Konzultációs anyag:
Caveolák
Az endocitózisban résztvevő sejtfelszíni képződményeket a sejtek plazmamembránjában régóta ismerik. +Az emlős sejtekben a különböző anyagok internalizácója háromféle módon történhet: az egyik út a chlatrinnal bevont üregek vezikulákká történő záródása (coated vezikulák keletkezése), az endocitózis másik módja a plazmamembrán chlatrin-independens lefűződése mikrofilamentumok segítségével, és harmadikként idesorolták a hetvenes évek elején a caveolákon keresztül történő transzportot. Napjainkban, a 90-es évek második felétől azonban felvetődött, hogy a caveolák az endocitózison kívül más sejtfunkciókban is részt vesznek. Szerepet játszanak a jelátviteli folyamatokban, a sejtosztódásban és a sejtek koleszterin homeosztázisában. A három terület átfed egymással, a kulcselem valamennyiben a caveola struktúrája, ami főbb vonalakban már tisztázódott. A caveolák A caveolák a plazmamembrán palack formájú betüremkedései. Keresztmetszeti elektronmikroszkópos felvételeken jellegzetesen omega alakúak, átmérőjük 100-150 nm. Gyakran csoportosan, gyöngysorszerű képletekben sorakoznak a plazmamembránban. Az alábbi táblázat mutatja gyakoriságukat néhány szövetben: sok kevés máj rezidens makrofágok
nyugvó fibroblaszt endothel zsírszövet epithel váz-, szív- és simaizom glia
egyátalán nincs caveola tumorsejtek (kivétel: MDR sejtek), limfociták, neuronok
Scanning elektronmikroszkóppal, mélymaratásos technikával készült metszeteken megfigyelhető, hogy citoplazmai felszínük mintázatos képet mutat, a membránjukban felhalmozódó fehérjék miatt (1. ábra a, b). 1. ábra
a
b
1
1. A caveolák szerkezete A.) Lipidszerkezet - raftok A caveolákat alkotó membrán lipidösszetétele speciális, úgynevezett lipid-raft struktúra. A raftok létezésének gondolatát az vetette fel, hogy egyes integráns membrán fehérjék eloszlása a sejtfelszínen inhomogén, amit a klasszikus SingerNicholson plazmamembrán modellel nem lehetett megmagyarázni. Specifikus antitestekkel, vagy jelölt ligandokkal kimutatták, hogy a fehérjék a plazmamembránban kitüntetett helyeken csómokat, clustereket képeznek, ahelyett, hogy a szabad bilaterális diffuzió következtében egyenletesen szétoszlanának a membrán kettősrétegében.
A nagy rendezettségű, ennélfogva alacsony fluiditású membrán microdomének elkülönülnek a rendezetlenebb membránkörnyezettől. A raftokban a membrán merevségét a magas koleszterin és szfingolipid tartalom okozza. Sűrűségük alacsonyabb, mint a fluidabb, foszfolipidben gazdagabb membrán struktúráké, így külön fázist alkothatnak a membránban, miképpen a vízen úszó jégtáblák. Detergensekkel szemben nagyfokú rezisztenciát mutatnak, ennélfogva izolálni is viszonylag könnyen lehet ezt a plazmamembrán frakciót. A koleszterin jelentőségét mutatja, hogy ha mesterségesen csökkentik a membrán koleszterin szintjét – oxidálják, vagy kivonják filipinnel, - a raftok szétesnek, és ezzel a különböző molekulák inhomogén eloszlása is megszűnik. Bebizonyosodott, hogy egyes membránkötött fehérjék csak ezeket a területeket preferálják, itt dúsulnak fel. Az extracelluláris térből érkező szignálok továbbításában szerepet játszó molekulák nagy része ezeken a membránterületeken koncentrálódik. Nem meglepő továbbá, hogy a tipikus un. houskeeping fehérjék, - mint például a Na/K-ATPáz – feldúsulása nem jellemző a raftokban. A raftok valamennyi eukariota sejtben megtalálhatók, ezzel szemben, mint a fenti táblázat is szemlélteti, a caveolák nem. A caveola voltaképpen a citoplazmába betüremkedő óriási raftnak tekinthető, amelyet caveolinoligomerek és a koleszterin együttesen stabilizálnak: Eltűnnek a caveolák, ha a membrán koleszterin szintje csökken és nem tudnak kialakulni caveolin hiányában sem. Caveolák csak a caveolint expresszáló sejtekben fordulnak elő. A raftok kialakulásáért tehát a koleszterin, s hogy ezekből jellegzetes palack alakú caveola formálódjon, a caveolin fehérje a felelős. Az utóbbit bizonyítja, hogy a cavolin overexpressziójával (cav-1 cDNS transzfektálásával) előidézhető a caveolák formációja olyan sejtekben is – pl. limfocitákban - ahol egyébként nem fordulnak elő. 2
A lipidraftok létezését, a legutóbbi években a következőkkel bizonyították: - A membránhoz glikozil foszfatidil inozitol horgonnyal kötődő fehérjékről, valamint a kétszeresen acilált, src családba tartozó tirozin kinázokról kimutatták, hogy Triton-X-100 detergenssel feloldhatatlan membrándoménekkel komplexet képeznek (Simons – Ikonnen 1997). - Modell membránokon igazolták, hogy fiziológiás koncentrációknál a koleszterin/szfingolipid keverék foszfolipid környezetben detergens inszolubilis raftokat képes kialakítani (Ahmed és mtsi 1997). - Sejtmembránból izolált detergens inszolubilis membrán frakcióról igazolódott, hogy hasonló „rendezett folyadék” (liquid-ordered) struktúrákat tartalmaz, mint amelyek a mesterséges mebránokban kialakultak (Ge és mtsi 1999). - Élő sejtekben egymástól független kísérletekkel megmérték, hogy GPI horgony-fehérjék kb. 70 nm-es átmérőjű területeken halmozódnak fel (oligomerizálódnak) a membránban, s koleszterin kivonására ezek a clusterek szétesnek. Arra vonatkozóan csak hipotézisek vannak, hogy a raftok hogyan alakulnak ki. Lehetséges, hogy már előre összeállított raftelemekként, panelekként szállítódnak a membránhoz, s ha igen, kérdés, hogy milyen fehérjék vesznek ebben részt? Többféle koleszterin kötő caveolin-like fehérjét – flotillin család, cavetilinek – találtak a caveolint nem expresszáló sejtekben pl. neuronokban, limfocitákban, de intracellulárisan meglévő raftok létezése még nem bizonyított. További kérdés, hogy a caveolákban gazdag sejtekben, a caveolák mellett találhatók-e kisebb, caveolinmentes raftok. ,
B.) A caveolin fehérjék
A caveolin fehérjék döntő hányadát képezik a caveolák fehérje összetevőinek. A caveolinnak eddig négy izoformáját azonosították: caveolin-1a, 1b, 2 és 3. A caveolin-1a és 1b változata a közös mRNS-en lévő két transzlációs iniciációs helyből adódik, a caveolin-2 és -3 izoformákat külön gének kódolják. Valódi caveola vázalkotó fehérjének a caveolin-1, illetve a haráncsikolt izmokban a caveolin-3 minősül. A caveolin 2 csak a caveolin-1 és –3 mellett segítő fehérjeként közös oligomerekben fordul elő. Különböző fajok caveolinjait összehasonlítva megállapították, hogy a molekula izoformái a két végükön lévő rövid, hidrofil, variábilis szakaszoktól eltekintve rendkívül konzervatív fehérjék. A caveolin-1 178 aminosavból álló 21 kD-os fehérje, amelynek az N és a C terminálisa a citoplazma felé néz (2.a ábra). A polipeptid láncot hat prolin osztja struktúrális és funkcionális doménekre. A két citoplazmai részt elválasztó hidrofób peptid szakasz mindössze 22 aminosavból áll (P110-P132) és csak a membrán citoplazma felőli lipidrétegébe merül be, ahol a koleszterin molekulák veszik körül (az ábrán a bevonalkázott oválisok). Az N terminális felőli citoplazmai rész (P27-P55, P55-P75) amfipatikus tulajdonsága révén asszociálódik a membrán belső felszínéhez. Az ezt követő szakaszon (P75P110) helyezkedik el a scaffolding domén, az a 81-101 aminosav közötti régió, ahol különböző jelátviteli molekulák kötödhetnek a caveolin-1 és –3 fehérjékhez (lásd később). A C terminális felőli citoplazmai domén (P132P154) jelegzetessége, hogy két ciszteinjéhez zsírsav kapcsolódik - általában 3
palmitinsav - ami a C terminális citoplazmai domént is a plazmamembránhoz köti. A caveolin 15-20 monomerből felépülő stabil oligomereket képez, melyek a koleszterin megkötésével stabilizálódnak. Ez az oligomerizáció teszi lehetővé, hogy a caveolin mint vázfehérje kialakítsa a caveolák jellegzetes formáját. Az izoformák közül a caveolin-2 nem képes oligomerizációra, és ezért önnálóan nem is fordul elő a caveolákban.
2. ábra
Az oligomerek kialakításában az N és a C terminális felőli citoplazmai domének is részt vesznek (2b ábra). Asszociációjukkal a caveolin molekulák a caveola citoplazmai felszínét jellegzetes, hálózatos fehérje bevonattal látják el (1.b ábra) Az egyes izoformák az N terminális felőli citoplazmai részben térnek el egymástól. A caveolin-2 és –3 esetében is rövidebb ez a szakasz, mint a caveolin-1-ben. A caveolin-2 molekulájából hiányzik a scaffolding domén is.
4
2. A caveolák funkciói A.) Caveolák szerepe a transzport folyamatokban: A caveolák legrégebben felismert funkciója, hogy részt vesznek a sejt transzport folyamataiban. A coated vezikulákhoz hasonlóan tartalmaznak dynamint. Ez a fehérje az endocitózis folyamán, GTP felhasználásával, elősegíti a vezikulák lefűződését a plazmamembránról. A caveolákban receptoraikhoz kötve, koncentrálódhatnak különböző anyagok, majd lefűződve tartalmukat közvetlenül a citoplazmába üríthetik, vagy a plazmamembránhoz közeli endoplazmatikus retikulummal fúzionálva annak lumenébe. A kiürült caveolák ezt követően visszatérnek a membránba. Ezt a fajta reciklációt is magába foglaló transzportot nevezik potocitózisnak. Endothel sejtekben gyakori a transzcitózis, azaz a lefűződött caveolák tartalmukat a sejt ellentétes oldalán exocitózissal adják le. A caveolákból kialakuló endocitotikus vezikulák és a coated vezikulák más-más anyagok szállítását végzik. A potocitózisnak egy sajátos formáját is megfigyelték, (Anderson és mtsi 1992) amikor is a caveola nem hagyja el a plazmamembránt: A felvételre kerülő anyagok ( pl. 5-metil-folát) beáramlanak a caveola üregébe, kötődnek a caveolákban lévő fehérjékhez, (folát receptor), és felhalmozódnak, majd ezt követően a caveola szája záródik. A kövekező fázisban a caveola belsejében a mikrokörnyezet megváltozik - pl. a pH -, a ligand disszociál, és az egyidejűleg megnyílt csatornákon keresztül a citoplazmába áramlik. Végül a caveola újra kinyílik az extracelluláris tér felé. A folyamat részlépései azonban, mint pl. a nyitás-zárás ciklusa, még korántsem tisztázottak. Mivel különböző anyagok caveolákon keresztüli felvételét okadánsav gátolja, gyanítható, hogy a foszforilációnak szerepe van a caveoláris transzport regulációjában.
B.) Caveolák szerepe a jelátviteli folyamatokban A caveolák azonban nem csak az anyagszállításban vesznek részt, hanem a caveoláknak fontos szerepük van a különböző jelátviteli pályák módosításában is, amihez nem szükséges lefűződniük a plazmamembránról. Kétségtelen, hogy ez a módosító szerep egyrészt annak köszönhető, hogy a caveola speciális lipidkörnyezetében - mint a raftokban - lokálisan koncentrálódnak a különböző molekulák, ezáltal a köztük létrejövő kölcsönhatások esélye megnő. Másrészt a caveolin molekula maga is kapcsolódhat több jelátviteli molekulával.
5
A caveolákban feldúsúló fehérjék: A mellékelt táblázat felsorolja, - 1998-ig közölt adatok alapján -, a caveoláris membránban koncentrálódó fehérjéket.
Class of molecules Lipid
Name of molecule Biochemical localization Ganglioside + Sphingomyelin + Ceramide + Diacylglycerol (DAG) + Cholesterol + Acylated protein Heterotrimeric G and Gß + Src, Fyn, Hck, Lck + E-NOS + CD-36 + Caveolin + Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored protein Folate receptor + Thy 1 + Alkaline phosphatase + Prion + Urokinase Rec + Multiple GPI proteins + 5'-Nucleotidase + CD14 + Prenylated protein Rap1A + Ras + Membrane receptor Platelet-derived growth factor (PDGF) + Insulin Epidermal growth factor (EGF) + Receptor for advanced glycation end product (RAGE) Cholecystokinin (CCK) receptor + m2 acetylcholine + Tissue factor + ß Adrenergic Bradykinin + Endothelin + SR-B1 + Signal transducer PKC + SHC + SOS + GRB2 + Mitogen-activated protein (MAP) kinase + Adenylyl cyclase + SYP + PI3 kinase + Raf1 + Calmodulin + Phosphoinositides + Polyphosphoinositide phosphatase + Engrailed + Membrane transp. Porin + IP3 receptor + Ca+2 ATPase + Aquaporin-1 + H+ ATPase + Structural mol. Annexin II + Ezerin + Myosin + VAMP + NSF + MAL + Actin +
Morphological localization +
+ + + + + + + + + + + + + + + + +
+ +
+ +
+
6
A caveolák a szövetekben átlagban a teljes membránfelszín mindössze ≈1%-át teszik ki, mégis egyes membrán kötött fehérjék – pl. a GPI-horgony-fehérjék, vagy az src kinázok – 60-70 %-ban ebben a kompartmentben tömörülnek. Más membránfehérjék azonban – pl. növekedési faktor receptorok, vagy a heterotrimer G fehérjék – megtalálhatók ugyan a caveolákon kívül is, itt viszont a funkcionálisan kapcsolódó elemek térben is összerendeződnek, hatótávolságba kerülnek egymáshoz. Ez a caveolák szerepét egyfajta információ kezelő központtá emeli . A caveolákban előforduló fehérjéket a következők szerint csoportosítjuk: GPI horgonnyal kötődő fehérjék: az extracelluláris tér felől kapcsolódnak mint pl. a folát receptor, alkalikus foszfatáz, 5’nukleotidáz, vagy a prionok, Acilált fehérjék: Src kináz család tagjai, eNOS és a heterotrimer Gproteinek kötődnek a membránhoz a citoplazma felől, Receptorok: béta adrenerg, számos peptidhormon, inzulin és a növekedési hormonok (EGF, PDGF) receptorai valamint a koleszterin transzportban szerepet játszó SR-B1 (scavenger receptor-B1), Szignáltranszdukciós fehérjék: adenilcikláz, calmodulin, protein kinázCα, a növekedési hormon jelpályák valamint a MAP kináz kaszkád elemei (Grb, SoS, Raf, Erk1/2), Transzport fehérjék: IP3 függő Ca-csatorna, a plazmamembrán Capumpa, A fehérjéken kívül a foszfatidilinozitol 4,5 foszfát is koncentrálódik a caveoláris membránban. Példák világítják meg leginkább, hogy a jelátviteli folyamatok hatékonyságát hogyan befolyásolja, ha a jelpályában résztvevő komponensek feldúsúlnak a caveolákban/raftokban: - Egy normál (nem tumoros) sejtkultúrában megállapították, hogy a membrán PI 4,5 P tartalmának csaknem a fele a caveolákban koncentrálódik, és ugyancsak jelen van itt a bradikinin, és az EGF receptor is ami ligandot kötve közvetve aktiválja a PIP2 hasítását a PLC-β vagy γ aktiválásával. A kisérlet azt igazolta, hogy a hormonhatásra történő IP3-felszabadítás (PIP2 vesztés) szinte kizárólag ebből a kompartmentből történt, ahol egyébként a másodlagos messenger receptora az IP3 receptor, valamint a keletkezett diacilglicerol célpontja a proteinkináz is jelen van. (Pike és Casy 1996). - Az src kinázokat kettős mirisztil-lánc köti a raftokhoz/caveolákhoz. Ha ezt farnezillel helyettesítik, a membránhoz történő asszociáció áttevődik a raftokon kívüli területekre,ami kináz aktivitását nem befolyásolja. Azonban a módosított fyn (src kináz) azáltal, hogy kiszorult a raftokból, nem tud megfelelő hatótávolságba kerülni a T-sejt receptor ξ láncával, s így a receptorhoz kapcsolódó jeltovábbítás nem működik.
7
A caveolin scaffolding doménje A caveolin-1-hez (vázizomban a caveolin-3-hoz) néhány molekula olyan szorosan kötődik, hogy a caveolin-specifikus antitesttel képződő immunprecipitátumban is kötődve maradnak a fehérjéhez. A kötőhely, a caveolin-1 N terminális felőli citoplazmai részén egy 20 aminosavból álló részlet, az úgynevezett scaffolding domén (4.ábra). A caveolin-1-hez kötődő fehérjék szerkezetében a közös elem az, hogy tartalmaznak scaffolding domént felismerő homológ szekvenciákat, amelyekben kitüntetett szerepe van aromás oldalláncoknak (az ábrán: X). Scaffolding doménhez kötődő fehérjék közé tartozik az eNOS, több (receptor vagy nem-receptor jellegű) tirozinkináz (EGF, PDGF, Src család tagjai), a proteinkinázC, proteinkinázA, a heterotrimer G protein alfa-alegysége, valamint a Ha-Ras. 3. ábra
A felsorolt fehérjék a scaffolding doménnek megfelelő 20 aminosavas szintetikus peptiddel is komplexet képeznek. Ennek a peptidnek a kötődése gátolja G fehérjéken a GDP kicserélődését GTP-re és az Src családba tartozó tirozin kinázok autofoszforillációját, tehát gátolja aktiválódásukat. A fehérjék a scaffolding doménhez általában inaktív („off”) állapotban kötődnek és amíg a kapcsolat fennáll inaktívak is maradnak. Az inaktiválódásra képtelen (konstitutivan aktív) mutáns formákat (v-Src, G12V Ha-Ras) a caveolin nem is képes megkötni. Ezek szerint a caveolin mintegy „parkoltatja” a jelátvivő molekulák feleslegét az aktuális jelpályát aktiváló szignál megjelenéséig. Ezzel, mint negatív regulátor biztosítja, hogy szignál hiányában a nyugalomban lévő sejtekben a jelpályák jelenlévő enzimei - (pl. eNOS, PKA, és MAP-kináz kaszkád egyes elemei) - visszafogottan működjenek. 8
Pl: Az intracelluláris Ca szint megemelkedésével, aktiválódik az eNOS. Ilyenkor a Ca-calmodulin komplex leválasztja a caveolákról az enzimet, átmenetileg - a Ca szint csökkenéséig - a citoplazmába transzlokálódik majd az intracelluláris Ca szint csökkenésével az inaktiválodott NOS újra a caveolinhoz kötődik.
A caveolában található inzulin receptor esetében viszont, a caveolin pozitív regulátorként hat. A caveolin-1, sőt a vázizomban lévő caveolin-3 is fokozza a receptor kináz aktivitását. A kötődés ebben az esetben is a scaffolding doménen keresztül történik. Az aktiválást - érdekes módon - nem kíséri a receptor autofoszforillációja, ez csak az inzulin kötődését követően mutatható ki, ami többszörösére növeli a receptor tirozinkináz aktivitását. Úgy tűnik, hogy az inzulin receptort a caveolin „on” állásban stabilizálja. C.)A caveolák szerepe a sejtosztódásban Miután a caveolákban számos olyan molekula koncentrálódik, melyek fontos szerepet játszanak a növekedési jelpályákban, sőt egyeseket közülük mint a G fehérjéket és az src kinázokat a caveolin inaktív formában köt, logikusan következik, hogy a caveolának és ezen belül a caveolin-1-nek szerepe van a sejtosztódás szabályozásában mint negatív tényező. Összhangban van ezzel az, hogy a caveolák nagy száma a G0 fázisban lévő véglegesen differenciált sejtekre jellemző, a tumorokból és a transzformált sejtekből viszont hiányoznak. Amikor a sejt a sejtciklus S fázisába lép, a caveolin expressziója downregulálódik, s ezzel párhuzamosan eltűnnek a detergens-inszolubilis caveolák is a membránból. A downregulációban szerepe van növekedési jelpályák aktiválódásának (PKA, PKC, MAP-kináz kaszkád), ami végeredményként gátolja a caveolin-1 transzkripcióját. A sejtek G0 állapotában ezzel szemben intenzív caveolin-1 mRNS szintézis folyik, amelyet többek között mint transzkripciós faktor, a tumor szupresszor p53 is elősegít. Megállapították, hogy a sejtosztódásban aktív kinázok (Erk1/2, ciklin D-CDK2) aktivitása reciprok módon változik a caveolin expressziójával. - Az onkogénekkel transzformált sejtekben, ahol aktivitásuk magas, gyakorlatilag nincs caveolin-1, szelektív gátlásuk viszont fokozza a caveolin-1 szintézisét. - Caveolin-1 overexpresszió gátolta az említett enzimek aktivitását, és ezzel egyidejűleg csökkentette az osztódás sebességét. - Caveolin-1 mRNS antiszenz bevitele nyugvó fibroblasztokba gátolta a caveolin-1 fehérje transzlációját. Ezzel párhuzamosan az Erk 1/2 a citoplazmába transzlokálódott és aktiválódott, végső soron ez a sejtek transzformációjához vezetett. Az antiszenzzel transzformált sejtek kísérleti állatokba oltva tumorképződést indukáltak. A caveoin-1 promoterhez kötődő transzkripciós faktorok komplexében résztvevő E2F, p53 és az Sp1 együttesen fokozza a transzkripciót. Az E2F foszforilációja destabilizálja a komplexet. A transzkripciós faktorok komplexét mutatja az 4. ábra.
-
9
4.ábra
Ahogy az korábban kiderült, a caveolák megszűnése kiváltható a koleszterin membránból történő kivonásával. Érdekes módon ez a növekedési jelpályák aktiválódásához és így a caveolin downregulációjához vezet. Ebből az következik, hogy a caveolákat alkotó és létrehozó lipid és fehérje komponensek mennyisége koordináltan változik a sejtciklus során. D.)A caveolák szerepe a sejtek koleszterin homeosztázisában. A caveolin-1 molekula rendkívül nagy affinitással köti a koleszterint. Erélyes tisztítási eljárásokat követően is, legalább 1 mol/mol arányban kötve marad a fehérjéhez. Másfelől, a rekombináns módszerrel előállított caveolin nem képes koleszterin hiányában a mesterséges, tisztán foszfolipid membránokba beépülni. Épp ezért feltételezik, hogy caveolák biogenezisében a caveolin molekulák és a koleszterin együtt, közös komplexben, vagy caveolin oligomereket is tartalmazó raftokban („precaveolákban”) szállítódnak a Golgi-tól a plazmamembránhoz. Idevonatkozó meggyőző kísérleti bizonyítékok még nincsenek. Az utóbbi években kimutattak a citoplazmában egy HSP-56/Cyclophilin–40 és A/caveolin-1/koleszterin Komplexet, amelyről feltételezik, hogy részt vehet a koleszterin szállításában.
A caveolákban a koleszterin lokális koncentrációja meghaladja az összlipid tartalom 30 %-át. Hozzá kell tenni, hogy ez mindössze 2-5%-a a membrán összes koleszterin tartalmának. Fontos viszont, hogy a koleszterin csak a caveolákban helyezkedik el a membrán kettős lipidrétegének extracelluláris tér felé néző lemezében. (Kísérletekben az ép sejtekhez adott koleszterin oxidáz csak a caveolákban tudja szubsztrátját elérni.) A koleszterin „kihelyezése”
10
feltétele annak, hogy a sejt képes legyen a szabad koleszterin szintjét efflux szinten szabályozni. A sejtek koleszterin tartalma szigorúan szabályozott. Az intracelluláris koleszterin szint szabályozásában három folyamat vesz részt: 1. Az exogen koleszterin influx LDL felvétele, mely a coated vezikulákhoz kapcsolt receptor mediált endocitózissal történik. 2. De novo koleszterin szintézis történik az ER felszinén. 3. A koleszterin szintet csökkenti a caveolákon keresztül folyó efflux. A koleszterin homeosztázisának jellemzői alapján a sejtek két típusba sorolhatók: A típus
B típus
normal sejtek
hepatociták, limfociták, rezidens makrofágok
transzformált sejtek
tumorsejtek
adipociták, pneumociták, nyugvó fibroblastok, endothel és epithel sejtek, simaizom sejtek MDR sejtek
LDL receptor
sok
kevés
caveolák
kevés vagy nincs
sok
koleszterin homeosztázis szabályozása
influx
efflux
A caveoláris koleszterin efflux mechanizmusa még nem tisztázott minden részletében (5. ábra). Annyi bizonyos, hogy az akceptor pre-β HDL (kevés koleszterinészter, sok apo A-1), a caveolákhoz kötődve facilitálja a szabad koleszterin eltávolítását. A jelenlévő scavanger receptor (SR-BI) révén viszont az αHDL (sok koleszterinészter) növelheti a caveola membrán, egyúttal a sejt koleszterin szintjét. A caveolákon keresztüli nettó koleszterin fluxust tehát a sejt környezetében lévő HDL-ek aránya valamint a sejt koleszterin igénye dönti el. 5.ábra
11
A sejt koleszterin igényét befolyásolja a sejtciklus. A G1 (G0) fázisban lévő sejtekben a caveoláris koleszterin efflux egyensúlyt tart az exogén és endogén forrásból származó koleszterinnel (6.ábra A). Emelkedett koleszterin szint képes fokozni a caveolin expressziót, ezzel párhuzamosan nő a efflux kapacitása (6.ábra C). Csökkenő koleszterin szint ezzel szemben gátolja a caveolin transzkripcióját (6. ábra B) és kiváltja a növekedési jelpályák aktiválódását. 6.ábra
Magas koleszterin szintnél a SREBP (sterol responsive element binding protein) transzkripciós faktor inaktív, ilyenkor a caveolin szintézis intenzitása fokozódik. Ha a koleszterin koncentrációja csökken, a SREBP gátolja a caveolin expressziót, de ugyanakkor fokozza a de novo koleszterin szintézis kulcsenzimeinek és az LDL receptornak a transzkripcióját. Kísérletekből arra lehet következteni, hogy a SREBP mint destabilizáló faktor kötődik a caveolin-1 promoteren (5. Ábra)
Az S fázisban a sejtek koleszterin szintje megduplázódik, ami a fokozott koleszterin felvételnek és a de novo szintézisnek köszönhető. Caveolin hiányában azonban a koleszterin nem koncentrálódik a kiterjedt raftokban caveolákban- hanem az osztódás során elfeleződik a leány sejtekben. Megfogalmazhatjuk ezt úgy is, hogy az S fázisban a sejtfelszíni "differenciálódás" csökken. Ha növekedési pályák aktiválódása következtében a caveolin tartósan downregulálódik, és megszakad a koleszterin és caveolin közötti koordináció, akkor a koleszterin homeosztázis szabályozása szempontjából B típusú szövetekben levő sejtek átváltanak az A típusra (az influx szabályozásra) ami a transzformált sejtekre jellemző. A koleszterin szerepe maga is átértékelődött a közelmúltban. Azontúl, hogy előfeltétele a raftok kialakulásának, a koleszterin nélkülözhetetlennek bizonyult egy egyedfejlődésben fontos szignáltranszdukciós pálya aktiválódásában. A Hedgehog (Hh) jelpálya koleszterin fűggését a muslinca egyedfejlődésében mutatták ki, amivel analóg folyamatok (Shh) az emlős agy fejlődése folyamán is
12
lejátszódnak. A Hh illetve Shh morphogének által bekapcsolt jelpályák a differenciálódás folyamán a kétoldali szimmetria kialakulásáért felelősek. Genetikai károsodásuk jellegzetes fejlődési rendellenességekhez vezetnek (holoprosenkephalia, cyclopia). A meglepő az volt, hogy egyes koleszterin biogenezisét gátló szerek kísérleti alkalmazása gyengébb formájú, de azonos jellegű tünetegyüttest eredményezett. A koleszterin egyrészt azért szükséges, mert a ligand biogenezisében posttranszlációs modifikáció során kovalensen kapcsolódik a fehérjéhez (Hh vagy Shh protein). Másrészt a receptoron sterol sens domain (SSD) található, melyen keresztül a koleszterin aktiválja a jeltovábbítást. Más fehérjék szerkezetében is felfedeztek hasonló SSD szekvenciákat (eddig 7 ilyet ismerünk), melyek túlnyomó része a koleszterin homeosztázisban játszik szerepet, mint például a HMG-coA-reduktáz vagy a SREBP-t aktiváló SCAP (sterol regulator element binding protein cleaveage activating protein).
Függelék: Néhány példa a caveolák orvosi vonatkozásához Prion-betegség: A prion fehérjék poszttranszlációs átalakulásával keletkező forma (PrSc) halálos kimenetelű encephalopathiat okoz. Úgy tűnik, hogy ebben a folyamatban a caveolák szerepet játszanak, mivel a koleszterin szint csökkentése (a caveolák szétesése) gátolja a kórokozó prion fehérje kialakulását. Vírusfertőzés, pathogének: A caveolák mind a vírusok, mind a pathogének számára lehetőséget nyújtanak a sejtekbe való bekerülésre. Koleratoxin, SV40, Campylobacter jejuni, Plasmodium Trypanosoma, Leishmania által termelt GPI fehérjék a caveolákban halmozódnak fel és lefűződésükkel jutnak be a sejtekbe. Alzheimer -kór: Alzheimer-kóros betegek agyszövetében a szenilis plaque-k kialakulása jellemző tünete a betegségnek. A környező astroglia sejtekben a caveolin jelentős upregulációja volt megfigyelhető. A szenilis plaque-k fő fehérje alkotója a B-amiloid fehérje, amely egy amiloid prekurzorból szintetizálódik, és ez a caveolákban halmozódik fel. A caveolin-3 aktiválja a szintézist katalizáló enzimet. Myopáthiák: Caveolin-3 upregulációját figyelték meg Duchenne izom disztrófiában, ami összefügghet azzal, hogy a dystrophin downregulálódik. Továbbá azonosítottak egy caveolin-3 mutációt egy más típusú izomdegenerációban szenvedő egyénekben (limb-girdle muscular dystrophy ). A mutáció a caveolin-3 tökéletlen oligomerizációját eredményezi. . Javasolt irodalom: Okamoto T, Schlegel A, Scherer PE, Lisanti MP..Caveolins, a family of scaffolding proteins for organizing "preassembled signaling complexes" at the plasma membrane. J Biol Chem. 1998 Mar 6;273(10):5419-22. Review Anderson RG.. The caveolae membrane system. Annu Rev Biochem. 1998;67:199-225. Review. Fielding CJ, Fielding PE.: Cholesterol and caveolae: structural and functional relationships. Biochim Biophys Acta. 2000 Dec 15;1529(1-3):210-22. Review. Incardona JP, Eaton S: Cholesterol in signal transduction. Curr Opin Cell Biol. 2000 Apr;12(2):193-203. Review.
13
