BIDANG ILMU : BIOTEKNOLOGI PERTANIAN DAN PERKEBUNAN
LAPORAN TAHUNAN PENELITIAN HIBAH BERSAING
Menciptakan Kultivar Baru Anggrek Vanda tricolor Lindl. var. suavis forma Bali yang Cepat Berbunga melalui Rekayasa Genetika
Tahun ke 3 dari rencana 3 tahun TIM PENGUSUL Dr. Ir. Rindang Dwiyani, MSc. (NIDN : 0007056203) Ir. Hestin Yuswanti, M.P. (NIDN: 0015035904) Ida Ayu Putri Darmawati, S.P., M.Si.(NIDN: 0015097110 )
UNIVERSITAS UDAYANA NOVEMBER 2015
2
RINGKASAN Anggrek merupakan salah satu komodititas hortikultura unggulan yang ditetapkan pemerintah Indonesia untuk dikembangkan sejak tahun 2007. Salah Satu anggrek alam Indonesia yang berasal dari Bali adalah Vanda tricolor Lindl. var suavis forma Bali. Permasalahan utama dalam budidaya anggrek, khususnya genus Vanda adalah masa vegetatif yang panjang, sehingga membutuhkan waktu yang relatif lama untuk mencapai masa berbunga. Tujuan dari penelitian ini adalah menciptakan kultivar baru tanaman anggrek V. tricolor forma Bali yang memiliki kemampuan berbunga lebih cepat . Penelitian ini dilaksanakan dalam 3 tahap. Dari tahun ke 2 penelitian sudah diperoleh 2 kandidat transgenik secara in vitro, namun secara in planta belum diperoleh kandidat transgenik. Hal ini disebabkan karena buah anggrek hasil transformasi in planta baru bisa dipanen dan ditabur bijinya pada umur 7 bulan setelah selfing (29 April 2015). Buah ini merupakan hasil selfing dimana polen sudah direndam dengan Agrobacterium tumefaciens yang membawa gen pembungaan PaFT. Transformasi in planta ini dilakukan secara faktorial dengan dua faktor. Faktor pertama yaitu lama perendaman polen dengan suspensi Agrobacterium (1 dan 2 jam). Faktor kedua yaitu pemberian Asetosyringone (AS), tanpa AS dan dengan 25 ppm AS, diperoleh empat macam perlakuan dan diulang tiga kali, sehingga dilakukan 12 kali selfing untuk mendapatkan 12 buah (kapsul) anggrek. Pada tahun ketiga dilakukan pekerjaan sebagai berikut: penaburan biji hasil transformasi in planta; seleksi awal untuk mendapatkan kandidat transgenik in planta; isolasi DNA; dan PCR dengan primer spesifik kandidat transgenik (baik yang dihasilkan secara in vitro maupun in planta) untuk mendapatkan tanaman transgenik V. tricolor yang membawa gen PaFT. Hasil penelitian tahun ketiga diperoleh bahwa lama perendaman polen selama 2 jam dengan pemberian 25 ppm AS menghasilkan persentase kandidat tertinggi melalui seleksi awal dengan 10 ppm higromisin. Dari 5 kandidat transforman yang di PCR dengan primer Ubiquitin (forward: 5'-TTGTCGATGCTCACCCTG-3 ') dan TNos (reverse: 5'GATCTAGTAACATAGAT GACACCGCG-3'), 4 diantaranya mengamplifikasi 1.1kb (1100 bp) yang keseluruhannya adalah hasil transformasi in planta. Hasil ini menyimpulkan bahwa metode in planta yang digunakan dalam penelitian ini dapat digunakan sebagai metode insersi gen pada tanaman anggrek.
3
PRAKATA
Puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa kami panjatkan atas selesainya rangkaian penelitian panjang yang kami kerjakan pada anggrek Vanda tricolor Lindl. Spesies anggrek ini merupakan kekayaan plasma nutfah Indonesia yang layak mendapat perhatian dari kita semua, termasuk para peneliti di perguruan tinggi. Untuk itu kami haturkan terimakasih yang tak berhingga kepada Kementerian Riset Teknologi dan Pendidikan Tinggi melalui Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi dan LPPM Universitas Udayana yang telah berkenan membiayai penelitian kami. Hasil penelitian tahap tiga ini memberikan harapan besar untuk kemajuan ilmu pengetahuan untuk metode transformasi in planta yang dilakukan karena merupakan sesuatu yang baru (inovatif). Di akhir tahun ketiga telah diperoleh tanaman transgenik anggrek Vanda tricolor yang mengoverekspresikan gen pembungaan. Diharapkan tanaman ini mampu berbunga lebih cepat. Mudah-mudahan apa yang kami peroleh dapat bermanfaat khususnya untuk kemajuan ilmu pengetahuan dan dapat diadopsi oleh para peneliti lain di Indonesia. Mudah-mudahan Tuhan Yang Maha Esa senantiasa meridhoi pekerjaan kami.
Denpasar, 02-11- 2015
Tim Peneliti
4
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN SAMPUL
1
HALAMAN PENGESAHAN
2
RINGKASAN
3
PRAKATA
4
DAFTAR ISI
5
DAFTAR TABEL
6
DAFTAR GAMBAR
7
BAB 1. PENDAHULUAN
8
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA
9
BAB 3. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN
11
BAB 4. METODE PENELITIAN
11
BAB 5. HASIL YANG SUDAH DICAPAI
13
BAB 6. LUARAN YANG SUDAH DICAPAI
19
BAB 7. KESIMPULAN DAN SARAN
20
DAFTAR PUSTAKA
20
5
DAFTAR TABEL Tabel 1. Hasil Pengamatan Uji Higromisin
Halaman 14
Tabel 2. Hasil Seleksi Awal Transforman dengan vektor yang membawa gen PaFT dan gen hpt
15
Tabel 3. Hasil Seleksi Awal Transforman dengan vektor yang membawa hanya gen hpt
15
6
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Buah hasil transformasi in planta pada tahap 2 yang ditanam tahap 3
13
Gambar 2. Biji anggrek hasil transformasi in planta setelah ditanam
14
Gambar 3. Hasil seleksi awal transforman PGA102 dengan 5ppm higromisin
16
Gambar 4. Hasil seleksi awal transforman PGA 102 dengan 15 ppm higromisin
17
Gambar 5. Hasil seleksi awal transforman PGA 3426 pada 15 ppm higromisin
18
Gambar 6. Hasil Elektroforesis
19
7
BAB 1. PENDAHULUAN Anggrek merupakan salah satu komoditas hortikultura unggulan RI dan ditetapkan sebagai komoditas yang memiliki prospek untuk dikembangkan (Departemen Pertanian RI, 2007). Di dunia terdapat lebih dari 30 000 spesies anggrek alam (Banks, 1999), 5000 spesies di antaranya terdapat di Indonesia (Irawati, 2002). Bali merupakan salah satu daerah di Indonesia dimana usaha tanaman hias berkembang pesat.
Pengembangan florikultura di Bali diperlukan tidak hanya untuk
menunjang Bali sebagai daerah tujuan wisata, namun hal ini juga akan berdampak terhadap peningkatan ilmu pengetahuan dan income para petani, khususnya petani tanaman hias. Vanda tricolor Lindl. var. suavis forma Bali adalah anggrek alam pulau Bali, salah satu sumber kekayaan hayati pulau Bali yang perlu mendapat perhatian kita semua. Spesies ini merupakan induk persilangan dari anggrek Vanda hibrida yang yang diperjualbelikan secara komersial saat ini dan dengan harga yang relatif tinggi.. Dwiyani (2012) menndapatkan bahwa forma Bali memiliki karakter spesifik dibandingkan forma Merapi dan forma Jawa Barat, yakni ukuran bunga dan buah yang lebih besar serta totol-totol dan labelum yang berwarna ungu kemerahan, sementara forma Merapi berwarna ungu dan forma Jawa Barat berwarna coklat. Lestari (2010) melaporkan bahwa forma Bali memiliki tingkat keharuman bunga yang lebih tinggi dibanding forma Merapi. Salah satu permasalahan dalam budidaya anggrek, khususnya genus Vanda, adalah masa vegetatif yang panjang, sehingga saat (waktu) pembungaan (flowering) membutuhkan waktu yang relatif lama. Vanda tricolor Lindl. var. suavis membutuhkan waktu kurang lebih 5 tahun setelah disemai untuk menghasilkan bunga pertama kali, padahal sebagai tanaman hias, bunga merupakan organ tanaman penting yang dinikmati nilai estetikanya. Perbaikan sifat-sifat (karakter) tanaman dapat dilakukan secara konvensional melalui plant breeding maupun secara lebih modern dengan rekayasa genetika.
Penelitian ini
menggunakan rekayasa genetika untuk memperbaiki karakter pembungaan dari anggrek V. tricolor Lindl. var. suavis forma Bali.
Pada penelitian ini dilakukan overekspresi gen
pembungaan yaitu gen PaFT dengan „strong promoter‟ Ubiquitin. Gen PaFT adalah gen ortholog dari FLOWERING LOCUS T (FT) yang diisolasi dari tanaman Platanus acerifolia (Pa) (Zhang et al. 2011). Mercuriani (Komunikasi pribadi 2013) sudah berhasil melakukan transformasi gen PaFT melalui Agrobacterium tumefaciens pada
anggrek Phalaenopsis
amabilis, namun belum ada yang melaporkan untuk tanaman anggrek genus Vanda yang memiliki masa juvenil sangat panjang, lebih panjang dari anggrek P. amabilis. Sementara itu, 8
promoter Ubiquitin dilaporkan memiliki tingkat ekspresi gen yang tinggi pada tanaman monokotil (Christensen & Quail 1996), sehingga diharapkan tanaman anggrek V. tricolor yang sudah disisipi gen PaFT ini nantinya mampu berbunga lebih cepat. Kultivar baru anggrek V. tricolor Lidl. forma Bali yang dihasilkan melalui penelitian ini dapat dijadikan tanaman induk untuk menghasilkan hibrida-hibrida baru genus Vanda yang berbunga lebih cepat.
Rhodora & Thomas (1996) menyatakan bahwa gen asing yang ada pada tanaman
transforman yang dihasilkan melalui transformasi dengan Agrobacterium diturunkan pada progeninya. Mengingat Vanda hibrid memiliki nilai tinggi secara ekonomis, maka hasil penelitian ini akan sangat bermanfaat bagi pengembangan agribisnis anggrek khususnya di Indonesia.
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA Transformasi tanaman dengan perantara A. tumefaciens merupakan metode yang paling banyak digunakan untuk induksi gen asing ke dalam sel tanaman untuk selanjutnya dihasilkan tanaman transgenik (Alimohamdi dan Bagherieh-Najjar, 2009). Secara alamiah, A. tumefaciens menginokulasi bagian yang luka dari tanaman dikotil dan menyebabkan terbentuknya tumor. Strain virulen dari A. tumefaciens memiliki plasmid yang besar (> 200kb) disebut Ti (Tumor inducing) plasmid yang berperan dalam induksi tumor. Selama inokulasi, suatu segmen DNA yang bersifat mobile dari Ti plasmid (disebut TDNA) ditransfer ke inti sel tanaman dan terintegrasi ke dalam genom tanaman (Zupan dan Zambryski, 1995) dan 95% dari sel-sel tumor tersebut tertransformasi (Deeken et al., 2006). Sifat alamiah A. tumefaciens dalam menginduksi tumor pada tanaman seperti tersebut di atas kemudian dimanfaatkan dalam rekayasa genetika tumbuhan.
Tiga hal penting yang
mendasari proses transfer T-DNA ke sel tanaman adalah sebagai berikut. 1. Pembentukan tumor, merupakan suatu proses transformasi yang dihasilkan dari transfer dan integrasi T-DNA ke sel tanaman dan ekspresi gen-gen pada T-DNA. 2. Gen-gen pada T-DNA ditranskripsi hanya dalam sel tanaman dan tidak berperan selama proses transfer. 3. Suatu DNA asing yang disisipkan diantara T-DNA border dapat ditransfer ke sel-sel tanaman (Opabode 2006). Pada tanaman anggrek, transformasi genetik dengan perantara A. tumefaciens sudah berhasi dilakukan untuk anggrek Dendrobium nobile (Men et al., 2003), Phalaenopsis hibrida (Chai et al., 2002); Mishiba et al., 2005), anggrek Cymbidium (Chin et al., 2007), 9
Phalaenopsis amabilis (Semiarti et al., 2007), Vanda hibrida ‟Tokyo Blue‟ (Shresta et al., 2007) dan Vanda tricolor Lindl. (Dwiyani dkk., 2011). Transformasi genetik tersebut pada tanaman anggrek dilakukan pada target transformasi berupa protocorm like bodies / plb yang berasal dari sel somatik (Men et al., 2003; Chin et al., 2007; Shresta et al., 2007) serta protocorm yang berasal dari biji (Mishiba et al., 2005; Semiarti et al., 2007; Dwiyani dkk., 2011). Penelitian ini menggunakan anggrek Vanda tricolor Lindl. var. suavis forma Bali seperti yang dilakukan oleh Dwiyani dkk. (2012), akan tetapi menggunakan target transformasi yang lebih bervariasi yakni protocorm dan plb. Sedangkan Dwiyani (2012) hanya menggunakan protocorm sebagai target transformasi. Meskipun relatif lebih sulit untuk menghasilkan plb (dari sel somatik) dibandingkan menghasilkan protocorm (dari biji), namun diharapkan dengan target berupa plb, terjadinya chimera dapat dihindarkan.
Selain itu,
seleksi transforman dalam penelitian ini menggunakan higromisin, sedangkan Dwiyani dkk. (2011) menggunakan kanamisin sebagai agen penyeleksi transforman.
Hasil seleksi
menggunakan kanamisin bersifat sangat bias, sehingga banyak ditemukan adanya tanaman non-transforman diantara kandidat transforman yang dihasilkan (Dwiyani, 2012), sedangkan menggunakan antibiotik higromisin hasilnya lebih akurat, karena jaringan tanaman umunnya bersifat sensitif terhadap antibiotik higromisin. Penelitian ini juga menggunakan metode transformasi in planta yang sangat spesifik untuk tanaman anggrek dan belum pernah dilaporkan sebelumnya. Pada penelitian ini dilakukan overekspresi gen pembungaan yaitu gen PaFT dengan „strong promoter‟ Ubiquitin. Gen PaFT adalah gen ortholog dari FLOWERING LOCUS T (FT) yang diisolasi dari tanaman Platanus acerifolia (Pa) (Zhang et al. 2011). Mercuriani (Komunikasi pribadi 2013) sudah berhasil melakukan transformasi gen PaFT melalui Agrobacterium tumefaciens pada anggrek Phalaenopsis amabilis, namun belum ada yang melaporkan untuk tanaman anggrek genus Vanda yang memiliki masa juvenil sangat panjang, lebih panjang dari anggrek P. amabilis.
10
BAB 3. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk menghasilkan kultivar baru anggrek V. tricolor Lindl. var. suavis forma Bali yang memiliki kemampuan mencapai masa berbunga lebih cepat melalui rekayasa genetika. Tujuan penelitian tahap 3 adalah mendapatkan kandidat transgenik dari transformasi in planta serta mendeteksi keberadaan gen pembungaan pada genom tanaman melalui analisis PCR dengan primer spesifik untuk gen PaFT. Selanjutnya kandidat transforman yang positif mengandung gen PaFT disebut transforman.
Manfaat Penelitian Hasil penelitian ini berguna secara aplikatif karena kultivar baru anggrek yang dihasilkan dapat dikembangkan untuk kepentingan agribisnis florikultura di pulau Bali. Kultivar baru anggrek V. tricolor Lidl. forma Bali yang dihasilkan melalui penelitian ini dapat dijadikan tanaman induk untuk menghasilkan hibrida-hibrida baru genus Vanda yang berbunga lebih cepat.
Rhodora dan Thomas (1996) menyatakan bahwa gen asing yang ada
pada tanaman transgenik yang dihasilkan melalui transformasi dengan Agrobacterium diturunkan pada progeninya melalui Hukum Mendel. Metode transformasi yang juga dihasilkan dari penelitian ini dapat memperkaya hasilhasil penelitian Universitas Udayana di bidang bioteknologi dan biomolekuler, sehingga diharapkan dapat bersaing secara nasional maupun internasional dalam pengembangan IPTEK. Tanaman transgenik yang dihasilkan pada tahap 3 ini dapat didaftarkan sebagai paten karena sejauh ini penelitian mengenai tanaman transgenik Vanda tricolor Lindl. yang cepat berbunga belum pernah dilaporkan. Metode transformasi in planta yang dilakukan dalam penelitian ini juga belum pernah dilaporkan sebelumnya, sehingga juga berpotensi paten.
BAB 4. METODE PENELITIAN PENELITIAN TAHAP 3 Pekerjaan yang sudah dan akan dilakukan pada penelitian tahap 3 adalah sebabagi berikut: Panen Buah (kapsul) anggrek Hasil Penelitian Transformasi In planta Tahap 2 Transformasi in planta tahap 2 menghasilkan 12 buah anggrek Vanda tricolor (merupakan 4 kombinasi perlakuan, 3 ulangan) dan 2 buah anggrek tanpa perlakuan. Buah-
11
buah tersebut bijinya layak ditabur pada umur 7 bulan setelah semai yakni tanggal 29/04/2015, dengan demikian panen dilakukan pada tanggal tersebut. Penanaman Biji Anggrek Hasil Transformasi in planta Buah anggrek hasil selfing yang berumur 7 bulan dipanen, disterilisasi baru kemudian ditabur pada media MS (dengan konsentrasi 50%) yang ditambah 100 gram per liter tomat. Sterilisasi terhadap material tanam dilakukan dengan tahapan sebagai berikut. Pertama buah anggrek (yang akan ditabur bijinya) dicuci pada kucuran air kran sambil disikat (dengan sikat gigi bersih) menggunakan detergen.
Selanjutnya buah anggrek yang sudah bersih ini
dicelupkan dalam spiritus dan dibakar di atas lampu bunsen. Hal ini dilakukan sebanyak tiga kali, baru kemudian dimasukkan ke dalam laminar. Di dalam laminar, buah anggrek tersebut dipegang dengan pinset, dibakar sekali lagi baru kemudian dibelah. Selanjutnya biji-biji anggrek ditanam pada media yang sudah disiapkan. Uji Higromisin Uji higromisin terhadap protokorm anggrek V. tricolor dilakukan dengan konsentrasi higromisin 0 ppm (kontrol), 5 ppm, 10 ppm, 15 ppm dan 20 ppm. Diamati persentase protokorm mati setiap minggu. Seleksi Protokorm Seleksi awal terhadap keberadaan gen PaFT dilakukan dengan menanam protokorm yang berumur 8 minggu pada media higromisin. Protokorm yang tetap hijau pada media yang mengandung higromisin disebut sebagai kandidat transforman, mengindikasikan bahwa gen tersebut diduga terinsersi pada genom tanaman. Konfirmasi transgen dengan PCR Selanjutnya protokorm hijau tersebut ditumbuhkan hingga menjadi plantlet yang memiliki 2 daun. Plantlet ini kemudian dambil satu daunnya untuk diisolasi DNA genomnya. Selanjutnya
di
PCR
dengan
primer
dengan
primer
Ubiquitin
(forward:
5'-
TTGTCGATGCTCACCCTG-3 ') dan TNos (reverse: 5'-GATCTAGTAACATAGAT 12
GACACCGCG-3'). Dengan menggunakan primer ini maka harus dihasilkan 1100bp untuk konfirmasi bahwa transgen benar-benar terinsersi. BAB 5. HASIL YANG SUDAH DICAPAI Panen Buah (Kapsul) Anggrek Hasil Transformasi In planta Buah hasil transformasi in planta yang berumur 7 bulan setelah selfing dapat dilihat pada Gambar 1. Buah-buah tersebut dipanen selama 3 hari berturut-turut. Ulangan satu dipanen pada hari pertama dan hari selanjutnya berturut turut untuk ulangan 2 dan 3.
Gambar 1. Buah hasil transformasi in planta pada tahap 2 yang dipanen pada tahap 3
Penanaman Biji Anggrek Hasil Transformasi in planta Biji anggrek yang berasal dari buah yang dipanen tersebut ditabur secara in vitro pada media ½ MS yang mengandung 100 gram ekstrak tomat (Gambar 2).
13
Gambar 2. Biji anggrek hasil transformasi in planta setelah ditanam Uji Higromisin terhadap protokorm kontrol (Wildtype) Pengamatan setelah tanaman kontrol ditanam selama 4 minggu pada media MS yang ditambah higromisin dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Hasil Pengamatan Uji Higromisin Konsentrasi Higromisin (ppm) 0 5 10 15 20
Persentase Prokorm hijau (%) Ulangan 1 100 20 60 14 0
Ulangan 2 87 60 10 12,5 0
Berdasarkan uji higromisin ini, maka digunakan konsentrasi higromisin 15 ppm untuk seleksi.
Seleksi Transforman Hasil seleksi terhadap protokorm anggrek hasil transformasi in planta dapat dilihat pada Tabel 2 (PGA 102) dan Tabel 3 (PGA 3426). PGA 102 adalah vektor yang membawa gen PaFT, sedangkan PGA 3426 adalah hanya vektor tanpa gen PaFT.
Namun kedua
konstruksi ini mengandung gen ketahanan terhadap higromisin (gen hpt) sehingga seleksi awal tanaman juga dapat dilakukan dengan antibiotik higromisin. 14
Tabel 2 memperlihatkan bahwa perlakuan perendaman selama 2 jam pada suspensi Agrobacterium yang ditambah 25 ppm asetosiringon (AS) memberikan hasil terbaik.
Hasil
penelitian juga menunjukkan bahwa lamanya perendaman polen dengan suspensi Agrobacterium sangat penting.
Hasil penelitian ini membuktikan bahwa lamanya
perendaman polen pada suspensi Agrobacterium memberikan peran lebih penting dibandingkan asetosiringon. Tabel 2. Hasil seleksi awal transforman dengan vektor yang membawa gen PaFT dan gen hpt Perlakuan
PGA 102 perendaman dengan 25 ppm AS selama 1 jam PGA 102 perendaman dengan 25 ppm AS selama 2 jam PGA 102 perendaman 0 ppm (tanpa AS) selama 2 jam
Jumlah Prokorm hijau Ulangan 1 3 dari 38 = 7.89%
Ulangan 2 1 dari 33 = 3.03%
Ulangan 3 0 dari 32 = 0%
Rata-rata
11 dari 35 = 31.42%
3 dari 14 = 28.57%
3 dari 17 = 17.6%
25.86%
3 dari 20= 15%
0 dari 17= 0%
3 dari 19= 15.8%
10.27%
3.61%
Tabel 3. Hasil seleksi awal transforman dengan vektor yang membawa hanya gen hpt Perlakuan
PGA 3426 perendaman 0 ppm (tanpa AS) selama 1 jam PGA 3426 perendaman 0 ppm (tanpa AS) selama 2 jam
Jumlah Prokorm hijau Ulangan 1 0 dari 15 = 0%
Ulangan 2 0 dari 15 = 0%
Ulangan 3 0 dari 15 = 0%
3 dari 17 = 20%
3 dari 15= 17.65%
3 dari 9 = 33.33%
Rata-rata 0%
23.66%
Tabel 3 menunjukkan bahwa meskipun tanpa asetosiringon namun dengan lama perendaman 2 jam,tetap dihasilkan kandidat transforman, sementara pada perlakuan lama perendaman 1 jam tidak dihasilkan kandidat transforman. Poin ini juga membuktikan bahwa peran dari lama perendaman sangat penting. 15
Hasil Tabel 2 dan 3 ini membuktikan bahwa asetosiringon tetap dibutuhkan untuk transfer gen pada anggrek V. tricolor, lama perendaman meningkatkan proses transformasi sehingga dihasilkan lebih banyak kandidat transforman. Gambar 3 dan 4 memperlihatkan hasil seleksi transforman PGA 102 dengan antibiotik higromisin, yakni 5 ppm (Gambar 3) dan 15 ppm (Gambar 4). Dihasilkan lebih banyak kandidat transforman dengan 5 ppm higromisin. Gambar 5 memperlihatkan hasil seleksi transforman
PGA 3426 pada 15 ppm higromisin.
Protokorm hijau atau kandidat
transforman hanya didapat pada perlakuan perendaman polen selama 2 jam. Pembuktian bahwa gen tersebut terintegrasi pada genom tanaman dilakukan dengan analisis PCR yang akan dilakukan jika tanaman sudah memiliki minimal 2 daun. Berdasarkan pengalaman penelitian sebelumnya, daun V. tricolor akan terbentuk pada 4 bulan setelah semai.
PGA 102 +25 ppm AS (perendaman 1 jam)
PGA 102 +25 ppm AS (perendaman 2 jam) Gambar 3. Hasil seleksi awal transforman PGA 102 dengan 5 ppm higromisin 16
Hasil sementara penelitian ini mendapatkan bahwa lamanya perendaman serta asetosiringon dibutuhkan untuk transformasi in planta dengan metode yang dijelaskan dalam penelitian ini.
Tanaman umumnya tidak memiliki gen ketahanan terhadap antibiotik
higromisisn, sehingga kandidat transforman hasil seleksi menggunakan higromisin lebih memberikan gambaran yang tidak bias jika dilakukan analisis PCR.
Protokorm PGA 102 perendaman dengan 25 ppm asetosiringon selama 2 jam
Protokorm PGA 102 perendaman dengan 25 ppm asetosiringon selama 1 jam
Protokorm PGA 102 perendaman dengan distilled water selama 2 jam
Protokorm Kontrol (Wild type)
Gambar 4. Hasil seleksi awal transforman PGA 102 dengan 15 ppm higromisin
17
PGA 3426 perendaman selama 1 jam
PGA 3426 perendaman selama 2 jam
Gambar 5. Hasil seleksi awal transforman PGA 3426 pada 15 ppm higromisin Hasil Konfirmasi transgen dengan PCR Hasil konfirmasi transgen dilakukan menggunakan primer Ubiquitin (forward: 5'TTGTCGATGCTCACCCTG-3 ') dan TNos (reverse: 5'-GATCTAGTAACATAGAT GACACCGCG-3'). Yang dicoba sebanyak 5 kandidat, karena baru 5 kandidat transforman yang bisa diambil sampel daunnya untuk isolasi DNA, artinya baru 5 tanaman yang memiliki daun 2 buah dan berukuran agak besar yang bisa diambil sampel daunnya. Daun tersebut diisolasi DNA-nya dan di PCR dengan primer tersebut di atas menggunakan metode yang tercantum dalam “Bahan dan Metode”.
Hasil elektroforesis
menunjukkan bahwa 4 dari 5 tanaman yang dicoba, mengamplifikasi pita sepanjang 1100bp (Gambar 6), mengindikasikan bahwa gen PaFT yang dikonstruksi bersama promoter ubiquitin dan transminator Tnos terinsersi ke genom tanaman Vanda tricolor.
18
M
1
2
3
4
5
K
1100bp
500 bp
100 bp
Gambar 6. Hasil Elektroforesis M=Marka; 1,2,3,4,5 = sampel kandidat transforman V. tricolor; K=V.tricolor kontrol
BAB 6. LUARAN YANG SUDAH DICAPAI Beberapa luaran yang sudah dihasilkan dari Penelitian Hibah Bersaing Dikti hingga memasuki tahun 3 ini adalah sebagai berikut: 1. Jurnal nasional tidak terakreditasi (Jurnal Agrotropika vol 18 no 2, Juli-Desember 2013, FP Unila) 2. Jurnal internasional terindexed Scopus (Agrivita Vol 37 no 2 tahun 2015). 3. Disampaikan secara oral pada Seminar Nasional PERHORTI di Malang tahun 2014. 4. Disampaikan secara oral pada Seminar 5th International Conference on Bioscience and Biotechnology (ICBB) di Denpasar tahun 2014. 5. Disampaikan sebagai poster presenter pada Seminar 6th International Conference on Bioscience and Biotechnology (ICBB) di Denpasar tahun 2015. 6. Disampaikan secara oral pada Seminar Senastek UNUD 2015 7. Buku ber-ISBN
19
BAB 7. KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan hasil penelitian ini adalah sebagai berikut: 1. Pada transformasi In planta dengan Agrobacterium, lama perendaman polen selama 2 jam dan penambahan asetosiringon 25 ppm pada suspensi Agrobacterium memberikan persentase kandidat transforman tertinggi. 2.
Hasil
konfirmasi
transgen
dengan
primer
Ubiquitin
(forward:
5'-
TTGTCGATGCTCACCCTG-3 ') dan TNos (reverse: 5'-GATCTAGTAACATAGAT GACACCGCG-3'), menunjukkan bahwa transgen telah terinsersi pada genom tanaman.
DAFTAR PUSTAKA Alimohammadi, M & Bagherih-Najjar, MB 2009, „Agrobacterium-mediated transformation of plants : Basic principles and influencing factors‟, African J. Biotechnol., vol. 8, no. 20, pp. 5142-5148. Banks,D.P. 1999. Tropical Orchids of Indonesia. Periplus Edition (HK) Ltd, Singapore. 64p. Chai, ML, Xu, CJ, Senthil, KK, Kim, JY, & Kim, H 2002, „Stable transformation of protocorm like bodies in Phalaenopsis orchid mediated by Agrobacterium tumefaciens‟, Sci. Hort., vol. 96, pp.213-224. Cheng, M, Fry, JE, Pang, SZ, Zhou, HP, Hironaka, CM, Duncan, DR, Conner, W & Wan, YC 1997, „Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens‟, Plant Physiol., vol. 115, pp. 971-980. Chin, DP, Mishiba, K, & Mii, M 2007, „Agrobacterium-mediated transformation of protocorm-like bodies in Cymbidium‟, Plant Cell Rep., vol. 26, pp. 735-743. Christensen, AH & Quai, PH 1996, „Ubiquitin promoter based-vector for high level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants‟, Transgenic Res., vo. 5, pp. 213-218 Deeken,R., Engelmann,J.C., Efetova,M., Czirjak,T., Muller,T., Kaiser,W.M., Tietz, Krischke,M.O., Mueller,M.J., Palme,K., Dandekar,T., Hedricha, R. 2006. An Integrated View of Gene Expression and Solute Profiles of Arabidopsis Tumors: A Genome-Wide Approach. Plant Cell, 18:3617-3634. Departemen Pertanian RI 2007, Prospek dan Arah Pengembangan Agribisnis: Rangkuman Kebutuhan Investasi , Edisi Kedua, diunduh tanggal 17 Desember 2014 (http://www.google.com/.litbang.pertanian.go.id_bidangmasalah investasi) Dwiyani, R 2012, „Mikropropagasi Tanaman Anggrek Vanda tricolor Lindl. var suavis forma Bali yang membawa gen KNOTTED1-LIKE Arabidopsis thaliana (KNAT1)‟, Disertasi, Program Studi Bioteknologi, Sekolah Pasca Sarjana, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Dwiyani, R, Purwantoro, A, Indrianto, A & Semiarti, E 2009, „Peningkatan kecepatan pertumbuhan embrio anggrek Vanda tricolor Lindl. pada medium diperkaya dengan ekstrak tomat‟, Prosiding Seminar Biologi Nasional XX, Universitas Islam Negeri Malang , Hlm. 590 - 597. 20
Hiei, Y, Ohta, S, Komari, T & Kumashiro, T 1994, „Efficient transformation of rice (Oryza sativa) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA‟, The Plant J., vol. 6, pp. 271-282. Indrianto,A. 2003. Kultur Jaringan Tumbuhan (Bahan Ajar). Fakultas Biologi Universitas Gadjahmada, Yogyakarta. Irawati 2002, „Pelestarian jenis anggrek Indonesia‟, Buku panduan Seminar Anggrek Indonesia, Yogyakarta, Hlm. 34-45. Ishida, Y, Saito, H, Ohta, S, Hiei, Y, Komari, T & Kumashiro,T 1996, „High efficiency of transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens‟, Nat. Biotechnol., vol. 14, pp. 745-750. Islam, MO, Ichihasi, S & Matsui, S 1998 „Control of growth and development of protokorm like body derived from callus by carbon sources in Phalaenopsis‟, Plant Biotechnol., vol. 15, pp. 183-187. Lestari, E.S. 2010. Karakterisasi Morfologis dan Molekuler Anggrek Vanda tricolor Lindl. var. suavis Asal Merapi dan Bali. Skripsi. Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada. Men,S., Ming,X., Liu,R., Wei,C., Li,Y. 2003. Agrobacterium-mediated genetic transformation of a Dendrobium orchid. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 75: 63-71. Mishiba,K., Chin,DP., Mii,M. 2005. Agrobacterium-mediated transformation of Phalaenopsis by targeting protocorms at an early stage after germination. Plant Cell Rep. 24: 297-303. Nazim-Ud-Dowla, MAN, Ahmed, NU & Hasan, L 2008, „Optimization of Agrobacteriummediated Genetic Transformation in Indica Rice‟, Thai Journal of Agric.Sci., vol. 41, pp. 127-133 Opabode,J.T. 2006. Agrobacterium-mediated transformation of plants : emerging factors that influence efficiency, Review. Biotechnol. and Mol. Biol. 1: 12-20. Pandey, V, Misra, P, Chaturvedi, P, Misra, MK, Trivedi, PK & Tull, R. 2010. Agrobacterium-mediated Transformation of Whithania somnifora (L.) Dunul: An Important Medical Plant‟, Plant Cell Rep., vol. 29, pp. 133-141 Semiarti, E, Indrianto, A, Purwantoro, A, Isminingsih, S, Suseno, N, Ishikawa, NT, Yoshioka, Y, Machida, Y & Machida, C 2007, „Agrobacterium-mediated transformation of the wild orchid species Phalaenopsis amabilis‟, Plant Biotechnol., vol. 24, pp. 265272. Shrestha, BR, Chin, DP, Tokuhara, K & Mii, M 2007, „Efficient production of transgenic plants of Vanda through sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation of protocorm-like bodies‟, Plant Biotechnol., vol. 24, pp. 429-434. Yenchon, S & Te-Cato, S 2012, „Effect of bacteria density, innoculation and co-cultivation period of Agrobacterium-mediated transformation of oil palm embryogenic callus‟, J. Agric. Technol., vol. 8, no. 4, pp. 1485-1496 Zhang J1, Liu G, Guo C, He Y, Li Z, Ning G, Shi X, Bao M 2011, „The FLOWERING LOCUS T orthologous gene of Platanus acerifolia is expressed as alternatively spliced forms with distinct spatial and temporal patterns‟, Plant Biol., vol. 13, no. 5, pp. 809-820. Zhao, ZY, Gu, W, Chai, T, Tagliani, L, Miller, M, Wang, N, Pang, H, Rudert, M, Schroeder, S, Hondred, D, Seltzer, J & Piercce, D 2000, „Agrobacterium-mediated shorgum transformation‟, Plant Mol.Biol., vol. 44, pp. 789-798. Zupan,J.R., Zambryski,P.C., 1995. Transfer of T-DNA from Agrobacterium to the plant cell. Plant Physiol. 107: 1041-1047. 21
LAMPIRAN Publikasi selama 3 tahun 1. Agrotropika vol 18 no 2 (Juli-Desember) 2013
22
2. Jurnal Agrivita vol 37 no2 2015 (Internasional terindex Scopus, Elsevier, Cross-Reff, ProQuest, SJR)
23
3.
Disampaikan sebagai pemakalah oral pada HORTIKULTURA Di Malang (Nov. 2014)
SEMINAR
PERHIMPUNAN
24
4. Pemakalah oral dalam ICBB ke 5 Sept 2014
25
5. Poster Presenter ICBB 6 (Sept 2015)
26
6. Senastek UNUD 2015 Abstrak Senastek UNUD 2015 Transformasi In Planta melalui Agrobacterium tumefaciens pada Tanaman Anggrek Vanda tricolor 1) R. Dwiyani , H. Yuswanti1), I.A.P. Darmawati1), I.S. Mercuriani2) dan E. Semiarti3) 1) Fakultas Pertanian, Universitas Udayana, Denpasar, Bali 2) Fakultas Biologi Universitas Negeri Yogyakarta, Yogyakarta 3) Fakultas Biologi Univarsitas Gadjah Mada, Yogyakarta Coresponding author: HP 0811386265; e-mail:
[email protected] ABSTRAK Penelitian mengenai transformasi In planta melalui Agrobacterium tumefaciens pada anggrek Vanda tricolor telah dilakukan dari bulan September 2014 hingga Juni 2015. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh periode inokulasi serta pengaruh asetosiringon terhadap persentase kandidat transforman yang dihasilkan pada transformasi in planta melalui A. tumefaciens pada anggrek V. tricolor.. Penelitian ini menggunaka T-DNA membawa gen pembungaan PaFT dengan „strong promoter‟ Ubiquitin dan gen hpt yaitu gen ketahanan higromisin sebagai „selectable marker‟ yang dikonstruksi pada vektor PGAS. . Penelitian transformasi in planta ini dilakukan secara faktorial dengan dua faktor. Faktor pertama yaitu lama perendaman polen dengan suspensi Agrobacterium (1 dan 2 jam). Faktor kedua yaitu pemberian Asetosyringone (AS), tanpa AS dan dengan 25 ppm AS. Hasil penelitian mendapatkan bahwa lama perendaman polen selama 2 jam dengan pemberian 25 ppm AS menghasilkan persentase kandidat transforman tertinggi (yakni 25%) melalui seleksi awal dengan 15 ppm higromisin. Kata kunci: Transformasi in planta, Agrobacterium tumefaciens, Asetosiringon, gen PaFT, periode inokulasi, Vanda tricolor
27
7. Buku ber ISBN
28
