), Structure-Function Anylysis of Diacylglycerol Acyltransferase Sequences from 70 Organism. BMC Research Notes, 4: 249. 51

Cardoso S. R., Queiroz L. B., Alonso Goulart V., Mourão G. B., Benedetti E. and Goulart L. R., (2011), Productive performance of the dairy cattle Girolando breed mediated by the fat related genes DGAT1 and LEP and their polymorphisms, Veterinary Science, 91(3): 107-11

Cui J.X., Zeng Y.Q., Wang H., Chen W., Du J.F., Chen Q.M., Hu Y.X. and Yang L., (2011), The effects of DGAT1 and DGAT2 mRNA expression on fat deposition in fatty and lean breeds of pig, Livestock Science, 140: 292-296

Du M., Tong J., Zhao J. F., Zhao J., Underwood K. R., Zhu M., Ford S. P. and Nathanielsz P. W., (2010), Fetal programming of skeletal muscle development in ruminant Animals, Journal of Animal Science, 88, E51−E60 Fortes M. R. S., Curi R. A., Chardulo L. A. L., Silveira A. C., Assumpção M. E. O. D., Visintin J. A. and de Oliveira H. N., (2009), Bovine gene polymorphisms related to fat deposition and meat tenderness, Genet Mol Biol., 32(1): 75–82 Fruhbeck G., Gomez-Ambrosi J., Muruzabal F. J. and Burrell M. A., (2001), The adipocyte: a model for integration of endocrine and metabolic signaling in energy metabolism regulation, Am. J. Physiol. Endocrinol., 280: 827-847

Giblin L., Butler S. T., Kearney B. M., Waters S. M., Callanan M. J. and Berry D. P., (2010), Association of bovine leptin polymorphisms with energy output and energy storage traits in progeny tested Holstein-Friesian dairy cattle sires, BMC Genet., 11: 73

Gotoh T., Albrecht E., Teuscher F., Kawabata K., Sakashita K. and Iwamoto H., (2009), Differences in muscle and fat accretion in Japanese Black and European cattle, Meat Science, 82, 300−308

Grisart B., Coppieters W., Farnir F. et al., (2002), Positional candidate cloning of a QTL in dairy cattle: Identification of a missense mutation in the bovine DGAT1 gene with major effect on milk yield and composition, Genome Research, 12: 222 – 231

52

Grobet L., Martin L. J. R., Pirottin D., Brouwers B., Riquet J., Schoeberlein A., Dunner S., Menissier F., Massabanda J., Hanset R. and Georges M., (1997), A deletion in the bovine myostatin gene causes the double-muscled phenotype in cattle, Nat. Genet, 17:71–7

Harper G. S. and Pethick D. W., (2001), The physiology of marbling: what is it, and why does it develop, Australian Journal of Experimental Agriculture, 73: 457-461

Harper, G. S. and Pethick, D. W., (2004), How might marbling begin?, Australian Journal of Experimental Agriculture, 44, 653−662 Hocquette J. F., Renand G, Levéziel H. Picard B. and Cassar-Malek I., (2006), Genetic effects on beef meat quality, The Science of Beef Quality, 13-19 Horecký Č., (2013), Analýza genetických markerů ovlivňujících jakost a kvalitu masa pro zpřesnění selekce ve stádě masného skotu, Diplomová práce, Mendelu Brno, 75 str.

Hou G. Y., Yuan Z. R., Zhou H. L., Zhang L. P., Li J. Y., Gao X., Wang D. J., Gao H. J. and Xu S. Z., (2011), Association of thyroglobulin gene variants with carcass and meat quality traits in beef cattle, Molecular Biology Reports, 38: 4705-4708 Huidobro de R. F., Miguel E., Onega E. and Blázquez B., (2003), Changes in meat quality characteristics of bovine meat during the first 6 days post mortem, Meat Science, 65 (4): 1439-1446 Chambaz A., Scheeder M. R. L., Kreuzer M. and Dufer P.A., (2003), Meat quality of Angus, Simmental, Charolais and Limousin steers compared at the same level of intramuscular fat, Meat Science, 63: 491-500

Kaupe B., Brandt H., Prinzenberg E. M. and Erhardt G., (2007), Joint analysis of the influence of CYP11B1 and DGAT1 genetic variation on milk production, somatic cell score, conformation, reproduction, and productive lifespan in German Holstein cattle, Journal of Animal Science, 85: 11-21 53

Kaupe B., Winter A., Fries R. and Erhardt G., (2004), DGAT1 polymorphism in Bos indicus and Bos taurus cattle breeds, Journal of Dairy Research, 71: 182-187 Lešková L., Bauer M., Chrenek P., Lacková Z., Soročinová J., Petrovič V. and Kováč G., (2013), Detection of DGAT1 gene polymorphism and its effect on selected biochemical indicators in dairy cows after calving, Acta Vet. Brno, 82: 265–269 Li X., Ekerljung M., Lundström K. and Lundén A., (2013),Association of polymorphisms at DGAT1, leptin, SCD1, CAPN1 and CAST genes with color, marbling and water holding capacity in meat from beef cattle populations in Sweden, Meat Science, 94:153–158

Liu H. Y., Tian W. Q., Zan L. S., Wang H. B. and Cui H. A., (2010), Mutations of MC4R gene and its association with economic traits in Qinchuan cattle., Mol Biol Rep., 37:535–540

Loftus R. T., Ertugrul O., Harba A. H., El-Barody M. A. A., MacHugh D. E., Park S. D. E. and Bradley D. G., (1999), A microsatellite survey of cattle from a centre of origin: the Near East, Molecular Evolution, 8: 2015–2022

Loftus R. T., MacHugh D. E., Bradley D. G., Sharp P. M. and Cunningham E. P., (1994), Evidence for two independent domestications of cattle, Proceedings of the National Academy of Sciencies of the USA, 91: 2757–2761

Lucy M. C., Savio J. D., Badinga L., De La Sota R. L. and Thatcher W. W., (1992), Factors that affect ovarian follicular dynamics in cattle, Journal of Animal Science, 70: 3615–3626

McPherron A. C., Lawler A.M. and Lee S.J., (1997), Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-β superfamily member, Nature, 387:83–90

54

Mears G. J., Mir P. S. and Bailey D. R. C., (2001), Effect of Wagyu genetics on marbling, backfat and circulating hormones in cattle, Can. J. Anim. Sci., 81:65–73

Michal J. J., Zhang Z. W. Gaskins C. T. and Jiang Z., (2006), The bovine fatty acid binding protein 4 gene is significantly associated with marbling and subcutaneous fat depth in Wagyu x Limousin F2 crosses, Anim Genet.,37(4):400-402 Monsón F., Sañudo C. and Sierra I., (2004), Influence of cattle breed and ageing time on textural meat quality, Meat Science, 68: 595-602

Nkrumah J. D., Li C., Yu J., Hansen C., Keisler D. H. and Moore S. S., (2005), Polymorphisms in the bovine leptin promoter associated with serum leptin concentration, growth, feed intake, feeding behavior, and measures of carcass merit, J. Anim. Sci., 83: 20–28 Nowacka-Woszuk J., Noskowiak A., Strabel T., Jankowski T. and Świtoński M., (2008), An effect of the DGAT1 gene polymorphism on breeding value of Polish Holstein-Friesian sires, Anim. Sci. Pap. Rep., 26:17-23

Pannier L., Sweeney T., Hamill R. M., Ipek F., Stapleton P. C. and Mullen A. M., (2009) Lack of an association between single nucleotide polymorphisms in the bovine leptin gene and intramuscular fat in Bos taurus cattle, Meat Science, 81(4): 731 – 737

Pringle T. D., Williams S. E., Lamb B. S., Johnson D. D and West R. L., (1997), Carcass characteristics, the Calpain proteinase system, and aged tenderness of Angus and Brahman crossbred steers, J. Anim. Sci., 75:2955–2961

Shi Y. and Cheng D., (2009), Beyond triglyceride synthesis: the dynamic functional roles of MGAT and DGAT enzymes in energy metabolism, Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 297(1): 10–18

55

Shibata M., Matsumoto K., Aikawa K., Muramoto T., Fujimura S. and Kadowaki M., (2006), Gene expression of myostatin during development and regeneration of skeletal muscle in Japanese Black Cattle, J. ANIM. SCI., 84( 11): 2983-2989

Schenkel F. S., Miller S. P., Jiang Z., Mandell I. B., Ye X., Li H. and Wilton J. W., (2006), Association of a single nucleotide polymorphism in the calpastatin gene with carcass and meat quality traits of beef cattle1, J. Anim. Sci., 84:291-299

Schennink A., Stoop W. M., Visker M. H., Heck J. M., Bovenhuis H., van der Poel J. J., van Valenberg H. J. and van Arendonk J. A., (2007), DGAT1 underlies large genetic variation in milk-fat composition of dairy cows, Animal Genetics, 38: 467-473

Smith S. J., Cases S., Jensen D. R., Chen H. C., Sande E., Tow B., Sanan D. A., Raber J., Eckel R. H. and Farese R. V. Jr., (2000), Obesity resistance and multiple mechanisms of triglyceride synthesis in mice lacking Dgat, Nat. Genet., 25: 87–90

Souza F. R. P., Mercadante M. E. Z., Fonseca F. L. S., Ferreira L. M. S., Regatieri I. C., Ayres D. R., Tonhati H., Silva S. L., Razook A. G. and Albuquerque L. G., (2010), Assessment of DGAT1 and LEP gene polymorphisms in three Nelore (Bos indicus) lines selected for growth and their relationship with growth and carcass trakte, J. Anim. Sci., 88:435–441

Spelman R. J., Ford C. A., McElhinney P., Gregory G. C. and Snell R. G., (2002), Characterization of the DGAT1 gene in the New Zealand dairy population, Journal of Dairy Science, 85: 3514–3517 Stejskal D., Karpí M. and Kollar P., (2006), Posouzení klinické relevance hodnoty sérové koncentrace adipocytárního proteinu vázajícího mastné kyseliny u pacientů s diagnózou metabolického syndromu novou metodou ELISA, Chem. Listy 100, 1116−1119

56

Stone S. J., Myers H. M., Watkins S. M., Brown B. E., Feingold K. R., Elias P. M. and Farese R. V. Jr., (2004), Lipopenia and skin barrier abnormalities in DGAT2deficient mice, J. Biol. Chem., 279: 11767–11776

Streeper R. S., Koliwad S. K., Villanueva C. J. and Farese R. V. Jr., (2006), Effects of DGAT1 deficiency on energy and glucose metabolism are independent of adiponectin, Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 291(2): 388–394

Szyda J. and Komisarek J., (2007), Statistical modeling of candidate gene effects on milk production traits in dairy cattle, Journal of Dairy Science, 90: 2971-2979

Taniguchi Y., Itoh T., Yamada T. and Sasaki Y., (2002), Genomic Structure and Promoter Analysis of the Bovine Leptin Gene, IUBMB Life, 53: 131 – 135

Taylor J. F., Coutinho L. L., Herring K. L., Gallagher D .S. Jr., Brenneman R. A., Burney N., Sanders J. O., Turner J. W., Smith S. B., Miller R. K. et al., (1998), Candidate gene analysis of GH1 for effects on growth and carcass composition of cattle, Animal Genet., 29:194-201

Thaller G., Kun C., Winter A., Ewald G., Bellman O., Wegner J., Zuhlke H. and Fries R., (2003), DGAT1, a new positional and functional candidate gene for intramuscular fat deposition in cattle. Animal Genetics 34: 354-357

Wang C. Y. and Liao J. K., (2012), A mouse model of diet-induced obesity and insulin resistence, Methods Mol Biol., 821:421-433

Wang Y., Xu H. Y. and Zhu Q., (2007), Progress in the study on mammalian diacylgycerol acyltransgerase (DGAT) gene and its biological function, Yi Chuan, 29(10):1167-72

57

Wang Y. H., Bower N. I., Reverter A., Tan S. H., De Jager N., Wang R., McWilliam S. M., Cafe L. M., Greenwood P. L. and Lehnert S. A., (2009), Gene expression patterns during intramuscular fat development in cattle, Journal of Animal Science, 87: 119–130

Warner R. D., Greenwood P. L., Pethick D. W. and Ferguson D. M., (2010), Genetic and environmental effects on meat quality, Meat Science, 86: 171-183

Watson R., Gee A., Polkinghorne R. and Porter M., (2008), Consumer assessment of eating quality – development of protocols for Meat Standards Australia (MSA) testing, Aus. Jour. of Eperimental Agriculture, 48: 1360-1367

Weiss S. B., Kennedy E. P. and Kiyasu J. Y., (1960), The Enzymatic Synthesis of Triglycerides, J. Biol. Chem., 235: 40-44 Winter A., Krämer W., Werner F. A., Kollers S., Kata S., Durstewitz G., Buitkamp J., Womack J. E., Thaller G. and Fries R., (2002), Association of a lysine232/alanine polymorphism in a bovine gene encoding acyl-CoA:diacylglycerol acyltransferase (DGAT1) with variation at a quantitative trait locus for milk fat content, Proc. Natl. Acad. Sci., 99: 9300–9305

Wood I. A., Moser G., Burrell D. L., Mengersen K. L. and Hetzel D. J., (2006), A meta-analytic assessment of a thyroglobulin marker for marbling in beef cattle, Genet. Sel. Evol., 38: 479-494

Yuan Z., Li J., Li J., Gao X., Gao H. and Xu S., (2013), Effects of DGAT1 gene on meat and carcass fatness quality in Chinese commercial cattle, Mol Biol Rep, 40:1947– 1954

58

8 SEZNAM ZKRATEK AciI

restrikční endonukleáza z Arthrobacter citreus I

A, K

Alanin, lyzin

AMP

Aktivovaná protein kináza (activated protein kinase)

BMP

Kostní morfogenetický protein (bone morphogenetic protein)

BMS

Standarty hovězího marblingu (beef marbling standards)

CACNA2D1

Calcium channel voltage-dependent alpha 2/delta subunit 1

CAST

Calpastatin

DAG

Diacylglycerol

DGAT1

Diacylglycerol O-acyltransferáza 1

DGAT2

Diacylglycerol O-acyltransferáza 2

DMSO

Dimetyl sulfoxid

FABP 4

Fatty acid binding protein 4

FABP 5

Fatty acid binding protein 5

FTO

Fat mass and obesity-associate genes

GH1

Růstový hormon 1 (Growth hormone 1)

HGD

Homogentisate 1,2-dioxygenase

IMT

Intramuskulární tuk

LEP

Leptin

LM

Oblast nejdelších zádových svalů skotu (longissimus muscle)

MAG

Monoacylglycerol

MC4R

Melanocortin 4 receptor

MUFAs

Mononenasycené mastné kyseliny (monounsaturated fatty acids)

MGAT

Monoacylglycerol acyltransferáza

PCR

Polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction)

QT

Kvantitativní vlastnosti (quantitative traits)

QTL

Lokusy kvantitativních znaků (quantitative trait loci)

PPARs

Receptory peroxizómů aktivovaných proliferatory (Peroxisome proliferator-activated receptors)

RE

Restrikční enzym (restriction enzyme)

59

RFLP

Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (Restriction fragment lenght polymorphism)

SCD1

Stearoyl-CoA desaturase

T3

Trijódthyronin

T4

Tetrajódthyronin

TAG

Triacylglycerol

TBE

Tris-Borate-EDTA

TG

Thyroglobulin

TGF-β

Transformující růstový faktor β (transforming growth factor β)

UTR

Nepřekládaná oblast mRNA (untranslated region)

Wnt

Signální dráha Wnt (Wingless, Int-1)

60

9 SEZNAM OBRÁZKŮ Obrázek 1

Znázornění stupně marblingu u hovězího masa (zdroj:http://ieatishootipost.sg/2010/02/shabu-shabu-gen-thereswagyu-and-then.html, upraveno).

Obrázek 2

Tukové buňky vznikající procesem adipogeneze (Du et al., 2010, upraveno).

Obrázek 3

Zapojení enzymů DGAT a MGAT do regulace energetické homeostázy (Shi and Cheng, 2009, upraveno).

Obrázek 4

Znázornění lokalizace bovinního genu FAPB 4 (zdroj: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/281759).

Obrázek 5

Struktura bovinního genu FABP 4 (zdroj: Ensembl:ENSBTAG00000037526).

Obrázek 6

Znázornění lokalizace bovinního genu TG (zdroj: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/280706).

Obrázek 7

Struktura bovinního genu TG (zdroj: Ensembl:ENSBTAG00000007823).

Obrázek 8

Znázornění lokalizace bovinního genu leptinu (zdroj: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/280836).

Obrázek 9

Struktura bovinního genu leptinu (zdroj: Ensembl:ENSBTAG00000014911).

61

Obrázek 10

Znázornění lokalizace bovinního genu DGAT1 (zdroj: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/282609).

Obrázek 11

Struktura bovinního genu DGAT1 (zdroj: Ensembl:ENSBTAG00000026356).

Obrázek 12

Znázornění distribuce alely DGAT1A a DGAT1K u plemen Bos taurus a Bos indicus (Kaupe et al., 2004).

Obrázek 13

Amplifikovaný úsek DNA, gen DGAT1.

Obrázek 14

Amplifikovaný úsek DNA, gen DGAT1.

Obrázek 15

Vizualizace štěpení RE AciI polymorfismu K232A genu DGAT1.

Obrázek 16

Štěpený PCR produkt (gen DGAT1) restrikční endonukleázou AciI.

Obrázek 17

Štěpený PCR produkt (gen DGAT1) restrikční endonukleázou AciI.

Obrázek 18

Ukázka homozygota QQ (AA/AA) v genu DGAT1.

Obrázek 19

Ukázka heterozygota Qq (AA/GC) v genu DGAT1.

Obrázek 20

Ukázka homozygota qq (GC/GC) v genu DGAT1.

62

10 SEZNAM TABULEK Tabulka 1

Složení reakční směsi pro PCR reakci

Tabulka 2

Složení reakční směsi pro RFLP reakci

Tabulka 3

Složení sekvenační směsi

Tabulka 4

Výpočet frekvencí genotypů (zdroj: http://user.mendelu.cz/urban/vsg3/pop/popul3b.html)

Tabulka 5

Výpočt frekvencí alel (zdroj: http://user.mendelu.cz/urban/vsg3/pop/popul3b.html)

Tabulka 6

Frekvence genotypů genu DGAT1

Tabulka 7

Frekvence alel genu DGAT1

Tabulka 8

Stanovení genetické rovnováhy dle Hardy-Weinbergova zákona

Tabulka 9

Porovnání vypočítaných hodnot χ2 testu s tabulkovými hodnotami (zdroj: http://user.mendelu.cz/urban/vsg3/pop/popul4b.html)

Tabulka 10

Popisná analýza hodnocených znaků

Tabulka 11

Vliv genotypu DGAT1 na sledované znaky

63