Maligne mesotheliomen. Woord vooraf

Maligne mesotheliomen

Woord vooraf Ik heb mijn stage gelopen in het UZ – Gent in het laboratorium van de dienst pathologie. Mijn onderwerp betreft het uittesten van het antilichaam WT1 op maligne mesotheliomen en het uittesten van het antilichaam NF-κB op sarcomatoid mesothelioom en subacute pleuritis. Hierbij wil ik vooral de volgende personen bedanken: vooreerst Prof Praet, mijn promotor, voor het interessante onderwerp van mijn stage en de uitstekende begeleiding. De vele uitleg van, en de vlotte samenwerking met de laboranten van de dienst pathologie heb ik ten zeerste op prijs gesteld. Ik wil Mevr. Willems, mijn stagementor, bedanken voor de waardevolle begeleiding. Tevens wil ik ook de lectoren van de Hoge School West – Vlaanderen bedanken voor de kansen die ik heb gekregen om mijn opleiding te voltooien. Ten slotte wil ik nog mijn vriend en mijn ouders bedanken voor de steun, in de goede en mindere momenten.

1


Samenvatting Mijn stage is uitgevoerd in het UZ – Gent dienst pathologie. Mijn onderwerp bestaat uit de volgende twee delen. Het eerste deel van mijn scriptie gaat over het uittesten van het antilichaam WT1 op maligne mesotheliomen. Meer bepaald de drie verschillende histopathologisch patronen: epitheliaal mesothelioom, sarcomatoid mesothelioom en bifasisch mesothelioom. Hierbij onderzoeken we of de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 diagnostisch is voor epitheliaal mesothelioom, sarcomatoid mesothelioom en bifasisch mesothelioom. Het tweede deel van mijn scriptie gaat over het uittesten van het antilichaam NF-κB op sarcomatoid mesothelioom en subacute pleuritis. Hierbij onderzoeken we of we onderscheid maken tussen het inflammatoire beeld dat te zien is bij subacute pleuritis en het carcinogene beeld dat te zien is bij sarcomatoid mesothelioom. Hierbij is de ABC methode toegepast als immunohistochemische kleuring. ABC staat voor Avidine – biotine complex verbonden met een enzym peroxidase. Deze methode maakt gebruik van de affiniteit van het eiwit avidine voor de vitamine biotine. Het protocol bestaat uit de volgende stappen: fixatie van het weefsel, paraffineren en inbedden, snijden van coupes, deparaffineren, voorbehandeling, ABC – methode, dehydrateren en monteren. Voor elk antilichaam worden de meest geschikte parameters bepaalt op een positieve controle om een optimale immunohistochemische kleuring te verkrijgen. Deze zijn: de verdunning van het antilichaam, de voorbehandeling, amplificatie en de incubatietijd van het antilichaam. De positieve controle geeft de specificiteit of het aantal gekleurde kernen weer. Tevens gebeurt er een negatieve controle. De negatieve controle geeft de aspecificiteit of achtergrond weer. Voor een immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 zijn de volgende parameters het meest geschikt: verdunning 1/50 van het antilichaam WT1, de voorbehandeling EDTA, met amplificatie en een incubatietijd van 32 minuten van het antilichaam WT1. Deze parameters zijn bepaald op epitheliaal mesothelioom. Voor een immunohistochemische kleuring met het antilichaam NF – κB zijn de volgende parameters het meest geschikt: verdunning 1/1500 van het antilichaam NF – κB, de voorbehandeling EDTA, zonder amplificatie en een incubatietijd van 32 minuten van het antilichaam NF – κB. Deze parameters zijn bepaald op een positieve controle, het borstweefsel. 2


Biopten, van 15 verschillende patiënten van wie men weet dat het weefsel epitheliaal mesothelioom bevat, zijn gekleurd met het antilichaam WT1. Biopten, van 15 verschillende patiënten van wie men weet dat het weefsel sarcomatoid mesothelioom bevat, zijn gekleurd met het antilichaam WT1. Biopten, van 15 verschillende patiënten van wie men weet dat het weefsel epitheliaal mesothelioom bevat, zijn gekleurd met het antilichaam WT1. Hierbij onderzoeken we of de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 diagnostisch is voor epitheliaal mesothelioom, sarcomatoid mesothelioom en bifasisch mesothelioom. Tevens zijn biopten, van 15 verschillende patiënten van wie men weet dat het weefsel sarcomatoid mesothelioom bevat, zijn gekleurd met het antilichaam NF – κB. Biopten, van 15 verschillende patiënten van wie men weet dat het weefsel subacute pleuritis bevat zijn gekleurd met het antilichaam NF – κB. Hierbij onderzoeken we het onderscheid tussen het inflammatoire beeld dat te zien is bij subacute pleuritis en het carcinogene beeld dat te zien is bij sarcomatoid mesothelioom. Als resultaat wordt de gevoeligheid en de specificiteit weergegeven. De gevoeligheid van de immunohistochemische kleuring met het WT1 antilichaam geeft de sterkte van de kleuring weer. De specificiteit geeft het aantal gekleurde kernen weer. De gevoeligheid van de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 op epitheliaal mesothelioom bedraagt 66%. De specificiteit van de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 op epitheliaal mesothelioom bedraagt 63%. De gevoeligheid en de specificiteit liggen duidelijk hoog. Hieruit besluiten we dat de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 diagnostisch is voor epitheliaal mesothelioom. De gevoeligheid van de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 op sarcomatoid mesothelioom is 30%. De specificiteit van de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 op sarcomatoid mesothelioom is 15%. De gevoeligheid en de specificiteit liggen duidelijk laag. Hierbij besluiten we dat de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 niet diagnostisch is voor sarcomatoid mesothelioom. De gevoeligheid van de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 op bifasisch mesothelioom bedraagt 68%. De specificiteit van de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 op bifasisch mesothelioom bedraagt 57%. De gevoeligheid en de specificiteit liggen lager dan het epitheliaal mesothelioom. Hieruit besluiten we dat de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 minder diagnostisch is dan het epitheliaal mesothelioom. 3


Het WT1 – antilichaam kleurt specifiek de kernen van epitheliaal tumorale cellen. Het WT1 – antilichaam kleurt aspecifiek de vaatwand, het spierweefsel. Het kleurt geen necrose. Het antilichaam NF-κB kan door middel van immunohistochemische kleuring geen onderscheid maken tussen het inflammatoire beeld dat te zien is bij subacute pleuritis en het carcinogeen beeld dat te zien is bij sarcomatoid mesothelioom.

4


Lijst met afkortingen en symbolen 11p13

Chromosoom

ABC – methode

Avidine biotine complex methode

APK

Tris gebaseerd buffer oplossing

BER – EP4

Glycoproteïne merker

B72.3

Glycoproteïne merker

CK 5/6

Mesothelioom merker cytokeratine 5/6

CEA

Carcino embryonaal antigen, adenocarcinoma merker

DAB

3,3 – diamino – benzidine

DNA

Desoxyribonucleïnezuur

EGFR

-1

EDTA

Epidermale groei factor receptor “Ethyleen diamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate”

G – T transversie

Guanine – thymine transversie

G1 – fase

Groei fase - 1 in de celcyclus waarbij toename van cytoplasma.

H2O2

Waterstofperoxide

HBME – 1

Mesothelioom merker

IL – 1

Interleukine 1, transcriptiefactor

IGF

“Insuline like growth factor”

IkB

Inhibitie proteïne

IKKs of IkB kinasen Enzymen die de IkB subeenheid van het NF-kB p65 proteïne fosforyleren. LEU – M1

Monoclonaal antilichaam CD15, adenocarcinoma merker

NaCl

Natriumchloride

NF-κB

Nucleaire factor voor Ig kappa (κ) in B cellen 5


NAC

N – acetyl cysteïne

p 53

Proteïne 53, tumorsupressorgen

p 15


p 16


PDGFA

“Platelet derived factor A chain”, groei gerelateerd gen

P60/ p65

Dimeer geassocieerd met een inhibitie proteïne Ikb

P65/Rel A

Proteïne van NF-κB

PDTC

“Pyridine-2,6-dithiocarboxylic acid”, “pyrollidine dithiocarbamate”

Rb1

Retinoblastoma proteïne

RHD

Rel homoloog domein

ROS

“Reactie oxygen species”

RNS

Reactief nitrogeen specie

SEN 6

Locus op chromosoom 6 voor SV40 immunisering

SPC11

Mesothelioma cellijn

Ser 468

Serine 468

Ser 536

Serine 536

Ser 276

Serine 276

SA – HRP

“Straptavidine – horse radisch peroxidase”

TTF – 1

thyroid transcriptie factor, adenocarcinoma merker

TNF – α

Tumor necrosis factor α

TBS

Tris buffer oplossing

T.I.P.S.

Totaal geïntegreerd pipetten systeem

V – cis

variabele oncogen

WT1

Wilm’s tumor

WAGR

“Wilm’s tumor aniridia genital malformation and mental redardation” 6


Verklarende woordenlijst Adenocarcinoom

Het carcinoom ontstaat in klierweefsel. Het kenmerk is dat de cellen een excretiefunctie hebben. Een adenocarcinoom kan vooraf aanwezig zijn als een goedaardig gezwel of adenoom.

Apoptose

Apoptose betekent celdood.

Aspecificiteit

Aspecificiteit betekent de achtergrond in een gekleurde coupe.

Bifasisch

Het bestaat een sarcomatoid en epitheliaal histologisch patroon.

Desmoplastisch

Desmoplastisch patroon door elkaar lopende bundels van hyaline collageen.

Endometrium

Synoniem is baarmoederslijmvlies. Het is een bedekkende laag aan de binnenzijde van de baarmoeder.

Epitheel

Epitheelweefsel bekleed verschillende lichaamsholten en het vrij oppervlak van het lichaam. Tussen epitheelcellen is weinig intercellulaire stof waardoor ze dicht tegen elkaar liggen. Hierdoor kunnen de moleculen moeilijk tussen de cellen diffunderen. Synoniem is epithelium.

Epitopen

Een antigeen heeft verschillende epitopen. Dit zijn herkenningsplaatsen voor antistoffen of antilichamen.

Fagocytose

Fagocytose heeft als doel het afbreken van eiwitten zodat de bestanddelen door de cel kunnen hergebruikt worden. Vaste deeltjes worden opgenomen door het membraam van een cel. Hierbij wordt een holte of fagosoom gevormd. Vervolgens breken proteasen de eiwitten af.

Gevoeligheid

De gevoeligheid geeft de sterkte van de kleuring weer.

Glomerulair

Glomerulair heeft betrekking tot vaatkluwens. 7


Heterodimeer

Heterodimeer bestaat uit twee verschillende delen.

Homodimeer

Homodimeer bestaat uit twee gelijke delen.

Inflammatie

Inflammatie is een ontsteking.

Mesotheel

Deze laag cellen vormt de bedekking van een aantal vliezen. Bijvoorbeeld: voor het buikvlies, het hartzakje. Synoniem is mesothelium.

Microvili

Microcvili zijn structuren die het celoppervlak vergroten. Hierdoor is er een betere absorbtie en secretie.

Mitose

Mitose betekent celdeling.

Nucleus

Synoniem voor nucleus is kern.

Oncogenen

Oncogenen zijn groeifactoren. Ze versnellen de celdeling.

Proteïne

Een proteïne is een eiwit.

Silicaat

Silicaat bestaat uit een verbinding van silicium en zuurstof met één of meer metalen en hydroxide-ionen.

Synovium

Synovium is zacht weefsel dat de niet kraakbeenachtige oppervlakten (verbindsstukken van gewrichten) met holten (synocviale verbindingen) bekleed.

Syncytiotrofoblasten

Syncytiotrofoblasten zijn stukjes DNA restant bij de afbraak van foetale cellen uit de placenta.

Sarcomatoid

Het bestaat uit sarcomatoid (spoelvormige cellen) en desmoplastisch patroon.

Specificiteit

Specificiteit betekent het aantal gekleurde kernen.

Supressie

Supressie betekent onderdrukking.

Sertoli cellen

Sertoli cellen bevinden zich in de testis van de man.

Tumorsupressorgen

Een tumorsuppressorgen is een gen dat onbeperkte deling van de cel voorkomt. Hierbij verhindert het ontstaan van een tumor. 8


Transcriptiefactor

Een proteïne dat de transcriptie van andere genen regelt.

Ubiquitine

Ubiquitine is een eiwit.

9


Lijst van tabellen en figuren Tabellen: Tabel 2-1 Chemische en fysische eigenschappen van asbestvezel ................................. 17 Tabel 2-2 Wereldwijde sterfte door mesothelioom bij mannen .......................................... 19 Tabel 2-3 Sterfte door asbest in België ............................................................................. 20 Tabel 2-4 Immunohistchemische anti-lichamen die het onderscheid maken tussen carcinomen en mesotheliomen................................................................................... 22 Tabel 3-1 Programma toestel "Tissue-Tek® VIPTM5 ........................................................ 27 Tabel 3-2 Nummers gesneden paraffineblokjes ................................................................ 35 Tabel 3-3 Nummers gesneden paraffineblokjes ................................................................ 36 Tabel 4-1 Resultaten Epitheloid mesothelioom ................................................................. 37 Tabel 4-2 Resultaten Sarcomatoid mesothelioom ............................................................. 38 Tabel 4-3 Resultaten Bifasisch mesothelioom................................................................... 39 Tabel 4-4 Specificiteit en gevoeligheid antilichaam WT1 .................................................. 40 Tabel 6-1 Mesothelioom over 30 jaar in West-Australië .................................................... 51 Tabel 6-2 Jaarlijkse sterfte door mesotheliomen in Zuid-Afrika ......................................... 51

10


Figuren: Figuur 2-1 NF-κB signalisatie ............................................................................................ 25 Figuur 3-1 Microtoom......................................................................................................... 28 Figuur 3-2 ABC – methode ................................................................................................ 31 Figuur 4-1bifasich mesothelioom (paraffine blokje 1659) .................................................. 40 Figuur 4-2 Bifasich mesotheloom (paraffineblokje 2298) .................................................. 41 Figuur 4-3 Bifasisch mesothelioom (paraffineblokje 1659) ................................................ 41 Figuur 4-4 Sarcomatoid mesothelioom (paraffineblokje 3012) .......................................... 41 Figuur 4-5 Sarcomatoid mesothelioom (paraffineblokje 1582) .......................................... 42 Figuur 4-6 Subacute Pleuritis (paraffineblokje 4012)......................................................... 42 Figuur 6-1 Huis gebouwd met blokken die erionietvezels bevatten ................................... 52

11


Inhoudsopgave Woord vooraf ..................................................................................................................... 1 Samenvatting ..................................................................................................................... 2 Lijst met afkortingen en symbolen .................................................................................. 5 Verklarende woordenlijst .................................................................................................. 7 Lijst van tabellen en figuren ........................................................................................... 10 Inhoudsopgave ................................................................................................................ 12 1

Inleiding, situatieschets en probleemstelling ................................................. 15

2

Literatuurstudie ................................................................................................. 16

2.1

Inleiding mesotheliomen .................................................................................. 16

2.1.1

Etiologie ........................................................................................................... 16

2.1.1.1

Asbest .............................................................................................................. 16

2.1.1.1.1

Wat is asbest ................................................................................................... 16

2.1.1.1.2

Longmechanisme asbest vezel ....................................................................... 17

2.1.1.1.3

Chromosomale veranderingen ten gevolge van asbest .................................. 18

2.1.1.2

Ionisatie radiologie ........................................................................................... 18

2.1.2

Epidemiologie .................................................................................................. 18

2.1.3

Histopathologische indeling van pleurale mesotheliomen ............................... 20

2.1.3.1

Epitheliaal mesothelioom ................................................................................. 20

2.1.3.2

Sarcomatoid mesothelioom ............................................................................. 20

2.1.3.3

Bifasische mesothelioom ................................................................................. 21

2.1.4

Immunohistochemie......................................................................................... 21

2.1.5

Mesotheliomen merkers .................................................................................. 22

2.1.5.1

cytokeratine 5/6 ............................................................................................... 22

2.1.5.2

Calretinine........................................................................................................ 22

2.1.5.3

Tromboduline ................................................................................................... 23 12


2.1.5.4

HBME – 1 ........................................................................................................ 23

2.2

WT1 gen .......................................................................................................... 23

2.3

Antilichaam tegen NF – κB .............................................................................. 24

3

Materiaal en methode ........................................................................................ 26

3.1

Fixatie van weefsel .......................................................................................... 26

3.1.1

Principe ............................................................................................................ 26

3.1.2

Benodigdheden................................................................................................ 26

3.1.3

Praktische uitvoering ....................................................................................... 26

3.2

Paraffineren en inbedden ................................................................................ 26

3.2.1

Principe ............................................................................................................ 26

3.2.2

Benodigdheden................................................................................................ 26

3.2.3


3.3

Snijden van de coupes .................................................................................... 28

3.3.1

Principe ............................................................................................................ 28

3.3.2

Benodigdheden................................................................................................ 28

3.3.3


3.4

Deparaffineren ................................................................................................. 29

3.4.1

Principe ............................................................................................................ 29

3.4.2

Benodigdheden................................................................................................ 29

3.4.3


3.5

Voorbehandelingen.......................................................................................... 29

3.5.1

Principe ............................................................................................................ 29

3.5.2

Benodigdheden................................................................................................ 29

3.5.3


3.6

Immunohistochemische kleuring ..................................................................... 30

3.6.1

Principe ............................................................................................................ 30

3.6.2

Benodigdheden................................................................................................ 31

3.6.3


3.6.3.1

Automatische uitvoering .................................................................................. 32

3.6.3.2

Manuele uitvoering .......................................................................................... 33

3.7

Dehydrateren ................................................................................................... 33 13


3.7.1

Principe ............................................................................................................ 33

3.7.2

Benodigdheden................................................................................................ 34

3.7.3


3.8

Monteren.......................................................................................................... 34

3.8.1

Principe ............................................................................................................ 34

3.8.2

Benodigdheden................................................................................................ 34

3.8.3


3.9

Gebruikte biopten ............................................................................................ 35

3.9.1

Antilichaam WT1.............................................................................................. 35

3.9.2

Antilichaam NF- κB .......................................................................................... 36

4

Resultaten .......................................................................................................... 37

4.1

Antilichaam WT1.............................................................................................. 37

4.1.1

Epitheliaal mesothelioom ................................................................................. 37

4.1.2

Sarcomatoid mesothelioom ............................................................................. 38

4.1.3

Bifasisch mesothelioom ................................................................................... 39

4.1.4

Gevoeligheid en specificiteit ............................................................................ 40

4.1.5

Foto’s coupes gekleurd met antilichaam WT1 ................................................. 40

4.2

Antilichaam NF – κB ........................................................................................ 42

4.2.1

Resultaten........................................................................................................ 42

4.2.2

Foto’s coupes gekleurd met antilichaam NF – κB ........................................... 42

5

Discussie ............................................................................................................ 43

5.1

Antilichaam WT1.............................................................................................. 43

5.2

Antilichaam NF-κB ........................................................................................... 45

6

Conclusie ............................................................................................................ 47

6.1

Antilichaam WT1.............................................................................................. 47

6.2

Antilichaam NF– κB ......................................................................................... 47

Literatuurlijst .................................................................................................................... 48 Bijlagen ............................................................................................................................. 51 Colofon 53 Voor akkoord verklaring ................................................................................................. 54 14

Maligne mesotheliomen Literatuurstudie

1

Inleiding, situatieschets en probleemstelling

Mijn stage is uitgevoerd in het UZ – Gent dienst pathologie. Mijn onderwerp bestaat uit de volgende twee delen. Het eerste deel van mijn scriptie gaat over het uittesten van het antilichaam WT1 op maligne mesotheliomen. Meer bepaald de drie verschillende histopathologisch patronen: epitheliaal mesothelioom, sarcomatoid mesothelioom en bifasisch mesothelioom. Hierbij onderzoeken we of de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 diagnostisch is voor epitheliaal mesothelioom, sarcomatoid mesothelioom en bifasisch mesothelioom. Het tweede deel van mijn scriptie gaat over het uittesten van het antilichaam NF-κB op sarcomatoid mesothelioom en subacute pleuritis. Hierbij onderzoeken we of we onderscheid maken tussen het inflammatoire beeld dat te zien is bij subacute pleuritis en het carcinogene beeld dat te zien is bij sarcomatoid mesothelioom. In de dienst pathologie van het UZ – Gent gebruikt men al vier mesotheliomen merkers om maligne mesotheliomen te bepalen. Deze vier mesotheliomen merkers zijn de volgende: cytokeratine 5/6, calretinine, trombomoduline en HBME – 1. Deze vier mesotheliomen merkers werken uitstekend. In de literatuur blijkt dat het antilichaam WT1 zeer diagnostisch is voor maligne mesotheliomen. Mij is gevraagd om de diagnostische waarde van het antilichaam WT1 uit te testen op epitheliaal mesothelioom, sarcomatoid mesothelioom en bifasisch mesothelioom door middel van een immunohistochemische kleuring. Indien de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 een duidelijk onderscheid vertoont tussen epitheliaal mesothelioom, sarcomatoid mesothelioom en bifasisch mesothelioom wordt het antilichaam toegevoegd in het antilichaampanel voor het diagnosticeren van maligne mesotheliomen. Het tweede deel van de scriptie dat bestaat uit het uittesten van het antilichaam NF-κB op sarcomatoid mesothelioom en subacute pleuritis met als doel het onderscheiden van een inflammatoir beeld (subacute pleuritis) en carcinogeen beeld (sarcomatoid mesothelioom). Dit is bedoeld als een extra onderzoek.

15


2

Literatuurstudie

2.1

Inleiding mesotheliomen

Mesotheliomen zijn kankers die voorkomen rondom de vliezen van de long en de buik.

2.1.1 Etiologie Mesotheliomen hebben verschillende oorzaken. De meest voorkomende oorzaken bepreken we in de volgende alinea’s. Deze zijn: asbest en ionisatieradiologie. (1)

2.1.1.1 Asbest Mesotheliomen ontstaan door blootstelling aan asbest. De expositie aan asbest is carcinogeen. Bij rokers is er schade aan de mucus laag van de luchtwegen Hierdoor is er contact tussen de asbestvezel en de mucus laag. Dit is de verklaring van het synergisme tussen roken en asbestexpositie in de long. (1)

2.1.1.1.1 Wat is asbest De kern van asbest bestaat uit silicaat met gelijkaardige fysische en chemische eigenschappen. Op basis van de morfologie kan men drie verschillende groepen onderscheiden: amfibool, serpentijn en erioniet. De groep amfibool bestaat uit crocidoliet (blauwe asbest), amosiet (bruine asbest), tremoliet, actinoliet, en anthophylliet. Deze vezels hebben een scherpe vorm. De groep serpentijn bestaat uit chrysoliet (witte asbest). De vezels zijn lang gebogen met een holle centrale kern. De vorm van serpentijn asbest vezels is minder dynamisch dan amfibool asbest. Erioniet is een fibreuze zeoliet. Het bestaat uit aluminium silicaat. Deze vezels hebben een gelijkende structuur en chemische samenstelling als deze van amfibool. Chrysoliet is het meest toxisch. Amosiet is minder toxisch. Crocidoliet is het minst toxisch.

16


Tabel 2-1 Chemische en fysische eigenschappen van asbestvezel (1)

Het carcinogeen potentieel wordt beïnvloed door de aanwezigheid van verschillende metalen in de kernstructuur is. De verschillende metalen in de kernstructuur beïnvloeden de fysische en chemische eigenschappen beïnvloeden. De lengte – breedte verhouding van de asbestvezel is belangrijk voor de carcinogenese. Vezels groter dan acht millimeter lang en met een breedte kleiner dan 0,25 millimeter zijn het meest toxisch. (1)

2.1.1.1.2 Longmechanisme asbest vezel Het longmechanisme bevat vijf stadia: inhalatie, bezinking, afzetting, translocatie, en ontbinding. Asbestvezels zijn enkel carcinogeen wanneer men ze inademt. De grootte van de vezel beïnvloed de hoeveelheid vezels die in de longen blijven. Wanneer de asbestvezel in de bovenste luchtwegen aanwezig is, wordt de asbestvezel afgezet op het epitheliaal oppervlak. Hoe groter de vezels, hoe beter de afzetting. Rechte vezels met grote lengte tot breedte verhouding (bijvoorbeeld amfibool asbest) worden het minst afgezet op het epitheliaal oppervlak. Asbestvezels kunnen in de distale luchtwegen het epithelium innemen en daarna het interstitium doorboren. Nadat het asbest vezels het interstitium doorboort, worden de vezels verwijderd op de volgende manieren: door afvoer in het lymfatische systeem, door fagocytose, en door ontbinding door lokale macrofagen. De manier van verwijderen wordt beïnvloed door de fysische eigenschappen (grote, dichtheid, vorm) en de chemische eigenschappen. Kleine moleculen worden verwijderd door afvoer in het lymfatische systeem. Grote moleculen worden gefagocyteerd en kunnen niet door de cellen heen.

17


Macrofagen versterken het toxisch effect door vorming van ijzerhoudende – of asbestlichaampjes. Macrofagen omvattende asbest vezels met ijzerrijke proteïnen en een mucopolysacharide laag. (1)

2.1.1.1.3 Chromosomale veranderingen ten gevolge van asbest Hierbij bespreken we het mutagene effect van asbest in menselijke mesotheliale cellen. Asbest veroorzaakt een aantal structurele chromosomale abnormaliteiten (bijvoorbeeld in de chromosomen: 1, 4, 6, 9, 13, en 17). Na verandering onder invloed van asbest komt monosomie 22 komt voor in mesotheliomen. Tevens kunnen er veranderingen ontstaan in oncogenen en tumorsupressorgenen (bijvoorbeeld p53, p15, p16), WT1, SEN 6, Rb1, en het virale oncogen v-cis. Amosiet is de oorzaak van multikaryotypische veranderingen. (bijvoorbeeld verlies van chromosoom 11 en 21). Crocidoliet veroorzaakt mutaties door G - T transversie. (1)

2.1.1.2 Ionisatie radiologie Ionisatie radiologie kan schade veroorzaken aan DNA (bijvoorbeeld genetische mutaties). Bij ionisatie worden elektronen uit moleculen of atomen verwijderd. Hierdoor blijven elektrische geladen deeltjes (ionen) achter. Door het proces ionisatie ontstaan er chemische veranderingen in bestraalde moleculen. Mesotheliomen ontstaan door een radiotherapie behandeling (bijvoorbeeld na een radiotherapie behandeling van de Hodgkin’s ziekte) of door andere bronnen van bestraling. Een andere bron van straling is bijvoorbeeld gammastraling. Ionisatie radiologie is een zeldzame oorzaak van mesotheliomen. (1) (15)

2.1.2 Epidemiologie Asbest is een wereld probleem. Dit is te zien in tabel 2-2. Velen zijn blootgesteld aan asbest zonder het te weten of blootgesteld aan asbest wanneer het carcinogeen gevaar nog niet gekend was. Bij deze mensen werd de diagnose klinisch vastgesteld.

18


Tabel 2-2 Wereldwijde sterfte door mesothelioom bij mannen (1)

West Australië heeft de grootste mortaliteit. De grootste oorzaak is de consumptie van cement met asbest. De mortaliteit is laag in Polen. De oorzaak is blootstelling aan chrysoliet en crocidoliet. Zuid - Afrika heeft de grootste mortaliteit van. De verhouding van mortaliteit bedraagt 2,5/1 tussen man en vrouw. De mortaliteit is vooral hoog bij vrouwen en kinderen. Dit heeft als oorzaak dat asbestvezels gebruikt werden om huizen te bepleisteren. Hoofdzakelijk gaat het om de blootstelling aan crocidoliet, chrysoliet en amosiet. In tabel 2-3 is de sterfte door asbest in België weergegeven volgens de inventaris van het fonds van beroepsziekten. De aandoening mesotheliomen vertoont een stijging na 1983. Deze late stijging heeft als oorzaak dat de ziekte soms pas 30 à 40 jaar na de blootstelling van asbest uitkomt. (1) (13)

19


Tabel 2-3 Sterfte door asbest in België (13)

2.1.3 Histopathologische indeling van pleurale mesotheliomen Mesotheliomen worden onderverdeeld op basis van histologisch beeld. De onderverdeling bestaat uit epitheliaal, bifasisch en sarcomatoid mesothelioom.

2.1.3.1 Epitheliaal mesothelioom Een epitheliaal mesothelioom heeft betrekking tot het epithelium. De kern is regelmatig in een epitheel cel, met een duidelijke nucleoli. Het cytoplasma is eosinofiel. De cel randen zijn afgelijnd. De nucleaire – tot cytoplasmatische verhouding is constant. Mitosen, nucleaire polymorfisme, atypische mitosen en tumorale reuzencellen worden zelden gezien in de meeste mesothelioma. Ze kunnen waargenomen worden na radiotherapie of chemotherapie. (1) (16)

2.1.3.2 Sarcomatoid mesothelioom Hieronder valt het sarcomateus en desmoplastisch patroon. Het sarcomateus patroon bevat spoelvormige cellen. Het desmoplastisch patroon vertoont door elkaar lopende bundels van hyaline collageen. Tussen deze bundels zijn er tumorcellen. Desmoplastisch patroon heeft karakteristiek bundels van hyaline collageen, gebieden van necrose en hya20


line plaque. Desmoplastisch mesothelioom is een variant van het sarcomatoïd patroon. (1) (2)

2.1.3.3 Bifasische mesothelioom Bifasische mesotheliomen vertonen een epitheliaal en sarcomatoid patroon . Eén histologische differentiatie kan dominant voorkomen. (1)

2.1.4 Immunohistochemie Men maakt gebruik van men antilichamen tegen specifieke epitopen. De antilichamen zijn specifiek tegen 1 bepaald celtype. Door de specifieke binding tussen de antilichamen en de epitopen op de antigenen kan men de herkomst van het tumorweefsel achterhalen. De voorbereiding van het weefsel, de fixatie en de methode kan de immunohistochemische kleuring beïnvloeden. Onder deze invloeden wordt de epitopen plaatsen en de graad van tumor differentiatie gewijzigd. De resultaten worden ook beïnvloed door klinische factoren (bijvoorbeeld asbest). Sommige invasieve gedeelten zijn niet waar te nemen met een hematoxiline - eosine kleuring. Hierdoor helpt de specifieke aankleuring van de antilichamen bij de diagnose van mesotheliomen. De ideale eigenschappen van een antilichaam zijn 100% gevoeligheid (geen valse negatieven) en 100% specificiteit (geen valse positieven) . Er kan een onderscheid gemaakt worden tussen tussen eptiheliaal mesothelioma en long adenocarcinoom. Dit gebeurt door verschillende antilichamen te gebruiken die ofwel mesotheliale ofwel epitheliale cellen (adenocarcinoma merkers) aankleuren. De mesotheliale merkers zijn calretinine, CK 5/6, HBME – 1, trombomoduline. De adenocarcinoma merkers zijn mucin, LEU – M1, TTF – 1 (thyroid transcriptie factor – 1), CEA (carcino embryonaal antigen), en glycoproteïne merkers Ber – EP4 en B72.3. Deze merkers worden in de volgende paragrafen in detail besproken. (1)

21


Tabel 2-4 Immunohistchemische anti-lichamen die het onderscheid maken tussen carcinomen en mesotheliomen (1)

2.1.5 Mesotheliomen merkers Antilichamen met mesotheliale merkers kleuren bij een immunohistochemische kleuring enkel cellen van mesotheliale oorsprong.

2.1.5.1 cytokeratine 5/6 Cytokeratine 5/6 kleurt het meerlagig epitheel en de basale cellaag. Cytokeratine 5/6 als merker voor mesotheliomen heeft een specificiteit van 85% en een gevoeligheid van 83%. Sommige epitheliaal tumoren die metastaseren tot de pleura (borstcarcinomen) zijn cytokeratine 5/6 positief. (1)

2.1.5.2 Calretinine Calretinine bestaat uit een 29 kDa calcium – bindingsmolecuul. De meeste epitheliale mesotheliomen en epitheliale differentiatie in bifasische mesotheliomen zijn calretinine positief. De meeste sarcomatoide mesothelioma zijn calretinine negatief. De specificiteit van calretinine voor mesotheliomen is 85%. De gevoeligheid van calretinine voor mesotheliomen is 82%. De gevoeligheid kan variëren door biologische redenen. De oorzaak zou zijn dat de expressie het grootst is gedurende de celcyclus en de G1 – fase. Tevens dat expressie cyclisch verloopt. De expressie van calretinine vindt plaats in het centraal zenuwstelsel, het mesothelium en het perifeerzenuwstelsel. Calretinine kleurt het nucleair en cytoplasmatisch patroon. Het nucleair patroon is belangrijker in de diagnose. (1)

22


2.1.5.3 Tromboduline Trombomoduline bestaat uit een 75 kDa glycoproteïne. De expressie van Tromboduline vindt plaats in het mesothelium, het epithelium, de placenta syncytiotrofoblasten en in het synovium. De specificiteit voor mestheliomen bedraagt 80%. De gevoeligheid voor epithleiale mestheliomen bedraagt 61%. (1)

2.1.5.4 HBME – 1 HBME is een monoclonaal antilichaam. HBME – 1 kleurt de microvilli. De specificiteit voor mesotheliomen bedraagt 43%. De gevoeligheid voor mesotheliomen bedraagt 85%. (1)

2.2

WT1 gen

Het WT1 gen heeft betrekking tot de inductie van de Wilm’s tumor. Het WT1 gen is gelegen op chromosoom 11p13. Het WT1 gen codeert een proteïne WT1. Het proteïne WT1 bevat vier C terminale zink – vinger gebieden en een glutamine – proline rijk N terminus. Het WT1 proteïne herkent een specifieke DNA sequentie (5’-GCGGGGGCG-3’). Het WT1 proteïne regelt de transcriptie van andere genen (transcriptiefactor). Het activeert de transcriptie of onderdrukt de transcriptie. (3) (4) WT1 onderdrukt de transcriptie van groeigerelateerde genen. Bijvoorbeeld: “platelet – derived factor A chain” (PDGF-A), “insuline like growth factor (IGF)”… Geprogrammeerde celdood is het gevolg van inductie van WT1. Fysische interaktie tussen WT1 en p53 regelt de werking van het WT1 gen. Wanneer p53 afwezig is, is de functie van WT1 transcriptie activator van de EGFR -1 promotor. (3) (5) De proteïne speelt een belangrijke rol in de nier. Mutaties komen vooral voor bij kinderen met WAGR (Wilm’s tumor, aniridia, genital malformation, and mental retardation). Mutaties komen ook voor bij kinderen met familiale Wilm’s tumor. Echter 10% van de toevallige Wilm’s tumoren hebben als oorzaak een WT1 mutatie. In de epiteliale patronen is de expressie hoog van de Wilm’s tumor. In stromale elementen is de expressie laag. Bij immunohistochemische kleuring van mesotheliomen met antilichaam gericht tegen WT1 (WT1 – antilichaam) wordt de kern of het cytoplasma aangekleurd. Dit is afhankelijk van de cloon. In enkele gevallen van adenocarcinoom, desmoplastisch stroma en basaal membraam van sommige carcinomen wordt het cytoplasma aangekleurd. (3) (5) 23


WT1 komt tot expressie in een normale cel tijdens de embryonale ontwikkeling, in de nier en in de milt. WT1 komt tot expressie bij volwassen weefsel in de Sertoli cellen van de testis, en granulaire cellen van de baarmoeder pleura, de milt, het hart, de voorhuid, het endometrium en glomerulair epitheel van de nier. (3) Het uit te testen antilichaam WT1 is de cloon 6F-H21,2. Het is een monoclonaal antilichaam. Het kleurt de kernen.

2.3

Antilichaam tegen NF – κB

NF-kB is een heterodimeer of homodimeer transcriptie factor. De activatie van de NF-kB signalisatie bestaat uit de volgende stappen. NF-kB bestaat als een voorgevormd complex in het cytosol. Dit complex bestaat uit een inhibitie proteïne IkB gebonden aan een p50/p65 dimeer . De receptor krijgt signalen. Door de signalisatie van de receptor ontstaat er activatie van IkB – kinasen. IkB – kinasen (IKKs) fosforyleren de inhibitie proteïne IkB. Er vindt een tyrosine fosforylatie plaats op Ser 468 en Ser 536. Tevens wordt de transcriptie activiteit versterkt door fosforylatie p65/ Rel – A op Ser 276. Ik – B wordt via ubiquitine activatie afgesplitst van de p50/65 dimeer. P50/65 is de activator van transcriptiefactor NF-kB. De activator NF-kB gaat in de nucleus. De activator NF-kB (p50/p65 dimeer) kan in de nucleus binden op het DNA. Daarna start de transcriptie. De rol van transcriptie in mitose is het volgende. Door activatie NF – κB ontstaat er mitose. Er ontstaat een ongecontroleerde activatie van NF – κB dat een rol kan spelen in kanker of ongecontroleerde celdeling. Sigaretten rook, ozon, oxidanten, ultraviolette straling, inflammatoire cytokines (zoals TNF-α and IL-1), T and B cell mitogenen,… stimuleren de activatie van NF-kB. Door oxidatieve stres kan NF – κB activatie optreden, onafhankelijk van receptor binding. Immers, blootstelling aan oxidatie kan leiden tot tyrosine fosforylatie van Ik – B.

24


Figuur 2-1 NF-κB signalisatie (7)

Sterke inhibitoren van de NF-kB activatie zijn anti - oxidanten (“dihidrolipic acid”, PDTC, NAC, vitamine E ester). Anti - oxidanten worden toegepast in therapieën van kanker. Door incubatie van de cellen met anti – oxidanten wordt IkB niet van NF-kB afgesplitst. (6) (7) Het uit te testen antilichaam is gericht tegen de p65 subeenheid transcriptiefactor NF-kB. P65 is lid van de Rel A familie. De proteïnen van de Rel A familie bestaan uit een 300 aminozuur aminoterminaal Rel homoloog domein (RHD). Het in N – terminaal domein is verantwoordelijk voor de specifieke DNA binding. Een C - terminaal domein dat verantwoordelijk is voor de dimerisatie met p50 en voor de IkB binding. (1) (12) Bij een korte blootstellingtijd aan een hoge dosis asbest wordt het alveolair epitheel aangetast. Het aantasten van het alveolair epitheel leidt tot mutaties. Mutaties leidt tot

DNA

– schade. De productie van reactief oxidatieve species (ROS) en reactief nitrogene species (RNS) vindt hierbij plaats. Asbest induceert de activatie van NF-kB. Dit alles leidt tot apoptose (celdood). Apoptose is een verdediging tegen DNA – schade. Bij langdurige blootstelling aan een lage dosis asbest ontstaat er een resistentie voor apoptose geïnduceerd door asbest. (6) 25

Maligne mesotheliomen Materiaal en methode

3

Materiaal en methode

3.1

Fixatie van weefsel

3.1.1 Principe Er bestaan coagulerende en niet coagulerende fixatieven. Dit gebeurt om de structuur te behouden van het weefsel.

3.1.2 Benodigdheden •

Formol

3.1.3 Praktische uitvoering Het biopt wordt in een oplossing formol gelegd.

3.2

Paraffineren en inbedden

3.2.1 Principe Bij het paraffineren vertrekt men van een waterige oplossing (alcohol) naar een niet waterige oplossing (paraffine). Als tussenstap is er xyleen. Xyleen wordt gebruikt omdat het oplosbaar is zowel in alcohol als in paraffine. Bij het inbedden wordt het biopt in een paraffineblokje gevat. Hierdoor kan men gemakkelijker een coupe snijden van het biopt met de rotatie microtoom. (8)


Toestel “Tissue –Tek® VIPTM 5”

•

Toestel “ TSIS88 paraffine inbedding systeem”

•

formaline

•

alcohol

•

Methanol

•

Xyleen 26


•

Paraffine

•

Cassette

•

Ijzeren houder

3.2.3 Praktische uitvoering Paraffineren van het biopt gebeurt vanuit formaline naar paraffine via de volgende stappen in tabel 3-1. Dit wordt uitgevoerd met het toestel “ Tissue – Tek® VIPTM5”. (8) % Formaline

Incubatie tijd (u) 1.45

Alcohol

70

0.30

Alcohol

96

0.30

Alcohol

96

0.30

Alcohol

96

0.30

Alcohol

96

0.54

Methanol

1.18

Methanol

1.18

Xyleen

1.00

Xyleen

1.00

Paraffine

0.30

Paraffine

0.30

Paraffine

0.30

Paraffine

1.00

Tabel 3-1 Programma toestel "Tissue-Tek® VIPTM5 (8)

Het weefsel wordt vanuit de cassette overgebracht in een metalen houder of moule. Deze moule bestaat in vier formaten die worden gebruikt naargelang de grootte van het biopt (voor kleine, middelmatige, grote en zeer grote afmetingen). Hierna wordt warme paraffine in de moule gebracht. Vervolgens wordt de moule enkele seconden op een koude plaat van -7°C geplaatst. Daarna wordt het onderste stuk van de cassette, waarop het nummer staat van het biopt, op de warme paraffine aangedrukt. Uiteindelijk voegt men voor een tweede keer warme paraffine toe en plaatst men de moule op een koude plaat van -7°C. 27


Als de paraffine genoeg afgekoeld is, haalt men het paraffineblokje uit de moule. Het inbedden van het weefsel gebeurt met het toestel “ TSIS88 paraffine inbedding systeem “.

3.3

Snijden van de coupes

3.3.1 Principe Er wordt een weefselcoupe gesneden van een paraffineblokje. De weefselcoupe wordt op een draagglaasje gelegd.


Rotatief microtoom

•

Warme plaat

•

Paraffineblokje

•

draagglaasje

3.3.3 Praktische uitvoering Het mesje van het microtoom is beweeglijk en het paraffineblokje is vast in het microtoom. Het mesje glijdt over het paraffineblokje. De weefselcoupe wordt op een draagglaasje met gedestilleerd water gelegd. Het draagglaasje wordt op een warme plaat geplaatst van ± 60°C. Door het verwarmen rekt de weefselcoupe open. Het gedestilleerde water wordt van het draagglaasje gegoten. Het draagglaasje wordt gedrukt op filterpapier gedrenkt met gedestilleerd water.

Figuur 3-1 Microtoom

28


3.4

Deparaffineren

3.4.1 Principe Het verwijderen van de paraffine van de gesneden weefselcoupe op het draagglaasje. Dit heeft als doel dat het antigeen in het biopt toegankelijker wordt voor het antilichaam.


Xyleen

•

Gedestilleerd water

•

Gedenatureerd alcohol 95% C2H20H, gedenatureerd met 5% ether

3.4.3 Praktische uitvoering Het deparaffineren bestaat uit de volgende stappen (9): • • • • • • •

3.5

5 minuten in Xyleen, 5 minuten in Xyleen, 5 minuten in Xyleen, 3 minuten in Alcohol 95%, 3 minuten in Alcohol 95%, 3 minuten in Alcohol 95%, Het draagglaasje spoelen met water en vervolgens met gedestilleerd water.

Voorbehandelingen

3.5.1 Principe Er zijn drie mogelijke voorbehandelingen: EDTA, Citraat, en protease. Het antigeen in het biopt wordt toegankelijker voor het antilichaam.


Warmwater bad “GFL”

•

EDTA “Ethyleendiaminetetraaceticacid Disodium Salt Dihydrate” 29


•

Citraat

•

Protease

•

NaCl

3.5.3 Praktische uitvoering De coupes (geplaatst in een rekje) worden maximaal 30 minuten geïncubeerd in de kokende oplossingen EDTA en Citraat. De voorbehandeling protease gebeurt automatisch op het toestel “Ventana”.

3.6

Immunohistochemische kleuring

3.6.1 Principe Als immunohistochemiche methode gebruikt men ABC. ABC staat voor Avidine – biotine complex verbonden met een enzym peroxidase. Deze methode maakt gebruik van de affiniteit van het eiwit avidine voor de vitamine biotine. (10) Het principe van de ABC methode bestaat uit de volgende stappen. De weefselcoupe bevat de antigenen. Eerst voegt men een peroxidase blok of H2O2 toe om endogene peroxidase tegen te gaan. In de tweede stap voegt men het primair antilichaam toe. Het primair antilichaam bindt met de antigenen in de weefselcoupe. In de derde stap voegt men het biotine gelabeld secundair antilichaam toe dat bindt met het primair antilichaam. In de vierde stap voegt men SA – HRP (“streptavidine – horse radisch peroxidase”) toe. Het eiwit avidine bindt met de vitamine biotine. In de vijfde stap voegt men het chromogeen DAB (3,3 – diaminobenzidine) toe dat bindt met SA – HRP en de eigenlijke kleurreactie geeft.

30


Figuur 3-2 ABC – methode (14)


Het toestel “Ventata”

•

Wasbuffer APK Wash Solution

•

Liquid CoverslipTM

•

Bluing reagent Kleurstof

•

Hematoxiline Kleurstof

•

Amplificatie kit (10mL) Amplifier A 31


(10mL) Amplifier B •

Detection kit “Ventana” (±) 25mL I – VIEUW Inhibitor – H2O2 (3%) (±) 25 mL I – VIEUW Biotinylated Ig (<200 µg/mL) (±) 25 mL I – VIEUW SA – HRP (<300 µg/mL) (±) 25 mL I – VIEUW DAB – DAB (0,2%) (±) 25 mL I – VIEUW H2O2 – H2O2 (<0,08%) (±) 25 mL I – VIEUW Copper – Cu4SO4 (5g/L)

•

TBS (Tris Buffer Solution) Het is een buffer gebaseerd op tris. Het heeft een pH ± 7,4. (17) (18)

•

Peroxidase blok

•

LSAB2 kit Secundair antilichaam muis anti konijn HRP

•

Chromogeen DAB Eén druppel 3’3’ – diaminobenzidine DAB (vloeibaar) per milliliter substraat buffer.

•

WT1-antilichaam (Willms tumor 1) Clone: 6F-H21,² Monoclonaal Muis anti-human

•

Verdunningsvloeistof antilichaam

•

Eppendorf pipetten

•

Eppendorf T.I.P.S.

3.6.3 Praktische uitvoering 3.6.3.1 Automatische uitvoering De immunohistochemische kleuring wordt uitgevoerd met het toestel “Ventana”. Eerst wordt wash buffer en olie op het draagglaasje gebracht. Vervolgens wordt het glaasje opgewarmd tot 37°C. Alle reacties die verder besproken worden gebeuren bij 37°C. I – Vieuw Inhibitor wordt toegevoegd met een incubatietijd gedurende vier minuten. Dit is om endogene peroxidase tegen te gaan. 100 µL van het antilichaam wordt aangebracht met een incubatietijd gedurende 32 minuten. De monoclonaal primair antilichaam bindt 32


met het antigeen in de weefselcoupe. Eén druppel amplifier A en B wordt aangebracht met elk een incubatie tijd van acht minuten. Hierdoor versterkt men de binding tussen het antigeen in de coupe en het antilichaam. Eén druppel I – Vieuw Biotine wordt toegevoegd met een incubatietijd van acht minuten. Dit secundair gebiotynileerd antilichaam bindt met het primair antilichaam. Eén druppel I – Vieuw SA - HRP wordt toegevoegd met een incubatietijd van acht minuten. Hierbij bindt het avidine met het biotine. Eén druppel I – Vieuw DAB en één druppel I- Vieuw H2O2 wordt toegevoegd met een incubatietijd van acht minuten. Dit is de eigenlijke kleurreactie. Eén druppel I – Vieuw Copper wordt toegevoegd met een incubatietijd van vier minuten. Eén druppel I – Vieuw Hematoxiline (tegenkleuring) wordt toegevoegd met een incubatietijd van zes minuten. Eén druppel I – Vieuw Bluing Reagent (extra tegenkleuring) wordt toegevoegd met een incubatietijd van twee minuten. Tussen deze stappen wordt er gespoeld met Wash buffer om de niet gebonden reagentia weg te spoelen. (11)

3.6.3.2 Manuele uitvoering De handmatige kleuring bestaat uit de volgende stappen. Spoelen met TBS. Toevoegen van peroxidase Block met tien minuten incubatietijd. Toevoegen van primair antilichaam met één uur incubatietijd bij kamertemperatuur. Spoelen met TBS. Toevoegen van secundair gebiotinileerd antilichaam met 30 min incubatietijd bij kamertemperatuur. Spoelen met TBS. Toevoegen van HRP met 20 min incubatietijd bij kamertemperatuur. Spoelen met TBS. Toevoegen van DAB. Spoelen met TBS. Toevoegen van Hematoxiline gedurende twee minuten. Spoelen met stromend water.

3.7

Dehydrateren

3.7.1 Principe Het draagglaasje met de gekleurde coupe van een waterige oplossing (alcohol) in een niet waterige oplossing (xyleen) brengen. Dit is een voorbereidende stap op het monteren omdat er xyleen gebruikt wordt. Bij de manuele uitvoering wordt geen hydratering uitgevoerd omdat men bij het monteren water oplosbare aquatex gebruikt. (9)

33


3.7.2 Benodigdheden • Detergent • Alcohol 95% • Xyleen

3.7.3 Praktische uitvoering Het dehydrateren bestaat uit de volgende stappen (9): • • • • • • •

3.8

Spoel het draagglaasje met water en detergent, Spoelen met water, 3 minuten in Alcohol 95%, 3 minuten in Alcohol 95%, 3 minuten in Alcohol 95%, 3 minuten in Xyleen, 3 minuten in Xyleen.

Monteren

3.8.1 Principe De coupe bedekken met een dekglaasje.


Het toestel “Tissue – Tek SCA”

•

Xyleen

•

Aquatex

•

Dekglaasje

3.8.3 Praktische uitvoering Er zijn twee methodes: automatisch en handmatig. De automatische methode gebeurt met het toestel “Tissue – Tek® SCA”. Men gebruikt xyleen als monteermiddel. Vervolgens wordt er een plastiek film opgelegd. Het handmatig monteren gebeurt met het monteermiddel aquatex. Hierbij wordt een druppeltje op een dekglaasje gelegd. Dit dekglaasje wordt vervolgens op de weefselcoupe gelegd. 34


3.9

Gebruikte biopten

3.9.1 Antilichaam WT1 Nummer van Nummer van Nummer van paraffineblok paraffineblok paraffineblok sarcomatoid epitheloid bifasisch mesothelioom mesothelioom mesothelioom 196

862

725

836

1147

826

933

1443

832

984

1706

1589

1007

2178

1659

1087

2189

1941

1329

2239

1994

1582

2269

2007

1710

2312

2131

2012

2559

2230

2215

2570

2236

2229

2578

2285

2299

2580

2298

2544

2996

2310

3012

3019

3007

Tabel 3-2 Nummers gesneden paraffineblokjes

35


3.9.2 Antilichaam NF- κB sarcomatoid Subacute Pleuritis 196

2217/1

836

2459/1

933

2561/1

984

3006/2

1007

4012/1

1087

5156/1

1329

6948/5

1582

9089/1

1710

11130/1

2012

11288/1

2215

12343/1

2229

12343/2

2299

13866/1

2544

13905/1

3012

14710/1

Tabel 3-3 Nummers gesneden paraffineblokjes

36

Maligne mesotheliomen Resultaten

4

Resultaten

4.1

Antilichaam WT1

Het doel is het onderzoek van de toevoegende waarde in het antilichaampanel voor het diagnosticeren van maligne mesotheliomen. Hierbij hebben we het antilichaam WT1 uitgetest op epitheliaale, sarcomatoide en bifasische mesotheliomen. De gevoeligheid en specificiteit worden besproken. De gevoeligheid en de specificiteit zijn bepaald door microscopisch onderzoek. Gevoeligheid betekent de sterkte van de kleuring. De gevoeligheid is uitgedrukt in niveau 1 tot 3. Niveau 1 betekent 33%. Niveau 2 betekent 66%. Niveau 3 betekent 100%. Deze percentages zijn gegeven door Prof. Praet. Prof. Praet heeft deze uit ervaring kunnen bepalen. De specificiteit betekent het aantal gekleurde kernen. De specificiteit wordt procentueel uitgedrukt.

4.1.1 Epitheliaal mesothelioom Tabel 4-1 Resultaten Epitheloid mesothelioom nummer paraffineblok

specificiteit

gevoeligheid

862

100

3

1147

80

3

1443

20

2

1706

10

1

2178

90

1

2189

40

2

2239

80

2

2269

0

0

2312

20

1-2

2559

60

2

2570

100

2-3

2578

80 - 100

3

2580

80

2

2996

80

3

3019

100

3

37


Hierbij konden de volgende opmerkingen gemaakt worden. Het weefsel is tijdens de kleuring losgekomen van het draagglaasje van paraffineblok nummer 2580. Dit kan als oorzaak hebben dat het glaasje niet genoeg gecoat was voor de kleuring of dat er hyaline plaque aanwezig is in het weefsel. Hier was hyaline plaque in het weefsel de oorzaak van het loskomen van het weefsel van paraffineblokje 2580. Epitheliaal weefsel is zacht weefsel waardoor men vlotter kan snijden.

4.1.2 Sarcomatoid mesothelioom Tabel 4-2 Resultaten Sarcomatoid mesothelioom nummer paraffineblok

specificiteit

gevoeligheid

196

0

0

836

20

2

933

10

1

984

10

1

1007

10

1

1087

10

1

1329

10

1

1582

0

0

1710

60

1

2012

5

1

2215

0

0

2229

<5

1

2299

60

1-2

2544

<5

1

3012

20

1-2

Hierbij konden de volgende opmerkingen gemaakt worden. Het weefsel is tijdens de kleuring losgekomen van het draagglaasje van paraffineblok nummer 2229. Dit kan als oorzaak hebben dat het glaasje niet genoeg gecoat was voor de kleuring of dat er hyaline plaque aanwezig is in het weefsel. Hier was hyaline plaque in het weefsel de oorzaak van het loskomen van het weefsel van paraffineblokje 2229. Sarcomatoid weefsel is consistent weefsel waardoor het snijden moeilijker is. 38


4.1.3 Bifasisch mesothelioom Tabel 4-3 Resultaten Bifasisch mesothelioom nummer specificiteit gevoeligheid paraffineblok

epitheloid en/of sarcomatoid

725

30

2

epitheloid

826

30

1

epitheloid

832

60 - 70

3

epitheloid

1589

100

3

epitheloid

20

1

sarcomatoid

100

3

epitheloid

80

3

sarcomatoid

70

2

epitheloid

70

2

sarcomatoid

100

3

epitheloid

10

1

sarcomatoid

100

3

epitheloid

70

1

sarcomatoid

2131

0

0

epitheloid

2230

60

3

epitheloid

80

3

sarcomatoid

30

1

sarcomatoid

30

1

epitheloid

2285

60

1

sarcomatoid

2298

80

3

epitheloid

30

2

sarcomatoid

30

3

epitheloid

10

1

sarcomatoid

100

3

epitheloid

50

2

sarcomatoid

1659 1941 1994 2007

2236

2310 3007

Hierbij konden de volgende opmerkingen gemaakt worden. Het weefsel van het paraffineblokje 2007 is zeer diffuus. Bifasisch mesothelioom is moeilijker te snijden doordat er sarcomatoid weefsel aanwezig is.

39


4.1.4 Gevoeligheid en specificiteit De cijfers in tabel 4-4 zijn gemiddelden berekend uit de tabellen 4-1, 4-2 en 4-3. Deze tabel geeft de gemiddelde gevoeligheid en specificiteit weer van de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 op epitheliale -, sarcomatotoide en bifasische mesotheliomen. Binnen het bifasisch mesothelioom is het gemiddelde berekend van het epitheliaal – en sarcomatoid patroon. Tabel 4-4 Specificiteit en gevoeligheid antilichaam WT1

gevoeligheid

epitheloid sarcomatoid bifasich mesothelioom mesothelioom mesothelioom 66% 30% 68% 79% 54%

specificiteit

63%

15%

epitheliaal patroon sarcomatoid patroon

57% 66% 46%

epitheliaal patroon sarcomatoid patroon

4.1.5 Foto’s coupes gekleurd met antilichaam WT1

Figuur 4-1bifasich mesothelioom (paraffine blokje 1659)

40


Figuur 4-2 Bifasich mesotheloom (paraffineblokje 2298)

Figuur 4-3 Bifasisch mesothelioom (paraffineblokje 1659)

Figuur 4-4 Sarcomatoid mesothelioom (paraffineblokje 3012)

41


4.2

Antilichaam NF – κB

Het doel is een onderscheid maken tussen het sarcomatoid mesothelioom en subacute pleuritis door middel van een immunohistochemische kleuring met het antilichaam NF-κB gericht tegen NF-κB. Hierbij maakt men meer specifiek het onderscheid tussen kanker (sarcomatoid mesothelioom) en inflammatie (subacute pleuritis).

4.2.1 Resultaten De immunohistochemische kleuring met het antilichaam NF-κB tegen NF-κB op sarcomatoid mesothelioom en subacute pleuritis vertoont veel achtergrond of aspecificiteit. Hierdoor zijn geen resultaten van de immunohistochemische kleuring met het antilichaam NFκB.

4.2.2 Foto’s coupes gekleurd met antilichaam NF – κB

Figuur 4-5 Sarcomatoid mesothelioom (paraffineblokje 1582)

Figuur 4-6 Subacute Pleuritis (paraffineblokje 4012)

42

Maligne mesotheliomen Discussie

5

Discussie

5.1

Antilichaam WT1

Bij een immunohistochemische kleuring test men bepaalde parameters uit om een optimale kleuring te verkrijgen. Deze zijn: de verdunning van het antilichaam, de voorbehandeling, amplificatie en de incubatietijd van het antilichaam. Deze parameters hebben een invloed op de sterkte van de kleuring (gevoeligheid) en de achtergrond in een gekleurde coupe (aspecificiteit). Deze parameters zijn getest op epitheliaal mesothelioom met het toestel “Ventana”. Het antilichaam WT1 kleurt de kernen. De verdunning 1/50 van het antilichaam WT1 is aangeraden in de bijsluiter om een immunohistochemische kleuring uit te voeren. De verdunning 1/50 van het antilichaam WT1 is uitgetest. De verdunning 1/50 van het antilichaam WT1 is geschikt doordat er weinig achtergrond gekleurd is. De voorbehandelingen: EDTA – buffer (pH ± 8), Citraat – buffer (pH ± 6) en protease (tien minuten, 30 minuten) zijn uitgetest. EDTA is als voorbehandeling het meest geschikt. De voorbehandeling dient om de antigenen toegankelijker te maken. Het antilichaam WT1 is uitgetest eens met amplificatie en eens zonder amplificatie. De immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 is met amplificatie het meest geschikt doordat de gevoeligheid stijgt. Amplificatie zorgt voor een versterking tussen het primair antilichaam en het gebiotinyleerde secundair antilichaam. Een incubatietijd van 32 minuten is getest. De verdunning 1/50 van het antilichaam WT1, de voorbehandeling EDTA, met amplificatie, 32 minuten incubatietijd antilichaam WT1 is het meest geschikt voor een optimale immunohistochemische kleuring. Bij het uittesten van deze bovenbenoemde parameters is waargenomen dat het antilichaam WT1 de vaat wand en het spierweefsel aspecifiek kleurt. Het antilichaam WT1 kleurt geen necrose. Het antilichaam kleurt de kernen specifiek. Een immunohistochemische kleuring (met de hierboven meest geschikte parameters) is uitgevoerd het antilichaam WT1 op epitheliaal mesothelioom, sarcomatoid mesothelioom en bifasisch mesothelioom.

43


De specificiteit van de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 op epitheliaal mesothelioom bedraagt 63%. De gevoeligheid van de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 op epitheliaal mesothelioom bedraagt 66%. De specificiteit en de gevoeligheid zijn duidelijk hoog. Hierbij kan men besluiten dat de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 diagnostisch is voor het epitheliaal mesothelioom. De specificiteit van de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 op sarcomatoid mesothelioom bedraagt 15%. De gevoeligheid van de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 op sarcomatoid mesothelioom bedraagt 30%. De specificiteit en de gevoeligheid zijn duidelijk laag. Hierbij kan men besluiten dat de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 niet diagnostisch is voor het sarcomatoid mesothelioom. De specificiteit van de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 op het epitheliaal patroon van het bifasisch mesothelioom bedraagt 66%. De gevoeligheid van de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 op het epitheliaal patroon van het bifasisch mesothelioom bedraagt 79%. De specificiteit van de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 op het sarcomatoid patroon van het bifasisch mesothelioom bedraagt 46%. De gevoeligheid van de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 op het sarcomatoid patroon van het bifasisch mesothelioom bedraagt 54%. Binnen het bifasisch mesotheliomen heeft het epitheliaal patroon een groter specificiteit en gevoeligheid dan het sarcomatoid patroon. De gemiddelde specificiteit voor epitheliaal en sarcomatoid patroon van de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 op bifasisch mesothelioom bedraagt 57%. De gemiddelde gevoeligheid voor epitheliaal en sarcomatoid patroon van de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 op bifasisch mesothelioom bedraagt 68%. De specificiteit en de gevoeligheid zijn duidelijk lager tegenover de epitheliaal mesothelioom. Hierbij kan men besluiten dat de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 minder diagnostisch is voor het bifasisch mesothelioom.

44


5.2

Antilichaam NF-κB

Om te testen als het antilichaam NF - κB functioneert, hebben we een positieve controle en negatieve controle uitgevoerd. Uit de literatuur is geweten dat borstweefsel positief kleurt bij een immunohistochemische kleuring met het antilichaam NF - κB. De positieve en negatieve controle is uitgevoerd op borstweefsel. Een positieve controle bepaalt de specificiteit van de kleuring. Een negatieve controle bepaalt de aspecificiteit of de achtergrond. Dit kunnen we doen door hetzelfde protocol uit te voeren als bij de positieve controle maar in plaats van antilichaam NF - κB, antilichaam verdunning vloeistof toe te voegen. Bij de positieve controle worden de volgende parameters uitgetest om een optimale immunohistochemische kleuring te verkrijgen. Deze zijn: de verdunning van het antilichaam, de voorbehandeling, amplificatie en de incubatietijd van het antilichaam. Deze parameters hebben een invloed op de sterkte van de kleuring (gevoeligheid) en de achtergrond in een gekleurde coupe (aspecificiteit). De verdunning 1/250 – 1/500 van het antilichaam NF - κB is aangeraden in de bijsluiter om een immunohistochemische kleuring uit te voeren. De verdunningen 1/250, 1/500, 1/500, 1/1000 en 1/1500 zijn uitgetest. De verdunningen 1/250 en 1/500 zijn handmatig uitgetest. De overige uitgeteste verdunningen zijn uitgetest met het toestel “Ventana”. Met de verdunning 1/1500 is de minste achtergrond waargenomen. Hierdoor is de verdunning 1/1500 het meest geschikt. De voorbehandelingen: EDTA – buffer (pH ± 8) en Citraat – buffer (pH ± 6) zijn uitgetest. De voorbehandeling zijn handmatig en met de “Ventana” uitgetest. EDTA is als voorbehandeling het meest geschikt. De voorbehandeling dient om de antigenen toegankelijker te maken. Het antilichaam NF - κB is uitgetest eens met amplificatie en eens zonder amplificatie. De immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 is zonder amplificatie het meest geschikt. De verklaring hiervan is dat indien de immunohistochemische kleuring met het antilichaam NF - κB met amplificatie wourd uitgevoerd, er meer aspecificiteit waargenomen wordt. De parameter amplificatie is uitgetest op het toestel “Ventana” Amplificatie zorgt voor een versterking tussen het primair antilichaam en het gebiotinyleerde secundair antilichaam. Een incubatietijd van 32 minuten is getest. De verdunning 1/1500 van het antilichaam NF – κB, de voorbehandeling EDTA, zonder amplificatie, 32 minuten incubatietijd antilichaam NF – κB is geschikt voor een immunohistochemische kleuring. 45


Een immunohistochemische kleuring (met de hierboven de meest geschikte parameters) is uitgevoerd met het antilichaam NF – κB op sarcomatoid mesothelioom en subacute pleuritis. Hierbij is de bedoeling om te gaan bepalen of het antilichaam NF – κB kan gebruikt worden om een onderscheid te maken tussen het inflammatoir beeld dat te zien is bij subacute pleuritis en het carcinogeen beeld dat te zien is bij sarcomatoid mesothelioom. De immunohistochemische kleuring met het antilichaam NF-κB tegen NF-κB op sarcomatoid mesothelioom en subacute pleuritis vertoont veel achtergrond of aspecificiteit. Hierbij kunnen we besluiten dat het antilichaam NF-κB door middel van een immunohistochemische kleuring geen onderscheid maakt tussen sarcomatoid mesothelioom (carcinogeen beeld) en subacute pleuritis (inflammatoir beeld).

46

Maligne mesotheliomen Conclusie

6

Conclusie

6.1

Antilichaam WT1

De gevoeligheid van de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 op epitheliaal mesothelioom bedraagt 66%. De specificiteit van de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 op epitheliaal mesothelioom bedraagt 63%. De gevoeligheid en de specificiteit liggen duidelijk hoog. Hieruit besluiten we dat de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 diagnostisch is voor epitheliaal mesothelioom. De gevoeligheid van de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 op sarcomatoid mesothelioom is 30%. De specificiteit van de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 op sarcomatoid mesothelioom is 15%. De gevoeligheid en de specificiteit liggen duidelijk laag. Hierbij besluiten we dat de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 niet diagnostisch is voor sarcomatoid mesothelioom. De gevoeligheid van de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 op bifasisch mesothelioom bedraagt 68%. De specificiteit van de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 op bifasisch mesothelioom bedraagt 57%. De gevoeligheid en de specificiteit liggen lager dan het epitheliaal mesothelioom. Hieruit besluiten we dat de immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 minder diagnostisch is dan het epitheliaal mesothelioom. De immunohistochemische kleuring met het antilichaam WT1 is het meest diagnostisch voor epitheliaal epitheel, minder diagnostisch voor bifasisch mesothelioom en het minst diagnostisch is voor het sarcomatoid mesothelioom.

6.2

Antilichaam NF– κB

Het antilichaam NF-κB kan door middel van immunohistochemische kleuring geen onderscheid maken tussen het inflammatoire beeld dat te zien is bij subacute pleuritis en het carcinogeen beeld dat te zien is bij sarcomatoid mesothelioom.

47

Literatuurlijst Lijst van de boeken: (1)

Malignant Mesothelioma, gezien 25 februari 2008 Uitgegeven door Douglas W. Henderson, Keith B. Shilkin, Suzanne Le P. Langlois, Darrel Whitaker De cancer series Hemisphere publishing corporation

(2)

Malignant pleural mesothelioma, gezien 25 februari 2008 Uitgegeven door Kenneth O’byrne & Valerie Rusch Oxford university press 2006

(3)

Bijsluiter antilichaam WT1, gezien 3 maart 2008

(8)

Operating manual toestel “Tissue – Tek® VIPTM5”, gezien 13 februari 2008 Lab pathologie, UZ, De pintelaan 185 9000 Gent

(9)

Software handleiding “Ventana”, gezien 13 februari 2008 Lab pathologie, UZ, De pintelaan 185 9000 Gent

(10)

Cursus Immunohistochemie, Partim Immunohistochemie en radioprotectie, Gezien 11 februari 2008 Hoge school West – Vlaanderen Departement Simon Stevin

(11)

Protocol 201 WT1 (05-03-2008), NexES IHC staining module, gezien 5 maart 2008 Lab pathologie, UZ, De pintelaan 185 9000 Gent

(17)

Abstracts from the Immunocytochemistry Meeting in Preston March 2002 , gezien 1 juni 2008 The Official Journal of the UK National External Quality Assessment Scheme for Immunocytochemistry, volume 1 issue 4

48

Lijst van artikels: (4)

The Wilm’s tumor gene product WT1, represses transcription of the platelet derived growth factor A – chain gen, gezien 4 maart 2008 The journal of biological chemistry Vol. 267, No. 31, Issue of November 5 Pp 21999 – 22002, 1992

Lijst van internetsites: (5)

Cancer genetics web, www.cancer – genetics.org, gezien 5 maart 2008 This page created: 09/10/1999 Last revised: 29/04/2003 URL: http://www.cancerindex.org/geneweb/WT1.htm

(6)

Anadam grafics, 2001, gezien 25 maart 2008 URL: http://www.thiawave.com

(7)

Korean unigen information (KUGI), gezien 28 maart 2008 http://kugi.kribb.re.kr/KUGI/Pathways/BioCarta/h_nfkbPathway/

(12)

Rice university department of statistics, 6100 Main St MS-138, Duncan Hall, Houston, Texas 77005-1827, gezien 10 maart 2008 URL:http://www.stat.rice.edu

(13)

Fonds van beroepsziekten, tweede federaal rapport inzake duurzame ontwikkeling, 2002, gezien 25 mei 2008 URL: http://www.plan.be/websites/ferado/nl/html_books/ferado/2nl17.html

(14)

Vector Laboratories, united kingdom and canidian subsidiaries, gezien 26 mei 2008 URL: http://www.vectorlabs.com

(15)

Wikimedia foundation, inc, de vrije encyclopedie, gezien 1 juni 2008 URL: http://nl.wikipedia.org/wiki/Straling

49

(16)

Encyclo online encyclopedie, gezien 1 juni 2008 URL: http://www.encyclo.nl/begrip/epitheliaal

(18)

Encyclo online encyclopedie, gezien 1 juni 2008 URL: http://en.wikipedia.org/wiki/Tris

50

Bijlagen • Tabellen: Tabel 6-1 Mesothelioom over 30 jaar in West-Australië (1)

Tabel 6-2 Jaarlijkse sterfte door mesotheliomen in Zuid-Afrika (1)

51

• Figuren:

Figuur 6-1 Huis gebouwd met blokken die erionietvezels bevatten (1)

52

Colofon Mijn eindwerk werd tot stand gebracht door middel van: • Laptop pentium M 730 • Tekstverwerkingsprogramma Word 2003 De lopende tekst is uitgewerkt in het lettertype Arial 11pts; de kopjes in lettertype Arial 12pts; vet.

Datum van de voltooiing: 10 juni 2008

53

Voor akkoord verklaring

Willems Ann stagementor

Mevr. Praet stagebegeleider

54

Maligne mesotheliomen. Woord vooraf

Recommend Documents