MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA
DIPLOMOVÁ PRÁCE
BRNO 2013
KRISTÝNA MARXOVÁ
Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin
Stanovení rodu Bacillus v dehydratovaných potravinách tržní sítě v ČR Diplomová práce
Vedoucí práce: Ing. Doubravka Rožnovská, Ph.D.
Vypracovala: Bc. Kristýna Marxová
Brno 2013
ZADÁNÍ
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Stanovení rodu Bacillus v dehydratovaných potravinách tržní sítě v ČR vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.
dne ………………………………………. podpis diplomanta ……………………….
PODĚKOVÁNÍ Touto cestou bych chtěla poděkovat své vedoucí diplomové práce Ing. Doubravce Rožnovské, Ph.D. za poskytnutí odborných rad a materiálů a také za čas, který mi věnovala při vypracovávání mé práce. Velký dík také patří Ing. Pavle Pospíškové, Ph.D. za odborné vedení a cenné rady při mikrobiologických rozborech. V neposlední řadě bych chtěla poděkovat rodičům a všem blízkým, kteří mě po dobu mého studia podporovali.
ABSTRAKT Stanovení rodu Bacillus v dehydratovaných potravinách tržní sítě v ČR Tato diplomová práce se zabývá dehydratovanými potravinami a jejich mikrobiální kontaminací, zejména rodem Bacillus. Jeho zástupci jsou všudypřítomné půdní mikroorganismy a obecně považovány za neškodné. Jsou ale známy i druhy patogenní. Nejvýznamnějším je Bacillus cereus, který způsobuje emetický a diarhotický syndrom. Dehydratované potraviny mohou být také kontaminovány plísněmi, které jsou nebezpečné z hlediska tvorby zdraví ohrožujících mykotoxinů. V praktické části byly analyzovány vzorky polévek na vaření od tří výrobců a instantní polévky od jednoho výrobce. Hodnotil se výskyt rodu Bacillus, druhu B. cereus a plísní a kvasinek v časovém intervalu 0, 30, 60, 90 a 120 min po uvaření a skladovaní při pokojové teplotě. Takto byly vzorky zkoumány na začátku a na konci doby minimální trvanlivosti. Rod Bacillus byl detekován ve všech vzorcích, plísně a kvasinky téměř ve všech a B. cereus v šesti vzorcích dehydratovaných polévek. Žádný vzorek ale nepřesáhl limity, které by mohly ohrozit lidské zdraví. Klíčová slova: dehydratované potraviny, Bacillus, Bacillus cereus, plísně a kvasinky
The determination of the genus Bacillus in dehydrated food from the market in the Czech Republic This diploma thesis deals with dehydrated food and its microbial contamination, especially Bacillus genus. Its members are ubiquitous soil microorganisms and generally considered harmless. But they are also known pathogenic species. The most important is Bacillus cereus which causes the emetic and diarrheal syndrome. Dehydrated foods can be contaminated by molds that are dangerous in terms of making mycotoxins hazardous to health. In the practical part there were analyzed the samples of simmer soups from three producers and instant soups from the same manufacturer. There were assessed incidence of the genus Bacillus, B. cereus and the molds and yeasts in a time interval of 0, 30, 60, 90 and 120 min after cooking and stored at room temperature. Thus, the samples were analyzed at the beginning and the end of the minimum durability. Genus Bacillus was detected in all samples, molds and yeasts in almost all of samples and B. cereus in the six samples. But no sample exceeded levels that could endanger human health. Key words: dehydrated food, Bacillus, Bacillus cereus, molds and yeasts
OBSAH 1
ÚVOD........................................................................................................... 11
2
CÍL PRÁCE .................................................................................................. 12
3
LITERÁRNÍ PŘEHLED .............................................................................. 13 3.1
ROD BACILLUS ................................................................................... 13
3.1.1 Charakteristika a význam ................................................................ 13 3.1.2 Významné druhy rodu Bacillus ....................................................... 15 3.1.3 Význam rodu Bacillus v potravinářství ........................................... 18 3.2
DEHYDRATOVANÉ POTRAVINY ................................................... 22
3.2.1 Legislativní požadavky na dehydratované potraviny ...................... 22 3.2.2 Mikrobiologické aspekty dehydratovaných potravin ...................... 25 3.2.3 Mikroorganismy
při
výrobě,
skladování
a
přípravě
dehydratovaných výrobků ......................................................................... 25 3.2.4 Zdravotní rizika dehydratovaných potravin .................................... 27 3.2.5 Preventivní opatření ........................................................................ 28 3.3
BACILLUS CEREUS ............................................................................. 29
3.3.1 Základní charakteristika .................................................................. 29 3.3.2 Obecný popis alimentárních onemocnění ....................................... 31 3.3.3 Historie ............................................................................................ 32 3.3.4 Charakteristika onemocnění způsobených druhem B. cereus ......... 33 3.3.5 Faktory virulence a mechanismy patogenity ................................... 34 3.3.6 Infekční dávky ................................................................................. 38 3.3.7 Výskyt v surovinách a potravinách ................................................. 38 3.3.8 Preventivní opatření ........................................................................ 39 3.3.9 Legislativní limity pro B. cereus ..................................................... 40 3.3.10 Metody stanovení B. cereus v potravinách a jeho konfirmace........ 41 3.4
PLÍSNĚ A KVASINKY ....................................................................... 43
3.4.1 Plísně ............................................................................................... 43 3.4.2 Kvasinky.......................................................................................... 45 3.4.3 Význam plísní a kvasinek při kažení potravin ................................ 46 3.4.4 Legislativní limity pro plísně a kvasinky ........................................ 47 4
MATERIÁL A METODY ........................................................................... 48 4.1
Charakteristika vzorků .......................................................................... 48
4.2
Charakteristika použitého materiálu ..................................................... 48
4.2.1 Bakteriální kmeny ........................................................................... 48 4.2.2 Chemikálie....................................................................................... 49 4.2.3 Kultivační média a roztoky ............................................................. 49 4.2.4 Přístroje a pomůcky ......................................................................... 51 4.3
Příprava materiálu ................................................................................. 51
4.3.1 Příprava laboratorních pomůcek ..................................................... 51 4.3.2 Způsob odběru a zpracování vzorků ............................................... 51 4.3.3 Mikrobiologické rozbory................................................................. 52 4.3.4 Vyjadřování výsledků...................................................................... 53 4.3.5 Mikroskopie a biochemické testy .................................................... 53 4.3.6 Oživování kultur z želatinových disků ............................................ 53 4.3.7 Příprava preparátů buněk sbírkových a terénních kmenů barvených podle Grama .............................................................................................. 53 4.3.8 Negativní barvení ............................................................................ 54 4.3.9 Barvení spor .................................................................................... 54 4.3.10 Důkaz produkce katalázy ................................................................ 55 4.3.11 Test na zkvašování manitolu ........................................................... 55 4.3.12 Test na utilizaci citrátu .................................................................... 55 4.3.13 Voges-Proskauerův test (VP test).................................................... 56 4.3.14 Test na tvorbu β-hemolýzy .............................................................. 56 4.4 5
Statistické vyhodnocení ........................................................................ 56
VÝSLEDKY................................................................................................. 57 5.1
Mikrobiologická analýza vzorků polévek na vaření a jejich statistické
vyhodnocení ................................................................................................... 57 5.1.1 Polévka hrachová ............................................................................ 57 5.1.2 Polévka francouzská ........................................................................ 59 5.1.3 Polévka čočková .............................................................................. 60 5.1.4 Polévka rajská.................................................................................. 62 5.1.5 Polévka s játrovými knedlíčky ........................................................ 64 5.1.6 Polévka gulášová ............................................................................. 66 5.2
Mikrobiologická analýza instantních polévek (na zalití) a jejich
statistické vyhodnocení .................................................................................. 68
5.2.1 Instantní polévka s játrovými knedlíčky ......................................... 68 5.2.2 Instantní polévka francouzská ......................................................... 69 5.2.3 Instantní polévka gulášová .............................................................. 70 5.2.4 Instantní polévka hrášková .............................................................. 71 5.2.5 Instantní polévka čočková ............................................................... 72 5.3
Porovnání
počtů
sledovaných
mikroorganismů
v
jednotlivých
variantách dehydratovaných polévek na vaření za celé sledované období .... 73 6
DISKUSE ..................................................................................................... 78
7
ZÁVĚR ......................................................................................................... 81
8
LITERATURA ............................................................................................. 82
9
SEZNAM OBRÁZKŮ, TABULEK A ZKRATEK ..................................... 91
10
PŘÍLOHY ................................................................................................. 97 10.1 Přehled dehydratovaných potravin tržní sítě ČR ................................. 97
1
ÚVOD Dnešní uspěchaná doba nedovoluje lidem věnovat se zdlouhavému vaření, a pro-
to řada lidí sahá po snadných variantách jídel – instantních pokrmech. Tento fenomén rychlých jídel je v poslední době velmi rozšířen a oblíben. Na výběr je nepřeberné množství výrobků a různých značek - polévky, bramborové kaše, těsta, ovesné kaše, omáčky, pudinky… Některé výrobky se musí ještě tepelně opracovat, jiné stačí zalít teplou vodou. Výroba dehydratovaných pokrmů se tedy úspěšně rozvíjí vzhledem k časové nenáročnosti a jednoduchosti přípravy. Výhodou je rovněž nízká hmotnost produktů. Malá pozornost se ale věnuje uchovávání těchto potravin ve spotřebním obalu, kdy nadměrný sluneční svit a vlhkost mohou způsobit změny v chuťové i mikrobiologické kvalitě výrobku. Také je nutné sledovat datum minimální trvanlivosti, které může mít zásadní vliv na potravinu. Mnohým konzumentům ale nevadí kupovat a konzumovat prošlé potraviny. Lidé sice chtějí jíst kvalitně, na druhou stranu jim to finanční stav nedovoluje a prodejny se zlevněnými prošlými potravinami bývají lidmi doslova přeplněny. Dostatečné tepelné zpracování, uchovávání a opětný ohřev dehydratovaných potravin často také nejsou prováděny dle doporučení, a proto se nelze divit, že lidem některé jídlo takzvaně nesedne a způsobí jim trávící obtíže, jako jsou průjmy a zvracení. Původci těchto zdravotních potíží mohou být různí, jedním z nich ale může být právě Bacillus cereus. Onemocnění vzniklá touto bakterií, tedy jejími emetickými či diarhotickými toxiny, jsou často nehlášená, obě formy onemocnění mají relativně mírný průběh a obvykle trvají méně než 24 hodin. Existují však i vážné případy, které skončily smrtí.
11
2
CÍL PRÁCE 1) Nastudovat problematiku rodu Bacillus včetně jeho patogenních druhů, výskyt bacilla v dehydratovaných potravinách. 2) Nastudování problematiky stanovení. 3) Zajištění vzorků tržní sítě, provedení mikrobiologické analýzy a vyhodnocení výsledků. Výsledky přehledně zpracovat do tabulek a grafů.
12
3
LITERÁRNÍ PŘEHLED
3.1 ROD BACILLUS 3.1.1 Charakteristika a význam Zařazení rodu Bacillus: doména Bacteria, kmen Firmicutes, třída Bacilli a řád Bacillales. Jsou to grampozitivní, aerobní, popř. fakultativně anaerobní bakterie ve tvaru tyčinky se zaoblenými nebo rovnými konci, které se ojediněle shlukují do řetízků. S výjimkou B. anthracis jsou pohyblivé. Druhy rodu Bacillus jsou kataláza pozitivní, štěpí bílkoviny za vzniku amoniaku, sacharidy fermentují obyčejně s méně výraznou tvorbou kyselin a některé i s tvorbou plynu a redukují dusičnany. V nepříznivých podmínkách, ovšem za přístupu kyslíku, buňky vytvářejí oválné endospory, které nemění tvar buňky a jsou lokalizovány v různých částech sporangia (centrálně, paracentrálně, subterminálně, terminálně či laterálně). Jsou vysoce rezistentní, díky čemuž se rod Bacillus vyskytuje v půdě, na rostlinách, ve vodě, v surovinách a potravinách, tedy ubikvitárně (MAUGHAN a AUVERA 2011, TODAR 2012, CURTIS 2007). Tvar endospory a mateřské buňky je charakteristickým znakem pro jednotlivé druhy bacilů, čehož se využívá v taxonomii. Bacillus spp. je dle těchto charakteristik možné rozdělit do tří morfologických skupin. I. morfologická skupina zahrnuje endospory oválného tvaru, které neztlušťují buňku. Do této skupiny patří: B. cereus, B. subtilis, B. anthracis, B. lichnoformis, B. mycoides a B. thuringiensis. Tyto rody jsou významné ve veterinárním lékařství. II. morfologická skupina je typická tvorbou endospor oválného tvaru, které ztlušťují mateřskou buňku. Mezi zástupce řadíme B. circulans, B. coagulans nebo B. alcalophilus. Do III. morfologické skupiny se řadí bakterie tvořící endospory kulatého tvaru, které vždy ztlušťují mateřskou buňku (SEDLÁČEK 2007, FVL VFU BRNO). Kolonie rodu Bacillus rostou velmi dobře na běžných agarových půdách za aerobních podmínek a jejich morfologie je značně rozmanitá. Časté jsou růstové fáze S a R, vyskytuje se i plazivý růst (viz Obr. 1). Ke sporulaci na půdách in vitro dochází většinou snadno při aerobní respiraci (FVL VFU BRNO). Dle teplotního optima se druhy rodu Bacillus dělí na: psychrotolerantní druhy (rostou při 0 °C, ne při 30 °C) - B. insoli-
13
tus, B. globisporus; mezofilní druhy - B. cereus, B. anthracis, B. megaterium, B. thuringensis; termofilní druhy - B. stearothermophilus, B. coagulans, B. acidicaldarius, B. subtilis, B. Licheniformis. Nejlépe rostou v prostředí o pH 5,5 – 8,5, některé však rostou i při pH 5 a nižším - B. coagulans, B. polymixa (TODAR 2012).
Obr. 1 Plazivý růst (B. cereus) (http://fvl.vfu.cz/sekce_ustavy/mikrobiologie/obrazova_priloha/mikrob/img/14-05.jpg)
Z více než 40 druhů je z hlediska ohrožení zdraví nejzávažnější B. anthracis, patogen zvířat a člověka, původce onemocnění zvaného antrax (sněť slezinná), který získal kvůli teroristickým útokům nežádoucí popularitu. Další druhy bacilů se účastní při kontaminaci potravin, krmiv a surovin živočišného původu. Některé druhy rodu Bacillus se podílejí na vzniku alimentárních onemocnění, zejména Bacillus cereus (především enterotoxigenní kmeny) a méně B. licheniformis, B. subtilis a B. pumilus (CURTIS 2007; EFSA 2005; GÖRNER a VALÍK 2004). Významnou skupinou jsou i druhy patogenní pro hmyz (jsou to tzv. biologické insekticidy), jako je například B. thuringiensis. Je pozoruhodné, že B. athracis a B. thuringiensis zřejmě vznikly evolucí z druhu B. cereus, protože geneticky (dle chromozomální DNA) jsou neodlišitelné (RUKMINI et al. 2000, FVL VFU BRNO). Většina druhů má velmi aktivní amylolytické enzymy (štěpí škrob), řada druhů má pektolytické enzymy (štěpí rostlinné pektiny) a většina druhů má velmi aktivní proteolytické enzymy (uplatňují se při aerobním a anaerobním rozkladu bílkovin). Určité druhy tak slouží pro průmyslovou přípravu enzymů. Bakteriální amylázy získané 14
z B. subtilis se uplatňují v pivovarství a v textilním průmyslu, proteinázy se používají především do pracích prostředků (ŠILHÁNKOVÁ 2002; GÖRNER a VALÍK 2004). Řada druhů produkuje antibiotika polypeptidové povahy, některá se pomocí těchto bakterií vyrábějí i průmyslově (např. bacitracin). Uvedená antibiotika se tvoří ve stadiu sporulace a v přírodě tak zřejmě přispěla k velkému rozšíření svého producenta. Některé druhy tvoří současně několik polypeptidových antibiotik. Jiné druhy tvoří polysacharidová slizovitá pouzdra, která způsobují nežádoucí nitkovitost pečiva a pšeničného chleba. Velký význam v konzervárenství mají termofilní bacily (B. stearothermophilus), které často přežívají tepelný sterilační zákrok a způsobují kažení konzerv (SOROKULOVOVA 2003; ŠILHÁNKOVÁ 2002; CINAR et al. 2008; ICBP 2012). 3.1.2 Významné druhy rodu Bacillus Mezi nejznámější a nejprostudovanější druhy patří: 3.1.2.1 Bacillus subtilis Bacillus subtilis (někdy též zvaný senný bacil) tvoří velmi pevné endospory, které odolávají extrémním podmínkám prostředí (EPA 1997a.). Ačkoliv se běžně vyskytuje v půdě, ve vodě i ve vzduchu, Hong (2009) uvádí, že jej lze považovat i za běžnou střevní bakterii. Není považován za patogenní či toxický pro lidi, zvířata či rostliny, ojediněle ale může způsobovat mastitidy skotu (EPA 1997a., FVL VFU BRNO). Pouze u osob s oslabenou imunitou může způsobovat onemocnění, u zdravých osob ho lze využít jako probiotikum (OGGIONI et al. 1998). B. subtilis produkuje řadu proteáz a dalších enzymů, které umožňují degradaci řady přírodních substrátů, čímž přispívají ke koloběhu živin. Jedním z enzymů je extracelulární enzym známý jako subtilisin. Tento a některé další enzymy B. subtilis jsou široce používány jako přídatné látky do pracích prostředků. I když je jeho toxicita nízká, může u některých jedinců, kteří jsou v častém styku s tímto toxinem, způsobit alergickou reakci. Jsou známy případy alergické či hypersenzitivní reakce, včetně dermatitidy a respiračních potíží, které jsou spojeny s používáním těchto pracích prostředků (EPA 1997a.). B. subtilis je také používán k výrobě některých medicínsky významných proteinů, jako je např. lidský interleukin (hIL) – 1 nebo antidigoxin single-chain antipody (SCA) fragment (WONG 1995).
15
B. subtilis společně s B. mesentericus a B. licheniformis způsobují tzv. nitkovitost chleba při jeho nedostatečném propečení (SOROKULOVOVA 2003; ICBP 2012). 3.1.2.2 Bacillus licheniformis Bacillus licheniformis se běžně nachází v půdě a na peří ptáků zdržujících se na zemi či ve vodě (kachny, vrabci aj.). Oproti ostatním bacilům, kteří jsou převážně aerobní, je fakultativně anaerobní. Některé kmeny B. licheniformis mají denitrifikační aktivitu (US EPA 1997 b.). B. licheniformis je spojován s alimentárními otravami a kažením potravin. Stejně jako B. subtilis způsobuje tzv. nitkovitost chleba tvorbou slizovitých pouzder. Je původcem gastroenteritid, které mohou vyústit až v život ohrožující septikémii. Nejvíce rizikovou potravinou jsou v tomto ohledu mléčné výrobky, rizikové jsou ale také vařené maso, syrové mléko, zelenina a dětská výživa. Symptomy zahrnují bolesti břicha, průjmy a někdy zvracení. Inkubační doba onemocnění je 2-14 hodin a netrvá déle než 36 hodin (SALKINOJA-SALONEN et al. 1999). B. licheniformis produkuje řadu extracelulárních enzymů, čímž přispívá ke koloběhu živin v přírodě. Jeho optimální teplota růstu je 50 °C, enzymy jsou sekretovány při 37 °C. Je využíván v průmyslu k výrobě proteáz, amyláz, antibiotik a speciálních chemikálií (k. citronová, inosin aj.) Proteázy jsou žádoucí složkou pracích prostředků pro svoji účinnost při nízkých teplotách, rovněž se využívají pro zpracování kůže. Amylázy jsou využívány pro hydrolýzu škrobu (EPA 1997 b., MICROBEWIKI 2011b) 3.1.2.3 Bacillus anthracis Je patogenem savců, u nichž vyvolává sněť slezinnou (antrax). Charakteristickým znakem B. anthracis je jeho nepohyblivost. Antrax se u člověka vyskytuje po vdechnutí spor nebo po konzumaci kontaminované potraviny (PATOČKA 1972). Ve vyspělých zemích Evropy se antrax u zvířat vyskytuje pouze sporadicky, a to v souvislosti s importem surovin živočišného původu (zejména kůží) obsahujících jeho spory. B. anthracis byl považován za možnou biologickou zbraň již ve druhé světové válce, ale vývoj těchto biologických zbraní byl ukončen mezinárodní úmluvou. Znovu se stal předmětem zájmu kvůli bioterorizmu v USA vzhledem k vysoké stabilitě spor a nízké infekční dávce pro člověka při snadném přenosu vzduchem (FVL VFU BRNO).
16
Vyskytují se tři druhy antraxu: kožní, plicní a gastrointestinální. Nejčastější je kožní antrax související s infekcí oděrek sporami z půdy nebo ze zvířat (ohroženi jsou lidé zpracovávající vlnu, kožešiny a kůži). Během 12 – 36 hodin spory vyklíčí, začnou se množit vegetativní buňky a vznikne charakteristický želatinový edém na místě kontaminace, který se přes stádia papuly, vezikuly a pustuly mění na finální černý nekrotický vřed, ze kterého infekce může rozšířit a vést k septickému stavu. Plicní antrax vzniká nejčastěji z inhalace spor spolu s prachem ze zvířecích chlupů (tzv. woolsorters‘ disease) a projevuje se náhlou bolestí na hrudi a horečkou. Gastrointestinální atrax je analogický kožnímu, jen se odehrává na střevní sliznici (TODAR 2011; SIU 2012). B. anthracis je rezistentní vůči mnohým antibiotikům, je citlivý k penicilinu a léčí se ciprofloxacinem (FVL VFU BRNO). 3.1.2.4 Bacillus coagulans Tento bacil byl v roce 1932 izolován a pojmenován jako Lactobacillus sporogenes zřejmě proto, že produkuje kyselinu mléčnou. Později byl zařazen do rodu Bacillus, protože na rozdíl od bakterií mléčného kysání B. coagulans tvoří spory. Je fakultativně anaerobní a jeho optimální teplota růstu má okolo 50 °C. Může být původcem některých infekcí, nezpůsobuje však alimentární onemocnění. Některé studie se zabývaly využitím B. coagulans jako probiotika při léčbě dráždivého tračníku, dětských průjmů, zánětlivých střevních onemocnění aj. Autoři většinou uvádějí jeho příznivý efekt, nicméně dle NIH (2011) je jeho efekt zatím nedostatečně průkazný. Je známa jeho veterinární aplikace, především jako probiotikum pro zvířata (prasata, dobytek, drůbež). Také zlepšuje vaginální mikroflóru (JURENKA 2012; HARTEMINK 2007). 3.1.2.5 Bacillus stearothermophilus B stearothermophilus (nazývaný také Geobacillus stearothermophilus) patří mezi termofilní bakterie rodu Bacillus. Tato bakterie se nachází v půdě, horkých pramenech či sedimentech oceánů a je schopna růstu při teplotách 30 - 75 °C (MICROBEWIKI 2011c). Způsobuje kažení potravin, především mléka a mléčných výrobků, protože přežívá pasterační teploty. Velký význam má v konzervárenství, protože jeho silně termorezistentní spory často přežívají tepelný sterilační zákrok u nekyselých zeleninových a masových nebo maso-zeleninových konzerv. Jelikož je B. stearothermophilus nepato-
17
genní, dá se těchto vlastností využít a spory jsou cíleně využívány jako indikátor letality mikroorganismů při sterilaci konzerv. Dále také pro hodnocení správné sterilizace výrobních nástrojů a povrchů v průmyslu i zdravotnictví (RAY a BHUNIA 2008; ŠILHÁNKOVÁ 2002). 3.1.2.6 Bacillus thuringiensis Tento bacil je patogenní pro hmyz a používá se jako biologický insekticid. Insekticidy jsou založeny na produkci δ-endotoxinů (krystalových proteinů), které lze komerčně dostat v práškových preparátech či granulích obsahujících směs endospor a proteinů. Pomocí těchto produktů je možno chránit úrodu ovoce a zeleniny. Spory tohoto mikroorganizmu mohou zůstat jako rezidua v potravinách, které jsou těmito insekticidy chráněny. Bývají např. v nápojích připravovaných z čaje, kdy spory přežívají pasteraci a dále klíčí a množí se. Díky redukci obsahu dusíku a kyslíku v lahvích, které čaj obsahují, se obsah B. thuringiensis pohybuje ve velmi malém množství (10-1 KTJ/ml). Kvůli produkci enterotoxinů může být přítomnost tohoto bacila v čaji určitým rizikem pro zdraví člověka (TÁBORSKÁ 2009, CINAR et al. 2008, RUKMINI et al. 2000). 3.1.3
Význam rodu Bacillus v potravinářství Aerobní sporotvorné bakterie, mezi které rod Bacillus patří, se podílí na kažení
různých druhů potravin a indikují primární a sekundární kontaminace surovin a potravin. Jejich zvýšený výskyt bývá v tepelně upravených poživatinách, které byly po delší dobu uchovávány bez náležitého zchlazení. Růst těchto bakterií je umožněn teplotní eliminací jejich antagonistů (GÖRNER a VALÍK 2004). 3.1.3.1 Mléko a mléčné výrobky Rod Bacillus má v mlékárenství velký význam. Syrové mléko je ihned při dojení primárně kontaminováno mikroorganismy ze zvířete a okolního prostředí, kde jsou přítomny zástupci tohoto rodu. Pokud není syrové mléko ihned zchlazeno, je umožněn růst mezofilním mikroorganismům, jako jsou Bacillus spp. Pasteraci přežívají pouze termotolerantní bakterie (Streptococcus, Mikrococcus aj.) a spory rodů Clostrydium a Bacillus, které vyklíčí a způsobují hořknutí mléka a produkcí rennin-like enzymu způsobují bacily sladké srážení mléka. Mléko ošetřené UHT ohřevem přežívají spory B. cereus, B. licheniformis, B. badius, a B. sporothermodurus
18
(TÁBORSKÁ 2009; RAY a
BHUNIA 2008; JAY et al. 2005). Cupáková et al. (2011) ovšem udává, že UHT ošetření spory B. cereus obvykle spolehlivě ničí. U mléčných výrobků závisí hlavně na původním obsahu těchto bakterií v mléce a prostředí. Výrobu slazeného zahuštěného mléka mohou přežívat spory B. licheniformis, B. stearothermophilus a B. subtilis, které při skladování v nevhodných teplotách vyklíčí. U neslazeného zahuštěného mléka tvoří bacily H2 a CO2 a současně sráží mléko (na vločky, sraženiny, nebo pevnou sýřeninu) (TÁBORSKÁ 2009; RAY a BHUNIA 2008). Bacily mají rovněž negativní vliv na sýry (Tab. 1). Tabulka 1 Vady sýrů způsobené bakteriemi z rodu Bacillus (TÁBORSKÁ 2009)
Vada
Druh sýru
Druh bacilu
hořká chuť
všechny druhy sýrů
B. cereus var. mycoides, B. brevis
červené skvrny
měkké sýry
B. fusci
hnědé skvrny
sýry s plísní v těstě
B. mesentericum var. niger
modrání sýrů
všechny sýry
B. cyaneofuscus
černání sýrů
měkké a kyselé sýry
B. demingrams
roztékání sýrů
měkké a kyselé sýry
B. cereus var. mycoides, B. brevis
3.1.3.2 Vejce Čerstvá vejce jsou sterilní nebo ve svém vnitřku při nedodržení pravidel zoohygieny obsahují salmonely. Z vnějšího prostředí mohou póry vnikat různé mikroorganismy, ochranou jsou zde bakteriocidní bílkoviny a lyzozym obsažený v bílku. Ten má schopnost lyzovat buněčné stěny G+ bakterií a s určitými modifikacemi i G- bakterií. Je účinný zejména proti bakteriím rodu Pseudomonas, Staphylococcus, Clostridium a Bacillus. Jeho aktivita závisí na teplotě a přestává v okamžiku smísení bílku se žloutkem (GÖRNER a VALÍK 2004; RAKOVÁ 2008) 3.1.3.3 Obilniny a jejich produkty Obilí je snadno kontaminováno z prostředí (půda, voda, vzduch) a bakterie Bacillus spp. působí v následně vyrobených produktech problémy (TÁBORSKÁ 2009).
19
Při nevhodném upečení a skladování (teplota, vlhkost) mohou v pšeničném chlebu a pečivu vyklíčit spory některých rodů Bacillus spp. a způsobit nitkovitost, která je výsledkem tvorby slizovitých pouzder těchto bakterií za současné enzymové hydrolýzy lepku a škrobu, který po zcukernatění podporuje tvorbu pouzder. Nitkovitost se projevuje jako nepřirozené zabarvení a mazlavost a tvoří se lepkavé, elastické slizovité nitky (SOROKULOVOVA 2003;RAY a BHUNIA 2008; ICBP 2012). Bailey a Holy (1993) náhodně odebrali ze surovin, těsta a chlebů 300 izolátů rodu Bacillus v tomto zastoupení: 41,5% B. licheniformis, 38,4% B. subtilis, 12,0% B. megaterium, 3,9% B. pumilis, 2,5% B. laterosporus and 1,1% B. cereus. Leuschner ve své studii odebral vzorky zkažených chlebů a uvádí tyto zástupce: B. subtilis, B. pumilus, a B. licheniformis (LEUSCHNER et al. 1998 cit. dle JAYE et al. 2005).
3.1.3.4 Ovoce a zelenina Rod Bacillus také kontaminuje ovoce a zeleninu z prostředí, a tak se objevuje v sušených či fermentovaných produktech. Vaughn (1951) uvádí, že převládající mikroflórou sušené zeleniny, jak se dá předpokládat vzhledem k nižšímu obsahu cukrů a nižší aciditě než má ovoce, jsou bakterie, a to rod Bacillus a Pseudomonas. Rovněž se zde nacházejí plísně (Aspergillus, Mucor, Penicillium, Sporotrichum a další), ne však kvasinky. Černání nakládaných okurek je způsobeno druhem B. nigrificans, který produkuje ve vodě rozpustný pigment. B. subtilis je zase jednou z možných příčin měknutí okurek kvůli nízkému obsahu soli a málo kyselému prostředí uvnitř okurky. V sušené zelenině mohou spory bacilů bez problémů přežívat, a proto mohou být posléze přeneseny do finálního výrobku (TÁBORSKÁ 2009, JAY et al. 2005). 3.1.3.5 Kakao, čokoláda a cukrovinky Významným patogenem vyskytujícím se v těchto produktech jsou salmonely. Pro dostatečné snížení počtu těchto mikroorganismů, tedy nejen kvůli senzorickým vlastnostem, je používáno pražení kakaových bobů, v moderních technologiích doprovázené ošetřením horkou párou. Tento procesní krok je důležitý především pro zničení sporotvorných bakterií, protože převládající mikroflórou kakaa je rod Bacillus, se zástupci B. subtilis, B.cereus, B. alvei, B.licheniformis, a B. megaterium. Mohou být pří-
20
tomny i termofilní druhy jako B. stearothermophilus nebo B. coagulans. Počty spor bacilů se mění na základě použité technologii výroby, ale většinou nepřekračují hodnotu 104 KTJ/g. Z kakaa se dostávají spory bacilů do čokolády a čokoládových cukrovinek (TÁBORSKÁ 2009, ICMFS 1986). 3.1.3.6 Konzervy Rod Bacillus bývá také příčinou kažení zeleninových, maso-zeleninových nebo masových konzerv, což indikuje nedostatečnou sterilaci výrobků. Příčinou plynuprostého kažení jsou rody B. stearothermophilus a B. coagulans, které jsou schopny vyklíčit i za nepřístupu kyslíku. Dochází k tvorbě kyselin a mění se chuť a vůně. Rozmezí teploty růstu pro tyto mikroorganizmy je 30 – 60 °C, přičemž B. stearothermophilus je schopen růst i při 75 °C. Příčinou kažení s tvorbou plynu (bombáž) mohou být fakultativně anaerobní bakterie B. cereus, B. subtilis nebo B. circulans. U konzerv je většinou vyžadována tzv. komerční sterilita, což znamená, že výrobky mohou obsahovat spory aerobních mikroorganizmů, ale pouze v desítkách na gram (TÁBORSKÁ 2009, RAY a BHUNIA 2008). 3.1.3.7 Koření a byliny Bacily se hojně vyskytují v koření a bylinách. Jay et al. (2005) uvádí, že u 53 % ze 110 vzorků zpracovaného koření byla potvrzena přítomnost B. cereus. Hodnoty B. cereus a rodu Bacillus se v této komoditě pohybují mezi 102 – 106 KTJ/ ml (EFSA 2005). Večeřová (2012) uvádí, že koření je velmi často kontaminováno spory rodu Bacillus (B. subtilis, B. mesentericus), ale i plísněmi a kvasinkami, proto je pro snížení počtu mikroorganismů v koření doporučováno ošetřit ho ionizujícím zářením. Jeho použití je v České republice upraveno ve vyhlášce č. 133/2004 Sb. Pro sušené byliny, koření a kořenící přípravky je povolená dávka do 10 kGy.
3.1.3.8 Ostatní potraviny Některé bacily jsou rovněž spojovány se znehodnocováním hořčice a to tvorbou plynu (RAY a BHUNIA 2008). Příčinou tmavnutí a dělení emulze v dresinku Tisíce ostrovů byl B. vulgatus, jeho zdrojem ale byly přísady jako pepř a paprika (JAY et al. 2005).
21
Maso je bacily kontaminováno sekundárně. Zde můžou bacily způsobit rozklad bílkovin, a to díky široké škále proteolytických enzymů. U šunek mohou být příčinou zkysnutí výrobku (JAY et al. 2005). Mikrobiologie dehydratovaných potravin je rozebrána v samostatné kapitole.
3.2 DEHYDRATOVANÉ POTRAVINY Dehydratace neboli sušení je prastará metoda uchovávání potravin. Ta je spolu s uzením, zahušťováním a kvasnými procesy (použití mléčného nebo alkoholového kvašení) jedním z nejstarších způsobů konzervace potravin. Při dehydrataci dochází k postupnému snižování obsahu vody, čímž se zamezuje nepříznivému vývoji mikroorganismů a potraviny se tak mohou uchovat bez použití konzervačních látek (JAY et al. 2005). Výroba dehydratovaných pokrmů je založena na míchání surovin zpracovaných různými postupy a balení výsledných směsí. Tradičním postupem dehydratace je sušení na slunci (např. rozinek či fíků), což je ale limitováno horkým a suchým klimatem, na rozdíl od konvenčních mechanických metod, jako je běžné sušení proudícím vzduchem, sušení na válcových sušárnách, ve filmových a rozprašovacích sušárnách, extruze, expanzní sušení, eventuálně vymrazování (lyofilizace) (KADLEC et al. 2009; FORSYTHE a HAYES 1998). V dnešní době jsou dehydratované pokrmy nejčastěji připravovány z tepelně předem opracovaných složek (maso, těstoviny, kaše, zelenina, omáčky a základy polévek), které jsou po zalití horkou vodou připraveny ke konzumaci – tzv. instantní pokrmy. Ostatní dehydratované pokrmy musí projít tepelným opracováním a jsou to tedy spíš polotovary (KADLEC et al. 2009). 3.2.1 Legislativní požadavky na dehydratované potraviny Legislativně jsou požadavky na dehydratované výrobky uvedeny ve Vyhlášce MZe č. 419/2000 Sb. Dle této vyhlášky se dehydratovaným výrobkem rozumí potravina vzniklá smísením složek se sníženým obsahem vlhkosti, pastovité nebo sypké konzistence, která se před konzumací obnoví zejména tekutinou. Členění dehydratovaných výrobků na skupiny je uvedeno v následující tabulce.
22
Tabulka 2 Členění dehydrovaných potravin na skupiny (Vyhláška MZe č. 419/2000 Sb.)
Druh
Skupina
Dehydratovaný výrobek
Polévka Omáčka Bujón Vývar Šťáva Základ pokrmu Směs pro přípravu hotového pokrmu Směs pro přípravu dresinku Směs pro přípravu zálivky Směs pro přípravu dezertu Směs pro přípravu krému Směs pro přípravu polevy Směs pro přípravu zmrzliny Přísada do polévky
3.2.1.1 Požadavky na jakost a) Smyslové požadavky Dehydratované výrobky se hodnotí vždy po přípravě dle návodu. Vzhled, barva, konzistence, chuť a vůně musí být charakteristické pro druh výrobku označený na jeho obalu. Chuť a vůně výrobku musí být vlastní, bez cizích příměsí, nebo jinak změněné chuti a vůně. b) Fyzikální a chemické požadavky Dehydratované výrobky obsahují nejvýše 15 % vody. c) Přípustné záporné hmotnostní odchylky od spotřebitelského balení Viz následující Tabulka 3. (Vyhláška MZe č. 419/2000 Sb.).
23
Tabulka 3 Přípustné záporné hmotnostní odchylky (Vyhláška MZe č. 419/2000 Sb.)
Deklarovaná hmotnost v g
Přípustná záporná hmotnostní odchylka od hmotnosti deklarované na obalu v %
do 50
10
51 - 120
5
121 - 250
4
251 – 1000
3
1001 – 2500
2
nad 2500
1
3.2.1.2 Označování Kromě údajů uvedených ve vyhlášce MZe č. 324/1997 Sb. se dehydratované výrobky označí: a) názvem skupiny, u polévek, omáček a bujónů se doplní názvem druhu b) návodem k přípravě (Vyhláška MZe č. 419/2000 Sb.). 3.2.1.3 Uvádění do oběhu Dehydratované výrobky se dle Vyhlášky MZe ČR č. 331/1997 Sb. skladují v suchých, chladných a větratelných místnostech na podlážkách, nejméně 5 cm nad zemí a od stěn. Dehydratované výrobky se skladují odděleně od látek s výraznými pachy a vůněmi. 3.2.1.4 Mikrobiologické požadavky na dehydratované potraviny V současné době jsou mikrobiologické limity pro dehydratované potraviny určeny jen pro sušené mléko a kojeneckou stravu, které jsou uvedeny v Nařízení komise č. 1441/2007 o mikrobiologických kritériích pro potraviny. Evropská legislativa nicméně vyžaduje, že by pokrmy neměly obsahovat mikroorganismy a jejich toxiny v takovém množství, které představuje nepřijatelné riziko pro lidské zdraví. Pro některé země, jako Velká Británie a Irsko, jejich úřady pro ochranu zdraví (FSAI a HPA) vydaly směrnice pro přijatelné množství mikroorganismů v různých instantních potravinách. Udávají, že přijatelné množství B. cereus a dalších patogenních druhů Bacillus spp. v těchto pokrmech je <104 KTJ/g (CURTIS 2007).
24
3.2.2 Mikrobiologické aspekty dehydratovaných potravin Kvalita dehydratovaných výrobků je z bakteriologického hlediska posuzována podle: přítomnosti patogenů, potenciálních patogenů a jejich toxických produktů; a z hlediska kvalitativního a kvantitativního významu celkového obsahu bakterií v souvislosti s předpokládaným využitím výrobku. Mezi známé skupiny mikroorganismů, jejichž přítomnost by mohla být teoreticky v těchto produktech nebezpečná, patří sporulující anaerobní bakterie, z nichž je hlavní C. botulinum, dále střevní bakterie, skupina bakterií rodu Salmonella, některé stafylokoky a pravděpodobně i streptokoky. Kažení se zúčastňují aerobní sporulující bakterie, termofilní mikroorganismy a celá škála dalších bakterií (HAINES a ELLIOT 1944, AIIBP 2007). Dehydratované potraviny lze z hlediska rizikovosti rozdělit dle toho, zda před sušením jsou či nejsou vařeny a tedy více nebo méně sterilizovány. První skupina obsahuje sušené maso, ryby, polévky, a některé bramborové mouky. Druhá skupina, která je bakteriologicky více problematická, zahrnuje sušená vejce, mléko, mrkev, zelí a bramborové proužky. Tyto suroviny jsou kompletně nevařené nebo jen krátce blanšírované či pasterizované, kdy sice dojde k redukci, ale ne eliminaci doprovodné mikroflóry (HAINES a ELLIOT 1944). 3.2.3 Mikroorganismy při výrobě, skladování a přípravě dehydratovaných výrobků 3.2.3.1 Vliv dehydratace a lyofilizace na mikroorganismy Zvýšená acidita a nízký obsah proteinů v ovoci snižují jeho atraktivitu pro růst patogenních bakterií. Je tedy kontaminováno především kvasinkami a acidotolerantními bakteriemi způsobujícími kažení. Zelenina ve srovnání s ovocem není kyselá a umožňuje tak růst mnoha typů mikroorganismů, jako např. koliformních bakterií (GORESLINE 1947). Při běžně používaném sušení zeleniny je mikrobiální flóra modifikována počátečními procesními operacemi, jako je např. krájení. Zvýšené mikrobiálního znečištění lze očekávat při nedostatečném vyčištění výrobního zařízení. U většiny ovoce a zeleniny musí být provedeno blanšírování, což podstatně snižuje počet mikroorganismů. Ačkoliv jsou v první fázi dehydratace použity teploty vyšší než 90 °C, rychlá ztráta vlhkosti v této periodě indukuje chladící efekt a pomáhá udržet teplotu mezi druhým stupněm dehydratace okolo 40-50 °C, tudíž dojde jen k malému snížení počtu mikroorganismů.
25
V druhém stupni sušení potravin jsou teploty vyšší (60-70 °C), což v tomto okamžiku zabíjí kvasinky a mnoho bakterií; a mělo by tak být dosaženo 103 – 104 CPM/g (DENNIS 1987 cit. dle FORSYTHE a HAYESE 1998). Zbytková mikroflóra se po vysušení skládá hlavně ze sporotvorných bakterií (Bacillus spp.), Enterokoků a různých druhů plísní (např. Aspergillus, Penicillium, Alternaria a Cladosporium spp.) (FORSYTHE a HAYES 1998). Ve sprejově sušeném mléce a vejcích nejsou dosaženy tak vysoké teploty a v důsledku toho může přetrvávat mnohem různorodější mikroflóra, i když opět pravděpodobně převažují sporotvorné bakterie a termotolerantní streptokoky. Sprejové sušení mléka může také přežít Salmonella, proto je mléko předtím nejdříve pasterováno (MOSSEL 1976 cit. dle FORSYTHE a HAYESE 1998; GORESLINE 1947). Při lyofilizaci je zabito více bakterií než dehydratací (FRAZIER a WESTHOFF 1988 cit. dle FORSYTHE a HAYESE 1998). Sušení se provádí ve zmrazeném stavu ve vakuu, kdy následuje proces sublimace za použití tepla. Jak zmrazená vrstvá ustupuje, teplota se v blízkosti povrchu zvýší na teplotu tepelných desek (40-50 °C), a v tuto chvíli je možné zničení bakterií citlivých na teplo. Nicméně, i toto se děje pouze v úplně posledních fázích sušení, kdy se teplota jádra zvýší pouze nad 0 °C, takže v této zóně nelze očekávat redukci mikroorganismů. Specifické podmínky tohoto způsobu dehydratace ale znamenají, že po ukončení lyofilizace je stále přítomno okolo 30% z původní flóry, a počet jednotek v této potravině často překračuje 105 KTJ/g (SALEH et al. 1966 cit. dle FORSYTHE a HAYESE 1998). Jay et al. (2005) uvádí, že ačkoliv jsou při dehydrataci některé mikroorganismy zničeny, mnoho mikroorganismů může být z těchto výrobků regenerováno, zvláště pokud jsou použity nekvalitní suroviny. Jelikož mnoho bakterií vyžaduje pro růst hodnoty aw nad 0.90, nehrají v kontaminaci dehydratovaných potravin významnou roli. Sušením jsou mnohé buňky mikroorganismů pouze subletálně poškozené, což znamená, že nejsou usmrcené, ale ztratily schopnost růstu v běžných pomnožovacích mediích. To může vést chybnému posuzování potravin (např. Salmonella v sušených vejcích), proto se při mikrobiologické kontrole na obsah choroboplodných zárodku tyto potraviny vyšetřují speciálními tzv. resuscitačními metodami (GÖRNER a VALÍK 2004)
26
3.2.3.2 Stabilita dehydratovaných výrobků při skladování Během skladování dehydratovaných výrobků může docházet k mnoha změnám, z nichž většina je nemikrobiálního původu. Nejběžnější a nejdůležitější je neenzymatické hnědnutí, tzv. Maillardovy reakce, které zahrnují soubor chemických reakcí mezi redukujícími cukry a aminokyselinami či proteiny (MOGOL et al 2010). Hodnota aktivity vody (aw) musí být pro potlačení těchto reakcí mnohem nižší než aw potřebná pro potlačení růstu mikroorganismů, tudíž mikrobiální kontaminace by neměla vzrůstat. Ve skutečnosti dochází během skladování k ubývání vitálních buněk, spory bakterií a plísní však zůstávají. Pokud jsou potraviny nesprávně zabaleny nebo jsou skladovány ve vlhkém prostředí, může dojít k reabsorpci vody dostatečné pro růst plísní, nárůst bakterií by ale neměl nastat (FORSYTHE a HAYES 1998). Scott (1957 cit. dle JAYE et al. 2005) sledoval stabilitu dehydratovaných potravin a porovnal hodnoty aw s pravděpodobnosti jejich kažení. Při hodnotách aw mezi 0.80 a 0.85 dochází snadno ke kažení vlivem různých druhů plísní za 1–2 týdny; při aw = 0.75 je kažení opožděno s menším počtem druhů mikroorganismů podílejících se na kažení; při aw = 0.70 je kažení velice opožděno, nebo se během delšího skladování nemusí objevit; při aw = 0.65 je známo jen málo mikroorganismů, které rostou a kažení je nejméně pravděpodobné po dobu až dva roky. 3.2.3.3 Rehydratace Při rehydrataci dehydratovaných výrobků se s mikroorganismy dějí podobné reakce jako u rozmražených potravin; je zde lag fáze růstu a mnoho organismů vykazuje metabolické poškození. Na mikroflóru a následnou rychlost kažení potraviny má zřejmý efekt teplota vody použité k rehydrataci. Je-li použita vařící voda, bude převládat Bacillus spp., který způsobí kažení potraviny, při použití postupně chladnější vody se mikroflóra stává variabilnější a obsahuje více teplotně labilní mikroorganismy. Pokud je takto připravená potravina uskladněna v chladničce, její životnost je maximálně 1 – 2 dny, uchování při pokojové teplotě by mělo být omezeno na co nejkratší možnou dobu (FORSYTHE – HAYES 1998). 3.2.4 Zdravotní rizika dehydratovaných potravin Zdravotní rizika hrozí po zvlhnutí výrobku, jak je uvedeno výše. Výjimečně by se mohly uplatnit osmotrofní vláknité houby (při aw nad 0,6) produkující mykotoxiny,
27
ostatní mikroorganismy mohou v dehydratovaných pokrmech přežívat a uplatnit se v případě nedostatečné inaktivace vegetativních buněk při regeneraci vlažnou pitnou vodou. Pomnožení patogenních mikroorganismů hrozí při opožděné spotřebě pokrmů, které byly připraveny do zásoby, protože vyklíčí jejich spory (KADLEC et al. 2009). V komplexních potravinách lze některé ingredience považovat za silný zdroj kontaminace spory B. cereus, jako jsou látky upravující texturu, tekutá vejce, byliny a koření (ICMSF 1986). AIIBP (2007) dělí syrové suroviny používané při výrobě dehydratovaných polévek a bujonů do tří rizikových kategorií: bez patogenního rizika (cukr, sůl, chemikálie, glutamát, modifikovaný škrob), známé kontrolované patogenní riziko (sušené mléko, masový extrakt, sušené maso, dekontaminované koření a zelenina, nudle), možné patogenní riziko (přírodní bylinky a nedekontaminované koření a zelenina). Mezi rizikové ingredience, kde hrozí výskyt B. cereus, patří vařená a předvařená škrobnatá zelenina, brambory, čočka, fazole, kukuřice a rýže. Podle toho je pak vhodné zavést specifika správné výrobní praxe. Spory B. cereus byly také nalezeny v obalových materiálech (PIRTTIJARVI 2000). Jelikož je B. cereus ubikvitární, je jeho přítomnost v syrových materiálech nevyhnutelná. Další kontaminace během výroby svědčí o špatné hygienické praxi a designu výrobního náčiní (EFSA 2005). 3.2.5 Preventivní opatření V dehydratovaných potravinách, ve kterých je častá přítomnost spor patogenních Bacillus spp., může být po rehydrataci teplou vodou umožněn růst Bacillus cereus. Dle EFSA jsou některé dehydratované potraviny včetně sušené počáteční kojenecké výživy a sušených dietních potravin konzumovány potenciálně choulostivými spotřebiteli, a proto by počty spor B. cereus v sušené počáteční kojenecké výživě a sušených dietních potravinách měly být co nejnižší (Nařízení Komise (ES) č. 1441/2007). Komise BIOHAZ Evropského úřadu pro bezpečnost potravin (EFSA) vydala stanovisko k B. cereus a dalším Bacillus spp. v potravinách. Dospěla k závěru, že jedním z hlavních kontrolních opatření ve výrobním procesu při výrobě dehydratovaných výrobků je kontrola teploty a zavedení systému založeného na zásadách analýzy rizika a kritických kontrolních bodů. Dále se konzumentům doporučuje zkrátit prodlevu mezi přípravou jídla a jeho konzumací na co nejkratší dobu nebo ho udržovat dostatečně teplé 28
(nad 63 °C) nebo ho ihned zchladit a udržovat při 7 - 8 °C (ideálně pod 4 °C) (EFSA 2005).
3.3 BACILLUS CEREUS 3.3.1 Základní charakteristika Bacillus cereus je v přírodě široce rozšířený saprofyt a je často izolován z půdy, rostlin, prachu a odpadních vod. Roste na rozkládajících se zbytcích rostlin, hnoji a krmivech. Z přirozeného prostřední se snadno dostává do surovin a potravin (ovoce a zelenina, vejce, maso, mléčné výrobky). B. cereus je asociován s dvěma formami otrav z jídla, které jsou charakterizované buď průjmem a bolestmi břicha, nebo nevolnostmi a zvracením (HEREDIA et al. 2009; GRANUM 2001; CEMPÍRKOVÁ et al. 1997). Uvádí se, že B. cereus je zodpovědný až za 25 % alimentárních onemocnění (MICROBEWIKI 2011a). B. cereus (rod Bacillus, čeleď Bacillaceae) je fakultativně anaerobní, sporotvorná, grampozitivní tyčinka, která se pohybuje díky přítomnosti bičíků, jenž má po celém povrchu. Průměr vegetativní buňky je 1,0 - 1,2 µm, délka 3 – 5 µm a vyskytují ojediněle nebo v řetízcích (GRANUM 2001; TODAR 2011). B. cereus roste v rozmezí pH 4,9 – 9,3, minimální aw pro jeho růst a množení je 0,92 – 0,95 a je schopen růstu v prostředí s maximálním přídavkem 7,5 % soli (RASKO et al. 2005; BENNETT a TALLENT 2012). Důležitou vlastností B. cereus je schopnost přežívat a růst při nízkých teplotách. Kmeny tak mohou být rozděleny do skupiny s vysokoteplotním rozmezím růstu (10 – 42 °C) a nízkoteplotním rozmezím (4 – 37 °C). Kmeny mohou být také rozlišeny dle toho, zda jsou schopny růst pod 7 °C (psychrotropní, růstové optimum 25 do 30 °C) nebo nejsou (mezofilní, růstové optimum 37 °C) (RASKO et al. 2005). Nejvíce studovaná skupina Bacillus spp. náleží do mezofilní skupiny s optimem růstu mezi 30 – 45 °C. Všechny druhy Bacillus způsobující otravy z jídla patří do této mezofilní skupiny, která je dále rozdělena do tří skupin. Všechny druhy způsobující alimentární otravy náleží do 1. skupiny, která se dále dělí na skupinu A a B. B. cereus náleží do skupiny 1. A společně s B. megaterium, B. thuringiensis, B. mycoides a B. anthracis (GRANUM a BAIRD-PARKER 2000).
29
Za varianty B. cereus se někdy považují druhy jako je B. antracis, B. mycoides a B. thuringiensis, které jsou geneticky (podle chromozomální DNA) od sebe neodlišitelné. Vznikly evolucí z druhu B. cereus, skupina byla pojmenována Bacillus cereus sensu lato (TODAR 2011).
Obr. 2 Bacillus cereus ( http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/File:Bacilluscereus1.JPG)
Vegetativní buňky B. cereus tvoří vždy jednu endosporu, která má oválný až cylindrický tvar, je umístěna centrálně či subterminálně a nezvětšuje průměr buňky (tzv. ji nezduřuje). Bakterie sporuluje pouze aerobně, protože energii získává oxidací zásobních tuků. Endospory jsou vysoce odolné vůči extrémním podmínkám (např. teplo, chlad, vysoušení, chemikálie, enzymy, vysoký tlak, salinita prostředí, ionizace) (CUPÁKOVÁ et al. 2011; RASKO et al. 2005).
Obr. 3 Bacillus cereus se sporami uvnitř buňky (http://www.tumblr.com/tagged/Bacillus%20cereus)
30
Pro identifikaci B. cereus jsou zásadní tyto charakteristiky: nezkvašuje mannitol, je VP-test pozitivní, utilizuje citráty, ale ne močovinu, většina kmenů redukuje nitráty. Na krevním agaru vytváří různě širokou zónu ß-hemolýzy (CUPÁKOVÁ et al. 2011; KOLÁŘ 2001) 3.3.2 Obecný popis alimentárních onemocnění Protože je Bacillus cereus původcem alimentárních onemocnění, uvádím zde krátké obecné informace o alimentárních onemocněních. Alimentární onemocnění je každé onemocnění člověka a zvířat, kdy se jedinec nakazí konzumací kontaminované potravy či tekutiny (WIKIPEDIE 2012c) Tato onemocnění představují celosvětový problém. Nejčastějšími původci jsou bakterie, mohou je ale také způsobovat viry a parazité (CEMPÍRKOVÁ et al. 1997). Alimentární onemocnění způsobená patogenními bakteriemi lze podle charakteru mikroorganizmu vyvolávajícího onemocnění a podle mechanizmu jeho účinku rozdělit na infekce z potravin a otravy (toxoinfekce a intoxikace). Alimentární infekce vyvolávají mikroorganizmy, které se potravinou nebo vodou dostávají do trávicího traktu člověka, kde se pomnoží a vyvolají onemocnění. Toxoinfekce jsou vyvolány uvolněnými endotoxiny z bakterií působícími na střevní sliznici. Intoxikace (enterotoxikózy) jsou onemocnění vyvolaná potravinami, ve kterých se pomnožily bakterie a vlivem jejich metabolické aktivity se nahromadily toxické metabolity (exotoxiny) (DRÁPAL et al. 2005; KOMPRDA 2000). Podle způsobu přenosu lze infekce a otravy z potravin rozdělit do tří skupin: V první skupině se infekční agens přenáší znečištěnýma rukama. Zdravý jedinec se nakazí při nedostatečné osobní hygieně, většinou znečištěnýma rukama nebo kontaminovanými potravinami či vodou. Do této skupiny patří onemocnění bakteriálního původu např. břišní tyf, paratyf, cholera, bacilární dyzentérie a dále akutní průjmová onemocnění bakteriálního i virového původu a hepatitida typu A. V druhé skupině se přenos infekčního agens děje hlavně prostřednictvím kontaminovaných potravin či vody. Mluvíme o tzv. zoonózách, protože zdrojem je vždy zvíře. Přenos z člověka na člověka je u těchto onemocnění možný, není však častý. Mezi významná onemocnění této skupiny patří zejména salmonelózy, kampylobakterió-
31
zy, yerziniózy, listeriózy, onemocnění vyvolaná E. coli a zoonózy parazitárního původu (toxoplazmóza a teniázy). Ve třetí skupině se přenos uskutečňuje potravinou, ve které došlo k pomnožení bakterií a nahromadění produktů jejich metabolismu - bakteriálních toxinů. Intoxikace z potravin nejsou přenosné z člověka na člověka. Do této skupiny patří stafylokoková enterotoxikóza, botulismus, intoxikace Clostridium perfringens typu A a intoxikace Bacillus cereus (Intoxikace Vibrio parahaemolyticus je u nás velice vzácná) (DRÁPAL et al. 2005). Bacillus cereus tedy podle mechanismu vzniku onemocnění dle výše zmíněného rozdělení způsobuje toxoinfekci diarhotickým toxinem a intoxikaci emetickým toxinem. 3.3.3 Historie První záznamy o otravě z potravin způsobené rodem Bacillus jsou z roku 1906, kdy bylo popsáno propuknutí onemocnění v sanatoriu, kde se u 300 pacientů a zaměstnanců objevily silné průjmy, křeče žaludku a zvracení. V Evropě se pak objevila řada takovýchto onemocnění a v letech 1936 až 1943 Stockholmské ministerstvo zdravotnictví odhadovalo, že byl tento mikroorganismus tvořící aerobní spory příčinou onemocnění v 117-ti případech z 367 zkoumaných. Až v roce 1950 došlo k potvrzení, že příčinou onemocnění je právě Bacillus cereus, a to díky vyjasnění taxonomie této bakterie. Hauge v roce 1955 popsal čtyři propuknutí nákazy v Norsku dohromady u 600 lidí. Zdrojem byla vanilková omáčka, která byla připravena den předem a uložena při pokojové teplotě. U této omáčky bylo později zjištěno 2,5× 107 až 1,1× 108 buněk B. cereus v 1 ml (MCKILLIP 2000; GRANUM 2001; JAY et al. 2005). Tyto počáteční zprávy z Evropy popisují onemocnění, pro které byl převládajícím příznakem průjem. Nyní je známo, že Bacillus cereus je zodpovědný za dvě odlišné formy onemocnění z potravin: průjmové (diarhotický syndrom) s relativně delší inkubační dobou a onemocnění projevující se zvracením (tzv. emetický syndrom), který má rychlý začátek a byl poprvé popsán v roce 1971 ve Velké Británii (MCKILLIP 2000; KOLÁŘ 2001, JAY et al. 2005).
32
3.3.4 Charakteristika onemocnění způsobených druhem B. cereus B. cereus může způsobovat mnoho odlišných infekcí a intoxikací. Vedle alimentárních onemocnění může způsobovat onemocnění u hostitele s výrazně sníženou imunitou - může vyvolat meningitidu, endokarditidu, endophtalmitidu, konjunktivitidu nebo akutní gastroenteritidu (GRANUM 2001). Adler (2005) popsal osm sepsí u předčasně narozených novorozenců způsobených rodem Bacillus. Je též původcem oportunitních infekcí (GRANUM a BAIRD-PARKER 2000). Dancer et al. (2002) prokázal, že může být také příčinou závažné sepse u uživatelů drog v důsledku kontaminace heroinu právě bakteriemi B. cereus. Konzumace potravin kontaminovaných bakteriemi B. cereus může vyústit ve dvě různé formy alimentárních onemocnění – průjmový a emetický syndrom. 3.3.4.1 Průjmový syndrom Průjmový (diarhotický) syndrom vzniká působením enterotoxinů produkovaných po kolonizaci bakterií v tenkém střevě (toxoinfekce). Pokud dojde k produkci enterotoxinů v potravině (intoxikace), obvykle jsou inaktivovány nízkým pH a účinkem proteolytických enzymů v žaludku. Předpokládá se, že enterotoxiny vyvolávají průjem v důsledku tvorby transmembránových pórů v membráně enterocytů, což má za následek ztráty Na+, Cl- a H2O z epiteliálních buněk. Průjmový syndrom se projevuje 8 – 16 hodin po konzumaci kontaminované potraviny. Mezi klinické příznaky patří vodnatý průjem, nevolnost a bolesti břicha, příležitostně se může objevit i zvracení. Onemocnění probíhá většinou bez horečky. Potíže přetrvávají 12 – 24 hodin, potom spontánně odezní. Průjmový syndrom je svým průběhem podobný otravou způsobenou bakterií Clostridium perfringens (DRÁPAL et al. 2005; JAY 2005; CUPÁKOVÁ et al. 2011; GRANUM 2001). 3.3.4.2 Emetický syndrom Emetický syndrom je alimentární intoxikace a vzniká po konzumaci potravin obsahujících vyprodukovaný emetický toxin (cereulid). Toxická dávka je přibližně 30 μg na kg živé váhy. Toxin cereulid se váže na receptory nervus vagus v žaludku a vyvolává zvracení. V některých případech může také způsobit selhání jater jako následek degenerace hepatocytů. Typické symptomy jako nevolnost a zvracení se objevují 1 – 6 h po konzumaci kontaminované potraviny a nepřetrvávají obvykle déle než 24 h, poté
33
onemocnění spontánně odezní. Průběh onemocnění připomíná stafylokokovou enterotoxikózu, ta ale bývá doprovázena průjmem (CUPÁKOVÁ et al.2011; DRÁPAL et al. 2005; JAY et al. 2005). Alimentární otravy způsobené B. subtilis, B. licheniformis a B. pumilis jsou podobné těm, které způsobuje B. cereus co se týče trvání a rozsahu symptomů, nicméně inkubační doba a symptomy se liší dle druhu. B. thuringiensis pravděpodobně produkuje stejné enterotoxiny jako B. cereus (EFSA 2005; GRANUM a BAIRD-PARKER 2000; SALKINOJA-SALONEN et al. 1999). Tabulka 4 Alimentární onemocnění způsobené bakterií B. cereus (ARNESEN et al. 2008).
Průjmový syndrom
Emetický syndrom Cyklický peptid emetický toxin (cereulid)
Infekční dávka
Protein enterotoxiny: Hbl, Nhe, CytK 105 – 107 buněk i spor
Produkce toxinu
V tenkém střevě hostitele
V potravinách
Typ toxinu
Protein
Cyklický peptid
Inkubační doba
8 – 16 hodin (ojediněle do 0,5 - 6 hodin
Typ toxinu
105 – 108 KTJ/g
24 hodin) Trvání nemoci
12 – 24 hodin (ojediněle 6 – 24 hodin pár dní) Bolesti břicha, vodnatý Nevolnost, křeče, zvracení
Příznaky
průjem, příležitostně nevolnost Potraviny s nejčastějším Masné výrobky, zelenina, Opékaná a vařená rýže, polévky, mléko, mléčné těstoviny, cukrářské vý-
výskytem
výrobky, pudinky, omáč- robky ky,
3.3.5 Faktory virulence a mechanismy patogenity B. cereus produkuje širokou škálu toxinů a enzymů, mezi které patří zejména:
emetický toxin,
diarhogenní enterotoxiny,
34
hemolysiny,
2 typy fosfolipázy C,
sfingomyelináza,
enzymy s proteolytickou, lipolytickou a amylolytickou aktivitou (uplatňující se při kažení potravin) (GRANUM a BAIRD-PARKER 2000; JAY et al. 2005, MCKILLIP 2000).
3.3.5.1 Emetický toxin Emetický toxin (cereulid) je termostabilní (121 °C po 90 min), aktivní v širokém rozmezí pH (pH 2 – 11), odolný vůči působení proteolytických enzymů a není antigenní. Maximální produkce cereulidu je pozorována během stacionární fáze růstu bakterií v potravině a může být vázána na sporulaci (KOLÁŘ 2001). Syntéza tohoto toxinu se pohybuje v teplotním rozmezí 12 –37 °C, přičemž největší produkce byla zaznamenána mezi 12 – 22 °C. Mezi další faktory, které ovlivňují produkci toxinu, patří přístup kyslíku, pH nebo přítomnost specifických aminokyselin (ARNESEN et al. 2008) Struktura cereulidu byla dlouho záhadou, protože jediným detekčním systémem byli živí primáti. Díky objevu HEp-2 buněk a jejich vakuolové aktivitě došlo k jeho izolaci a determinaci jeho struktury. Jedná se o cyklický peptid, jehož struktura je tvořena třemi opakováními čtyř aminokyselin a/nebo oxokyselin: (D-O-Leu-D-Ala-L-OVal-L-Val)3. Jeho biosyntéza a mechanismus působení ještě musí být objasněny. Ukázalo se, že se cereulid váže na receptory 5-HT3 bloudivého nervu (nervus vagus) v žaludku, a tak vyvolává zvracení (AGATA et al. 1995 cit. dle GRANUM 2001 ). Byly popsány i některé další účinky cereulidu. Toxin působí jako kationtový ionofor (látka umožňující přenos iontu lipidovou bariérou) pro K+ (jako valinomycin), čímž působí inhibici oxidace mastných kyselin, což má za následek utlumení mitochondriální aktivity (MIKKOLA et al. 1999). Tento mechanismus účinku cereulidu byl příčinou selhání jater a následných úmrtí sedmnáctiletého chlapce ve Švýcarsku a sedmileté belgické dívky (MAHLER et al. 1997, DIERICK et al. 2005). Dalším účinkem cereulidu je buněčné poškození a inhibice NK-buněk (natural killer cell) imunitního systému (PANANEN et al. 2002 cit. dle ARNESEN et al. 2008)
35
3.3.5.2 Diarhogenní enterotoxiny Průjmový syndrom je způsoben enterotoxiny (proteiny), které jsou termolabilní – účinně jsou inaktivovány teplotou 56 °C po dobu 5 min, jsou citlivé k proteolytickým enzymům (pepsin, trypsin), jsou stabilní při pH 4 – 11 a jsou produkovány během pozdní exponenciální a na začátku stacionární fáze růstu při množení bakterií v tenkém střevě. Mezi hlavní enterotoxiny produkované B. cereus patří: Hemolyzin BL (Hbl), Nehemolytický enterotoxin (Nhe) a Cytotoxin K (CytK) (HEREDIA 2009, GRANUM 2001, GRANUM a LUND 1997). Jako první enterotoxin byl popsán tříkomponentní Hbl (skládající se ze tří proteinů: B a L1 a L2). Je známý svou dermonekrotickou aktivitou, cytotoxickou aktivitou, hemolytickou aktivitou a způsobuje cévní propustnost. Byl určený jako příčina vzniku akumulované tekutiny v králičí střevní smyčce a tento test byl tradičně považován za rozhodující test enterotoxicity, který je dnes nahrazen testováním na buněčných kulturách. Pro maximální enterotoxigenní aktivitu jsou nutné všechny tři proteinové komponenty, B protein váže Hbl k cílové buňce, L1 a L2 mají lytickou funkci (GRANUM 2001, GRANUM a LUND 1997). Nhe byl poprvé charakterizován v Norsku v roce 1995, kdy došlo k rozsáhlé otravě jídlem hbl-negativním kmenem B. cereus. Kmen produkující Nhe neprodukoval L2 protein, tudíž nebyla zjištěna hemolytická aktivita (ARNESEN et al. 2008; GRANUM 2001). Nhe se skládá ze tří jednotek: NhA, NhB a NhC. Geny, které je kódují, tvoří operon. Byly naklonovány odděleně a exprimovány buď B. subtilis, nebo E. coli. Tím se prokázalo, že pro biologickou aktivitu jsou nutné všechny tři jednotky (TODAR 2011). Zatímco Hbl a Nhe jsou příbuzné tříkomponentní toxiny, Cyt K je jednokomponentní a patří do rodiny póry-tvořících toxinů s konformací „β-barrel“. Je zodpovědný za nekrotickou enteritidu doprovázenou krvavým průjmem. Je podobný β-toxinu produkovaném C. perfringens. V roce 1998 byl příčinou krvavých průjmů několika lidí a smrti tří lidí v ošetřovatelském domě ve Francii (GRANUM a BAIRD-PARKER 2000). Mezi další toxiny produkované B. cereus patří také Enerotoxin T (BceT) a Enterotoxin FM (EntFM). Bylo zjištěno, že gen Enterotoxinu T byl nepřítomný u 57 z 95 kmenů B. cerueus a v 5 ze 7 kmenů, které způsobily alimentární onemocnění. BceT nemá signální sekvenci a je uvolňován pouze po lýze buňky B. cereus. Jeho účast při
36
otravách tedy není jistá. Stejně tak málo je známo o roli Eterotoxinu FM při otravách z jídla a nebyly provedeny žádné biologické studie (GRANUM et al. 2001). 3.3.5.3 Spory Spory B. cereus jsou významným faktorem při vzniku onemocnění z potravin, jelikož jsou více hydrofobní než spory jiných druhů Bacillus spp., což jim umožňuje snáze přilnout k různým povrchům. Z tohoto důvodu je není snadné odstranit během čištění a je to obtížné i při použití dezinfekce. Při adhezi sporám pomáhají také výběžky a/nebo pily (Obr.
4). To umožňuje sporám odolávat sanitaci a tak zůstávat na površích, odkud se snadnou dostanou na potraviny (MARTÍNEZ et al. 2007, ARNESEN et al. 2008). Hornstra et al. (2007) publikoval studii, kde adherované spory na povrchu mlékařských nádob před desinfekcí nechali vyklíčit pomocí mixu l-alaninu a inosinu. Tento proces vedl ke snížení přežitých buněk bacila o 3 logaritmické řády.
Ke tvorbě spor dochází obvykle na konci exponenciální a začátkem stacionární fáze růstu, za příznivých podmínek trvá 16 – 24 h. Sporulace není možná za nízkých teplot a bez přístupu kyslíku. Klíčení spor – germinace, je rychlejší než sporulace a je závislá na teplotě, při optimální teplotě trvá přibližně 1 hodinu. K aktivaci klíčení spor dochází záhřevem na pasterační teploty (72 – 85 °C). Termorezistence spor B. cereus je v porovnání s ostatními druhy rodu Bacillus relativně nízká. UHT ošetření spory B. cereus obvykle spolehlivě ničí (CUPÁKOVÁ et al. 2011).
Obr. 4 Adherované spory B. cereus (http://amgar.blog.processalimentaire.com/contaminantchimique/lalcool-et-les-bacteries-sporulees/)
37
3.3.6 Infekční dávky V potravinách, které vyvolaly otravu, se počet buněk B. cereus pohyboval v rozmezí 2 × 102 až 109 v 1 gramu (ml) potraviny. Celková infekční dávka kolísá mezi 105 a 109 životaschopných buněk nebo spor na 1 g (ml) potraviny, viz také Tabulka 4. Nicméně žádný pokrm, který obsahuje více jak 103 KTJ/g nelze považovat za zcela bezpečný ke konzumaci (RAY a BHUNIA 2008; ARNESEN et al. 2008). Není specifikována žádná riziková skupina lidí ohrožena alimentárním onemocněním způsobeném B. cereus, nicméně jedinci se sníženou aciditou žaludku, například starší lidé trpící achlorhydrií, jsou více ohroženi, neboť žaludkem projde více životaschopných buněk (CLAVEL et al. 2004). 3.3.7 Výskyt v surovinách a potravinách Schopnost tvořit velmi odolné spory vede k tomu, že onemocnění způsobující bacily jsou široce rozšířeny v potravinách. Ve většině případů však jsou pouze malou částí mikroflóry a jsou přítomné v počtu < 102 KTJ/g, což je považováno za přijatelnou hodnotu z hlediska zdravotní nezávadnosti (HEREDIA 2009, KOMPRDA 2007). Alimentární
otravy
způsobené
B.
cereus
jsou
spojované
především
s uchováváním vařených jídel při pokojové teplotě po dlouhou dobu, kdy je umožněn růst bakterií a jejich počet překročí 106 KTJ/g(ml). Potraviny s nízkým pH (< 5,0) a suché potraviny nepodporují růst B. cereus, ačkoliv mnoho sušených potravin je kontaminováno jeho spory. Je zaznamenáno několik případů otrav jídlem způsobených růstem B. cereus v nevhodně skladovaných rehydratovaných výrobcích (GRANUM a BAIRD-PARKER 2000). Rezistence spor k vysoušení jim dovoluje přežít na suchých potravinách, jako jsou obiloviny a mouka. Propuknutí otrav v Norsku (popsáno výše) měla za následek kukuřičná mouka, která byla použita k zahuštění vanilkové omáčky. Normální zahřátí během přípravy neinaktivovalo spory a následné dlouhodobé skladování omáčky při vysoké aktivitě vody a pokojové teplotě přispělo ke klíčení spor a nárůstu mikroorganismu. Nejčastější příčinou otrav emetickým toxinem jsou potraviny obsahující škrob, jako je rýže a těstoviny. V Anglii je onemocnění nazýváno „syndrom čínské restaurace“ (Fried Rice Syndrom). Velké množství rýže uvařené na několik dní dopředu je ideálním prostředím k pomnožení B. cereus. Spory, běžněji ty tepelně odolnějšího sérotypů 1, přežívají předvaření. Pak následuje jejich klíčení, růst a produkce cereulidu
38
v potravině během skladování. Tomu se dá předejít snížením teploty rýže pod 8 ˚C, ale úroveň chlazení uvnitř uvařeného množství rýže, i když je přemístěna do chladírny, může být příliš malá pro zastavení růstu a produkce toxinu. Opětné zahřátí rýže není dostatečné pro inaktivaci vytvořeného emetického toxinu (GRANUM a BAIRD-PARKER 2000; KOLÁŘ 2001; RAY a BHUNIA 2008). Průjmový syndrom může mít za následek větší škála potravin, včetně masových výrobků (např. játrová paštika), polévek, zeleniny, pudingů a omáček. Sušené byliny a koření používané při přípravě pokrmů, mohou být významným zdrojem B. cereus, což bývá relativně častým důvodem vysokého výskytu tohoto onemocnění v Maďarsku. V letech 1960 – 1968 to zde byla třetí nejběžnější příčina onemocnění z potravin, která postihla 15,2 % lidí. Čerstvější údaje naznačují, že se jeho význam poněkud snižuje, ale zda je to změnami v kulinárních úpravách, zlepšením hygieny, poklesem kontaminace koření nebo nedostatečností statických údajů, není známo (KOLÁŘ 2001; RAY a BHUNIA 2008) Vysoký výskyt B. cereus je znám v pasterovaném a jinak tepelně ošetřeném mléce (typické je 35 – 48 % pozitivních vzorků) ve srovnání s mlékem neošetřeným (~ 9 % pozitivních). Tepelné zpracování totiž v tomto případě pomáhá sporotvorným mikroorganismům. Ve většině případů byly detekované počty nízké (< 103 KTJ/ml ), ale pokud je pasterizované mléko nebo smetana skladována při nedostatečně nízké teplotě, B. cereus může růst a způsobovat kažení známé jako „sladké srážení“ nebo „hořknutí smetany“. Přesto jsou mléko a mléčné výrobky zřídka spojovány s onemocněním způsobeným B. cereus, ačkoli sušené mléko mělo za následek propuknutí nákazy, když se použilo na výrobu některých potravin (cukrovinek). Proto je nutná především prevence, tedy udržovat vemeno a struky krav čisté (GRANUM a BAIRD-PARKER 2000; KOLÁŘ 2001). 3.3.8 Preventivní opatření Spory B. cereus se běžně vyskytují v prostředí a často kontaminují potraviny. K alimentárním otravám dochází po pomnožení bakterií v potravinách na množství přibližně 107 KTJ/g (v případě dětí 105 KTJ/g). Spory B. cereus obvykle přežívají teploty používané při výrobě potravin a přípravě pokrmů, proto je důležitým preventivním opatřením pro zamezení růstu bakterií buď udržování teploty pokrmu nad 60 °C, nebo brzké zchlazení a skladování hotových pokrmů při teplotách, které neumožňují vyklíče-
39
ní spor, to je při teplotě pod 4 °C (TODAR 2011, GRANUM a BAIRD-PARKER 2000). RAY a BHUNIA 2008 ovšem uvádějí, že B. cereus při poskytnutí dostatečného času může i při skladování pokrmů v chladničce při 4 °C růst a produkovat toxiny, proto by ani zde neměly zůstávat dlouhou dobu. To znamená nepřipravovat pokrmy dlouho před konzumací. B. cereus se také může do potraviny dostat křížovou kontaminací, proto by měla být přijata vhodná hygienická opatření při manipulaci s potravinou. Jídlo podezřelé z kontaminace touto bakterií by mělo být před podáváním ohřáto nad 75 °C, nicméně toto opatření je účinné pouze pro zničení vegetativních buněk, emetický toxin je zachován. 3.3.9 Legislativní limity pro B. cereus Ministerstvo zdravotnictví vydalo v roce 2004 na základě zákona č. 110/1997 Sb. vyhlášku č. 132/2004 Sb. o mikrobiologických požadavcích na potraviny, způsobu jejich kontroly a hodnocení, kterou se zrušují vyhlášky č. 294/1997 a č. 91/1999. Tato vyhláška udávala tyto nejvyšší mezní hodnoty výskytu B. cereus v potravinách: -
potraviny neurčené k přímé spotřebě 105 KTJ/g,
-
potraviny určené k přímé spotřebě 104 KTJ/g,
-
potraviny určené pro kojeneckou a dětskou výživu 102 KTJ/g.
Překročení mezních hodnot znamenalo, že se jednalo o potravinu zdravotně závadnou. Tato vyhláška také upravovala hodnoty tolerované při stanovování u některých vybraných potravin. Poté však byla tato zrušena vyhláškou č. 467/2006 Sb. (ESIPA 2010). Limitní hodnoty pro obsah B. cereus v potravinách jsou dnes vymezeny pouze pro sušené mléko a kojeneckou stravu, které jsou uvedeny v Nařízení Komise (ES) č. 1441/2007 o mikrobiologických kritériích pro potraviny. Ačkoliv v současné době tedy nejsou dány žádné limity pro obsah B. cereus v potravinách (až na výše zmíněné sušené mléko a kojeneckou stravu), své výsledky v praktické části konfrontuji s limity danými Vyhláškou č. 132/2004 Sb.
40
3.3.10 Metody stanovení B. cereus v potravinách a jeho konfirmace Pro stanovení B. cereus se používají živná média obsahující selektivní složky inhibující růst doprovodných mikroorganismů (např. zvýšená koncentrace NaCl, polymyxin B), diagnostickou složkou je obvykle vaječný žloutek (precipitace v důsledku lecitinázové aktivity) a manitol, který B. cereus nefermentuje (TALLENT et al. 2012). Podle ČSN EN ISO 7932 (560092) (2005) je pro izolaci B. cereus z potravin určen Mannitol Yolk Polymyxine B agar (MYP). B. cereus zde roste ve velkých suchých drsných koloniích s nepravidelnými okraji, růžové barvy (negativní manitol), obklopených růžovou zónou precipitace (lecitinázová aktivita) (Obr. 5). Jako další je zařazen pouze test k průkazu hemolýzy (Obr. 6), kde vyrůstá ve velkých, drsných koloniích s nepravidelnými okraji, obklopených zónou ß-hemolýzy. Znaky fermentace glukózy, torba acetylmethylkarbinolu (test VP) a redukce dusičnanů, které obsahovala předchozí norma ČSN ISO 7932 (560092), odpadají. Touto metodou je stanoven počet tzv. presumptivních (předpokládaných) příslušníků druhu B. cereus. Použitými konfirmačními testy totiž nelze odlišit B. cereus od blízce příbuzných, ale řidčeji se vyskytujících druhů – B. anthracis, B. thuringiensis, B. weihenstephaniensis a B. mycoides.
Obr. 5 Růst B. cereus na MYP agaru (http://cit.vfu.cz/alimentarni-onemocneni/xbc/xbc03-05.html)
41
Obr. 6 B. cereus - hemolýza na krevním agaru (http://pictures.life.ku.dk/atlas/microatlas/veterinary/bacteria/Bacillus_cereus/)
Další možností je použití půdy Polymyxin Egg Yolk Mannitol Bromthymol agar (PEMBA), kde roste B. cereus v modrých koloniích opět obklopených zónou precipitace (lecitinázová aktivita) (viz Obr. 7). Jak MYP, tak PEMBA tedy jako diagnostické znaky využívají lýzu vaječného lecitinu, absenci tvorby kyselin z manitolu (nezkvašují ho) a polymixinu B jako selektivního činitele. Pro izolaci B. cereus lze využít i chromogenní média (TALLENT et al. 2012).
Obr. 7 Růst B. cereus na PEMBA agaru (http://pages.usherbrooke.ca/biomedias/images/PEMBAB-cereus-2.jpg)
42
Pro stanovení spor B. cereus je nutná tepelná inaktivace vegetativních buněk ve vzorku (80 °C po 10 min), kdy současně dojde i k aktivaci germinace spor. K vlastní kultivaci lze použít běžné obohacené médium (např. krevní agar). K detekci přítomnosti diarhogenních enterotoxinů B. cereus lze využít komerčně dostupné kity na bázi imunochemických metod - ELISA metodu detekující NheA podjednotku nehemolytického enterotoxinu (BDE-VIA) nebo reverzní pasivní latexovou aglutinaci detekující L2 podjednotku hemolyzinu BL (BCET-RPLA). Pro detekci emetického toxinu se používají metody využívající tkáňové kultury či biologický pokus, komerční kity pro detekci cereulidu zatím nejsou dostupné (ARNESEN et al. 2008; CUPÁKOVÁ et al.2011). Použitím metody PCR (polymerázové řetězové reakce) lze detekovat přítomnost genů kódujících produkci jednotlivých faktorů virulence (např. emetický toxin, diarhogenní enterotoxiny, hemolyziny). Dále lze metodu využít k odlišení druhu B. cereus od ostatních blízce příbuzných druhů ze skupiny 1A (tzv. B. cereus group). Při genotypové charakterizaci izolátů B. cereus lze vedle různých modifikací PCR (např. RAPD, RFLPPCR) využít i metodu MLST (Multilocus Sequence Typing), ribotypizaci či microarrays (DZIECIOL et al. 2013).
3.4 PLÍSNĚ A KVASINKY 3.4.1 Plísně Plísně jsou vícebuněčné, eukaryontní, pokročile heterotrofní, saprofytické nebo parazitické mikroorganismy, jejichž stáří se odhaduje na 300 milionů let (KRMENČÍK a KYSILKA 2007). Jako plísně jsou často označovány veškeré houbovité organismy, které tvoří na potravinách povlaky (viditelné mycelium) složené s jednotlivých vláken (hyf). Botanicky je tento pojem nepřesný, neboť všechny tyto organismy, společně s kvasinkami a kvasinkovitými mikroorganismy, tvoří skupinu mikroskopických hub (Mikromycety) a systematicky se řadí k říši hub (fungi) (ŠIMŮNEK 2003). Systematicky jsou plísně zahrnuté do oddělení Myxomycety, Chytridiomycety, Oomcety, Zygomycety, Ascomycety, Basidiomycety a houby s neznámým pohlavním stádiem rozmnožování jsou řazeny do uměle vytvořené třídy Deuteromycety. (GÖRNER a VALÍK 2004) Výskyt plísní v přírodě je běžný a častý. Společně s ostatními mikroorganismy rozkládají organickou hmotu a zajištují tím koloběh látek v přírodě. Svou biochemickou 43
činností jsou schopny rozkládat nejrůznější organické látky (potraviny, dřevo, textil). Jsou nenáročné na životní podmínky, jsou schopné využívat i vzdušnou vlhkost, rostou i při nízkých teplotách, odolávají vysokému osmotickému tlaku, rostou v kyselém prostředí a mají obrovskou rozmnožovací schopnost (RAY a BHUNIA 2008). Některé plísně jsou patogenní pro člověka či zvířata a také mohou u citlivých jedinců vyvolávat alergické reakce (SEIDU 2012). Mimořádně vysoký negativní význam mají plísně z hlediska tvorby sekundárních metabolitů – mykotoxinů. Riziko pro člověka představuje především konzumace mykotoxinů z kontaminovaných potravin rostlinného původu, dále jejich metabolitů a reziduí v živočišných produktech. (SPEIJERS a SPEIJERS 2004; KOMPRDA 2000; ŠIMŮNEK 2003) Hlavními producenty mykotoxinu jsou: Fusarium spp., Aspergillus spp., Penicillium spp. Ty se dělí podle výskytu na plísně polní, které napadají plodiny již před sklizní (rod Fusarium), na plísně skladištní, které napadají uskladněné plodiny (rod Aspergillus) a na plísně polní i skladištní (rod Penicillium) Nejvýznamnější mykotoxiny a jejich účinky jsou uvedeny v Tabulka 5. (COLAK et al. 2012; KOMPRDA 2000). Tabulka 5 Přehled nejdůležitějších mykotoxinů a jejich účinků (KRMENČÍK a KYSILKA 2007)
Mykotoxin
Producenti
Toxické účinky
Aflatoxiny
A. flavus, A. parasiticus, A. nomius, A. argentinicus
Hepatotoxicita, nádory jater (zvíře), gastritidy, enteritidy
Deoxynivalenol
Fusarium graminearum, F. culmorum, F. poae
Záněty trávicího traktu, anemie, poškození krvetvorby
Fumonisin B1
Fusarium proliferatum, F. moniliforme, aj.
Hepatotoxicita, nádory jater
Ochratoxin A
Penicillium verrucosum, Aspergillus ochraceus, aj.
Nefrotoxicita, nádory močového
ústrojí,
teratogenita (zvíře) Patulin
Penicillium expansum, Byssochlamys spp., aj.
Nefrotoxicita, gastroenteritidy,
dermální
iritace, imunotoxicita
44
Sterigmatocystin Aspergillus flavus, A. parasiticus, A. nomius, A. Hepatotoxicita, geno-
Zearalenon
versicolor, aj.
toxicita
Fusarium graminearum, F. culmorum, aj.
Estrogenní účinky
3.4.2 Kvasinky Kvasinky jsou v přírodě velmi rozšířené a vzhledem ke svým většinou pouze sacharolytickým schopnostem se vyskytují především na cukernatých materiálech a potravinách, v květních nektarech, v půdě, ve vzduchu, střevním traktu zvířat (i hmyzu – včely) a člověka (ŠILHÁNKOVÁ 2002). Kvasinky jsou většinou jednobuněčné eukaryotické heterotrofní mikroorganismy rozmnožující se pučením nebo dělením. O kvasinkovitých mikroorganismech hovoříme v tom případě, pokud se kromě jednotlivých pučících buněk vytváří i vlákna (pravé a nepravé hyfy), která zpravidla netvoří vřecka. Většina kvasinek patří do třídy vřeckovýtrusných hub (Ascomycotina), některé ale i do třídy hub stopkovýtrusných (Basidiomycotina), a rody, u nichž neznáme tvorbu pohlavních spor, řadíme mezi Deuteromycotina. Proto společně netvoří taxonomickou skupinu (WIKIPEDIA 2013 b.) Jsou hojně využívány v potravinářství a biotechnologiích, například při výrobě vína, piva nebo chleba. Kvasinky ale také mohou kontaminovat výrobní náčiní. Jsou ale mezi nimi i patogenní druhy, jako je např. Candida albicans. Tato kvasinka je běžným druhem střevní a ústní mikroflóry. Při přemnožení způsobuje kandidózu. Kandidózou kůže a nehtů jsou ohroženi lidé pracující s půdou (zahradníci) nebo s ovocem a cukernými nálevy (pracovníci konzervárenského průmyslu). C. albicans se však může přemnožit v dutině ústní, i v krvi a v genitálním traktu. U dětí způsobuje nemoc zvanou moučnivka. Kandidóza je často diagnostikována u osob se sníženou imunitou (vlivem AIDS, chemoterapie, transplantace orgánů), u nichž může být častou příčinou nemocí a úmrtí ((BEKATOROU et al. 2006; PATOČKA 1972; ŠILHÁNKOVÁ 2002).
45
Obrázek 8 nárůst plísní a kvasinek z vybraných vzorků polévek zkoumaných v praktické části této práce
3.4.3 Význam plísní a kvasinek při kažení potravin V potravinářství mají kvasinky a plísně jak význam pozitivní, tak negativní. I když některé lze využít v kvasném průmyslu, mlékárenství a pro výrobu aditiv či enzymů, mohou být plísně producenty mykotoxinů, plísně a kvasinky mohou být původci kažení potravin a tím pádem i indikátory mikrobiologické jakosti potravin (RAY a BHUNIA 2008). Plísně a kvasinky se vyznačují morfologickou rozmanitostí, výraznou proteolytickou, sacharolytickou a lipolytickou aktivitou, jsou nenáročné na složení živin. Oproti bakteriím mají menší nároky na přítomnost využitelné vody, tudíž rostou při nižší aktivitě vody, a mají zpravidla nižší optimální teploty, někdy jsou značně termorezistentní (konzervárenské produkty). Potraviny jsou proto vhodným substrátem pro osídlení, růst a rozmnožování kvasinek a plísní (HUIS IN´T VELD 1996). Mezi nejznámější rody plísní způsobující kažení potravin patří Aspergillus, Alternaria, Mucor, Penicillium, Fusarium, Geotrichum, Rhizopus a mezi nejznámější rody potraviny kazících kvasinek patří Saccharomyces, Rhodotorula, Pichia, Torulopsis, Candida, a Zygosaccharomyces (RAY a BHUNIA 2008). Mezi změny jimi vyvolané patří tvorba slizu, pigmentů, fermentace cukrů s produkcí kyselin, plynu či alkoholu, potraviny také mohou zapáchat a měnit chuť (HUIS IN´T VELD 1996). Plísně a kvasinky se ve značné míře zúčastňují při kažení potravin rostlinného původu. Mimořádně náchylné jsou potraviny slabě kyselé s hodnotami pH 5,5 až 5,0, se sníženou aktivitou vody, a to i při nižších teplotách. Z potravin živočišného původu to jsou maso a masné výrobky a to i při mrazírenském skladování. V kysaných mléčných výrobcích nahrazují z hlediska primární a sekundární kontaminace indikátorovou 46
úlohu koliformních bakterií, které ve velmi kyselém prostředí nerostou. Z hotových jídel jsou to hlavně saláty a výrobky studené kuchyně, majonézy a dresinky. Ve výrobcích tukového průmyslu (margaríny, ztužené pokrmové tuky) a kosmetického průmyslu (krémy, zubní pasty, oční kosmetika, šampony a jiné) jsou kvasinky a plísně indikátory primarní a sekundární kontaminace. Přítomnost a počet plísní Geotrichum candidum (Oospora lactis) na povrchu technologického nářadí a zařízení (v angličitě zvané machine moulds) indikuje péči o jeho sanitaci (GÖRNER a VALÍK 2004) 3.4.4 Legislativní limity pro plísně a kvasinky Nařízení Komise (ES) č. 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny a jeho novela Nařízení Komise (ES) č. 1441/2007 se regulací kvasinek a plísní v potravinách nezabývá. Maximální počet kvasinek a plísní (KTJ/g) v potravinách tedy není v EU legislativně limitován. Plesnivé potraviny jsou posouzeny pracovníky dozorových organizací jako jiné než zdravotně nezávadné. V zákoně č. 110/1997 Sb. V platném znění v § 10 odst, 1 písm. a) jsou definovány potraviny jiné než zdravotně nezávadné. V Nařízení EP a R (ES) č. 178/2002 článek 14 jsou požadavky na bezpečnost potravin v odst. 5. Při rozhodování o tom, zda potravina není vhodná k lidské spotřebě, se bere v úvahu skutečnost, zda není potravina nepřijatelná pro lidskou spotřebu z důvodu: hniloby, kažení nebo rozkladu (OSTRÝ 2013). V Nařízení 1881/2006 (ES), kterým se stanoví maximální limity některých kontaminujících látek v potravinách, jsou uvedeny maximální limity nejvýznamnějších mykotoxinů v některých potravinách.
47
4
MATERIÁL A METODY
4.1 Charakteristika vzorků V této práci byly analyzovány polévky zakoupené v tržní síti ČR. K hodnocení byly použity dva typy dehydratovaných polévek: polévky na vaření, které jsou obvyklé pro přípravu více porcí, a polévky instantní, tedy na zalití horkou vodou, obvyklé pro přípravu jedné porce. Pro analýzu polévek na vaření byli vybráni tři výrobci, pro instantní polévky jeden výrobce. Vzorky polévek na vaření – každý druh vždy od výrobce 1, 2 a 3: -
polévka hrachová,
-
polévka francouzská,
-
polévka čočková,
-
polévka rajská,
-
polévka s játrovými knedlíčky,
-
polévka gulášová. Vzorky instantních polévek – všechny od stejného výrobce:
-
instantní polévka s játrovými knedlíčky,
-
instantní polévka francouzská,
-
instantní polévka gulášová,
-
instantní polévka hrášková,
-
instantní polévka čočková. Uvedené vzorky polévek měly dobu minimální trvanlivosti (DMT) 12 – 18 mě-
síců a podle toho byly tříděny a analyzovány po ukončení doby DMT.
4.2 Charakteristika použitého materiálu 4.2.1 Bakteriální kmeny K experimentům byly pro srovnání použity laboratorní kmeny Bacillus cereus CCM 1540, Bacillus spp. CCM 2954 dodané Českou sbírkou mikroorganismů v Brně ve formě želatinových disků.
48
4.2.2 Chemikálie K přípravě kultivačních médií a roztoků byly použity následující chemikálie: Žloutková emulze Žloutková emulze s teluričitanem draselným Polymyxin B Fyziologický roztok 4.2.3 Kultivační média a roztoky Selektivní agar pro stanovení Bacillus cereus dle MOSSELA (MYP agar) MERCK (Německo) pepton z kaseinu
10,0 g/950 ml
hovězí extrakt
1,0 g/950 ml
d(-) mannitol
1,0 g/950 ml
chlorid sodný
10,0 g/950 ml
fenolová červeň
0,025 g/950 ml
agar
12,0 g/950 ml
pH při 25°C
7,2 ± 0,2
Přípravek o navážce 46g rozpustíme v 900 ml destilované vody. Sterilizujeme při 121 °C po dobu 20 min. Ochladíme na 50 – 45 °C a přidáme 100 ml sterilní žloutkové emulze a 1ml Polymixin B Selective Supplement.
Bacillus Cereus Agar Base (Himedia, Indie) masový pepton
1g
mannitol
10 g
chlorid sodný
2g
síran hořečnatý
0,10 g
hydrogenfosforečnan (di)sodný
2,50 g
dihydrogenfosforečnan draselný
0,25 g
pyrohroznan sodný
10 g
bromthymolová modř
0,12 g
49
agar
15,0 g
pH
7,2 ± 0,2
Živnou půdu o navážce 20,5 g rozpustíme ve 475 ml destilované vody a zahříváme do úplného rozpuštění. Sterilizujeme v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min. Následně médium ochladíme na teplotu 50 °C a asepticky přidáme 1 lahvičku Polymyxin B Selective Supplement a 25 ml sterilní žloutkové emulze.
Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC) NOACK (Francie) polypepton
5g
glukóza
10 g
hydrogenfostorečnan didraselný
1g
síran hořečnatý
0,5 g
dichloran
0,002 g
bengálská červeň
0,025 g
chloramfenikol
0,05 g
chlortetracyklin chlorhydrát
0,05 g
síran zinečnatý
0,01 g
síran měďnatý
0,005 g
tergitol
1g
bakteriologický agar
12,4 g
pH při 25 °C
5,6 ± 0,2
Přípravek o navážce 30,0 g rozpustíme v 1 litru destilované vody. Pomalu přivedeme k varu a mícháme do úplného rozpuštění přípravku. Sterilizujeme v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min. Pak zchladíme na 50 – 45 °C. Fyziologický roztok (dle Ringera) chlorid sodný
2,25 g
chlorid draselný
0,105 g
chlorid vápenatý
0,12 g
50
hydrogenuhličitan sodný
0,05 g
Jedna tableta se rozpustí v 500 ml destilované vody a sterilizuje se v autoklávu při 121 °C po dobu 20 min.
4.2.4 Přístroje a pomůcky laboratorní váhy, 220 A (Schoeller instruments, Praha, ČR) vodní lázeň, Julabo TW 20 (Schoeller instruments, Praha, ČR) horkovzdušný sterilizátor, D-91126, Memmert (Germany) autokláv, Sanyo MLS-3750/3780 (Schoeller instuments, Praha, ČR) myčka, G 7883. Miele professional, (Labor, Brno) lednice, Liebherr, 7082218-01, (Germany) Biohazard, ME-2880C (Schoeller instuments, Praha, ČR) termostat, Sanyo, (Schoeller instruments, Praha, ČR) homogenizátor bakmixer 400, Greisinger electronic gmbh (Německo) vortex VELT Scientscifica (USA) automatická mikropipeta odečítačka kolonií bakterií LKB 2002 (Polsko) běžné laboratorní sklo, laboratorní materiál a pomůcky
4.3 Příprava materiálu 4.3.1 Příprava laboratorních pomůcek Laboratorní sklo používané při rozborech bylo sterilizováno v horkovzdušném sterilizátoru při 165 °C po dobu 60 min. Erlenmayerovy baňky s živnými půdami a zkumavky s destilovanou vodou byly sterilizovány v parním sterilizátoru při 121 °C 20 min. 4.3.2
Způsob odběru a zpracování vzorků Vzorky polévek pro mikrobiologickou analýzu byly zakoupeny v tržní síti ČR.
Analýza vzorků byla prováděna na začátku a na konci doby minimální trvanlivosti. Odběr vzorků proběhl v souladu s Vyhláškou č. 211/2004 Sb., o metodách zkoušení a způsobu odběru a přípravy kontrolních vzorků § 3. 51
Při odběru vzorků byly použity vždy sterilní nástroje. 10 g vzorku bylo smícháno s 90 ml sterilního fyziologického roztoku a důkladně zhomogenizováno ve stomacheru. Poté byly takto připravené vzorky pro stanovení kvasinek a plísní jednotlivě napipetovány po 10 ml do zkumavek (tzv. desetinné ředění). Poté byla každá polévka vyočkována na půdy v Petriho miskách, a to vždy na dvě misky. Poté byly zkumavky se vzorky vloženy do horké lázně, kde při 80 °C po dobu 10 min proběhla inaktivace vitálních buněk a aktivace germinace spor. 4.3.3 Mikrobiologické rozbory Mikrobiologické rozbory byly provedeny v souladu s příslušnými normami ČSN: ČSN EN ISO 8261 - všeobecné pokyny pro úpravu analytických suspenzí a desetinásobných ředění pro mikrobiologické zkoušení. ČSN ISO 7954 - Plísně a kvasinky. ČSN ISO 7932 - všeobecné pokyny pro stanovení počtu presumptivního Bacillus cereus. Technika počítání kolonií vykultivovaných při 30 °C. ČSN EN 15784 - Krmiva - Izolace a stanovení počtu presumptivních bakterií rodu Bacillus. Inokulum bylo po inaktivaci zchlazeno a očkováno pomocí metody přelivu a roztěru na Petriho misky, zalito živnou půdou a pečlivě s živnou půdou promícháno. Agar se nechal zatuhnout na vodorovné ploše. Následně byly polévky uvařeny podle návodu výrobce a ponechány přirozeně chladnout při pokojové teplotě po dobu 0, 30, 60, 90 a 120 min. V těchto časových intervalech bylo vždy odebráno 0,1 ml a 1 ml inokula a očkováno na příslušné živné půdy. Kultivace mikroorganismů probíhala pro rod Bacillus při 30 °C po dobu 48 h aerobně, druh Bacillus cereus při 30 °C po dobu 48 h aerobně a plísně a kvasinky při 25 °C 72 h aerobně. Mikrobiologický rozbor výše popsaných vzorků polévek byl proveden v mikrobiologické laboratoři Ústavu technologie potravin Mendelovy univerzity v Brně.
52
4.3.4 Vyjadřování výsledků Ze dvou stanovení počtu mikroorganismů byl vypočítán aritmetický průměr, a pokud to bylo nutné, byly zohledněny počty mikroorganismů na kontrolních miskách. K výpočtu byly použity ty naočkované půdy, kde vyrostlo 30 až 300 kolonií. Vzorky byly počítány na počítačce kolonií. Výsledky byly zpracovány a vyčísleny pro 1 ml vzorku. 4.3.5 Mikroskopie a biochemické testy Pro mikroskopii a biochemické testování bylo z vybraných Petriho misek odebráno vždy 5 suspektních kolonií. Tyto kolonie byly na Petriho miskách 3x přečištěny. 4.3.6 Oživování kultur z želatinových disků 1) Byly připraveny šikmé agary se speciálními médii (viz níže) 2) Lahvička se želatinovými disky byla vyjmuta a z chladničky (4 °C) ponechána 10 min při pokojové teplotě, aby při otevření nedošlo ke kondenzaci vody v lahvičce. 3) Vyžíhanou lehce teplou očkovací jehlou byl disk přenesen do kondenzační vody na dně šikmého agaru. 4) Inkubace 1- 4 h při optimální teplotě. 5) Nakloněním zkumavky a pozvolným pohybem stekla suspenze buněk po celém povrchu šikmého agaru. 6) Inkubace byla provedena při optimální teplotě, zpravidla 24 – 48 h. Druhý den byly narostlé bakteriální buňky přeočkovány (pro kontrolu čistoty kultury) křížovým roztěrem na Petriho misky se selektivní živnou půdou Bacillus Cereus Agar Base (Himedia, Indie) a MYP (Merck, Německo) a kultivace proběhla aerobně při 30 °C po dobu 24 h. 4.3.7 Příprava preparátů buněk sbírkových a terénních kmenů barvených podle Grama 1) čisté podložní sklíčko bylo ožehnuto nad plamenem kahanu a na něj kápnuta kapka destilované vody nebo fyziologického roztoku.
53
2) Vyžíhanou ochladlou očkovací kličkou byl sterilně odebrán vzorek bakteriálního kmene a přenesen do kapky na podložním skle. V kapce byl vzorek rozmíchán a pečlivě rozetřen po podložním skle. 3) Fixace byla provedena teplem tak, že podložní sklo bylo několikrát protaženo nad plamenem kahanu do úplného zaschnutí vzorku. 4) Podložní sklíčko bylo ponořeno do zkoumadla s roztokem krystalové violeti po dobu 20 s. Vyjmuto ven a opláchnuto pod proudem vody. 5) Podložní sklíčko ponoříme do zkoumadla s lugolovým roztokem po dobu 20 s. Vyjmuto ven a opláchnuto pod proudem vody. 6) Podložní sklíčko bylo ponořeno do zkoumadla s roztokem acetonu po dobu 20 s. Vyjmuto ven a opláchnuto pod proudem vody. 7) Podložní sklíčko bylo ponořeno do zkoumadla s roztokem karbolfuchsinu po dobu 1 min. Vyjmuto ven a opláchnuto pod proudem vody. 8) Sklíčko bylo usušeno volně na vzduchu. 9) Bylo provedeno mikroskopování. 4.3.8 Negativní barvení 1. Barvení Nigrosinem: Kultury bakterií se očkovací kličkou suspendovali v kapce vody na sklíčku a přidala se kapka nigrosinu. Promíchá se pomocí druhého krycího sklíčka. Preparát byl ponechán uschnout volně na vzduchu a mikroskopován. 2. Barvení Kongo-červení: Na sklíčko se kápla kapka Kongo-červeně a přímo v ní se suspendovaly buňky. Suspenze se rozetřela po povrchu sklíčka a nechala zaschnout. Dále byla převrstvena na několik sekund HCl, preparát byl osušen, dosušen na vzduchu a mikroskopován. 4.3.9 Barvení spor 1) Běžným způsobem byl připraven preparát, který se po uschnutí fixuje v plamenu. 2) Nátěr byl převrstven malachitovou zelení a zahříván nad kahanem do výstupu par, potom za stálého přihřívání bylo doplňováno barvivo po dobu 5 min. 3) Následně byl preparát opláchnut vodou a dobarven Kongo-červení. 4) Preparát byl znovu opláchnut a dosušen na vzduchu.
54
5) Uschlý preparát byl mikroskopován s pomocí imerzního oleje při zvětšení 17x100. Spory byly obarveny zeleně a zbylý buněčný obsah červeně. 4.3.10 Důkaz produkce katalázy Na podložní sklíčko kápneme 3% peroxid vodíku a do kapky kličkou rozetřeme testovanou 24-hodinovou kulturu z agarové plotny. Pozitivní reakce se projeví uvolňováním bublinek O2 bezprostředně po přidání kultury. 4.3.11 Test na zkvašování manitolu Do příslušné selektivní živné půdy byl naočkován 1 ml suspenze rodu Bacillus a B. cereus dle McFarlandovy stupnice č. 2. Po utuhnutí media byl pod povrch agaru sterilní pinzetou vtlačen disk napuštěný minitolem (HiMedia, Indie). 4.3.12 Test na utilizaci citrátu Citrátový test dle Simmonse je zkumavkovým testem a provádí se na šikmém agaru. Připravené inokulum bakteriální kultury bylo naočkováno vlnovkou na šikmý agar. Zkumavky byly inkubovány otevřené při teplotě 30 °C 4 dny. Původní barva testovacího média byla zelená (pH 6,9). Při pozitivní reakci bakteriální kultura roste a dochází ke změně barvy indikátoru na intenzivní modré zbarvení. Negativní reakce není provázena růstem a změnou barvy média.
Obrázek 9 test na utilizaci citrátu – modrá = pozitivní test, zelená = negativní test (http://academic.missouriwestern.edu/jcbaker/images/citrate.jpg)
55
4.3.13 Voges-Proskauerův test (VP test) VP test je určen pro rychlou detekci produkce acetoinu. Z čisté kultury testovaného kmene byla připravena suspenze (zákalová stupnice č. 2 dle McFarlanda) ve zkumavce s 1 ml sterilního fyziologického roztoku. Následně byl do suspenze vložen testovací proužek VP testu a inkubován v termostatu při teplotě 37 °C po dobu 2 h. Po uplynutí inkubační doby byly k suspenzi přikápnuty 3 kapky činidla VPT I a činidla VPT II. Zkumavky byly protřepány a opětovně inkubovány při 37 °C po dobu 30 min. Následně byl test na detekci tvorby acetoinu vyhodnocen pomocí výsledné barevné reakce. Přítomnost acetoinu byla detekována pomocí červeného zbarvení.
Obr. 10 VP test – červené zbarvení značí přítomnost acetoinu (http://people.uleth.ca/~selibl/Biol3200/BiochTests/VogesPros.html)
4.3.14 Test na tvorbu β-hemolýzy Spolu s typickou morfologií kolonií na selektivně-diagnostických půdách se posuzuje tvorba úplné hemolýzy na krevním agaru.
4.4 Statistické vyhodnocení Chemické a mikrobiologické ukazatele byly měřeny ve dvou opakováních u každého vzorku polévky. Průměry z těchto dvou měření byly použity ve statistickém vyhodnocení. Program Statistica 8 (StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA) byl použit pro výpočet základních statistických charakteristik, regresí (včetně testování lineární a kvadra-
56
tické funkce), rozdílů mezi soubory jednotlivých polévek v počtu mikrobiálních kolonií (jednostupňové třídění analýzy rozptylu, včetně post hoc Duncanova testu).
5
VÝSLEDKY
5.1 Mikrobiologická analýza vzorků polévek na vaření a jejich statistické vyhodnocení Pro analýzu bylo vybráno šest druhů polévek (hrachová, francouzská, čočková, rajská, s játrovými knedlíčky, gulášová), každý druh vždy od tří výrobců. Byl stanovován rod Bacillus, Bacillus cereus a plísně a kvasinky. 5.1.1 Polévka hrachová
Obr. 11 Srovnání počtu Bacillus spp. v polévkách na vaření hrachových ve vzorku 1, vzorku 2, vzorku 3 v jednotlivých časových intervalech odběru 0, 30, 60, 90, 120 min na začátku a na konci DMT. Bacillus spp. vzorek 1 – začátek DMT:
y= 1,4 + 0,008x - 0,00003x2, R2 = 0,97, p < 0,05
Bacillus spp. vzorek 1 – konec DMT:
y= 1,5 + 0,008x - 0,00003x2, R2 = 0,97, p < 0,05
Bacillus spp. vzorek 2 – začátek DMT:
y= 1,8 + 0,004x - 0,00001x2, R2 = 0,97, p < 0,05
Bacillus spp. vzorek 2 – konec DMT:
y= 1,8 + 0,005x - 0,00001x2, R2 = 0,96, p < 0,05
Bacillus spp. vzorek 3 – začátek DMT:
y= 1,1 + 0,01x - 0,00005x2, R2 = 0,98, p < 0,05
Bacillus spp. vzorek 3 – konec DMT:
y= 1,2 + 0,007x - 0,00001x2, R2 = 0,69, p < 0,05
57
Obr. 12 Srovnání počtu plísní a kvasinek v polévkách na vaření hrachových ve vzorku 1, vzorku 2, vzorku 3 v jednotlivých časových intervalech odběru 0, 30, 60, 90, 120 min na začátku a na konci DMT. Plísně a kvasinky vzorek 1 – začátek DMT: y= 1,4 + 0,001x + 0,00002x2, R2 = 0,85, p > 0,05 Plísně a kvasinky vzorek 1 – konec DMT: y= 1,8 + 0,001x + 0,000009x2, R2 = 0,5, p > 0,05 Plísně a kvasinky vzorek 2 – začátek DMT: y= 1,1 + 0,007x - 0,00003x2, R2 = 0,95, p > 0,05 Plísně a kvasinky vzorek 2 – konec DMT: y= 1,9 - 0,00007x + 0,000001x2, R2 = -0,26, p > 0,05 Plísně a kvasinky vzorek 3 – konec DMT: y= 1,6 + 0,0009x - 0,00001x2, R2 = 0,47, p > 0,05
V těchto
vzorcích
hrachových
polévek
byla
stanovena
přítomnost
mikroorganismů ( dále jen MO) rodu Bacillus i plísní a kvasinek. Z Obr. 11 vyplývá, že i když u všech vzorků docházelo ve sledovaných časových intervalech (0, 30, 60, 120 min) ke statisticky průkaznému (p < 0,05) postupnému navyšování počtu bakterií rodu Bacillus, nebyly v žádném z nich překročeny hodnoty 101 až 102 KTJ/g. Naproti tomu mezi počtem bakterií rodu Bacillus na začátku a na konci DMT statisticky průkazný rozdíl nebyl (p > 0,05). U sledovaných plísní a kvasinek na Obr. 12 nedocházelo ve sledovaných časových intervalech ke statisticky průkaznému navyšování těchto MO, zatímco počty detekovaných MO na začátku a na konci DMT se statisticky průkazně lišily (p < 0,05). U vzorku 3 byly plísně a kvasinky detekovány až na konci DMT. Tato skutečnost může poukazovat na sekundární kontaminaci během skladování.
58
5.1.2 Polévka francouzská
Obr. 13 Srovnání počtu Bacillus spp. v polévkách na vaření francouzských ve vzorku 1, vzorku 2, vzorku 3 v jednotlivých časových intervalech odběru 0, 30, 60, 90, 120 min na začátku a na konci DMT. Bacillus spp. vzorek 1 – začátek DMT:
y= 1,2 + 0,01x - 0,00004x2, R2 = 0,97, p < 0,05
Bacillus spp. vzorek 1 – konec DMT:
y= 1,3 + 0,01x - 0,00004x2, R2 = 0,92, p < 0,05
Bacillus spp. vzorek 2 – začátek DMT:
y= 0,8 + 0,004x - 0,00007x2, R2 = 0,98, p < 0,05
Bacillus spp. vzorek 2 – konec DMT:
y= 0,9 + 0,01x - 0,00006x2, R2 = 0,89, p < 0,05
Bacillus spp. vzorek 3 – začátek DMT:
y= 1,7 + 0,004x - 0,000001x2, R2 = 0,99, p < 0,05
Bacillus spp. vzorek 3 – konec DMT:
y= 1,7 + 0,007x - 0,00002x2, R2 = 0,99, p < 0,05
Obr. 14 Srovnání počtu plísní a kvasinek v polévkách na vaření francouzských ve vzorku 1 a vzorku 2 v jednotlivých časových intervalech odběru 0, 30, 60, 90, 120 min na začátku a na konci DMT. Plísně a kvasinky vzorek 1 – začátek DMT: y= 1,4 + 0,002x - 0,000003x2, R2 = 0,92, p > 0,05
59
Plísně a kvasinky vzorek 1 – konec DMT: y= 1,4 + 0,002x - 0,000003x2, R2 = 0,80, p > 0,05 Plísně a kvasinky vzorek 2 – začátek DMT: y= 1,1 + 0,02x - 0,000005x2, R2 = 0,84, p > 0,05 Plísně a kvasinky vzorek 2 – konec DMT: y= 1,9 + 0,00003x + 0,00001x2, R2 = - 0,29, p > 0,05
Tyto vzorky francouzských polévek vykazovaly přítomnost rodu Bacillus a plísní a kvasinek. Z Obr. 13 vyplývá, že u všech tří vzorků docházelo ve sledovaných časových intervalech ke statisticky průkaznému (p < 0,05) postupnému navyšování počtu bakterií rodu Bacillus, v žádném z nich ale nebyly překročeny hodnoty 101 až 102 KTJ/g. Při posouzení počtu bakterií rodu Bacillus na začátku a na konci DMT nebyl shledán statisticky průkazný rozdíl (p > 0,05). Plísně a kvasinky (viz Obr. 14) se vyskytly pouze u vzorku 1 a 2, vzorek 3 nevykazoval jejich přítomnost ani na záčátku ani na konci DMT. U vzorků 1 a 2 na začátku a na konci sledovaných časových intervalů ke statisticky průkaznému navyšování těchto MO nedocházelo (p > 0,05), počty detekovaných MO se na začátku a na konci DMT statisticky průkazně lišily (p < 0,05) pouze u vzorku 2, u vzorku 1 tomu tak výjimečně nebylo. 5.1.3 Polévka čočková
Obr. 15 Srovnání počtu Bacillus spp. v polévkách na vaření čočkových ve vzorku 1, vzorku 2, vzorku 3 v jednotlivých časových intervalech odběru 0, 30, 60, 90, 120 min na začátku a na konci DMT. Bacillus spp. vzorek 1 – začátek DMT:
y= 0,6 + 0,03x - 0,0001x2, R2 = 0,94, p < 0,05
Bacillus spp. vzorek 1 – konec DMT:
y= 0,8 + 0,02x - 0,00008x2, R2 = 0,88, p < 0,05
Bacillus spp. vzorek 2 – začátek DMT:
y= 1,3 + 0,006x + 0,00003x2, R2 = 0,66, p < 0,05
60
Bacillus spp. vzorek 2 – konec DMT:
y= 1,4 + 0,01x - 0,00004x2, R2 = 0,98, p < 0,05
Bacillus spp. vzorek 3 – začátek DMT:
y= 1,5 + 0,008x - 0,00003x2, R2 = 0,97, p < 0,05
Bacillus spp. vzorek 3 – konec DMT:
y= 1,6 + 0,007x - 0,00002x2, R2 = 0,91, p < 0,05
Obr. 16 Srovnání počtu plísní a kvasinek v polévkách na vaření čočkových ve vzorku 1a vzorku 2 v jednotlivých časových intervalech odběru 0, 30, 60, 90, 120 min na začátku a na konci DMT. Plísně a kvasinky vzorek 1 – začátek DMT: y= 0,1 + 0,02x - 0,0001x2, R2 = 0,84, p > 0,05 Plísně a kvasinky vzorek 1 – konec DMT: y= 1,84 + 0,002x - 0,000002x2, R2 = - 0,23, p > 0,05 Plísně a kvasinky vzorek 2 – konec DMT: y= 1,9 + 0,00002x + 0,000005x2, R2 = - 0,12, p >0,05
Ve vzorcích čočkových polévek byly opět detekovány rod Bacillus, plísně a kvasinky. U všech tří vzorků na Obr. 15 docházelo ve sledovaných časových intervalech ke statisticky průkaznému (p < 0,05) navyšování počtu bakterií rodu Bacillus, v žádném vzorku zase nebyly překročeny hodnoty 101 až 102 KTJ/g. Rozdíl mezi počtem bakterií rodu Bacillus na začátku a na konci DMT ale statisticky průkazný nebyl (p > 0,05). Plísně a kvasinky (Obr. 16) u vzorku 3 nebyly detekovány vůbec, ve vzorku 2 pouze na konci DMT a na začátku a na konci DMT byly detekovány pouze ve vzorku 1, kde byl statisticky průkazný rozdíl v počtu MO (p < 0,05). Ovšem při porovnání hodnot vzorku 1 získaných na začátku časového limitu a na konci byl rozdíl statisticky neprůkazný (p > 0,05). Výskyt kvasinek a plísní ve vzorku 2 na konci DMT lze přičíst na vrub sekundární kontaminaci.
61
5.1.4 Polévka rajská
Obr. 17 Srovnání počtu Bacillus spp. v polévkách na vaření rajských ve vzorku 1, vzorku 2, vzorku 3 v jednotlivých časových intervalech odběru 0, 30, 60, 90, 120 min na začátku a na konci DMT. Bacillus spp. vzorek 1 – začátek DMT:
y= 1,8 + 1,004x - 0,00002x2, R2 = 0,92, p < 0,05
Bacillus spp. vzorek 1 – konec DMT:
y= 1,8 + 0,003x + 0,000004x2, R2 = 0,95 p < 0,05
Bacillus spp. vzorek 2 – začátek DMT:
y= 0,6 + 0,02x - 0,00006x2, R2 = 0,96, p < 0,05
Bacillus spp. vzorek 2 – konec DMT:
y= 0,9 + 0,01x - 0,00004x2, R2 = 0,89, p < 0,05
Bacillus spp. vzorek 3 – začátek DMT:
y= 0,8 + 0,02x - 0,00006x2, R2 = 0,97, p < 0,05
Bacillus spp. vzorek 3 – konec DMT:
y= 0,9 + 0,02x - 0,00007x2, R2 = 0,87, p < 0,05
Obr. 18 Srovnání počtu B. cereus v polévkách na vaření rajských ve vzorku 2 v jednotlivých časových intervalech odběru 0, 30, 60, 90, 120 min na začátku a na konci DMT. Bacillus cereus vzorek 2 – začátek DMT: y= 0,2 + 0,02x - 0,00008x2, R2 = 0,97, p < 0,05
62
Bacillus cereus vzorek 2 – konec DMT:
y= 0,4 + 0,02x - 0,00006x2, R2 = 0,95, p < 0,05
Obr. 19 Srovnání počtu plísní a kvasinek v polévkách na vaření rajských ve vzorku 1 a vzorku 2 v jednotlivých časových intervalech odběru 0, 30, 60, 90, 120 min na začátku a na konci DMT. Plísně a kvasinky vzorek 1 – začátek DMT: y= 1,5 + 0,004x - 0,00002x2,
R2 = 0,86, p > 0,05
Plísně a kvasinky vzorek 1 – konec DMT: y= 1,8+ 0,003x - 0,000003x2,
R2 = 0,09, p > 0,05
Plísně a kvasinky vzorek 2 – začátek DMT: y= 1,3 + 0,0008x + 0,000002x2,
R2 = 0,43, p >0,05
Plísně a kvasinky vzorek 2 – konec DMT: y= 1,9 + 0,00009x - 0,000001x2,
R2 = - 0,19, p >0,05
V rajských polévkách byly stejně jako v předešlých polévkách stanoveny rod Bacillus s plísněmi a kvasinkami, navíc byl ale ve vzorku 2 detekován i Bacillus cereus. Rod Bacillus i B. cereus na Obr. 17 a Obr. 18 se v průběhu časových intervalů významně statisticky pomnožovaly (p < 0,05), nikdy však nárůst nepřevyšoval hodnoty dané vyhláškou č. 132/2004 Sb. (104 - 105 KTJ/g), tudíž by zdraví konzumenta nemělo být ohroženo. Rozdíl v nárůstu MO na začátku a na konci DMT nebyl stastisticky průkazný (p > 0,05). Kvasinky a plísně byly detekovány ve vzorku 1 a 2, a to na začátku i na konci DMT (viz Obr. 19). V časových intervalech nebyl shledán statisticky průkazný rozdíl v nárůstu MO (p > 0,05), na rozdíl od statisticky průkazného rozdílu (p < 0,05) v počtu MO na začátku a konci DMT. Vzorek rajské polévky číslo 3 plísně a kvasinky neobsahoval.
63
5.1.5 Polévka s játrovými knedlíčky
Obr. 20 Srovnání počtu Bacillus spp. v polévkách na vaření s játrovými knedlíčky ve vzorku 1, vzorku 2, vzorku 3 v jednotlivých časových intervalech odběru 0, 30, 60, 90, 120 min na začátku a na konci DMT. Bacillus spp. vzorek 1 – začátek DMT:
y= 1,4 + 0,008x - 0,00002x2,
R2 = 0,99, p < 0,05
Bacillus spp. vzorek 1 – konec DMT:
y= 1,5 + 0,006x - 0,000009x2,
R2 = 0,87 p < 0,05
Bacillus spp. vzorek 2 – začátek DMT:
y= 1,1 + 0,01x - 0,00003x2,
R2 = 0,99, p < 0,05
Bacillus spp. vzorek 2 – konec DMT:
y= 1,2 + 0,008x - 0,00002x2,
R2 = 0,92, p < 0,05
Bacillus spp. vzorek 3 – začátek DMT:
y= 1,4 + 0,007x - 0,000022,
R2 = 0,99, p < 0,05
Bacillus spp. vzorek 3 – konec DMT:
y= 1,5 + 0,006x - 0,00006x2,
R2 = 0,89, p < 0,05
64
Obr. 21 Srovnání počtu B. cereus v polévkách na vaření s játrovými knedlíčky ve vzorku 2 v jednotlivých časových intervalech odběru 0, 30, 60, 90, 120 min na začátku a na konci DMT. Bacillus cereus vzorek 2 – začátek DMT: y= 0,3 + 0,01x - 0,00004x2, R2 = 0,98, p < 0,05 Bacillus cereus vzorek 2 – konec DMT:
y= 0,5 + 0,009x - 0,000009x2, R2 = 0,97, p < 0,05
Obr. 22 Srovnání počtu plísní a kvasinek v polévkách na vaření s játrovými knedlíčky ve vzorku 1, vzorku 2, vzorku 3 v jednotlivých časových intervalech odběru 0, 30, 60, 90, 120 min na začátku a na konci DMT. Plísně a kvasinky vzorek 1 – konec DMT: y= 1,6+ 0,0003x - 0,000001x2,R2 = 0,17, p > 0,05 Plísně a kvasinky vzorek 2 – konec DMT: y= 1,7 + 0,0001x - 0,000002x2, R2 = -0,12, p >0,05 Plísně a kvasinky vzorek 3 – konec DMT: y= 1,4 + 0,001x - 0,00001x2, R2 = - 0,36, p >0,05
65
V polévkách s játrovými knedlíčky byly stejně jako v rajských polévkách stanoveny rod Bacillus, plísně a kvasinky i Bacillus cereus, který byl opět ve vzorku 2. Rod Bacillus i B. cereus se na Obr. 20 a Obr. 21 v průběhu časových intervalů významně statisticky pomnožovaly (p < 0,05), nárůst ale nepřevyšoval hodnoty dané vyhláškou č. 132/2004 Sb. (104 - 105 KTJ/g). Rozdíl v nárůstu těchto MO na začátku a na konci DMT nebyl stastisticky průkazný (p > 0,05). Kvasinky a plísně byly zjištěny ve všech vzorcích, ale pouze na konci DMT (viz Obr. 22), což poukazuje na sekundární kontaminaci během skladování. Ve sledovaných časových intervalech na konci DMT nebyl shledán statisticky průkazný rozdíl v nárůsu MO (p > 0,05). 5.1.6 Polévka gulášová
Obr. 23 Srovnání počtu Bacillus spp. v polévkách na vaření gulášových ve vzorku 1, vzorku 2, vzorku 3 v jednotlivých časových intervalech odběru 0, 30, 60, 90, 120 min na začátku a na konci DMT. Bacillus spp. vzorek 1 – začátek DMT:
y= 1,2 + 0,01x - 0,00004x2, R2 = 0,98, p < 0,05
Bacillus spp. vzorek 1 – konec DMT:
y= 1,3 + 0,009x - 0,00003x2, R2 = 0,97 p < 0,05
Bacillus spp. vzorek 2 – začátek DMT:
y= 1,3 + 0,008x - 0,00003x2, R2 = 0,99, p < 0,05
Bacillus spp. vzorek 2 – konec DMT:
y= 1,4 + 0,006x - 0,00002x2, R2 = 0,92, p < 0,05
Bacillus spp. vzorek 3 – začátek DMT:
y= 1,7 + 0,005x - 0,000022, R2 = 0,99, p < 0,05
Bacillus spp. vzorek 3 – konec DMT:
y= 1,8 + 0,004x - 0,00001x2, R2 = 0,95, p < 0,05
66
Obr. 24 Srovnání počtu B. cereus. v polévkách na vaření gulášových ve vzorku 1 a vzorku 2 v jednotlivých časových intervalech odběru 0, 30, 60, 90, 120 min na začátku a na konci DMT. Bacillus cereus vzorek 1 – začátek DMT: y= 0,4 + 0,02x - 0,00005x2, R2 = 0,98, p < 0,05 Bacillus cereus vzorek 1 – konec DMT:
y= 0,3 + 0,02x - 0,00007x2, R2 = 0,87, p < 0,05
Bacillus cereus vzorek 2 – začátek DMT: y= 0,8 + 0,01x - 0,00003x2, R2 = 0,98, p < 0,05 Bacillus cereus vzorek 2 – konec DMT:
y= 0,9 + 0,009x - 0,00002x2, R2 = 0,97, p < 0,05
Obr. 25 Srovnání počtu plísní a kvasinek v polévkách na vaření gulášových ve vzorku 1 a vzorku 2 v jednotlivých časových intervalech odběru 0, 30, 60, 90, 120 min na začátku a na konci DMT. Plísně a kvasinky vzorek 1 – začátek DMT:
y= 1,1+ 0,002x + 0,000004x2, R2 = 0,96, p > 0,05
Plísně a kvasinky vzorek 1 – konec DMT:
y= 1,9 - 0,0001x + 0,000001x2, R2 = - 0,22, p > 0,05
67
Plísně a kvasinky vzorek 2 – začátek DMT:
y= 0,8 + 0,008x - 0,00003x2, R2 = 0,90, p > 0,05
Plísně a kvasinky vzorek 2 – konec DMT:
y= 1,9 - 0,002x + 0,00001x2, R2 = 0,62, p > 0,05
V gulášových polévkách byly stejně jako v polévkách rajských a s játrovými knedlíčky stanoveny rod Bacillus, plísně a kvasinky a Bacillus cereus, který byl dokonce přítomen ve vzorku 1 i 2. Rod Bacillus i B. cereus se na Obr. 23 a Obr. 24 v průběhu časových intervalů významně statisticky pomnožovaly (p < 0,05), nárůst opět nepřevyšoval hodnoty dané vyhláškou č. 132/2004 Sb. (104 - 105 KTJ/g), Rozdíl v nárůstu těchto MO na začátku a na konci DMT nebyl stastisticky průkazný (p > 0,05). Kvasinky a plísně byly zjištěny ve vzorcích 1 a 2 na začátku i na konci DMT (viz Obr. 25), vzorek 3 nebyl kontaminován. Ve sledovaných časových intervalech nebyl shledán statisticky průkazný rozdíl v nárůsu MO (p > 0,05), naproti tomu rozdíl v počtu MO na začátku a na konci DMT byl statisticky průkazný (p < 0,05).
5.2 Mikrobiologická analýza instantních polévek (na zalití) a jejich statistické vyhodnocení Pro analýzu instantních polévek – na zalití bylo vybráno pět druhů: s játrovými knedlíčky, francouzská, gulášová, hrášková, čočková, a to od jedné značky, ve kterých se stanovovaly: rod Bacillus, Bacillus cereus, plísně a kvasinky. 5.2.1 Instantní polévka s játrovými knedlíčky
Obr. 26 stanovení Bacillus spp. v instantní polévce s játrovými knedlíčky v časovém intervalu 0 a 30 min. Bacillus spp.:
y= 1,2 + 0,01x, R2 = 0,98, p < 0,05
68
Z obr. Obr. 26 lze vyčíst, že v instantní polévce s játrovými knedlíčky byl detekován pouze rod Bacillus, který své množství po 30 minách statisticky významně zvýšil (p < 0,05), i přes tuto skutečnost se jeho hodnoty pohybovaly maximálně 101 KTJ/g a tudíž neznamenají pro kunzumenta žádné zdravotní riziko. 5.2.2 Instantní polévka francouzská
Obr. 27 Srovnání počtu Bacillus spp. a plísní a kvasinek v instantní polévce francouzské v časovém intervalu 0 a 30 min. Bacillus spp.:
y= 1,1 + 0,02x, R2 = 0,99, p < 0,05
Plísně a kvasinky:
y= 0,2 + 0,01x, R2 = 0,14, p > 0,05
U polévky instantní francouzské je z Obr. 27 patrné, že zde byl přítomen rod Bacillus i plísně a kvasinky. Zatímco u rodu Bacillus docházelo ve sledovaném časovém horizontu ke statisticky průkaznému nárůstu (p < 0,05) těchto bakterií, plísně a kvasinky své počty statisticky průkazně (p > 0,05) nezvýšily.
69
5.2.3 Instantní polévka gulášová
Obr. 28 Srovnání počtu Bacillus spp., B. cereus a plísní a kvasinek v instantní polévce gulášové v časovém intervalu 0 a 30 min. Bacillus spp.:
y= 1,9 + 0,006x, R2 = 0,85, p < 0,05
B. cereus:
y= 1,6 + 0,006x, R2 = 0,93, p < 0,05
Plísně a kvasinky: y= 0,7 + 0,005x, R2 = 0,41, p > 0,05
Graf na Obr. 28 ukazuje, že v instantní polévce gulášové se vyskytovaly jak rod Bacillus, tak i B. cereus a také plísně a kvasinky. Rod Bacillus a B. cereus se v závislosti na čase statisticky významně pomnožily (p < 0,05), nárůst kvasinek a plísní se projevil jako statisticky neprůkazný (p > 0,05). Ani zde nedochází u sledovaných MO, včetně B. cereus, jehož výskyt je v potravinách nežádoučí, k takovému pomnožení, aby konzumace této polévky zapříčinila zdravotní obtíže konzumentů.
70
5.2.4 Instantní polévka hrášková
Obr. 29 Srovnání počtu Bacillus spp., B. cereus a plísní a kvasinek v instantní polévce hráškové v časovém intervalu 0 a 30 min. Bacillus spp.:
y= 2,3+ 0,004x, R2 = 0,99, p < 0,05
B. cereus:
y= 2,5 + 0,003x, R2 = 0,99, p < 0,05
Plísně a kvasinky: y= 0,8 + 0,002x, R2 = 0,34, p > 0,05
V hráškové instantní polévce na Obr. 29 byly opět stanoveny všechny sledované MO. Rod Bacillus a B. cereus se v závislosti na čase statisticky významně pomnožily (p < 0,05), nárůst kvasinek a plísní se projevil jako statisticky neprůkazný (p > 0,05). Ani u této polévky nedochází u sledovaných MO k takovému pomnožení, aby konzumace této polévky zapříčinila zdravotní obtíže konzumentů.
71
5.2.5 Instantní polévka čočková
Obr. 30 Srovnání počtu Bacillus spp., B. cereus a plísní a kvasinek v instantní polévce čočkové v časovém intervalu 0 a 30 min. Bacillus spp.:
y= 0,4+ 0,03x, R2 = 0,99, p < 0,05
B. cereus:
y= 1,2 + 0,01x, R2 = 0,99, p < 0,05
Plísně a kvasinky: y= 0,8 + 0,007x, R2 = 0,34, p > 0,05
Také čočková instantní polévka na Obr. 30 obsahovala všechny sledované MO. Rod Bacillus a B. cereus se po 30 minách statisticky významně pomnožily (p < 0,05), nárůst kvasinek a plísní zůstal statisticky neprůkazný (p > 0,05). Ani u této polévky nedochází u sledovaných MO k takovému pomnožení, aby konzumace této polévky zapříčinila zdravotní obtíže konzumentů.
72
5.3 Porovnání počtů sledovaných mikroorganismů v jednotlivých variantách dehydratovaných polévek na vaření za celé sledované období
Obr. 31 Porovnání počtů sledovaných MO v jednotlivých variantách hrachové polévky za celé sledované období (12 - 18 měsíců). A, B, C – průměry označené různými písmeny se průkazně (p < 0,05) liší, průměry označené stejnými písmeny se průkazně neliší (p > 0,05), n = 8.
Z Obr. 31 je patrné, že nejnižší počty jak rodu Bacillus,tak plísní a kvasinek obsahoval vzorek značky 3, na rozdíl od značek 1 a 2. I když všechny polévky dodržely limitní hodnoty obou detekovaných MO, lze hrachovou polévku značky 3 doporučit z mikrobiologického hlediska jako nejlepší.
73
Obr. 32 Porovnání počtů sledovaných MO v jednotlivých variantách francouzské polévky za celé sledované období (12 - 18 měsíců). A, B, C – průměry označené různými písmeny se průkazně (p < 0,05) liší, průměry označené stejnými písmeny se průkazně neliší (p > 0,05), n = 8.
Z Obr. 32 vyplývá, že nejnižší počet rodu Bacillus obsahoval vzorek 1, oproti vzorkům polévek 2 a 3. Vzorek č. 3, ale neobsahoval žádné kvasinky a plísně. I když všechny polévky dodržely limitní hodnoty obou detekovaných MO, z hlediska kvality lze tedy doporučit polévku od výrobce 3.
Obr. 33 Porovnání počtů sledovaných MO v jednotlivých variantách čočkové polévky za celé sledované období (12 - 18 měsíců). A, B, C – průměry označené různými písmeny se průkazně (p < 0,05) liší, průměry označené stejnými písmeny se průkazně neliší (p > 0,05), n = 8.
74
Z Obr. 33 je zřejmé, že nejméně Bacillus spp. obsahuje polévka od výrobce 1, na druhou stranu obsahuje nejvíce plísní a kvasinek. Z tohoto hlediska opět doporučuji vzorek 3, protože výskyt plísní a kvasinek na rozdíl od přítomného rodu Bacillus, i když v normě, může znamenat produkci zdraví škodlivých mykotoxinů.
Obr. 34 Porovnání počtů sledovaných MO v jednotlivých variantách rajské polévky za celé sledované období (12 - 18 měsíců). A, B, C – průměry označené různými písmeny se průkazně (p < 0,05) liší, průměry označené stejnými písmeny se průkazně neliší (p > 0,05), n = 8.
Ve vzorcích rajské polévky na Obr. 34 byl rod Bacillus detekován nejvíce u značky 1, B. cereus byl stanoven pouze u značky 2, plísně a kvasinky byly stanoveny ve vzorcích značek 1 a 2, vzorek značky 3 je opět neobsahoval. Vzhledem k výskytu B. cereus u značky 2 je tato polévka nejméně vhodná pro konzumenty z hlediska zdravotní nezávadnosti, ačkoliv stanovený počet nepřesáhl limit vyhlášky č. 132/2004 Sb. Proto jako nejvhodnější rajskou polévku lze opět doporučit od výrobce č. 3.
75
Obr. 35 Porovnání počtů sledovaných MO v jednotlivých variantách polévky s játrovými knedlíčky za celé sledované období (12 - 18 měsíců). A, B, C – průměry označené různými písmeny se průkazně (p < 0,05) liší, průměry označené stejnými písmeny se průkazně neliší (p > 0,05), n = 8.
Ze vzorků polévek s játrovými knedlíčky na Obr. 35 lze vyčíst, že rod Bacillus byl stanoven nejvíce u značky 1, B. cereus byl stanoven opět pouze u značky 2, plísně a kvasinky byly stanoveny ve vzorcích všech značek. Vzhledem k výskytu B. cereus a naměřeným hodnotám plísní a kvasinek u značky 2 je tato polévka nejméně vhodná pro konzumenty z hlediska zdravotní nezávadnosti, ačkoliv v žádné z polévek nebyl přesáhnut limit vyhlášky č. 132/2004 Sb.
76
Obr. 36 Porovnání počtů sledovaných MO v jednotlivých variantách gulášové polévky za celé sledované období (12 - 18 měsíců). A, B, C – průměry označené různými písmeny se průkazně (p < 0,05) liší, průměry označené stejnými písmeny se průkazně neliší (P>0,05), n = 8.
Vzorky gulášových polévek od výrobců 1 a 2 obsahovaly všechny stanovované MO. Vzorky značky 1 obsahoval nejvíce Bacillus spp. a plísní a kvasinek, vzorky značky 2 obsahovaly nejvíce B. cereus. Vzorek 3 obsahoval sice nejvíce Bacillus spp., zato ale neobsahoval ani B. cereus, ani plísně a kvasinky, a tudíž ho opět doporučuji spotřebitelům jako nejvíce vyhovující výrobek ze sortimentu gulášových polévek.
77
6
DISKUSE Při výrobě dehydratovaných potravin bývá zpravidla převážná část mikroorga-
nismů zničena. Většina totiž vyžaduje pro růst hodnoty aw nad 0,90, a proto nehrají v kontaminaci dehydratovaných potravin významnou roli (JAY et al. 2005). Avšak některé mikroorganismy mohou tento technologický proces přežívat, obzvláště jsou-li použity nekvalitní suroviny. Významnými kontaminujícími mikroorganismy dehydratovaných potravin, konkrétně dehydratovaných polévek, jsou: Salmonella, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Enterobacteriaceae, Clostridium perfringens a plísně (AIIBP 2007). Tato práce byla zaměřena na vybrané vzorky dehydratovaných polévek od tří různých výrobců zakoupených v obchodní síti České republiky. V těchto vzorcích byly na počátku a na konci doby minimální trvanlivosti, jejíž délka se pohybovala mezi 12 18 měsíci, sledovány: rod Bacillus, druh Bacillus cereus a plísně a kvasinky. Vzorky byly pečlivě uzavřeny a skladovány dle doporučení výrobce při pokojové teplotě a v suchém prostředí. Výsledky mikrobiologických vyšetření jednotlivých vzorků byly vyjádřeny statisticky a uvedeny v grafech na obrázcích Obr. 11 až Obr. 36. U všech vzorků polévek na vaření byla již v nultém dni zjištěna přítomnost bakterií rodu Bacillus, a poté docházelo ve všech případech ke statisticky průkaznému zvyšování těchto bakterií v závislosti na čase (p < 0,05). Při porovnání počtu bakterií tohoto rodu na začátku a na konci doby minimální trvanlivosti se však počty těchto bakterií statisticky významně neměnily (p > 0,05). Všechny vzorky vykazovaly hodnoty těchto bakterií nižší než 101 – 102 KTJ/g. I když pro aerobní sporulující bakterie nejsou dány legislativní limity, je samozřejmě žádoucí jejich co možná nejnižší počet v potravině, protože výskyt těchto bakterií by mohl způsobit pozdější vady výrobků v průběhu skladování a jsou známy i případy, kdy byly původci alimentárních onemocnění vedle B. cereus i jiné druhy rodu Bacillus, jako např. B. licheniformis, B. subtilis či B. pumilus (EFSA 2005 GRANUM a BAIRD-PARKER 2000; SALKINOJASALONEN et al. 1999). Tato práce byla nejvíce zaměřena na výskyt druhu Bacillus cereus, protože některé jeho kmeny produkují diarhotické enterotoxiny a emetický toxin, které v nadlimitním množství vyvolávají alimentární onemocnění, jejichž symptomy jsou 78
hlavně zvracení a průjem (GRANUM 2001, MCKILLIP 2000). Průběh těchto onemocnění je většinou mírný a rychle odezní, jsou ale známy i případy s fatálními následky. Mahler (1997) popsal úmrtí chlapce kvůli selhání jater, jako následek účinku emetického toxinu. V této práci byla přítomnost B. cereus zjištěna u těchto vzorků polévek na vaření: rajská, s játrovými knedlíčky, gulášová. V instantních polévkách byl B. cereus detekován v gulášové, hráškové a čočkové. Jeho počty v polévkách na vaření se ve sledovaném časovém intervalu 0 – 120 min statisticky průkazně zvyšovaly (p < 0,05), ale ani v tomto případě hodnoty nenabývaly hodnot vyšších než 102 KTJ/g, čímž nebyly překročeny limitující hodnoty 104 – 105 KTJ/g(ml) dříve platné vyhlášky č. 132/2004 Sb. Při srovnání počtu bakterií druhu B. cereus na začátku a na konci doby minimální trvanlivosti nebyl prokázán statisticky významný rozdíl (p > 0,05), tudíž během skladování nedošlo v potravině k vyklíčení spor a pomnožení bakterií. Mezi rizikové ingredience dehydratovaných polévek, u nichž hrozí výskyt B. cereus a pro které by měla být dle AIIBP ve výrobním podniku zavedena hygienická kritéria, patří vařená a předvařená škrobnatá zelenina, brambory, čočka, fazole, kukuřice a rýže (AIIBP 2007). Doporučené hodnoty pro B. cereus v těchto surovninách jsou 104 – 105 KTJ/g. Z toho vyplývá, že výskyt B. cereus v polévce čočkové, hrachové a rajské není překvapivý, výrobci nicméně dodrželi hygienická kritéria. Podle dat poskytnutých výrobci dehydratovaných polévek Campbell Soup Company (2005 cit. dle AIIBP 2007) bylo u 98 % z více než 1500 vzorků sušených polévek, bujonů a omáčkových směsí detekováno méně než 103 KTJ bakterií B. cereus v gramu potraviny. Pouze jeden vzorek (zeleninový mix) obsahoval 13,4 × 104 KTJ/g. Takové hodnoty ve vzorcích analyzovaných v této práci nebyly detekovány, nicméně ani takové by nebyly dostačující pro vytvoření takového množství toxinů, které by způsobilo otravu. Infekční dávky se totiž pohybují mezi 105 až 109 KTJ/g (GRANUM. 2001; JAY et al. 2005; ARNESEN et al. 2008) Problematikou mikrobiologického profilu dehydratovaných polévek se také zabýval Fanelli et al. (1965 citovaný dle JAYE et al. 2005), který zjistil, že 17 různých druhů dehydratovaných polévek od devíti výrobců mělo CPM mezi 102 a 105 na g. Rehydratovaná cibulová polévka obsahovala průměrně 105 CPM/ml, s 103 KTJ/ml koliformních bakterií, 104 KTJ/ml aerobních sporulujících bakterií a 102 KTJ/ml kvasinek a plísní. 79
Catsaras et al. (1972 cit. dle AIIBP 2007) provedl pokus se 100 vzorky dehydratovaných polévek. Spory B. cereus přežily var polévky u 93 % vzorků, nejvyšší hodnota byla 6×103 KTJ/ml. Při ponechání polévek při pokojové teplotě 24 h se počet bacillů zvýšil na 106 KTJ/ml u 32 % vzorků, 7 % tyto hodnoty přesahovalo a některé vzorky obsahovaly 15× 106 KTJ/ml. Takové hodnoty počtu bakterií B. cereus už jsou nadlimitní a mohou tedy způsobit emetický či diarhotický syndrom. Zda by vzorky zkoumané v této práci dosáhly po 24 h skladování při pokojové teplotě také těchto vysokých hodnot, lze jen spekulovat. Výskyt B. cereus je obzvláště nežádoucí u instantních polévek, neboť tepelnou úpravou zde není vaření, ale pouhé zalití vroucí vodou, což většina spor bez problémů přežívá, a při následném chladnutí polévky klíčí ve vegetativní buňky schopné rychlého množení a produkce toxinů. Nejohroženějšími skupinami konzumentů jsou vnímaví jedinci – malé děti, starší lidé a imunokompromitované osoby (GRANUM 2001, ADLER 2005, DANCER et al. 2002). Plísně představují jedno z největších mikrobiálních nebezpečí kontaminace potravin (dehydratované potraviny, sušené ovoce, léčivé rostliny, čaje, káva a další), protože některé druhy mohou být producenty mykotoxinů, které mohou, obzvláště při dlouhodobém příjmu, ohrozit zdraví konzumentů (KOMPRDA 2000; ŠIMŮNEK 2003; COLAK et al. 2012, SPEIJERS a SPEIJERS 2004). Až na výjimky byla přítomnost plísní a kvasinek zaznamenána u všech prověřovaných produktů. Ve sledované časové závislosti po uvaření polévek nedocházelo k jejich statisticky průkaznému zvyšování, naopak v porovnání počtu těchto mikroorganismů na začátku a na konci doby minimální trvanlivosti byly u většiny vzorků statisticky průkazné rozdíly (p < 0,05). Tento fakt lze vysvětlit přidruženou sekundární kontaminaci při skladování v laboratorních podmínkách. Při porovnání všech analyzovaných polévek bez ohledu na dobu trvanlivosti a časovou závislost vycházely pro konzumenty nejlépe polévky od výrobce číslo 3. U této značky byl sice detekován rod Bacillus, ne však B. cereus. Plísně a kvasinky se vyskytovaly v nízkých hodnotách a pouze ve dvou vzorcích polévek této značky.
80
7
ZÁVĚR Úkolem této diplomové práce bylo zjistit přítomnost rodu Bacillus, druhu Ba-
cillus cereus a plísní a kvasinek v dehydratovaných potravinách od různých výrobců a jejich následné pomnožování během skladování. Pro tuto práci byly vybrány dehydratované polévky určené k vaření a polévky na zalití instantní. Z mikrobiologických analýz a statistického zpracování plyne, že ve všech vzorcích dehydratovaných polévek byly přítomny bakterie rodu Bacillus. I když během časového intervalu sledování jejich počet vzrůstal, nebyly překročeny hodnoty 102 KTJ/g (ml). Ačkoliv počty aerobních sporulujících bakterií nejsou legislativně omezeny, tedy s výjimkou Bacillus cereus v některých potravinách, jejich výskyt by mohl způsobit pozdější vady výrobků v průběhu skladování. V některých vzorcích byla detekována i přítomnost Bacillus cereus a plísní a kvasinek. Jejich počty po celou dobu pokusu nepřekročily 102 KTJ/g(ml), což u B. cereus nepřesahuje limity dané vyhláškou č. 132/2004 Sb. I když počty plísní a kvasinek nejsou legislativně omezeny, jejich výskyt by mohl způsobit pozdější vady výrobků v průběhu skladování a je zde riziko produkce mykotoxinů ohrožujících zdraví. Z celkového vyhodnocení všech analyzovaných produktů lze konzumentům doporučit produkty výrobce 3, které jsou z mikrobiologického hlediska nejvhodnější.
81
8
LITERATURA 1. AGATA et al. 1995. A novel dodecadepsipeptide, cereulide, is an emetic toxin of Bacillus cereus. FEMS Microbiology Letters Vol. 129, 1, s. 17–19. 2. AIIBP ( Association internationale des industries de bouillons et potages) 2007: Microbiological Specifications for Dry Soups and Bouillons, and Ingredients to be used for Dry Soups and Bouillons. [online], [cit 28. 3. 2013]. Dostupné z: /http://www.culinaria-europe.eu/download/aiibp-micro-wg-dry-soup/ 3. ARNESEN P. S. et al. 2008. From soil to gut: Bacillus cereus and its food poisoning toxins. FEMS Microbiology Reviews. Vol. 32. s. 579-606. 4. BAILEY, C. P. a HOLY A. 1993. Bacillus spore contamination associated with commercial bread manufacture. Food Microbiology. Vol. 10: s. 287–294. 5. BEKATOROU A. et al. 2006. Production of Food Grade Yeasts. Food Technol. Biotechnol. 44 (3) s. 407–415. 6.
BENNETT R. a TALLENT S. 2012. Bacillus cereus and other Bacillus species. Bad Bug Book: Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins Handbook.
s.
92
–
96.
[online]
[cit.
5.
3.
2013]
Dostupné
na:
/http://www.fda.gov/Food/FoodborneIllnessContaminants/CausesOfIllnessBadBug Book/default.htm/ 7. CATSARAS M. et al. 1972. Microbiological study of dehydrated or concentrated soups in the French market – Annales de l’Institut Pasteur de Lille .163:74 8. CEMPÍRKOVÁ R. et al. 1997. Mikrobiologie potravin. 1. vyd. České Budějovice: Jihočeská univerzita, 165 s. 9.
CINAR C. et al. 2008. Isolation and characterization of Bacillus thuringiensis strains from olive-related habitats in Turkey. Journal of Applied Microbiology 104. s. 515–525
10. CLAVEL T. et al. 2004. Survival of Bacillus cereus spores and vegetative cells in acid media simulating human stomach. Journal of Applied Microbiology. 97: s. 214–219.
82
11. COLAK et al. 2012. Determination of Mould and Aflatoxin Contamination in Tarhana, a Turkish Fermented Food. The Scientific World Journal. Vol. 2012. Article ID 218679, s. 6. 12. CUPÁKOVÁ Š. 2011. Bakteriální původci alimentárních onemocnění - Bacillus cereus. [online] [cit 20. 2. 2013]. Dostupné z: /http://cit.vfu.cz/alimentarnionemocneni/bc/bc.html/ 13. CURTIS L. 2007. Bacillus species [online]. [cit 10. 2. 2013]. Dostupné z: /http://www.foodsafetywatch.com/public/489print.cfm/ 14. ČSN EN ISO 7932 (560092) Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení počtu presumptivního Bacillus cereus - Technika počítání kolonií vykultivovaných při 30 °C 15. ČSN EN ISO 8261 - všeobecné pokyny pro úpravu analytických suspenzí a desetinásobných ředění pro mikrobiologické zkoušení. 16. ČSN ISO 7954 - Plísně a kvasinky. 17. ČSN EN 15784 - Krmiva - Izolace a stanovení počtu presumptivních bakterií rodu Bacillus. 18. DANCER S. J. et al. 2002. Bacillus cereus cellulitis from contaminated heroin. Journal of Medical Microbiology. 51: s. 278-281. 19. DENNIS C. 1987. Microbiology of fruits and vegetables. In: NORRIS J. R. a PETTIPHER G. L. 1987. Essays in Agricultural and Food Microbiology. 448 s. Chichester-New York-Brisbane-Toronto-Singapore. John Wiley and Sons. 20. DIERICK K. et al. 2005. Fatal family outbreak of Bacillus cereus –associated food poisoning. Journal of Clinical Microbiology. 43: s. 4277-4279. 21. DRÁPAL J. et al. 2005: Alimentární onemocnění [online]. [cit 1. 3. 2013]. Dostupné
z:
/http://czvp.szu.cz/vedvybor/dokumenty/studie/alim_2005_1_deklas_rev2.pdf/ 22. DZIECIOL M. et al. 2013. A novel diagnostic real-time PCR assay for quantification and differentiation of emetic and non-emetic Bacillus cereus. Food Control 32. s.176–185.
83
23. EFSA. 2005. Opinion of the scientific Panel on Biological Hazards on Bacillus cereus and other Bacillus spp in foodstuffs. The EFSA Journal., 175: 1-48 Dostupné z: /http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/pub/175.htm/ 24. ESIPA, 2010: Sbírka právních předpisů. [online]. [cit 10. 3. 2013]. Dostupné z: /http://www.esipa.cz/sbirka/sbsrv.dll/navig?pos=uvod/ 25. FANELLI M. J. et al. 1965. Microbiology of dehydrated soups. I. A survey. Food Technol. 19: s. 83–86. 26. FORSYTHE S. a HAYES P. 1998. Food Hygiene, Microbiology and HACCP. 3. Vyd. Gaithersburg: Aspen Publishers, 18449 s. 27. FRAZIER W. a WESTHOFF D. 1988. Food Microbiology. 4. Vyd. New York, McGraw – Hill. 28. FVL VFU Brno: Text ke zkoušce – G+ tyčinky [online]. [cit 10. 2. 2013]. Dostupné z: /http://fvl.vfu.cz/export/sites/fvl/sekce_ustavy/mikrobiologie/mikrobiologie/Gx_ty cinky.pdf/ 29. GORESLINE H. E. 1947. A Discussion of Bacteriological Standards for Dehydrated Foods. American Journal of Public Health and the Nations Health.: 37. No. 10. s. 1277-1283. 30. GÖRNER F., VALÍK L. 2004. Aplikovaná mikrobiológia požívatín. Vyd. 1. Bratislava: Malé Centrum. 528 s. 31. GRANUM P. E. 2001. Bacillus cereus. In: DOYLE M. P. (Ed), Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers, 2 vyd. ASM Press. s. 373–381. 32. GRANUM P. E. a BAIRD-PARKER T. C. 2000. Bacillus species. In: LUND B. et al. 2000. The Microbiological Safety and Quality of Food – Svazek 1. Springer, 2080
s.
dostupné
z:
/http://books.google.cz/books?id=lYMF1GkPGH8C&pg=PA1039&dq=bacillus+c ereus&hl=cs&sa=X&ei=oCJjUbLiLIXTsgay2YGACg&redir_esc=y#v=onepage& q=bacillus%20cereus&f=false/ 33. GRANUM, P. E., LUND T. 1997. Bacillus cereus and its food poisoning toxins. FEMS Microbiology Letters. 157: 223-228 84
34. HAINES R. B. a ELLIOT E. M. L. 1944. Some bacteriological aspects of dehydrated foods. Journal of Hygiene. Vol., 6, 43 s. 370-381. 35. HARTEMINK R. 2007. Bacillus coagulans (Lactobacillus sporogenes) a probiotic ?
[online].
[cit.
15.
3.
2013].
Dostupné
z:
/http://www.food-
info.net/uk/ff/sporogenes.htm/ 36. HAUGE S. Food poisoning caused by aerobic spore forming bacilli. 1995. Journal of Applied Bacteriology. 18: s. 591-595. 37. HEREDIA et al. 2009. Microbiologically safe foods. Hoboken: John Wiley & Sons, 667 s. ISBN 978-0-470-05333-1. 38. HONG H. A. et al. 2009. Bacillus subtilis isolated from the human gastrointestinal tract. Research in Microbiology, 160: s. 134–143 39. HORNSTRA L.M. et al. 2007. Germination of Bacillus cereus spores adhered to stainless steel. International Journal of Food Microbiology, vol. 116, s. 367-371. 40. HUIS IN´T VELD J. H. J. 1996. Microbial and biochemical spoilage of foods: an overview . International Journal of Food Microbiology. 33. s. 1–18 41. ICBP (Informační centrum bezpečnosti potravin) 2012:: A-Z Slovník pro spotřebitele
–
Nitkovitost
chleba.
[online].
[cit
10.
3.
2013].
Dostupné
z:
/http://www.bezpecnostpotravin.cz/az/termin/76582.aspx/ 42. ICMSF 1986: Microorganisms in Foods 2. Sampling for microbiological analysis: Principles and specific applications. 2. vyd. International Commission on Microbiological Specifications for Foods. [online]. [cit 17. 2. 2013]. Dostupné z: /http://www.icmsf.org/pdf/icmsf2.pdf/ 43. JAY, J. et al. 2005. Modern food microbiology. 7. Vyd. New York: Springer Science + Business Media, 790 s. 44. JURENKA J. S. 2012. Bacillus coagulans: Monography. Alternative Medicine Review. 17. S. 76–81 45. KADLEC P. et al. 2009. Co byste měli vědět o výrobě potravin?: technologie potravin. Vyd. 1. Ostrava: Key Publishing, 536 s.
85
46. KOLÁŘ J. 2001. Bacillus cereus [online]. [cit 10. 3. 2013]. Dostupné z: /http://kolar-jiri.sweb.cz/ 47. KOMPRDA T. 2000. Hygiena potravin. dotisk. Brno: MZLU, 171 s. 48. KRMENČÍK P. a KYSILKA J. 2007: Toxikon: Mykotoxiny [online]. [cit. 5. 3. 2013]. Dostupné z: /http://www.biotox.cz/toxikon/mikromycety/mikromycety.php/ 49. LEUSCHNER R. G. K. et al. 1998. Bacilli spoilage in part-baked and rebaked brown soda bread. Journal of Food Science. 63: s. 915–918 50. MAHLER, H. et al. 1997. Fulminant liver failure in association with the emetic toxin of Bacillus cereus. The New England Journal of Medicine. 336: s. 11421148. 51. MARTÍNEZ et al. 2007. Effect of environmental parameters on growth kinetics of Bacillus cereus (ATCC 7004) after mild heat treatment. International Journal of Food Microbiology 117, s. 223–227. 52. MAUGHAN H. a AUVERA G. V. 2011. Bacillus taxonomy in the genomic era finds phenotypes to be Essentials though often misleading. Infection, Genetics and Evolution11. s.789–797 53. MCKILLIP J. L. 2000. Prevalence and expression of enterotoxins in Bacillus cereus and other Bacillus spp., a literature review. Antonie van Leeuwenhoek 77: s. 393–399 54. MICROBEWIKI, 2011 b): Bacillus licheniformis. Encyklopedie online [cit. 5. 3. 2013]. Dostupné z: /http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Bacillus_licheniformis/ 55. MICROBEWIKI, 2011a): Bacillus cereus. Encyklopedie online [cit. 5. 3. 2013]. Dostupné z: /http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Bacillus_cereus/ 56. MICROBEWIKI, 2011c): Bacillus stearothermophilus. Encyklopedie online [cit. 5. 3. 2013]. Dostupné z: /http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Bacillus_stearothermophilus_NEUF201 1/
86
57. MIKKOLA R. et al. 1999. Ionophoretic properties and mitochondrial effects of cereulide: the emetic toxin of Bacillus cereus. European Journal of Biochemistry. 1999, 263: 112-117 58. MOGOL B. A. et al. 2010. Inhibition of enzymatic browning in actual food systems by the Maillard reaction products. J Sci Food Agric; 90: s. 2556–2562 59. MOSSEL D. A. A. a SHENNAN J. L. 1976. Microorganisms in dried foods: their signifikance, limitation and enumeration. Journal of Food technology. 11. s. 205– 220. 60. Nařízení Komise (ES) č. 1441/2007, ze dne 5. prosince 2007, kterým se mění nařízení (ES) č. 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny. 61. Nařízení Komise (ES) č. 1881/2006 ze dne 19. prosince 2006, kterým se stanoví maximální limity některých kontaminujících látek v potravinách. 62. Nařízení Komise (ES) č. 2073/2005 ze dne 15. listopadu 2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny. 63. NIH (National Institutes of Health) 2011: Bacillus coagulans. [online]. [cit. 15. 3. 2013]. Dostupné z: /http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/druginfo/natural/1185.html#Effectiveness/ 64. OGGIONI, M. R. et al. 1998. Recurrent Septicemia in an Immunocompromised Patient Due to Probiotic Strains of Bacillus subtilis. Journal of Clinical Microbiology.. 36: s. 325-326. 65. OSTRÝ V. 2013. Identifikace nebezpečí výskytu vláknitých mikroskopických hub (plísní) v potravinách. Seminář "Mykotoxiny a zemědělská produkce". [online], [cit
30.
3.
2013].
Dostupné
z: /
http://www.ukzuz.cz/Articles/291856-2-
Seminar+Mykotoxiny.aspx/ 66. PATOČKA, F. 1972. Lékařská mikrobiologie. 2. vyd. Praha: Avicenum. 67. PIRTTIJÄRVI T. 2000. Contaminant Aerobic Sporeforming Bacteria in the Manufacturing Processes of Food Packaging Board and Food. Dizertační práce.University of Helsinki. 39 s. Dostupné z: /https://helda.helsinki.fi/bitstream/handle/10138/20894/contamin.pdf?sequence=1/
87
68. RAKOVÁ K. 2008. Mikrobiologie vajec tržní sítě. Zlín. Bakalářská práce. Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně. Dostupné z: /http://dspace.k.utb.cz/handle/10563/7709/ 69. RASKO D. et al. 2005. “Genomics of the Bacillus cereus group of organisms.” FEMS Microbiology Reviews. 2005. 29(2). s. 303-329. 70. RAY B. a BHUNIA A. K. 2008. Fundamental food microbiology. 4th ed. Boca Raton: CRC Press, 492 s. 71. RUKMINI V. et al. 2000. Bacillus thuringiensis crystal ä-endotoxin: Role of proteasesin the conversion of protoxin to toxin. Biochimie, 82, s. 109−116. 72. SALEH B. A. et al. 1966. Microbial evaluation of commercial freeze-dried foods. Food Technology, 20, s. 671–4. 73. SALKINOJA-SALONEN S. et al. 1999. Toxigenic Strains of Bacillus licheniformis Related to Food Poisoning. Applied Environmental Microbiology. October; 65(10): s. 4637–4645. 74. SCOTT W. J. 1957. Water relations of food spoilage microorganisms. Advances in Food Research. 1: s.83–127. 75. SEDLÁČEK, I. 2007. Taxonomie prokaryot. Brno. Masarykova univerzita, 270 s. 76. SEIDU L. 2012. Mold Allergy. [online], [cit. 15. 4. 2013] Dostupné z: /http://www.webmd.com/allergies/guide/mold-allergy/ 77. SIU (Southern Illinois University) School of Medicine. 2012. : Bacteriology, Clinical Presentations And Management [online]. [cit 15. 3. 2013]. Dostupné z:
78. SOROKULOVA I. B. et al. 2003. Genetic diversity and involvement in bread spoilage of Bacillus strains isolated from flour and ropy bread. Letters in Applied Microbiology.. 37: s. 169–173 79. SPEIJERS G. J. A. a M. H. M. SPEIJERS. 2004. Combined toxic effects of mycotoxins. Toxicology Letters 153. s. 91–98 80. ŠILHÁNKOVÁ, Ludmila. 2002. Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. Vyd. 3., opr. a dopl., v nakl. Academia 1. vyd. Praha: Academia, 363 s. 81. ŠIMŮNEK, J. 2003: Plísně a mykotoxiny [online]. [cit. 28. 3. 2013]. Dostupné z: /http://www.med.muni.cz/dokumenty/pdf/plisne_a_mykotoxiny.pdf/ 88
82. TÁBORSKÁ K. 2009. Výskyt bakterií rodu Bacillus v dehydrovaných potravinách. Zlín. Bakalářská práce. Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně. Dostupné z: / http://dspace.k.utb.cz/handle/10563/7832?show=full/ 83. TALLENT S. M. et al. 2012. Efficient Isolation and Identification of Bacillus cereus Group. Journal of AOAC International. Vol. 95, 2., s. 446–451 84. TODAR, K. 2011 Todar’s Online Textbook of Bacteriology: [online]. [cit. 16. 2. 2013 ] Dostupné z : / http://textbookofbacteriology.net/ 85. US EPA (ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY) 1997 a.: Bacillus subtilis Final Risk Assessment [online]. [cit. 8. 2. 2013]. Dostupné z: 86. US EPA (ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY), 1997 b.: Bacillus licheniformis Final Risk Assessment [online]. [cit. 8. 3. 2013]. Dostupné z: /http://www.epa.gov/biotech_rule/pubs/fra/fra009.htm/ 87. VAUGHN R. H. 1951. The microbiology of dehydrated vegetables. Journal of food science. Vol. 16, issue 1-6, s. 429–438. 88. VEČEŘOVÁ E. 2012. Mikrobiální obraz koření. Diplomová práce. Masarykova univerzita, Lékařská fakulta. Vedoucí práce Jan Šimůnek. [online]. [cit. 4. 4. 2013 ] Dostupné z: /http://is.muni.cz/th/258675/lf_m/. 89. Vyhláška č. 133/2004 Sb., o podmínkách ozařování potravin a surovin, o nejvyšší přípustné dávce záření a o způsobu označení ozáření na obalu. 90. Vyhláška MZe ČR č. 331/1997 Sb., ze dne 11. prosince 1997, kterou se provádí § 18 písm. a), d), h), i), j), a k) zákona č. 110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrocích a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů, pro koření, jedlou sůl, dehydrované výrobky a ochucovadla a hořčici. 91. Vyhláška MZe ČR č. 419/2000 Sb., ze dne 10. listopadu 2000, kterou se mění vyhláška Ministerstva zemědělství č. 331/1997 Sb., kterou se provádí § 18 písm. a), d), h), i), j) a k) zákona č. 110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů, pro koření, jedlou sůl, dehydrované výrobky a ochucovadla a hořčici.
89
92. WIJNANDS, L. 2006. Spores from mesophilic Bacillus cereus strains germinate better and grow faster in simulated gastro-intestinal conditions than spores from psychrotrophic strains. International Journal of Food Microbiology. s. 120-128. 93. WIKIPEDIE 2013 b): Kvasinky [online], Wikipedie: Otevřená encyklopedie, [cit. 31. 03. 2013] Dostupné z: /http://cs.wikipedia.org/w/index.php?title=Kvasinky&oldid=9955728/ 94. WIKIPEDIE, 2012 c): Alimentární onemocnění [online], Wikipedie: Otevřená encyklopedie [cit. 31. 03. 2013] Dostupné z: /http://cs.wikipedia.org/w/index.php?title=Aliment%C3%A1rn%C3%AD_onemoc n%C4%9Bn%C3%AD&oldid=8377598/ 95. WIKIPEDIE, 2013 a): Bacillus cereus. [online], Wikipedie: Otevřená encyklopedie. [cit 20. 2. 2013]. Dostupné z: /http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Bacillus_cereus&oldid=540893731/ 96. WONG S. 1995. Advances in the use of Bacillus subtilis for the expression and secretion of heterologous proteins. Current Opinion in Biotechnology. 6: s. 517522 97. Zákon č. 110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů.
90
9
SEZNAM OBRÁZKŮ, TABULEK A ZKRATEK SEZNAM OBRÁZKŮ
Obr. 1 Plazivý růst (B. cereus) (http://fvl.vfu.cz/sekce_ustavy/mikrobiologie/obrazova_priloha/mikrob/img/14-05.jpg) ........................................................................................................................................ 14 Obr. 2 Bacillus cereus (http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/File:Bacilluscereus1.JPG) .......................... 30 Obr. 3 Bacillus cereus se sporami uvnitř buňky (http://www.tumblr.com/tagged/Bacillus%20cereus) .................................................... 30 Obr. 4 Adherované spory B. cereus (http://amgar.blog.processalimentaire.com/contaminant-chimique/lalcool-et-lesbacteries-sporulees/) ....................................................................................................... 37 Obr. 5 Růst B. cereus na MYP agaru (http://cit.vfu.cz/alimentarnionemocneni/xbc/xbc03-05.html) .................................................................................... 41 Obr. 6 B. cereus - hemolýza na krevním agaru (http://pictures.life.ku.dk/atlas/microatlas/veterinary/bacteria/Bacillus_cereus/) .......... 42 Obr. 7 Růst B. cereus na PEMBA agaru (http://pages.usherbrooke.ca/biomedias/images/PEMBA-B-cereus-2.jpg) .................... 42 Obrázek 8 nárůst plísní a kvasinek z vybraných vzorků polévek ................................... 46 Obrázek 9 test na utilizaci citrátu – modrá = pozitivní test, zelená = negativní test (http://academic.missouriwestern.edu/jcbaker/images/citrate.jpg) ................................. 55 Obr. 10 VP test – červené zbarvení značí přítomnost acetoinu (http://people.uleth.ca/~selibl/Biol3200/BiochTests/VogesPros.html) .......................... 56 Obr. 11 Srovnání počtu Bacillus spp. v polévkách na vaření hrachových ve vzorku 1, vzorku 2, vzorku 3 v jednotlivých časových intervalech odběru 0, 30, 60, 90, 120 min na začátku a na konci DMT ............................................................................................ 57
91
Obr. 12 Srovnání počtu plísní a kvasinek v polévkách na vaření hrachových ve vzorku 1, vzorku 2, vzorku 3 v jednotlivých časových intervalech odběru 0, 30, 60, 90, 120 min na začátku a na konci DMT. ........................................................................................... 58 Obr. 13 Srovnání počtu Bacillus spp. v polévkách na vaření francouzských ve vzorku 1, vzorku 2, vzorku 3 v jednotlivých časových intervalech odběru 0, 30, 60, 90, 120 min na začátku a na konci DMT. ........................................................................................... 59 Obr. 14 Srovnání počtu plísní a kvasinek v polévkách na vaření francouzských ve vzorku 1 a vzorku 2 v jednotlivých časových intervalech odběru 0, 30, 60, 90, 120 min na začátku a na konci DMT. ........................................................................................... 59 Obr. 15 Srovnání počtu Bacillus spp. v polévkách na vaření čočkových ve vzorku 1, vzorku 2, vzorku 3 v jednotlivých časových intervalech odběru 0, 30, 60, 90, 120 min na začátku a na konci DMT. ........................................................................................... 60 Obr. 16 Srovnání počtu plísní a kvasinek v polévkách na vaření čočkových ve vzorku 1a vzorku 2 v jednotlivých časových intervalech odběru 0, 30, 60, 90, 120 min na začátku a na konci DMT .............................................................................................................. 61 Obr. 17 Srovnání počtu Bacillus spp. v polévkách na vaření rajských ve vzorku 1, vzorku 2, vzorku 3 v jednotlivých časových intervalech odběru 0, 30, 60, 90, 120 min na začátku a na konci DMT ............................................................................................ 62 Obr. 18 Srovnání počtu B. cereus v polévkách na vaření rajských ve vzorku 2 v jednotlivých časových intervalech odběru 0, 30, 60, 90, 120 min na začátku a na konci DMT................................................................................................................................ 62 Obr. 19 Srovnání počtu plísní a kvasinek v polévkách na vaření rajských ve vzorku 1 a vzorku 2 v jednotlivých časových intervalech odběru 0, 30, 60, 90, 120 min na začátku a na konci DMT .............................................................................................................. 63 Obr. 20 Srovnání počtu Bacillus spp. v polévkách na vaření s játrovými knedlíčky ve vzorku 1, vzorku 2, vzorku 3 v jednotlivých časových intervalech odběru 0, 30, 60, 90, 120 min na začátku a na konci DMT .............................................................................. 64 Obr. 21 Srovnání počtu B. cereus v polévkách na vaření s játrovými knedlíčky ve vzorku 2 v jednotlivých časových intervalech odběru 0, 30, 60, 90, 120 min na začátku a na konci DMT .............................................................................................................. 65 92
Obr. 22 Srovnání počtu plísní a kvasinek v polévkách na vaření s játrovými knedlíčky ve vzorku 1, vzorku 2, vzorku 3 v jednotlivých časových intervalech odběru 0, 30, 60, 90, 120 min na začátku a na konci DMT ........................................................................ 65 Obr. 23 Srovnání počtu Bacillus spp. v polévkách na vaření gulášových ve vzorku 1, vzorku 2, vzorku 3 v jednotlivých časových intervalech odběru 0, 30, 60, 90, 120 min na začátku a na konci DMT ............................................................................................ 66 Obr. 24 Srovnání počtu B. cereus. v polévkách na vaření gulášových ve vzorku 1 a vzorku 2 v jednotlivých časových intervalech odběru 0, 30, 60, 90, 120 min na začátku a na konci DMT .............................................................................................................. 67 Obr. 25 Srovnání počtu plísní a kvasinek v polévkách na vaření gulášových ve vzorku 1 a vzorku 2 v jednotlivých časových intervalech odběru 0, 30, 60, 90, 120 min na začátku a na konci DMT ................................................................................................. 67 Obr. 26 stanovení Bacillus spp. v instantní polévce s játrovými knedlíčky v časovém intervalu 0 a 30 min ........................................................................................................ 68 Obr. 27 Srovnání počtu Bacillus spp. a plísní a kvasinek v instantní polévce francouzské v časovém intervalu 0 a 30 min ...................................................................................... 69 Obr. 28 Srovnání počtu Bacillus spp., B. cereus a plísní a kvasinek v instantní polévce gulášové v časovém intervalu 0 a 30 min ....................................................................... 70 Obr. 29 Srovnání počtu Bacillus spp., B. cereus a plísní a kvasinek v instantní polévce hráškové v časovém intervalu 0 a 30 min ....................................................................... 71 Obr. 30 Srovnání počtu Bacillus spp., B. cereus a plísní a kvasinek v instantní polévce čočkové v časovém intervalu 0 a 30 min ........................................................................ 72 Obr. 31 Porovnání počtů sledovaných MO v jednotlivých variantách hrachové polévky za celé sledované období (12 - 18 měsíců). A, B, C – průměry označené různými písmeny se průkazně (p < 0,05) liší, průměry označené stejnými písmeny se průkazně neliší (p > 0,05), n = 8 ..................................................................................................... 73 Obr. 32 Porovnání počtů sledovaných MO v jednotlivých variantách francouzské polévky za celé sledované období (12 - 18 měsíců). A, B, C – průměry označené různými písmeny se průkazně (p < 0,05) liší, průměry označené stejnými písmeny se průkazně neliší (p > 0,05), n = 8 ..................................................................................... 74 93
Obr. 33 Porovnání počtů sledovaných MO v jednotlivých variantách čočkové polévky za celé sledované období (12 - 18 měsíců). A, B, C – průměry označené různými písmeny se průkazně (p < 0,05) liší, průměry označené stejnými písmeny se průkazně neliší (p > 0,05), n = 8 ..................................................................................................... 74 Obr. 34 Porovnání počtů sledovaných MO v jednotlivých variantách rajské polévky za celé sledované období (12 - 18 měsíců). A, B, C – průměry označené různými písmeny se průkazně (p < 0,05) liší, průměry označené stejnými písmeny se průkazně neliší (p > 0,05), n = 8 ...................................................................................................................... 75 Obr. 35 Porovnání počtů sledovaných MO v jednotlivých variantách polévky s játrovými knedlíčky za celé sledované období (12 - 18 měsíců). A, B, C – průměry označené různými písmeny se průkazně (p < 0,05) liší, průměry označené stejnými písmeny se průkazně neliší (p > 0,05), n = 8 .................................................................. 76 Obr. 36 Porovnání počtů sledovaných MO v jednotlivých variantách gulášové polévky za celé sledované období (12 - 18 měsíců). A, B, C – průměry označené různými písmeny se průkazně (p < 0,05) liší, průměry označené stejnými písmeny se průkazně neliší (P>0,05), n = 8 ...................................................................................................... 77
SEZNAM TABULEK Tabulka 1 Vady sýrů způsobené bakteriemi z rodu Bacillus (TÁBORSKÁ 2009) ....... 19 Tabulka 2 Členění dehydrovaných potravin na skupiny (Vyhláška MZe č. 419/2000 Sb.) ........................................................................................................................................ 23 Tabulka 3 Přípustné záporné hmotnostní odchylky (Vyhláška MZe č. 419/2000 Sb.) .. 24 Tabulka 4 Alimentární onemocnění způsobené bakterií B. cereus (ARNESEN et al. 2008). .............................................................................................................................. 34 Tabulka 5 Přehled nejdůležitějších mykotoxinů a jejich účinků (KRMENČÍK a KYSILKA 2007)............................................................................................................. 44
94
SEZNAM ZKRATEK
AIDS
Acquired Immune Deficiency Syndrome
AIIBP
Association internationale des industries de bouillons et potages
aw
hodnota aktivity vody
BceT
Enerotoxin T
BCET-RPLA Bacillus diarrhoeal enterotoxin by reversed passive latex agglutination BDE-VIA
Bacillus Diarrhoeal Enterotoxin Visual Immunoassay
CCM
Czech Collection of Microorganisms – Česká sbírka mikroorganismů
CPM
celkové počty mikroorganismů
CytK
Cytotoxin K
ČR
Česká republika
ČSN
Česká státní norma
DMT
datum minimální trvanlivosti
DNA
deoxyribonucleic acid - deoxyribonukleová kyselina
DRBC
Dichloran Rose-Bengal Chloramphenicol Agar
EFSA
European Food Safety Authority, Evropský úřad pro bezpečnost potravin
ELISA
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
EntFM
Enterotoxin FM
ES
Evropské společenství
FSAI
Food Safety Authority of Ireland
Hbl
Hemolyzin BL
HEp-2
lidské heteroploidní buňky z epidermoidního karcynomu
hIL
human inter Leukin
HPA
Health Protecting Agency
95
ICBP
Informační centrum bezpečnosti potravin
kGy
kiloGray - jednotka SI
KTJ
kolonie tvořící jednotky
MLST
Multilocus Sequence Typing
MO
mikroorganismy
MYP
Mannitol Egg Yolk Polymyxin Agar
MZe
Ministerstvo zemědělství
např.
například
Nhe
Nehemolytický enterotoxin
NHI
National Institutes of Health
NK-buněk
z angl. natural killer cells, přirození zabíječi
PCR
polymerázová řetězová reakce
PEMBA
Polymyxin Pyruvate Egg Yolk Mannitol Bromothymol Blue Agar Base
RAP
random amplification of polymorphic DNA
RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism
SCA
single-chain antipody (SCA) fragment
spp.
pro označení všech druhů patřících do vyššího taxonu, vyjadřuje množné číslo pomnožného slova "species"
tzv.
takzvaný
UHT
ultra hight temperature - vysokoteplotní krátkodobé ošetření ohřevem
VPT
Voges–Proskauerův test
96
10 PŘÍLOHY 10.1 Přehled dehydratovaných potravin tržní sítě ČR PRODUKT: Maggi jako od mámy Hrášková po- PRODUKT: Vitana Hrachová se slaninou lévka VÝROBCE: Vitana a.s., Česká republika VÝROBCE: Nestlé Česko s. r. o., Česká republika
PRODUKT: Vitana francouzská polévka VÝROBCE: Vitana a.s., Česká republika
PRODUKT : Knorr Čočková polévka VÝROBCE: Unilever ČR, spol. s r.o.
PRODUKT: Vitana Čočková polévka VÝROBCE: Vitana a.s., Česká republika
PRODUKT: Maggi ze Zahrádky rajská VÝROBCE: Nestlé Česko s. r. o., Česká republika
97
PRODUKT: Vitana Rajská polévka VÝROBCE: Vitana a.s., Česká republika
PRODUKT: Maggi Jako od mámy knedlíčky játrové a nudle VÝROBCE: Nestlé Česko s. r. o., Česká republika
PRODUKT: Vitana poctivá polévka s játrovými PRODUKT: Knorr polévka Gulášová knedlíčky VÝROBCE: Unilever ČR, spol. s r.o. VÝROBCE:. Vitana a.s., Česká republika
PRODUKT: Maggi Jako od mámy Gulášová po- PRODUKT: Vitana Do hrnečku gulášová lévka VÝROBCE: Vitana a.s., Česká republika VÝROBCE: Nestlé Česko s. r. o., Česká republika
98
PRODUKT: Maggi Chutná pauza francouzská VÝROBCE: Nestlé Česko s. r. o., Česká republika
PRODUKT : Knorr Prima pauza rajská VÝROBCE: Unilever ČR, spol. s r.o.
PRODUKT: Maggi Dobrý hostinec, Guláš VÝROBCE: Nestlé Česko, s.r.o.
PRODUKT: Maggi Dobrý hostinec, Kuře na paprice VÝROBCE Nestlé Česko s. r. o., Česká republika.
PRODUKT: Promil Laktino, sušené mléko VÝROBCE: PML Protein.Mléko.Laktóza, a.s.
PRODUKT : Bohemilk Sušené mléko VÝROBCE: Bohemilk a.s.
99
PRODUKT : Nutrilon VÝROBCE: Nutricia a.s.
PRODUKT : Sunar VÝROBCE: HERO CZECH s.r.o.
PRODUKT : Knorr Bramborová kaše s mlékem VÝROBCE: Unilever ČR, spol. s r.o.
PRODUKT Vitana Bramborová kaše s mlékem VÝROBCE: Vitana a.s., Česká republika
PRODUKT : Bask Bramborové knedlíky VÝROBCE: Vitana a.s., Česká republika
PRODUKT : Vitana Bramborové knedlíky VÝROBCE: Vitana a.s., Česká republika
100
PRODUKT: Mokate Carmen Classic VÝROBCE: MOKATE Czech, s.r.o.
PRODUKT: Mokate Carmen Classic VÝROBCE: SIMANDL, spol. s r. o.
101
