LightCycler® MRSA Advanced Test For Use With The LightCycler® 2.0 Instrument PRO ÚČELY DIAGNOSTIKY IN VITRO. LightCycler® MRSA Advanced Test LightCycler® Advanced Lysis Kit
LC MRSA LYS ADV
96 Tests
P/N: 05352894 190
96 Tests
P/N: 05205743 190
ÚČEL POUŽITÍ Test LightCycler® MRSA Advanced je kvalitativní diagnostický test in vitro na přímé zjištění přítomnosti nazální kolonizace baktérií Staphylococcus aureus (MRSA) rezistentní vůči methicilinu. Test slouží jako pomůcka při prevenci a léčbě infekce MRSA v lékařských zařízeních. Test se provádí na zařízení LightCycler® 2.0 se vzorky nazálních výtěrů pacientů s podezřením na kolonizaci. Pro přípravu vzorků se používá extrakce výtěru a mechanická lýza, po níž následuje amplifikace DNA MRSA pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) a detekce amplifikované DNA pomocí fluorogenních cílově specifických hybridizačních sond. Test LightCycler® MRSA Advanced není určen k diagnóze, ani k provádění nebo monitorování léčby infekcí MRSA. Původní kultury jsou nutné k izolaci organismů pro epidemiologické stanovení nebo pro další zjištění citlivosti. SOUHRN A PRINCIP TESTU Staphylococcus aureus je oportunní patogen přenášený jako komenzální organizmus na kůži a v nosní dutině u přibližně 30 % běžné populace s potenciálem zapříčinit široké spektrum onemocnění, která mohou být smrtelná do 30 dní po infekci přibližně u 34 % případů1,2. Staphylococcus aureus se dokáže rychle adaptovat na selekční tlak léčby antibiotiky, což vedlo ke vzniku a rozšíření kmenů Staphylococcus aureus (MRSA) rezistentních vůči methicilinu. Gen mecA se nachází na rozsáhlém mobilním genetickém elementu, který se nazývá stafylokoková chromozomální kazeta (SCCmec) a tento gen je zodpovědný za rezistenci vůči methicilinu a dalším β-laktamovým antibiotikům. Gen mecA kóduje variabilní vazebný protein pro penicilin, PBP2a nebo PBP2’, který má pro všechna β-laktamová antibiotika velmi nízkou afinitu, což umožňuje vznik normální syntézy peptidoglykanové vrstvy a to dokonce i v přítomnosti těchto antibiotik3. Četné kmeny MRSA vznikly a rozšířily se po celém světě a různé rody Staphylococcus aureus senzitivních na methicilin získaly SCCmec4. Do dnešního dne bylo rozlišeno sedm typů SCCmec (I–VII) a bylo popsáno několik variant těchto typů SCCmec4. Nozokomiální infekce (HAI) způsobené MRSA získaly ve zdravotnických zařízeních v poslední době na významu kvůli velkému počtu infekcí, úmrtnosti a vysokým nákladům na léčbu5-8. Kromě toho se komunitní MRSA (CA-MRSA) v několika posledních letech rozšířily9 a způsobily nárůst infekcí v nemocnicích10, 11 a zdůraznily tak potřebu komplexních programů pro kontrolu infekce. V roce 2008 byla shrnuta doporučení vzešlá z publikovaných pokynů několika státních, odborných a zdravotnických organizací, aby si instituce mohly určit priority při zavádění vlastních snah při prevenci přenosu MRSA12. Jakýkoli program prevence přenosu MRSA musí zahrnovat několik hlavních strategií, včetně aktivního sledovacího screeningu, mytí rukou, izolace pacienta a dalších úkonů pro prevenci přenosu. Detekce MRSA pomocí PCR v reálném čase snižuje čas detekce (méně než 2 hodiny času v laboratoři) ve srovnání se standardními testy na kulturách a tak zlepšuje efektivnost strategií kontroly a léčby.
Oddíl s informacemi o revizi dokumentu se nachází na konci tohoto dokumentu. 05548900001-06CS
1
Doc Rev. 5.1
PRINCIPY POSTUPU Detekce MRSA pomocí testu LightCycler® MRSA Advanced je založena na třech hlavních krocích: •
Příprava vzorků pomocí mechanické lýzy stěn bakteriálních buněk.
•
PCR amplifikace cílové DNA a detekce pomocí specifických hybridizačních sond.
•
Analýza vrcholů tání a automatická tvorba výsledků
Příprava vzorku Pomocí lyzační soupravy LightCycler® Advanced a zařízení MagNA Lyser se provede mechanická lýza vzorků nazálních výtěrů. Vatové smotky výtěrů se odstřihnou do zkumavek určených pro lýzu a zahříváním se inaktivují veškeré bakterie. Následně se zkumavky určené pro lýzu vloží do zařízení MagNA Lyser, kde dojde k mechanické lýze stěn bakteriálních buněk, čímž se připraví hrubý lyzát buněk. Po krátkém odstředění, kdy dojde k separaci skleněných kuliček s vlákny tampónů, se zpracovaný vzorek podrobí PCR analýze pomocí testu LightCycler® MRSA Advanced a zařízení LightCycler® 2.0. PCR amplifikace Volba cílové sekvence Primery a sondy testu LightCycler® MRSA Advanced detekují speciální sekvenci, která indikuje integraci kazety SCCmec v chromozomu Staphylococcus aureus, což je znakem přítomnosti DNA MRSA. Amplifikace Zpracované vzorky a amplifikační směs obsahující tzv. hot-start Taq polymerázu se vloží do kapilár ® ® LightCycler (20 µl), ve kterých dojde k PCR amplifikaci. Každá reakce testu LightCycler MRSA Advanced obsahuje vnitřní kontrolu, která kontroluje inhibici vzorku a monitoruje integritu činidla. ® Enzym AmpErase (uracil-N-glykosyláza), který je obsažený v testu LightCycler MRSA Advanced rozpozná a katalyzuje rozklad řetězců DNA obsahujících deoxyuridin, ale nikoliv DNA obsahující deoxythymidin. Protože amplikony vytvořené pomocí testu LightCycler® MRSA Advanced obsahují deoxyuridin, potenciální kontaminanty amplikonu jsou eliminovány během prodlouženého zahřívání, které se provádí před začátkem PCR amplifikace. Cílová sekvence v plazmidu se simultánně amplifikuje v pozitivní kontrole. Úkolem pozitivní kontroly, která se zařazuje do každého cyklu testu, je monitorovat selhání činidla. Každý cyklus obsahuje i negativní kontrolu, která slouží k detekci kontaminace činidla nebo okolního prostředí DNA MRSA. Specifická detekce produktů PCR hybridizačními sondami Amplikony MRSA a vnitřní kontroly se detekují fluorescencí pomocí specifického páru hybridizačních sond. Sondy se přichytí ke specifické interní sekvenci v amplifikovaném fragmentu a umístí se ve vzájemné blízkosti. Při excitaci tyto vázané sondy vydávají fluorescenční signál o specifické vlnové délce díky procesu nazývanému přenos fluorescenční rezonanční energie (FRET). Zařízení LightCycler® 2.0 měří emitované světlo. Specifické amplikony MRSA a vnitřní kontroly mohou být rozlišeny díky tomu, že jsou paralelně detekovány ve dvou různých detekčních kanálech. ® Po dokončení PCR v reálném čase provede zařízení LightCycler 2.0 automaticky analýzu vrcholů tání. Jednovláknové amplikony DNA s navázanými hybridizačními sondami jsou podrobeny vzrůstajícím teplotám. Když produkty PCR dosáhnou specifické teploty, jedna ze dvou navázaných hybridizačních sond roztaje, což má za následek ztrátu fluorescenčního signálu. K poklesu fluorescenčního signálu dojde při specifické teplotě a má za následek stanovení vrcholů tání, které slouží k určení a rozlišení specifických amplikonů MRSA a vnitřní kontroly.
Analýza vrcholů tání a automatická tvorba výsledků Po provedení vizuální identifikace vrcholů tání pomocí kolmic TM v softwaru LightCycler® se výsledky testu přenesou do určeného interpretačního nástroje (software Micro Analysis) a vytvoří se zpráva s výsledky IVD.
05548900001-06CS
2
Doc Rev. 5.1
ČINIDLA LightCycler® Advanced Lysis Kit Lyzační souprava LightCycler® Advanced (P/N: 05205743 190)
LYS ADV
LYS (Lyzační činidlo) Tris pufr EDTA < 15 % skleněné kuličky 0,09 % azid sodný
96 testů
96 x 0,6 ml
LightCycler® MRSA Advanced Test (P/N: 05352894 190)
LC MRSA
96 testů
MRSA RXNMX (Reakční směs MRSA) Tris pufr < 0,1 % chlorid hořečnatý Chlorid draselný < 0,001 % dATP, dCTP, dGTP, dUTP 0,19 % oktylglukosid 0,03 % albumin bovinního séra (savčí) < 0,1 % FastStart Taq DNA polymeráza (mikrobiální) < 0,1 % enzym AmpErase (uracil-N-glykosyláza) (mikrobiální) 0,09 % azid sodný
3 x 0,352 ml
MRSA DETMX (Detekční směs MRSA) ® 0,05 % roztok Brij 35 Tris pufr < 0,01 % EDTA < 0,01 % MRSA primery < 0,01 % fluorescenčně značené oligonukleotidové sondy specifické pro MRSA a MRSA vnitřní kontrolu 0,09 % azid sodný 0,001 % Poly rA RNA (syntetická) < 0,001 % neinfekční (mikrobiální) DNA plazmid s obsahem sekvencí vázajících MRSA primer a specifickou sekvenci pro vazbu sondy
3 x 0,176 ml
MRSA (+) C (Pozitivní kontrola MRSA) Tris pufr < 0,01 % EDTA 0,002 % Poly rA RNA (syntetická) 0,09 % azid sodný < 0,001 % neinfekční (mikrobiální) DNA plazmid s obsahem MRSA sekvencí
1 x 0,176 ml
05548900001-06CS
3
Doc Rev. 5.1
VAROVÁNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ A.
PRO ÚČELY DIAGNOSTIKY IN VITRO. S tímto výrobkem mohou pracovat pouze pracovníci proškolení v technice PCR.
B.
Tento test je určen pouze pro vyšetřování vzorků z nazálních výtěrů.
C.
Nepipetujte ústy.
D.
V laboratorních prostorech nejezte, nepijte a nekuřte. Při manipulaci se vzorky a s činidly ze soupravy noste ochranné rukavice na jedno použití, laboratorní pláště a prostředek pro ochranu očí. Po manipulaci se vzorky a činidly si pečlivě umyjte ruce.
E.
Při odebírání alikvotních podílů z lahviček s činidly dbejte na to, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci. Doporučuje se používat jednorázové špičky k pipetám.
F.
Nesměšujte dohromady činidla z různých šarží, ani z různých lahviček téže šarže.
G.
Nesměšujte dohromady činidla z různých šarží souprav.
H.
Nespotřebovaná činidla, odpad a vzorky likvidujte v souladu s celostátními a místními předpisy.
I.
Po uplynutí data expirace již soupravu nepoužívejte.
J.
Materiálové bezpečnostní listy (Material Safety Data Sheets, MSDS) jsou na požádání k dispozici u místního zastoupení firmy Roche.
K.
Manipulace se vzorky a kontrolami se musí řídit pravidly pro zacházení s infekčním materiálem. Musí být používány bezpečné laboratorní postupy, např. postupy uvedené v publikaci Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories13 a v dokumentu CLSI 14 č. M29-A3 . Všechny pracovní plochy důkladně očistěte a vydezinfikujte čerstvě připraveným roztokem 0,5 % chlornanu sodného v deionizované či destilované vodě.
Poznámka: Běžné bělicí prostředky pro domácnost obvykle obsahují chlornan sodný v koncentraci 5,25 %. Roztok o koncentraci 0,5 % tak získáte zředěním bělidla pro domácnost v poměru 1:10. L.
LYS, MRSA RXNMX, MRSA DETMX a MRSA (+) C obsahují azid sodný. Ten může reagovat s olověným nebo měděným potrubím a vytvářet vysoce explozivní kovové azidy. Při likvidaci roztoků obsahujících azid sodný do laboratorního umyvadla propláchněte odtok velkým množstvím vody, abyste tak zabránili vytváření azidů.
M.
Při práci s jakýmkoliv činidlem používejte rukavice na jedno použití, pracovní oděv a ochranné brýle. Dbejte na to, aby se tyto materiály nedostaly do styku s pokožkou, očima nebo sliznicemi. Pokud ke styku dojde, okamžitě postiženou oblast omyjte velkým množstvím vody. Pokud by byla tato opatření zanedbána, může dojít k popáleninám. Jestliže se některá činidla rozlijí, rozřeďte je vodou a dosucha vytřete.
N.
Kontaminaci od pozitivních kontrol a vzorků lze zabránit důsledným uplatňováním zásad správné laboratorní praxe a pečlivým dodržováním postupů uvedených v tomto příbalovém letáku.
POŽADAVKY NA SKLADOVÁNÍ A MANIPULACI A.
Po obdržení skladujte lyzační soupravu LightCycler® Advanced (LYS) ve svislé poloze při teplotě 15 až 25 °C.
B.
Po obdržení skladujte soupravu pro test LightCycler® MRSA Advanced (MRSA RXNMX, MRSA DETMX a MRSA (+) C) při teplotě –15 až –25 °C. Pokud nejsou tato činidla otevřená, jsou stabilní až do uplynutí doby použitelnosti, která je na nich uvedena. Po otevření můžete skladovat zbývající MRSA RXNMX a MRSA DETMX při teplotě –15 až –25 °C až 30 dní. MRSA RXNMX a MRSA DETMX lze až 5krát zmrazit a rozmrazit.
C.
Po otevření můžete skladovat zbývající MRSA (+) C při teplotě –15 až –25 °C nebo při teplotě 2 až 8 °C až 30 dní. MRSA (+) C lze až 22krát zmrazit a rozmrazit.
05548900001-06CS
4
Doc Rev. 5.1
D.
MRSA DETMX chraňte před světlem.
E.
Pracovní Master Mix (připravený přidáním činidla MRSA RXNMX a MRSA DETMX) musí být čerstvě připraven a použit do 24 hodin od přípravy. Jestliže pracovní Master Mix není použit ihned po přípravě, musí být pracovní Master Mix skladován v temnu při teplotě 2 až 8 °C maximálně po dobu 24 hodin.
F.
Zpracované vzorky a negativní kontroly připravené pomocí tamponů Liquid Stuart a gelových tamponů Amies (s aktivním uhlím nebo bez něho) jsou stabilní až 1 den při 15 až 25 °C nebo až 5 dní při 2 až 8 °C nebo až 12 měsíců při -15 až -25 °C.
G.
Amplifikace by měla začít okamžitě po přidání zpracovaných vzorků a kontrol do pracovního roztoku Master Mix. Není-li to možné, můžete naplněné kapiláry skladovat ve tmě max. 3 hodiny při teplotě 2 až 8 °C.
DODÁVANÝ MATERIÁL A.
LightCycler® Advanced Lysis Kit ® Lyzační souprava LightCycler Advanced (P/N: 05205743 190)
LYS ADV
LYS (Lyzační činidlo) B.
LightCycler® MRSA Advanced Test (P/N: 05352894 190)
LC MRSA
MRSA RXNMX (Reakční směs MRSA) MRSA DETMX (Detekční směs MRSA) MRSA (+) C (Pozitivní kontrola MRSA)
POTŘEBNÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ DODÁVKY Vybavení a software
•
Zařízení LightCycler® 2.0 (P/N: 03 531 414 201)
•
Software LightCycler® 4.1 (P/N: 04 898 915 001) nebo vyšší
•
Balíček softwaru LightCycler® MRSA Advanced v1.2 CE (P/N: 06 364 861 190) nebo vyšší
•
LC karuselová centrifuga 2.0 [P/N: 03 709 582 001 (230 V) nebo P/N: 03 709 507 001 (110 V)] Poznámka: Jestliže jste již zakoupili LC karuselovou centrifugu [P/N: 12 189 682 001 (230 V) nebo P/N: 03 030 512 001 (115 V)], je nutná i sada s rotorem LightCycler® Carousel 2.0 [P/N: 03 724 697 001].
•
Nebo standardní stolní mikrocentrifuga s rotorem pro 2,0 ml zkumavky, a adaptéry pro LC centrifugu (P/N: 11 909 312 001]
•
Zařízení MagNA Lyser [P/N: 03 358 976 001 (230 V) nebo 03 358 968 001 (110 V)]
•
Volitelná čtečka čárových kódů [P/N: 05 536 421 001]
Činidla a spotřební materiál
•
Souprava LightCycler® Multicolor Compensation (P/N: 04 484 355 001)
•
Kapiláry LightCycler®, 20 µl (P/N: 04 929 292 001)
05548900001-06CS
5
Doc Rev. 5.1
DALŠÍ POTŘEBNÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ DODÁVKY
•
BD CultureSwab™ Liquid Stuart (BD P/N: 220099 nebo 220109), nebo Copan Venturi Transystem™ Liquid Stuart (Copan Italia International P/N: 141C nebo 139C);
•
nebo BD CultureSwab™ plus gel Amies bez aktivního uhlí (BD P/N: 220116 nebo 220117), nebo Copan Venturi Transystem™ plus gel Amies bez aktivního uhlí (Copan Italia International P/N: 108C nebo 134C);
•
nebo BD CultureSwab™ plus gel Amies s aktivním uhlím (BD P/N: 220121 nebo 220122), nebo Copan Venturi Transystem™ plus gel Amies s aktivním uhlím (Copan Italia International P/N: 114C nebo 136C)
•
Rukavice na jedno použití bez pudru
•
Gáza
•
Etanol (70 %)
•
Nastavitelné pipetory*: (objem: 10 µl, 100 µl a 1000 µl) se sterilními špičkami bez DNázy, špičky s aerosolovým bariérovým filtrem nebo s přímým vypuzováním
•
Vyhřívací blok nastavený na 95 °C (± 2 °C): VWR (P/N: 12621-088) nebo ekvivalentní blok s 2,0 ml zkumavkami: VWR (P/N: 12985-050)
•
Mikrocentrifuga o výkonu 8 000 – 20 000 x g s rotorem vhodným pro 2,0 ml zkumavky se šroubovacím uzávěrem: (P/N: model Eppendorf 5417C) nebo ekvivalentní
•
Sterilní silikonované polypropylenové 1,5 ml zkumavky pro mikrocentrifugu: (P/N: obj. č. Eppendorf 0030 108.051) nebo ekvivalentní
•
Vířivý mixér (Vortex): Fisher (P/N: 12-812) nebo ekvivalentní
•
Volitelně nástroj pro mikrozkumavky: VWR (P/N: 20170-688) nebo Rainin (P/N: PJ-4A) nebo ekvivalentní
* Pipetory musí být přesné s 3 % objemovou chybou. Kde je tak uvedeno, musejí být použity špičky s aerosolovou bariérou nebo špičky s pozitivním posunem bez DNázy, aby se zabránilo vzájemné kontaminaci vzorku a amplikonu. ODBĚR, PŘEPRAVA A SKLADOVÁNÍ VZORKŮ Poznámka: Zacházejte se vzorky a kontrolami jako s potenciálně infekčním materiálem. A.
Odběr vzorků
1.
Tampon navlhčete dvěma kapkami (přibližně 50 µl) sterilního fyziologického roztoku nebo použijte suchý.
2.
Jemně zaveďte tampon do nosní dírky přibližně 1,3 cm (v případě použití dvojitého tamponu zaveďte oba vatové smotky najednou) a rotačním pohybem otřete pětkrát nosní sliznici za mírného tlaku na nos z vnější strany (takto napomůžete kontaktu vatového smotku s vnitřní stranou nosu).
3.
Stejný tampon zaveďte i do druhé nosní dírky a postup opakujte.
4.
Vraťte tampon do transportní zkumavky a řádně ji označte.
05548900001-06CS
6
Doc Rev. 5.1
B.
Přeprava a skladování vzorků
Při přepravě vzorků je třeba dodržovat celostátní i místní předpisy pro přepravu infekčních biologických materiálů15. Vzorky lze přepravovat při teplotě 15 až 25 °C. Vzorky je možné před zpracováním skladovat (včetně času nutného pro přepravu) podle podmínek uvedených níže. •
•
Vzorek odebraný pomocí tamponů Liquid Stuart je stabilní: –
při teplotě 15 až 25 °C až 5 dní,
–
při teplotě 2 až 8 °C až 5 dní,
–
při teplotě -15 až -25 °C až 1 měsíc.
Vzorek odebraný pomocí gelových tamponů Amies (s aktivním uhlím nebo bez něho) je stabilní: –
při teplotě 15 až 22 °C až 4 dny (při teplotě 25 °C byla míra detekce 95% ve dni 6).
NÁVOD K POUŽITÍ Příprava zařízení A.
Instalace softwaru Micro Analysis (MAS)
Pro instalaci aktualizací ověřte, jsou-li s produktem dodány dodatečné informace. 1.
K řídicí jednotce LightCycler® se přihlaste jako správce.
2.
Do jednotky CD řídicí jednotky LightCycler® vložte CD se softwarem LightCycler® MRSA Advanced v1.2 CE (nebo vyšší). Spusťte instalaci MAS poklepáním na soubor setup.exe, který se nachází na CD.
3.
Při první instalaci:
4.
a.
Jestliže není nainstalována aplikace Microsoft Data Access Components 2.8, budete na začátku nastavení MAS vyzváni k její instalaci. Aplikace Microsoft Data Access Components 2.8 musí být nainstalována, jinak MAS nebude správně fungovat.
b.
Nemáte-li nainstalován Microsoft .NET Framework 2.0 (x86), budete vyzváni k jeho instalaci na začátku nastavení MAS. Aplikace Microsoft .NET Framework 2.0 (x86) musí být nainstalována, jinak MAS nebude správně fungovat.
c.
Nemáte-li nainstalovanou aplikaci Microsoft Windows Installer 3.1, budete vyzváni k její instalaci na začátku nastavení MAS. Aplikace Microsoft Windows Installer 3.1 musí být nainstalována, jinak MAS nebude správně fungovat.
d.
Nemáte-li nainstalovanou aplikaci Microsoft Visual Studio 2008 Report Viewer, budete vyzváni k její instalaci na začátku nastavení MAS. Aplikace Microsoft Visual Studio 2008 Report Viewer musí být nainstalována, jinak MAS nebude správně fungovat.
e.
Nemáte-li nainstalovanou aplikaci Microsoft SQL Server 2005 Express SP2 (x86), budete vyzváni k její instalaci na začátku nastavení MAS. Aplikace Microsoft SQL Server 2005 Express SP2 (x86) musí být nainstalována, jinak MAS nebude správně fungovat.
Když budete vyzváni k restartu, potvrďte stiskem
.
Poznámka: Během restartu nevyjímejte CD se softwarem LightCycler® MRSA Advanced. 5.
Po restartu postupujte podle pokynů instalačního průvodce. Stiskem spustíte instalaci MAS.
05548900001-06CS
7
Doc Rev. 5.1
6.
Zvolte <Just Me>, bude-li s řídicí jednotkou LightCycler® pracovat pouze jeden uživatel, zvolte ® <Everyone>, bude-li s řídicí jednotkou LightCycler pracovat více než jeden uživatel.
7.
Kliknutím na v okně potvrďte úspěšnost instalace MAS.
8.
Automaticky se vytvoří datové složky pro soubory *.ixo a *.pdf (, a ).
B.
Instalace a export maker LightCycler® MRSA Advanced
1.
Nainstalujte makra *.lckit LightCycler® MRSA Advanced MCC Macro v1.0 (MRSA ® MCC_04484355001A_1.0.Ickit) nebo vyšší a LightCycler MRSA Advanced Macro v1.0 (MRSA_05352894190_1.0.Ickit) nebo vyšší z CD se softwarem LightCycler® MRSA Advanced v1.2 CE CD (nebo vyšší).
2.
Podívejte se prosím do provozní příručky A k zařízení LightCycler® 2.0, kapitola „Spouštění makra Roche“.
3.
Exportujte obě makra do složky ; když budete požádáni, abyste uložili soubor, jako typ souboru zvolte *.ixo a neměňte originální název makra.
C.
Ověření instalace softwaru Micro Analysis (MAS)
1.
Zkopírujte následující důkazní soubory z CD se softwarem LightCycler® MRSA Advanced v1.2 CE (nebo vyšší) do složky (neukládejte soubory do podsložek).
2.
a.
MRSA Advanced Proof File v1.2 CE.ixo, nebo vyšší
b.
MRSA Advanced Proof File v1.2 CE.pdf, nebo vyšší
® Zkopírujte následující soubory kompenzace barvy z CD se softwarem LightCycler MRSA Advanced v1.2 CE (nebo vyšší) do složky .
a.
MRSA_CCE_080905-01.ixo
b.
MRSA_CCO_080905-01.ixo
3.
Jestliže aplikace MAS není ještě spuštěná, poklepejte na ikonu MAS na pracovní ploše a stiskněte .
4.
Zvolte důkazní soubor MRSA Advanced v1.2 CE.ixo (nebo vyšší) ve složce .
5.
Do příslušných polí okna pro nastavení konfigurace MRSA zadejte číslo šarže, datum expirace a informace laboratoře. Lyzační souprava Advanced Lot No
11A00000
Expiration Date
12201812
Test MRSA Advanced Lot No
23A00000
Expiration Date
24201812
Personalizované informace Lab Info 6.
Roche Lab
Zvolte typ zprávy <MRSA Combined> a pokračujte kliknutím na . Soubor bude analyzován automaticky a data budou zobrazena.
05548900001-06CS
8
Doc Rev. 5.1
7.
Zprávu vytiskněte.
8.
Přejděte do složky a otevřete a vytiskněte důkazní soubor MRSA Advanced Proof File v1.2 CE.pdf (nebo vyšší).
9.
Ujistěte se, že vytištěná zpráva MAS a vytištěná zpráva PDF uvádějí stejné výsledky. V opačném případě kontaktujte místní zastoupení Roche pro získání technické pomoci.
D.
Odinstalace softwaru Micro Analysis (MAS)
1.
® K řídicí jednotce LightCycler se přihlaste jako správce.
2.
® Klikněte na <Start> na hlavním panelu řídicí jednotky LightCycler .
3.
V levém spodním rohu pracovní plochy Windows zvolte <Start> / / .
4.
Zobrazí se seznam aktuálně instalovaných programů; klikněte na <MAS>.
5.
Zvolte a potvrďte tento příkaz kliknutím na .
Poznámka: CD se softwarem MRSA Advanced nabízí funkci odinstalace a opravy. Tuto funkci odinstalace je možné použít místo postupu uvedeného výše. Funkce oprava se používá k obnovení poškozených nebo chybějících souborů softwaru Micro Analysis. E.
Kompenzační experiment více barev pomocí kompenzační soupravy LightCycler® Multicolor pro použití se zařízením LightCycler® 2.0
Těmito kroky vytvoříte nový nebo nahradíte expirovaný soubor pro kompenzaci barvy. 1.
Rozmrazte lahvičky 1, 2, 3 a 5; jemně rozviřte a krátce odstřeďte.
2.
Připravte trojnásobné ředění lahvičky 2 smícháním:
3.
a.
10 µl roztoku obsaženého v lahvičce 2,
b.
20 µl pufru ze zkumavky LYS; nepřenášejte skleněné kuličky.
® Napipetujte 10 µl každé složky do samostatné kapiláry LightCycler (20 µl).
a.
Kapilára 1: lahvička 1
b.
Kapilára 2: krok ředění E2
c.
Kapilára 3: lahvička 3
d.
Kapilára 4: lahvička 5
Poznámka: Po dokončení cyklu zlikvidujte roztok v lahvičce 2. 4.
Napipetujte 10 µl pufru ze zkumavky LYS (nepřenášejte skleněné kuličky) do každé kapiláry, abyste dosáhli celkového objemu 20 µl.
5.
Utěsněte každou kapiláru uzávěrem pomocí uzavíracího nástroje.
6.
Kapiláry odstřeďujte v LC karuselové centrifuze 2.0 nebo standardní centrifuze s adaptéry. Zkumavky musí být v karuselu umístěny takto: a.
Poloha karuselu 1: CCB (lahvička 1)
b.
Poloha karuselu 2: CC530 (lahvička 2)
c.
Poloha karuselu 3: CC610 (lahvička 3)
d.
Poloha karuselu 4: CC670 (lahvička 5)
05548900001-06CS
9
Doc Rev. 5.1
Poznámka: V kapilárách nepoužívejte menší objem. 7.
Umístěte karusel na vzorky LightCycler® do zařízení LightCycler® 2.0. Jestliže používáte standardní centrifugu, přeneste kapiláry do karuselu na vzorky LightCycler® v pořadí, které je uvedeno v kroku E6.
Poznámka: Neměňte pořadí činidel v karuselu. 8.
Spusťte a uložte Color Compensation Experiment (CCE). a.
Pokyny k použití makra LightCycler® MRSA Advanced MCC najdete v provozní ® příručce „A“ k zařízení LightCycler 2.0, kapitola „Spouštění makra Roche“.
Poznámka: Nepoužívejte pole . Pokud chcete přidat číslo šarže testu k experimentu, zadejte informaci do odpovídajícího pole v editoru vzorků.
9.
b.
Uložte cyklus; při tvorbě názvu použijte tyto povinné zásady experimentu kompenzace barvy: MRSA_CCE_RRMMDD-xx, kde je R=rok, M=měsíc, D=den a xx=číslo cyklu.
c.
Po dokončení cyklu se automaticky vytvoří zpráva LightCycler® a lze ji vytisknout.
Validace cyklu Zpráva nebude uvádět, zda byl experiment kompenzace barvy úspěšný. Úspěch experimentu kompenzace barvy je stanoven až po aplikaci objektu kompenzace barvy vytvořeného během CCE na původní cyklus MRSA Advanced.
10.
11.
a.
Jestliže zpráva softwaru LightCycler® (LCS) experimentu kompenzace barvy (CCE) obsahuje příznak <User Developed or Modified Test Method> je CCE neplatný. Opakujte experiment kompenzace barvy (od kroku E1).
b.
Jestliže zpráva LCS experimentu kompenzace barvy (CCE) neobsahuje příznak, pokračujte k dalšímu kroku.
Vytvořte objekt kompenzace barvy (CCO). a.
Aktivujte modul analýzy kompenzace barev a stiskněte tlačítko <save CC object>.
b.
Vytvořte krátké jedinečné jméno a použijte přitom povinné zásady pojmenování pro objekt kompenzace barvy: MRSA_CCO_RRMMDD-xx, kde je R=rok, M=měsíc, D=den a xx=číslo cyklu.
c.
Test LightCycler® MRSA Advanced používá tento objekt pro další analýzy.
Exportujte soubory CCE a CCO do složky ; když budete požádáni, abyste uložili soubor, jako typ souboru zvolte *.ixo a neměňte originální názvy souborů.
Příprava vzorku a kontroly A.
Příprava vzorků
1.
Pro každý vzorek od pacienta označte jednu zkumavku LYS.
Poznámka: Neoznačujte zkumavky na povrch uzávěru. 2.
Vyjměte tampon z transportní zkumavky.
3.
Vložte jeden vatový smotek s výtěrem do zkumavky LYS.
Poznámka: Jestliže používáte jeden vatový smotek, je možné provést přímou detekci kultury naočkováním smotku na destičku před jeho vložením do zkumavky LYS.
05548900001-06CS
10
Doc Rev. 5.1
4.
Podržte výtěr za špejli poblíž okraje zkumavky, zvedněte výtěr několik milimetrů nad dno zkumavky a tlakem špejle na okraj zkumavky špejli zlomte.
Poznámka: Aby byla minimalizována kontaminace při oddělování výtěru, používejte gázu. Pro každý výtěr používejte novou gázu. 5.
Uzávěr zkumavky LYS pevně uzavřete.
B.
Příprava negativní kontroly
Poznámka: Negativní kontroly musí být připraveny ve stejné době jako vzorky. 1.
Pro negativní kontrolu označte jednu zkumavku LYS.
Poznámka: Neoznačujte zkumavky na povrch uzávěru. 2.
Vložte sterilní tampon do transportní zkumavky. Viz oddíl „Další potřebný materiál, který není součástí dodávky“, kde najdete seznam doporučených tamponů.
3.
Po dobu alespoň 1 minuty při pokojové teplotě inkubujte.
4.
Vyjměte tampon z transportní zkumavky.
5.
Vložte jeden vatový smotek s výtěrem do zkumavky LYS.
6.
Podržte výtěr za špejli poblíž okraje zkumavky, zvedněte výtěr několik milimetrů nad dno zkumavky a tlakem špejle na okraj zkumavky špejli zlomte.
Poznámka: Aby byla minimalizována kontaminace při oddělování výtěru, používejte gázu. 7.
Uzávěr zkumavky LYS pevně uzavřete.
C.
Zpracování vzorků a kontrol
1.
Ve vyhřívacím bloku nastaveném na 95 ± 2 °C zahřívejte vzorky a negativní kontrolu po dobu 2 minut.
2.
Lýzujte vzorky a negativní kontrolu v zařízení MagNA Lyser po dobu 70 sekund při rychlosti 5 000 ot/m. Návod k použití najdete v provozní příručce k přístroji MagNA Lyser.
3.
Vzorky a negativní kontrolu odstřeďujte při pokojové teplotě po dobu 1 minuty rychlostí 8 000-20 000 x g.
Poznámka: Zpracované vzorky a negativní kontroly připravené pomocí tamponů Liquid Stuart a gelových tamponů Amies (s aktivním uhlím nebo bez něho) jsou stabilní až 1 den při 15 až 25 °C nebo až 5 dní při 2 až 8 °C nebo až 12 měsíců při -15 až -25 °C. Příprava činidel 1.
Při pokojové teplotě rozmrazte MRSA RXNMX a MRSA DETMX a MRSA (+) C. Před použitím činidel se ujistěte, že jsou zcela rozmražená.
2.
Rozviřte MRSA RXNMX a MRSA DETMX a MRSA (+) C po dobu 3–5 sekund a krátce odstřeďujte, aby bylo možné odebrat materiál ve spodní části zkumavky.
3.
Do sterilní silikonované polypropylenové zkumavky pro mikrocentrifugu připravte pracovní Master Mix pro požadovaný počet testovaných vzorků a kontrol. (Jako vodítko použijte tabulku 1.) Každý cyklus musí obsahovat alespoň jeden vzorek, jednu pozitivní kontrolu a jednu negativní kontrolu.
Poznámka: Doporučené množství je určené pro 2 reakce pro negativní kontrolu a pozitivní kontrolu a také další množství, které bere v úvahu mrtvý objem a usnadňuje pipetování ze zkumavky se směsí a pipetování do LC kapilár. Poznámka: Při otevírání MRSA RXNMX a MRSA DETMX si v případě potřeby pomozte nástrojem pro mikrozkumavky (VWR P/N 20170-688 nebo Rainin P/N PJ-4A).
05548900001-06CS
11
Doc Rev. 5.1
Tabulka 1 Příprava pracovního Master Mixu Počet vzorků
Objem MRSA RXNMX (µl)
Objem MRSA DETMX (µl)
Celkový objem (µl)*
1
40
20
60
2
50
25
75
3
60
30
90
4
70
35
105
5
80
40
120
6
90
45
135
7
100
50
150
8
110
55
165
9
120
60
180
10
130
65
195
11
150
75
225
12
160
80
240
13
170
85
255
14
180
90
270
15
190
95
285
16
200
100
300
17
210
105
315
18
220
110
330
19
230
115
345
20
240
120
360
21
260
130
390
22
270
135
405
23
280
140
420
24
290
145
435
25
300
150
450
26
310
155
465
27
320
160
480
28
330
165
495
29
340
170
510
30
350
175
525
* Zahrnuje objem pro NC, MRSA (+) C a mrtvý objem.
4.
Rozviřte pracovní Master Mix po dobu 3–5 sekund a krátce odstřeďte, aby bylo možné odebrat materiál ve spodní části zkumavky. Pracovní Master Mix musí být denně připravován čerstvý. Případný nepoužitý pracovní Master Mix zlikvidujte do 24 hodin od přípravy.
05548900001-06CS
12
Doc Rev. 5.1
Příprava zpracovaných vzorků a kontrol 1.
Přeneste požadovaný počet kapilár LightCycler® do karuselu na vzorky, nebo do adaptérů karuselu. Jsou nutné jedna (1) kapilára pro pozitivní kontrolu (pozice 1), 1 kapilára pro zpracovanou negativní kontrolu (pozice 2) a 1 kapilára pro každý zpracovaný vzorek (pozice 3 a vyšší).
Poznámka: Kapiláry LightCycler® uchopte v místě zásobníku. 2.
Do zásobníku každé kapiláry napipetujte 15 µl pracovního Master Mixu.
3.
5 µl čistého supernatantu z každého zpracovaného vzorku napipetujte do kapilár č. 3 a vyšších. Po každém vzorku vyměňte špičku pipety.
4.
Do kapiláry č. 2 napipetujte 5 µl zpracované negativní kontroly.
Poznámka: Zpracované vzorky a negativní kontroly připravené pomocí tamponů Liquid Stuart a gelových tamponů Amies (s aktivním uhlím nebo bez něho) jsou stabilní až 1 den při 15 až 25 °C nebo až 5 dní při 2 až 8 °C nebo až 12 měsíců při -15 až -25 °C. Jestliže používáte zmražené zpracované vzorky, rozmrazte je při teplotě laboratoře, rozviřte 10 sekund a poté je odstřeďte při 8 000–20 000 x g při teplotě laboratoře po dobu 1 minuty. 5.
Napipetujte 5 µl rozmražené MRSA (+) C do kapiláry č. 1.
6.
Utěsněte každou kapiláru uzávěrem pomocí uzavíracího nástroje.
7.
Kapiláry odstřeďujte v LC karuselové centrifuze 2.0 nebo standardní centrifuze s adaptéry.
8.
Umístěte karusel na vzorky LightCycler® do zařízení LightCycler® 2.0.
Poznámka: Jestliže používáte standardní centrifugu, přeneste kapiláry do karuselu na vzorky LightCycler® pořadí, které je uvedeno v kroku 1. Poznámka: Amplifikace by měla začít okamžitě po přidání zpracovaných vzorků a kontrol do pracovního roztoku Master Mix. V případě, že to není možné, lze naplněné kapiláry skladovat ve tmě až 3 hodiny při teplotě 2 až 8 °C. Plnění a provoz zařízení LightCycler® 2.0 1.
Přihlaste se k softwaru LightCycler®.
2.
Spusťte makro LightCycler® MRSA Advanced (podrobnosti viz provozní příručka „A“ k zařízení LightCycler® 2.0, kapitola „Spouštění makra Roche“).
Poznámka: Nepoužívejte pole . Před spuštěním analýzy výsledků si MAS vyžádá informace o činidle (číslo šarže testu lze vložit do příslušného pole editoru vzorků v softwaru LightCycler®). 3.
Jedinečným identifikátorem pojmenujte cyklus.
4.
Zredukujte přednastavený seznam plnění na takový počet vzorků, který se bude testovat. Je-li nedopatřením vymazáno příliš mnoho pozic vzorků, začněte postup od kroku 2.
5.
Nasnímejte štítky vzorků s čárovým kódem nebo ručně zadejte názvy vzorků do pole pro název vzorku nebo ponechte výchozí nastavení. K zadání dat je možné použít pole .
Poznámka: Neměňte výchozí název pozitivních a negativních kontrol. 6.
Postupujte podle pokynů na obrazovce a spusťte cyklus testu LightCycler® MRSA Advanced.
05548900001-06CS
13
Doc Rev. 5.1
VÝSLEDKY Identifikace vrcholů a automatická analýza výsledků: Poznámka: Pokud cyklus zařízení LightCycler® probíhá, nezačínejte analýzu dat. •
Manuální TM Calling vyžaduje manuální ovládání ve dvou automaticky vybraných modulech TM Calling.
•
Moduly pro absolutní kvantifikaci se v analýze tohoto testu nepoužívají.
•
V okně vrcholů tání jsou zobrazeny všechny křivky vybraných grafů.
•
Nastavení kolmice TM pro každý modul analýzy je předdefinováno v makru LightCycler® MRSA Advanced.
•
Je možné označit volbu nebo zrušit výběr kolmice TM bez vzniku příznaku.
•
Výchozí hodnoty každého modulu analýzy jsou předdefinovány v makru LightCycler MRSA Advanced podle následující tabulky a nesmí se zrušit jejich výběr, ani měnit. Pokud je nedopatřením provedena změna, zapište správné hodnoty z tabulky 2.
®
Tabulka 2 Výchozí hodnoty CH 610
CH 670
0,085
0,100
Výchozí hodnota •
Vrcholy jsou definovány jako maxima nad výchozími hodnotami. Ramena nejsou vrcholy.
•
Příklady typických vrcholů a vrcholu s ramenem (graf 3), pozitivní kontroly (graf 1, kanál 610) a interní kontroly (graf 2, kanál 670).
Graf 1
Graf 2
05548900001-06CS
14
Doc Rev. 5.1
Graf 3
Nastavení kolmic TM: 1.
Po dokončení cyklu zobrazí průvodce experimentem .
2.
Přesuňte okno Message do dolní části obrazovky, aby bylo možné vidět hodnoty TM a výchozí hodnoty (neklikejte na ).
3.
Kliknutím na modul analýzy TM Calling 610; zobrazí se přehled všech pozic.
4.
Posunutím levé čáry s úchytkou doprava zmenšete okno s grafem, takže by se měly objevit sloupce „Baseline“, „TM1“, „Height1“.
Poznámka: Je-li zvolena více než jedna pozice, objeví se nastavení první zvolené kapiláry. Poznámka: Přesunutí kolmic má vliv na všechny aktivované a zvolené kapiláry. 5.
Kliknutím na pozici pozitivní kontroly (#PC#) zvolíte pozitivní kontrolu.
6.
Jestliže kolmice TM není umístěna na vrcholu (nad výchozí hodnotou), přesuňte ji na vrchol a zaměřte se na specifikované rozsahy TM (viz tabulka 3).
7.
Jestliže nad výchozí hodnotou nejsou žádné vrcholy, ponechte kolmici TM ve výchozí pozici. Ujistěte se, že kolmice neoznačují sklony žádných aktuálních vrcholů (např. mimo specifikovaný rozsah TM range).
8.
Ujistěte se, že ve sloupcích „TM1“ a „Height1“ jsou zobrazeny hodnoty daného vzorku (jakékoli hodnoty). Jestliže nejsou viditelné žádné hodnoty (je tam prázdné místo), posuňte kolmici TM na vrchol; ve sloupcích „TM1“ a „Height1“ by se teď měly objevit hodnoty. Tabulka 3 Specifikované TM rozsahy Nízký TM (°C)
Vysoký TM (°C)
MRSA (CH 610)
57,00
62,00
Vnitřní kontrola (CH 670)
57,00
62,00
Poznámka: U vzorků bez vrcholů (např. u negativních kontrol) se automatické nastavení stupnice upraví na nejvyšší hodnotu pozadí. V takovém případě nemusí být vidět předdefinovaná výchozí hodnota. Jestliže chcete, aby byla výchozí hodnota viditelná, zvolte tuto pozici kapiláry spolu s pozitivní kontrolou. Poznámka: Označené vrcholy mimo specifikovaný rozsah TM se objeví ve zprávě MAS. 9.
U všech zbývajících pozic proveďte detekci vrcholů podle popisu v krocích 5 až 8 výše (kontroly a vzorky).
10.
Klikněte na modul analýzy TM Calling 670.
11.
U všech pozic proveďte detekci vrcholů podle popisu v krocích 4 až 8 výše (kontroly a vzorky).
05548900001-06CS
15
Doc Rev. 5.1
Dokončete TM calling: 1.
Přesuňte okno průvodce experimentem zpět do středu obrazovky a stiskněte .
2.
Zpráva LightCycler® je automaticky vygenerována a může být vytisknuta.
3.
Experiment je automaticky uložen.
Poznámka: Jestliže po uložení dojde k jakýmkoli změnám v polích s názvy vzorků v softwaru LightCycler®, obsluha musí zvolením a kliknutím na ikony „Abs Quant 610“ a „Abs Quant 670“ aktualizovat databázi a znovu uložit soubor. 4.
Soubor *.ixo exportujte kliknutím na \ <Export> do složky .
Automatická analýza výsledků pomocí softwaru Micro Analysis (MAS): 1.
Poklepejte na ikonu MAS na pracovní ploše počítače a stiskněte <Start>.
2.
Zvolte experiment MRSA Advanced k analýze ze složky a nahrajte soubor *.ixo.
3.
Nasnímejte nebo manuálně vložte číslo šarže a datum expirace, které najdete na soupravě Advanced Lysis a na testu LightCycler® MRSA Advanced.
4.
Popř. zadejte osobní informace (např. jméno obsluhy).
Poznámka: Od tohoto okamžiku se budou používat naposledy zadané informace do MAS. 5.
Zvolte příslušný formát zprávy (v tabulce, ve skupinách nebo smíšený).
6.
Soubor *.ixo experimentu MRSA Advanced bude automaticky analyzován a data budou zobrazena ve zvoleném formátu zprávy.
7.
Vytiskněte zprávu MAS a/nebo ji exportujte ve formátu *.pdf.
Poznámka: Zpráva MAS zobrazuje výsledky IVD, a proto nahrazuje informace ze všeobecné zprávy LightCycler® (zpráva LCS).
05548900001-06CS
16
Doc Rev. 5.1
VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ 1.
Software LightCycler® vypočítá výsledky na základě změřených fluorescenčních signálů a vnitřních výpočetních algoritmů. Poté software Micro Analysis (MAS) výsledky prezentuje.
2.
MAS automaticky provádí cyklus, kontroly a validace vzorků.
Poznámka: Pro stav cyklu, stav kontrol a stav vzorku (RUN STATUS, CONTROLS STATUS a SAMPLE STATUS) mohou být vygenerovány příznaky a poznámky. Obsluha musí zkontrolovat všechna pole zprávy MAS, zda se v ní nevyskytují příznaky nebo poznámky. Poznámka: Negativní výsledek testu LightCycler® MRSA Advanced nevylučuje přítomnost nazální kolonizace baktérií MRSA. 3.
V případě platného cyklu jsou výsledky interpretovány takto: Výsledek CH 610 (MRSA)
Výsledek CH 670 (IC)
Výsledek MRSA
Poznámka
Interpretace
DETECTED
-
Vzorek je pozitivní na DNA MRSA. Předpoklad nazální kolonizace MRSA.
POZITIVNÍ
nebo
POZITIVNÍ
NEGATIVNÍ
NEGATIVNÍ
NEGATIVNÍ
INVALID
IC not detected
Neplatný výsledek. Opakujte PCR postup s rozmraženými zpracovanými vzorky nebo s novými vzorky. Jestliže je výsledek stále neplatný, vykažte neplatný výsledek a kontaktujte mistní zastoupení firmy Roche.
NEGATIVNÍ
POZITIVNÍ
NOT DETECTED
-
DNA MRSA nebyla detekována. Nazální kolonizace MRSA je nepravděpodobná.
MAS může poskytnout další poznámky o pozitivní kontrole, negativní kontrole a o výsledku analýzy vzorku: Poznámka
Interpretace
Peak(s) outside Target TM range
Amplikony detekovány mimo specifikovaný rozsah MRSA TM.
Peak(s) outside IC TM range
Amplikony detekovány mimo specifikovaný rozsah IC TM.
Jestliže je v MAS pro výsledek vzorku, který je buď „Not Detected / Valid“ nebo „Invalid / Invalid“ (sloupce „MRSA Result“ a „Status“ zprávy MAS) uvedena poznámka „Peak(s) outside Target TM range“, musí být vzorek považován za podezřelý, že je pozitivní na DNA MRSA. Odeberte další vzorek (nebo použijte zbývající smotek z dvojitého tamponu) a proveďte opakované testování pomocí alternativního postupu, například kultivace, pro stanovení stavu nazální kolonizace pacienta. Výsledky vzorku, které jsou „Detected / Valid“ (sloupce „MRSA Result“ a „Status“ ve zprávě MAS), a pro které MAS zobrazí „Peak(s) outside Target TM range“, musí být interpretovány jako pozitivní na DNA MRSA (předpokládaná nazální kolonizace MRSA). Přítomnost těchto poznámek zobrazených v liště „Controls Status“ zprávy MAS nemění interpretaci „Controls Status“ ani „Run Status“ vytvořenou MAS a zobrazenou ve zprávě MAS.
05548900001-06CS
17
Doc Rev. 5.1
4.
MAS může zobrazit následující příznaky: Příznak Invalid macro version
Poznámky File could not be loaded
Interpretace Bylo aplikováno nesprávné makro. Důležité parametry v souborech *.ixo CCE a/nebo CCO a/nebo MRSA Advanced se liší od referenčních souborů *.ixo maker MRSA Advanced. Možné příčiny jsou uvedeny v provozní příručce ® k zařízení LightCycler 2.0 (např. úprava výchozího nastavení makra) Použitelnost lyzační soupravy LightCycler® Advanced vypršela Použitelnost testu LightCycler® MRSA Advanced vypršela
Stav Run INVALID
User Developed or Modified Test Method
-
Lysis Kit expired
-
MRSA Test expired
-
CCO expired on YYMMDD1
-
Soubor kompenzace barvy je starší než šest měsíců.
Run INVALID
INVALID CCO NAME
-
Objekt kompenzace barvy je nesprávně pojmenován.
Run INVALID
MULTIPLE CCO USED
-
V modulech analýzy jsou použity různé soubory kompenzace barvy.
Run INVALID
NO CCO USED
-
V modulech analýzy chybí jeden nebo více souborů kompenzace barvy.
Run INVALID
05548900001-06CS
18
Run INVALID
Run INVALID Run INVALID
Nápravné opatření Opakujte cyklus LightCycler®. Proveďte kontrolu správného makra v softwaru LightCycler® a/nebo softwaru MRSA Advanced. Jestliže se zobrazí další příznaky, podívejte se na nápravu pro daný příznak. Jestliže nejsou zobrazeny žádné další příznaky, opakujte experiment. Jestliže se opakovaně zobrazuje příznak, volejte místní servis Roche. Opakujte cyklus LightCycler® s neexpirovanými činidly. Opakujte cyklus LightCycler® s neexpirovanými činidly. Připravte nový cyklus kompenzace barvy a vytvořte nový objekt kompenzace barvy. Zopakujte cyklus LightCycler®, který byl proveden s expirovaným CCO. Připravte nový cyklus kompenzace barvy a vytvořte nový objekt kompenzace barvy s dodržením konvence pojmenování uvedené v tomto dokumentu. Zopakujte cyklus LightCycler®, který byl proveden s nesprávně pojmenovaným CCO. V softwaru LightCycler® otevřete soubor *.ixo experimentu MRSA a zvolte správný objekt kompenzace barvy. Uložte experiment a znovu exportujte. V softwaru LightCycler® otevřete soubor *.ixo experimentu MRSA a zvolte správný soubor kompenzace barvy. Uložte experiment a znovu exportujte.
Doc Rev. 5.1
Příznak
Poznámky
INVALID LCS VERSION
-
INVALID BASELINE
-
INVALID NC
• NC: Target peak(s) detected • NC: IC not detected
INVALID PC
PC: PC not detected
INVALID NC NAME
INVALID PC NAME
1
Interpretace Byla použita nesprávná verze softwaru LightCycler® pro danou proceduru.
Základní hodnoty byly nedopatřením změněny.
Stav Run INVALID
Run INVALID
Nápravné opatření Otevřete software LightCycler® a proveďte kontrolu správného čísla verze. Otevřete *.ixo soubor experimentu MRSA v softwaru LightCycler® a zkontrolujte základní hodnoty dle tabulky 2. Uložte experiment a znovu exportujte.
•
V rozsahu MRSA TM negativní kontroly detekován(y) amplikon(y). • V negativní kontrole nebyla detekována žádná IC. V pozitivní kontrole nebyla detekovaná cílová MRSA
Controls INVALID
Viz oddíl Kontrola kvality.
Controls INVALID
Viz oddíl Kontrola kvality.
-
Byl změněn výchozí název negativní kontroly.
Controls INVALID
-
Byl změněn výchozí název pozitivní kontroly.
Controls INVALID
Otevřete *.ixo soubor experimentu MRSA v softwaru LightCycler® a zadejte #NC#. Uložte experiment a znovu exportujte. Otevřete *.ixo soubor experimentu MRSA v softwaru LightCycler® a zadejte #PC#. Uložte experiment a znovu exportujte.
MAS vypíše varování 30 dní před expirací činidla.
05548900001-06CS
19
Doc Rev. 5.1
5.
MAS může zobrazit následující hlášení: Hlášení
Interpretace
Stav
Macro file <…> was not found
Soubor s makrem <…> chybí ve složce
Interpretation aborted
CCExperiment file <…> was not found
Soubor CCE <…> chybí ve složce
Interpretation aborted
CCObject <…> file was not found
Soubor CCO <…> chybí ve složce
Interpretation aborted
Error in… Color Compensation Experiment/Object / MRSA Experiment / or MD5 Hash code
Neúspěšná kontrola integrity souboru ixo.
Interpretation aborted
Modified test method in < ….>
Zjištění modifikovaného parametru
Run INVALID
Nápravné opatření Exportujte ještě jednou soubor s makrem ze softwaru LightCycler® do složky . Exportujte ještě jednou soubor CCE ze softwaru ® LightCycler do složky . Exportujte ještě jednou soubor CCO ze softwaru ® LightCycler do složky . Exportujte ještě jednou soubory experimentu, CC a makra ze softwaru LightCycler®. Jestliže se neustále zobrazuje toto hlášení, volejte místní servis Roche. Viz „User Developed or Modified Test Method“.
KONTROLA KVALITY 1.
Každá reakce LightCycler® MRSA Advanced obsahuje vnitřní kontrolu (IC). IC kontroluje inhibici vzorku a monitoruje integritu činidla. a.
Vnitřní kontrola (IC) Vnitřní kontrola musí být detekována jako pozitivní u všech MRSA negativních vzorků a také u negativní kontroly (NC). Jestliže je IC negativní u negativního vzorku, analýza vzorku není platná a PCR postup s čerstvě rozmraženým zpracovaným vzorkem se musí opakovat. Jestliže je IC negativní u NC, je neplatný celý cyklus a musí se opakovat se zmraženými nebo novými vzorky. Jestliže je opakovaný cyklus se zmraženými vzorky stále neplatný, vykažte neplatný výsledek a kontaktujte místní zastoupení společnosti Roche. Výsledek IC se u MRSA pozitivních vzorků a u platné pozitivní kontroly (PC) ignoruje, protože amplifikace MRSA může s touto kontrolou konkurovat.
2.
S každým cyklem se musí analyzovat alespoň 1 pozitivní kontrola a 1 negativní kontrola. Úkolem PC je monitorovat selhání činidla. Negativní kontrola se používá k detekci činidla nebo k detekci kontaminace prostředí MRSA DNA. Amplifikační činidla obsahují enzym, který zabraňuje kontaminaci amplikony MRSA. Software LightCycler® automaticky přiřazuje pozice obou kontrol v zařízení. a.
Negativní kontrola (NC) NC musí být negativní a její vnitřní kontrola musí být pozitivní. Jestliže NC nesplňuje tato kritéria, je neplatný celý cyklus a musí se opakovat se zmraženými nebo novými vzorky. Jestliže je opakovaný cyklus stále neplatný, kontaktujte místní zastoupení společnosti Roche.
05548900001-06CS
20
Doc Rev. 5.1
b.
Pozitivní kontrola (PC) PC musí být pozitivní (s vnitřní kontrolou pozitivní, nebo negativní). Jestliže PC nesplňuje toto kritérium, je neplatný celý cyklus a musí se opakovat se zmraženými nebo novými vzorky. Jestliže je opakovaný cyklus stále neplatný, kontaktujte místní zastoupení společnosti Roche. Software Micro Analysis (MAS) může vytvářet příznaky a poznámky. Obsluha musí zkontrolovat, zda výtisky neobsahují příznaky a poznámky a zda byl cyklus platný.
Kontrola
Výsledek CH 610 (MRSA)
Výsledek CH 670 (IC)
NEGATIVNÍ
POZITIVNÍ
Cyklus je platný, není zapotřebí žádná činnost
POZITIVNÍ
Cyklus je neplatný, analyzujte nové vzorky
POZITIVNÍ
Interpretace
nebo NEGATIVNÍ
Negativní kontrola NEGATIVNÍ
POZITIVNÍ
NEGATIVNÍ
Cyklus je neplatný, opakujte cyklus se zmraženými nebo novými vzorky. Jestliže je opakovaný cyklus se zmraženými vzorky stále neplatný, kontaktujte místní zastoupení společnosti Roche.
POZITIVNÍ
Cyklus je platný, není zapotřebí žádná činnost
nebo NEGATIVNÍ
Pozitivní kontrola
POZITIVNÍ NEGATIVNÍ
nebo NEGATIVNÍ
Cyklus je neplatný, opakujte cyklus se zmraženými nebo novými vzorky. Jestliže je opakovaný cyklus se zmraženými vzorky stále neplatný, kontaktujte místní zastoupení společnosti Roche.
Poznámka: Je-li negativní kontrola (NC) nebo MRSA (+) C testu LightCycler® MRSA Advanced stále neplatná, může být soubor kompenzace více barev LightCycler® nesprávný. Opakujte experiment kompenzace barev nebo kontaktujte místní zastoupení Roche pro technickou pomoc. Externí pozitivní kontrola (EPC) Pozitivní kontrolu MicroBioLogics® KWIK-STIK™ MRSA (P/N: 0158ROCHE) lze používat pro výcvik, test dovednosti při provádění analýzy a pro externí kontrolu kvality testu LightCycler® MRSA Advanced. V této externí pozitivní kontrole se používá kmen MRSA, typy RE2. Kmeny MRSA, typy RE3 a RE7, je možné, když jsou k dispozici, používat jako přídavné externí pozitivní kontroly a monitorovat tak primery testu a sondy, které nejsou v tomto testu přímo kontrolovány. Externí kontroly se musí používat v souladu s celostátními a místními předpisy akreditačních organizací, podle potřeby. Při přípravě tamponu postupujte podle kroků uvedených v příbalovém letáku KWIK-STIK™, ale nevkládejte nevkládejte tampon do kultivačního média. Po saturaci tamponu hydratovaným materiálem postupujte podle pokynů uvedených v příbalovém letáku pro test LightCycler® MRSA Advanced pro přípravu vzorků a testování výtěru. EPC musí být pozitivní (s vnitřní kontrolou pozitivní, nebo negativní). Jestliže EPC nesplňuje toto kritérium, je neplatný celý cyklus MagNA Lyser a musí se opakovat s novými vzorky. Jestliže je opakovaný cyklus stále neplatný, kontaktujte místní zastoupení společnosti Roche. Poznámka: Do dnešního dne bylo rozlišeno sedm typů SCCmec (I–VII) a bylo popsáno několik variant těchto typů SCCmec4. Test LightCycler® MRSA Advanced je založen na vlastním detekčním systému, který dokáže detekovat kmeny MRSA s různými molekulárními sekvencemi v blízkosti pravé krajní (RE) junkce kazety SCCmec s genem orfX. Mezi typy RE, které test LightCycler® MRSA detekuje, patří RE2, RE3 a RE7. Navíc sekvenční analýzou typu RE1 byla zjištěna 100 % shoda s primery a sondami používanými v testu LightCycler® 2.0 MRSA Advanced.
05548900001-06CS
21
Doc Rev. 5.1
BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ PŘI PRÁCI 1.
Jak je tomu při každém testovacím postupu, je pro správné fungování tohoto testu zásadním požadavkem dodržovat principy správné laboratorní praxe.
PROCEDURÁLNÍ OMEZENÍ 1.
Tento produkt se smí používat pouze se zařízením LightCycler® 2.0.
2.
Tento test je validován pouze pro vyšetřování lidských nazálních vzorků.
3.
K získání spolehlivých výsledků je třeba dodržovat příslušné postupy odběru (množství organizmů ve vzorku), transportu, skladování a zpracování vzorků.
4.
S tímto výrobkem mohou pracovat pouze proškolení pracovníci.
5.
Pozitivní výsledek testu LightCycler® MRSA Advanced není znakem přítomnosti živé MRSA. Je zde ale pravděpodobná přítomnost MRSA. Takže pozitivní výsledek nezbytně neznamená neúspěšný eradikační zásah, protože může přetrvávat neživá DNA. Ale negativní výsledek, který následuje po pozitivním výsledku testu, může, ale nemusí znamenat úspěšnou eradikaci.
6.
Vzhledem k rozdílům mezi technologiemi se doporučuje, aby uživatelé před přechodem od jedné technologie k druhé provedli ve své laboratoři studie pro stanovení rozdílů mezi těmito technologiemi.
7.
® Přítomnost enzymu AmpErase v reakční směsi LightCycler MRSA Advanced snižuje riziko kontaminace amplikonu. Kontaminaci od MRSA (+) C a klinických vzorků lze ovšem zabránit pouze důsledným uplatňováním zásad správné laboratorní praxe a pečlivým dodržováním postupů uvedených v tomto příbalovém letáku.
8.
Detekce MRSA s nízkou koncentrací (tj. 1 000 CFU/výtěr) za přítomnosti Staphylococcus aureus (MSSA) citlivé vůči meticilinu při koncentracích vyšších než 10E4 CFU/výtěr nebyla stanovena a tak zůstává neznámá.
9.
I když vzácně, mutace nebo polymorfismus v oblasti bakteriálního genomu pokryté primery testu LightCycler® MRSA Advanced a/nebo sondou testu, mohou vést k selhání detekce bakterie. Vzácné formy kmenů MSSA, které nesou genetickou variantu kazety SCCmec, mohou při analýze testem LightCycler® MRSA Advanced vést k pozitivním výsledkům.
10.
Jako je tomu i u ostatních diagnostických testů in vitro založených na PCR, velmi nízké hladiny cílové látky pod detekční hranicí (LOD) testu je možné detekovat, ale výsledky nemusí být možné reprodukovat (podrobnosti viz oddíl „Reprodukovatelnost“).
11.
Při koncentracích MRSA vyšších než (>) 10E5 CFU/výtěr může dojít k přenosu nebo ke křížové kontaminaci.
05548900001-06CS
22
Doc Rev. 5.1
Interferenční látky Látky, které mohou interferovat s detekcí MRSA při analýze pomocí testu LightCycler® MRSA Advanced a potenciálně vytvářet neplatné výsledky, zahrnují krev a nadměrné množství nazálního sekretu/hlenu. Krev byla nalezena na nazálních výtěrech u 20/1 620 (1,2 %) vzorků, u žádného ale nebyly neplatné výsledky díky neplatné vnitřní kontrole (IC). U následujících exogenních látek (viz tabulka 4), což jsou složky léků proti ucpání nosu a látky používané k dosažení úlevy při suché nosní sliznici a/nebo jejímu podráždění, se pomocí testu LightCycler® MRSA Advanced prokázalo, že neinterferují s detekcí MRSA. Tabulka 4 Exogenní látky testované na interferenci testem LightCycler® MRSA Advanced Obchodní název
Účinná látka
InfectoPyoderm®
Mupirocin 20 mg/g (antibiotikum)
Turixin®
Mupirocin calcium 21,5 mg/g (antibiotikum)
Nosní mast Bepanthen®
Dexpanthenol 50 mg/g (provitamin B5)
12h nosní sprej Accumed
Oxymetazolin hydrochlorid 0,05 % (nazální dekongestivum)
Otriven®
Xylometazoline 0,1 % (nazální dekongestivum)
Očekávané hodnoty V klinické zkoušce testu LightCycler® MRSA Advanced bylo odebráno 1 402 vzorků nazálních výtěrů od 1 402 vhodných subjektů na 5 místech v celých Spojených státech. Studovaná populace byla rozdělena na pacienty v nemocnicích, kteří nejsou na jednotkách intenzivní péče (1 007; 71,8 %), na pacienty v nemocnicích, kteří jsou na jednotkách intenzivní péče (67; 4,8 %), sanatoria/zařízení s pečovatelskou službou (255; 18,2 %) a personál zdravotnických zařízení (73; 5,2 %). Celkový počet MRSA pozitivních vzorků testovaných přímou detekcí chromogenní kultury byl 187 (13,3 %). Tabulka 5 shrnuje počet a procento pozitivních a negativních případů vyhodnocených přímou detekcí chromogenní kultury seskupených podle studované populace. Tabulka 5 Očekávané hodnoty MRSA v různých populacích Skupina
Pozitivních N (%)
Negativních N (%)
Celkem N (%)
Nemocnice, mimo jednotky intenzivní péče
74 (7,3 %)
933 (92,7 %)
1 007 (71,8 %)
Nemocnice, jednotky intenzivní péče
3 (4,5 %)
64 (95,5 %)
67 (4,8 %)
109 (42,7 %)
146 (57,3 %)
255 (18,2 %)
1 (1,4 %)
72 (98,6 %)
73 (5,2 %)
187 (13,3 %)
1 215 (86,7 %)
1 402
Sanatoria/zařízení s pečovatelskou službou Personál zdravotnických zařízení Celkem
05548900001-06CS
23
Doc Rev. 5.1
FUNKČNÍ CHARAKTERISTIKY KLINICKÉ VÝSLEDKY Funkční charakteristiky testu LightCycler® MRSA Advanced byly stanoveny v multicentrické prospektivní výzkumné studii v 5 zařízeních srovnáním testu LightCycler® MRSA Advanced s druhým amplifikačním testem nukleové kyseliny schváleným FDA (NAAT), přímou detekcí chromogenní kultury a kultury v živném médiu (bujon) (citlivější kultivační metoda). Subjekty zahrnovaly jednotlivce a zdravotnický personál s rizikem nazální kolonizace. Každý subjekt byl do studie zařazený jen jednou. Subjekty, které užívaly systémová nebo topická nazální antibiotika jako léčbu nazální kolonizace MRSA v den odběru vzorku až jeden týden před zahájením studie, subjekty mladší 2 let a/nebo subjekty s kontraindikací odběrů nazálních výtěrů byly ze studie vyloučeny. Od každého subjektu byl odebrán jeden dvojitý nazální tampon. Jeden smotek byl přímo naočkován na kvadrant chromogenní agarové destičky s cefoxitinem a poté zpracován podle příbalového letáku k testu LightCycler® MRSA Advanced. Zbývající kvadranty chromogenního agaru byly naočkovány sterilní kličkou. Druhý smotek byl přímo naočkován na druhou chromogenní destičku s cefoxitinem a poté zpracován podle příbalového letáku druhým NAAT testem schváleným FDA. Poté byl druhý smotek přenesen do Trypton sojového bujonu a inkubován 48 hodin při 35–37 °C a poté subkultivován na chromogenní destičku s cefoxitinem (bujonová kultura). Destičky s chromogenní kulturou byly inkubovány při 35–37 °C po dobu 20–48 hodin. Předpokládané kolonie MRSA ze všech kultivačních destiček byly potvrzeny testem na koagulázu a morfologickým vyšetřením, jestliže byly nalezeny po 44–48 hodinách inkubace. Každá zúčastněná laboratoř provedla všechny testy. Výsledky testu LightCycler® MRSA Advanced byly vypočítány v porovnání s výsledky druhého NAAT testu ověřeného FDA, přímé detekce chromogenní kultury a výsledky bujonové kultury. Vzorky, u kterých byly detekovány MRSA v přímé detekci chromogenní kultury ze smotku A a/nebo z smotku B, byly považovány za pozitivní na MRSA, pokud nebylo stanoveno jinak. Celkem bylo od subjektů na 5 místech v celých Spojených státech odebráno 1 620 vzorků nazálních výtěrů a testováno testem LightCycler® MRSA Advanced. Z těchto 1 620 testovaných vzorků bylo 1 402 vzorků vhodných pro zařazení do statistické analýzy. 1 Celkový počet vzorků pozitivních na MRSA přímou detekcí chromogenní detekcí kultury byl 187 (13,3 %). Celkem 2 (1,7 %) z 117 cyklů LightCycler® provedených během průzkumné studie byly neplatné vinou odchylek od protokolu studie. Deset (10) (0,6 %) z 1 620 vzorků nazálních výtěrů testovaných ® testem LightCycler MRSA Advanced mělo neplatné výsledky vinou selhání vnitřní kontroly (IC) po úvodním testování a 7 z 1 620 (0,4 %) vzorků zůstalo neplatných vinou selhání IC po retestování. Výsledky získané z nazálních výtěrů od vhodných subjektů testovaných na MRSA pomocí testu LightCycler® MRSA Advanced srovnány s přímou detekcí chromogenní kultury, druhým testem NAAT ověřeným FDA a bujonovou kulturou jsou uvedeny v tabulkách 6, 7 a 8. V tabulce 6 je uvedeno 1 402 vyhodnotitelných vzorků, které měly platné výsledky testu LightCycler® MRSA Advanced a srovnání s výsledky přímé detekce chromogenní kultury. V tabulce 7 je 1 385 vzorků s platnými výsledky testu LightCycler® MRSA Advanced a srovnání s druhým testem NAAT ověřeným FDA, jenž měl navíc shodné výsledky přímé detekce chromogenní kultury ze smotků A a B. V tabulce 8 je 1 395 vyhodnotitelných vzorků, které měly platné výsledky testu LightCycler® MRSA Advanced a srovnání s výsledky bujonové kultury.
1
218 vzorků nebylo vhodných pro statistickou analýzu: 36 subjektů nesplňovalo kritéria pro zařazení do studie, 153 vzorků nebylo testováno podle protokolu studie, 22 vzorků bylo neplatných vinou selhání externí kontroly a 7 vzorků bylo neplatných vinou selhání vnitřní kontroly. Po novém testování bylo těchto 7 vzorků stále neplatných vinou selhání interní kontroly.
05548900001-06CS
24
Doc Rev. 5.1
Tabulka 6 Srovnání testu LightCycler® MRSA Advanced s výsledky přímé detekce chromogenní kultury Test LightCycler® MRSA Advanced Pozitivní
Přímá detekce chromogenní kultury Pozitivní Negativní 178 44
Celkem 222
Negativní
9
1 171
1 180
Celkem
187
1 215
1 402
Procentní shoda pozitivních vzorků (95 % přesný CIa)
95,2 % (91,1 %, 97,8 %)
Procentní shoda negativních vzorků (95 % přesný CIa)
96,4 % (95,2 %, 97,4 %)
Poznámka: V této shrnující tabulce je uvedeno 1 402 vyhodnotitelných vzorků, které měly platné výsledky testu ® LightCycler MRSA Advanced a srovnání s výsledky přímé detekce chromogenní kultury. a CI = interval spolehlivosti
Ze 178 vzorků s pozitivními výsledky testu LightCycler® MRSA Advanced a přímé detekce chromogenní kultury, byl druhý test NAAT ověřený FDA pozitivní u 175 vzorků a negativní u 3 vzorků. U 44 vzorků, které byly pozitivní v testu LightCycler® MRSA Advanced a negativní v testu přímé detekce chromogenní kultury, byl druhý test NAAT ověřený FDA pozitivní u 25 vzorků a negativní u 19 vzorků. U 9 vzorků, které byly negativní v testu LightCycler® MRSA Advanced a pozitivní v testu přímé detekce chromogenní kultury, byl druhý test NAAT ověřený FDA pozitivní u 4 vzorků a negativní u 5 vzorků. Ze 1 171 vzorků s negativními výsledky testu LightCycler® MRSA Advanced a přímé detekce chromogenní kultury, byl druhý test NAAT ověřený FDA pozitivní u 76 vzorků, negativní u 1 091 vzorků a neplatný/chybějící u 4 vzorků. Tabulka 7 ® Srovnání testu LightCycler MRSA Advanced s druhým testemNAAT ověřeným FDA Druhý test NAAT ověřený FDA Test LightCycler® MRSA Advanced Pozitivní
Pozitivní 195
Negativní 20
Celkem 215
Negativní
77
1 093
1 170
Celkem
272
1 113
1 385
Procentní shoda pozitivních vzorků (95 % přesný CIa)
71,7 % (65,9 %, 77,0 %)
Procentní shoda negativních vzorků (95 % přesný CIa)
98,2 % (97,2 %, 98,9 %) ®
Poznámka: V tomto shrnutí je 1 385 vzorků s platnými výsledky testu LightCycler MRSA Advanced a testu NAAT ověřeného FDA, který měl navíc shodné výsledky testu přímé detekce chromogenní kultury ze smotků A a B. a CI = interval spolehlivosti
Ze 195 vzorků s pozitivními výsledky testu LightCycler® MRSA Advanced a druhého testu NAAT ověřeného FDA byla přímá detekce chromogenní kultury pozitivní pro 171 vzorků a negativní pro 24 vzorků (přítomnost MRSA byla potvrzena u 20 z těchto 24 vzorků dle analýzy nesrovnalostí).
05548900001-06CS
25
Doc Rev. 5.1
U 20 vzorků s pozitivními výsledky testu LightCycler® MRSA Advanced a negativními výsledky druhého testu NAAT ověřeného FDA byla přímá detekce chromogenní kultury pozitivní pro 1 vzorek a negativní pro 19 vzorků (přítomnost MRSA byla potvrzena u 10 z těchto 19 vzorků dle analýzy nesrovnalostí). U 77 vzorků s negativními výsledky testu LightCycler® MRSA Advanced a pozitivními výsledky druhého testu NAAT ověřeného FDA byla přímá detekce chromogenní kultury pozitivní pro 1 vzorek a negativní pro 76 vzorků (přítomnost MRSA byla potvrzena u 13 z těchto 76 vzorků dle analýzy nesrovnalostí). U 1 093 vzorků s negativními výsledky testu LightCycler® MRSA Advanced a druhého testu NAAT ověřeného FDA byla přímá detekce chromogenní kultury pozitivní pro 4 vzorky (přítomnost MRSA byla potvrzena u všech 4 vzorků dle analýzy nesrovnalostí) a negativní pro 1 089 vzorků. Tabulka 8 Srovnání testu LightCycler® MRSA Advanced s bujonovou kulturou Bujonová kultura Test LightCycler® MRSA Advanced Pozitivní
Pozitivní 184
Negativní 38
Celkem 222
Negativní Celkem Procentní shoda pozitivních vzorků (95 % přesný CIa)
21 205 89,8 % (84,8 %, 93,5 %)
1 152 1 190
1 173 1 395
Procentní shoda negativních vzorků (95 % přesný CIa)
96,8 % (95,6 %, 97,7 %)
Poznámka: V této tabulce je shrnuto 1 395/1 402 vyhodnotitelných vzorků s platnými výsledky testu ® LightCycler MRSA Advanced a testu bujonové kultury. Výsledky testu bujonové kultury chyběly/byly neplatné u 7 z 1 402 vyhodnotitelných vzorků. a CI = interval spolehlivosti
Souhrn výsledků testu 1 398 vhodných subjektů (jeden nazální výtěr od každého pacienta) testovaných na MRSA pomocí testu LightCycler® MRSA Advanced, druhý test NAAT ověřený FDA a přímá detekce kultury je v tabulce 9. Tabulka 9 Srovnání testu LightCycler® MRSA Advanced, druhého testu NAAT schváleného FDA a přímé detekce kultury Přímá detekce kultury Test LightCycler® MRSA Advanced
2.test NAAT
Pozitivní
Pozitivní
Pozitivní
175
25
200
Pozitivní
Negativní
3
19
22
Negativní
Pozitivní
4
76
80
Negativní
Negativní
5
1 091
1 096
Celkem
Celkem
187
1 211
1 398
Negativní Celkem
Poznámka: V této shrnující tabulce jsou uvedeny pouze vyhodnotitelné vzorky s platnými výsledky testů ® LightCycler MRSA Advanced a 2. testu NAAT, které měly navíc shodné výsledky testu přímé detekce kultury.
05548900001-06CS
26
Doc Rev. 5.1
Analýza nesrovnalostí Další vyšetřování (tj. test na genem mecA zprostředkovanou rezistenci na oxacilin pomocí difuzní diskové metody za použití disku cefoxitinu, fem- a mecA-specifická PCR a sekvencování oblastí SCCmec) probíhalo se všemi vzorky, které vykázaly neshodné výsledky mezi testem přímé detekce chromogenní kultury (pouze ty vzorky, které měly shodné výsledky u smotků A a B) a testem LightCycler® MRSA Advanced nebo mezi přímou detekcí chromogenní kultury (pouze ty vzorky, které měly shodné výsledky u smotků A a B) a druhým testem NAAT ověřeným FDA. •
Analýza nesrovnalostí potvrdila přítomnost MRSA u 30 z 44 vzorků, u kterých test ® LightCycler MRSA Advanced vykázal pozitivní výsledky, ale přímá detekce chromogenní kultury byla negativní.
•
® Přítomnost MRSA byla potvrzena u 4 z 9 vzorků, u kterých test LightCycler MRSA Advanced vykázal negativní výsledek, ale přímá detekce chromogenní kultury byla pozitivní.
•
Přítomnost MRSA byla potvrzena u 13 z 76 vzorků, u kterých druhý test NAAT ověřený FDA vykázal pozitivní výsledek, ale test LightCycler® MRSA Advanced a přímá detekce chromogenní kultury byla negativní.
HODNOCENÍ NEKLINICKÝCH FUNKČNÍCH PARAMETRŮ A.
Analytická citlivost
Analytická citlivost testu LightCycler® MRSA Advanced byla stanovena pomocí 3 kmenů MRSA, které představují tři typy RE, na které je tento test zacílen (pravá krajní junkce SCCmec s orfX (RE), typy 2, 3 a 7). Kultury těchto kmenů byly kvantifikovány, naředěny na hodnoty pokrývající rozsah od 100 do 400 kolonie tvořících jednotek (CFU) na jeden výtěr a absorbované do tamponů, které byly nejdříve ponořeny do různých transportních médií. Všechna ředění poblíž hodnoty detekční hranice (LOD) byla testována v replikátech o alespoň 30 vzorcích. Detekční limit získaný pro každý testovaný typ kmene a typ tamponu představuje nejnižší počet CFU/výtěrů, u kterých bude pozitivní výsledek ® získán s alespoň 95 % intervalem spolehlivosti. Výsledky prokazují, že test LightCycler MRSA Advanced získá pozitivní výsledek s 95 % intervalem spolehlivosti u výtěru o 240 CFU. Tabulka 10 Detekce MRSA v různých transportních médiích Typy výtěrů
CFU/výtěr
Transportní médium Liquid Stuart
240
Gel Amies bez transportního média s aktivním uhlím
240
Gel Amies s transportním médiem s aktivním uhlím
240
05548900001-06CS
27
Doc Rev. 5.1
B.
Analytická specificita
Inkluzivita Účinnost testu LightCycler® MRSA Advanced pro 137 dobře charakterizovaných izolátů představujících epidemiologické klony MRSA ve Spojených státech je uvedena v tabulce 11. Kmeny byly získány díky programu Network on Antimicrobial Resistance in Staphylococcus aureus (NARSA) podporovanému NIAID/NIH Contract No. HHSN272200700055C a z klinických laboratoří. Všechny kmeny byly testovány jako kultury o koncentraci 10E5 cfu/ml. Všechny izoláty až na jeden byly testem LightCycler® MRSA Advanced vyhodnoceny pozitivně (99,3 %). Tabulka 11 Izoláty MRSA představující epidemiologické klony získané díky programu Network on Antimicrobial Resistance in Staphylococcus aureus (NARSA) a dobře charakterizované izoláty z klinických laboratoří
Typ USA
Počet testovaných izolátů
Izoláty s pozitivními výsledky v testu LightCycler® MRSA Advanced
100
54*
53
200
5
5
300
37
37
400
4
4
500
7
7
600
3
3
700
4
4
800
7
7
1000
7
7
1100
4
4
Nelze typizovat/ neznámé Celkem
5
5
137
136 (99,3 %)
*Z těchto 54 testovaných kmenů typ USA 100 byl jeden kmen (NRS642) ® vyhodnocen testem LightCycler MRSA Advanced jako negativní
Exkluzivita Specificita testu LightCycler® MRSA Advanced byla vyhodnocena testem zkřížené reaktivity na patogenní mikroorganizmy a na kontaminanty potenciálně přítomné v normální nazální mikrofloře. Testované druhy se skládaly ze 13 virálních, 66 bakteriálních a 7 plísňových druhů, jak je uvedeno v tabulce 12. Mikroorganizmy byly testovány jako kultury v koncentracích 10E6 až 10E7 cfu/ml nebo jako přípravky genomické DNA v koncentracích 10 pg/PCR. Dále byla testována lidská DNA ® v koncentraci 5 ng/reakci. Lidská DNA a všechny testované druhy byly v testu LightCycler MRSA Advanced na MRSA negativní.
05548900001-06CS
28
Doc Rev. 5.1
Tabulka 12 Druhy testované na zkříženou reaktivitu testem LightCycler® MRSA Advanced Druhy Staphylococcus aureus (MSSA) Haemophilus influenzae Staphylococcus cohnii ssp. cohnii Haemophilus parainfluenzae Staphylococcus epidermidis Virus Herpes simplex 1 Staphylococcus haemolyticus Lidská DNA Staphylococcus hominis Chřipka typu A (H1N1), A (H3N2) Staphylococcus intermedius Chřipka typu B Staphylococcus lugdunensis Issatchenkia orientalis (Candida krusei) Staphylococcus pseudointermedius Klebsiella pneumoniae ssp,ozeanae Staphylococcus saprophyticus Kocuria kristinae Staphylococcus schleiferi ssp. coagulans Kytococcus schroeteri Staphylococcus sciuri Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii Staphylococcus simulans Legionella pneumophila Staphylococcus warneri Metapneumovirus Staphylococcus xylosus Microbacterium testaceum Acinetobacter baumannii Micrococcus luteus Actinobacillus actinomycetemcomitans Moraxella catarrhalis Actinomyces odontolyticus Morganella morganii Mycobacterium avium Adenovirus typ 7A Aerococcus urinaeequi Mycoplasma pneumoniae Aspergillus fumigatus Mycoplasma salivarium Bacteroides fragilis Neisseria meningitidis Bacteroides uniformis Oerskovia jenensis Bacteroides vulgatus Parainfluenza 1 Bordetella bronchioseptica Parainfluenza 2 Bordetella parapertussis Parainfluenza 3 Bordetella pertussis Parvimonas micra (Peptostreptococcus micros) Burkholderia cepacia Peptostreptococcus stomatis Candida albicans Peptostreptococcus anaerobius Candida glabrata Planococcus maritimus Candida parapsilosis Proteus mirabilis Candida tropicalis Proteus vulgaris Citrobacter freundii Pseudomonas putida Pseudomonas aeruginosa Coronavirus Corynebacterium glutamicum Respirační syncyciální virus (RSV A, B & A2) Corynebacterium amycolatum Rhinovirus Corynebacterium jeikeium Rhodococcus equi Cryptococcus neoformans Rothia mucilaginosa Eikenella corrodens SARS Enterococcus faecalis Streptococcus agalactiae Enterococcus faecium Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Enterovirus Escherichia coli Streptococcus viridans Finegoldia magna (Peptostreptococcus magnus) Veillonella atypica Haemophilus aphrophilus U 100 % testovaných organizmů nebyla zjištěna zkřížená reaktivita. Dále bylo z různých evropských klinických center získáno 117 izolátů stafylokoků negativních na koagulázu rezistentní vůči methicilinu, 104 izolátů stafylokoků negativních na koagulázu senzitivní na methicilin a 100 izolátů Staphylococcus aureus senzitivních na methicilin a ty byly testovány v koncentracích 10E4 až 10E5 CFU/reakci. Všechny další kmeny byly testem LightCycler® MRSA Advanced vyhodnoceny negativně.
05548900001-06CS
29
Doc Rev. 5.1
Reprodukovatelnost Testu byl podroben panel vzorků o různých koncentracích MRSA a Staphylococcus epidermidis senzitivní na methicilin (MSSE). Dva pracovníci v každém ze 3 center prováděli jeden cyklus denně po dobu 5 dní se třemi šaržemi činidel (4 vzorky x 3 replikáty x 5 dní x 3 centra x 3 šarže x 2 pracovníci). Byl použit 12členný panel, který se skládal ze vzorků kmene ATCC 43300 Staphylococcus aureus senzitivního na methicilin (MRSA), naředěného v koncentracích uvedených v tabulce 13. Staphylococcus epidermidis senzitivní na methicilin (MSSE), kmen ATCC 14990 byl zahrnut v konstantní koncentraci v každém členu panelu, aby bylo dosaženo příslušné matrix vzorku. V panelu byl negativní člen, člen s koncentrací pod detekční hranicí (LOD) (20 CFU/výtěr s očekávanou mírou pozitivity mezi 30 až 70 %), slabě pozitivní člen (300 CFU/výtěr) a pozitivní člen (800 CFU/výtěr). Negativní člen panelu vykázal negativní výsledek od spodního limitu 99 % po 100 %, míra pozitivity člena panelu s koncentrací pod LOD se pohybovala od spodního limitu 42 % po 47 %, míra pozitivity slabě pozitivního člena panelu se pohybovala od spodního limitu 99 % po 100 % a míra pozitivity pozitivního člena panelu se pohybovala od spodního limitu 99 % až po 100 % v závislosti na centru. Tabulka 13 Shrnutí výsledků reprodukovatelnosti TM TM Mezi šaržemi Mezi pracovišti Mezi jednotl. dny Prů- Směro- TM Počet/ Počet/ Počet/ CV měr datná Šarže testov. % Pracov. testov. % Den testov. % (°C) odchyl- (%) počet počet počet ka 1 90/90 100 % 1 90/90 100 % 1 53/54** 98 % 2 90/90 100 % 2 89/90** 99 % 2 54/54 100 % 0 Negativní n/a n/a n/a 3 89/90** 99 % 3 90/90 100 % 3 54/54 100 % 4 54/54 100 % 5 54/54 100 % 1 52/90 58 % 1 38/90 42 % 1 25/54 46 % 2 30/90 33 % 2 41/90 46 % 2 26/54 48 % 20* Pod LOD 59,56 0,22 0,4 3 39/90 43 % 3 42/90 47 % 3 22/54 41 % 4 25/54 46 % 5 23/54 43 % 1 90/90 100 % 1 89/90 99 % 1 53/54 98 % 2 89/90 99 % 2 90/90 100 % 2 54/54 100 % Slabě 300 59,48 0,20 0,3 3 90/90 100 % 3 90/90 100 % 3 54/54 100 % pozitivní 4 54/54 100 % 5 54/54 100 % 1 90/90 100 % 1 90/90 100 % 1 53/54** 98 % 2 90/90 100 % 2 89/90** 99 % 2 54/54 100 % 800 Pozitivní 59,43 0,21 0,3 3 89/90** 99 % 3 90/90 100 % 3 54/54 100 % 4 54/54 100 % 5 54/54 100 %
MRSA Typ CFU/ vzorku výtěr
Poznámka: *Koncentrace, která vytvoří přibližně 30 až 70 % pozitivních výsledků. **Došlo ke zjevné záměně jednoho pozitivního a jednoho negativního vzorku, které byly umístěné vedle sebe ve stejném cyklu. Vyřazením těchto vzorků z výsledků analýzy by reprodukovatelnost mezi šaržemi, mezi pracovišti a mezi jednotlivými dni byla 100 %.
Přenos/zkřížená kontaminace Byla provedena analytická studie pro vyhodnocení potenciální zkřížené kontaminace mezi vysoce koncentrovanými vzorky MRSA a MRSA negativními vzorky zpracovanými paralelně v celém pracovním cyklu testu LightCycler® MRSA Advanced. Dva pracovníci provedli každý pět kompletních cyklů (včetně přípravy), každý zpracoval vždy patnáct výtěrů, ke kterým bylo přidáno 3,3 x 10E5 cfu MRSA typu RE2 a k patnácti výtěrům nebylo přidáno nic. Během přípravy vzorků a přípravy PCR se střídavě používaly vysoce pozitivní i negativní výtěry a poté byly vloženy do zařízení LightCycler® 2.0 pro testování PCR. Během testování při koncentraci 3,3 x 10E5 cfu/výtěr nebyl zjištěn žádný falešně pozitivní výsledek způsobený zkříženou kontaminací.
05548900001-06CS
30
Doc Rev. 5.1
LITERATURA 1.
Kuehnert MJ, et al. Prevalence of Staphylococcus aureus nasal colonization in the United States, 2001-2002. JID 2006; 193:172-9.
2.
Wyllie DH, et al. Mortality after Staphylococcus aureus bacteraemia in two hospitals in Oxfordshire, 1997-2003: cohort study. BMJ. 2006; 333 (7562):281.
3.
Pinho MG, Filipe SR, de Lencastre H, Tomasz A Complementation of the essential peptidoglycan transpeptidase function of penicillin-binding protein 2 (PBP2) by the drug resistance protein PBP2A in Staphylococcus aureus. : J Bacteriol. 2001 Nov; 183(22):6525-31.
4.
Berglund C, Ito T, et al. Novel type of staphylococcal cassette chromosome mec in a methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain isolated in Sweden. Antimicrob Agents Chemother 2008 Oct; 52(10): 3512-6.
5.
Cosgrove SE, et al. Comparison of Mortality Associated with Methicillin-Resistant and Methicillin-Susceptible Staphylococcus aureus Bacteremia:A Meta-analysis. CID 2003:36, 53-59.
6.
Engemann JJ, et al. Adverse clinical and economic outcomes attributable to methicillin resistance among patients with Staphylococcus aureus surgical site infection. Clin Infect Dis. 2003; 36(5):592-598.
7.
Abramson MA, et al. Nosocomial methicillin-resistant and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus primary bacteremia: at what costs? Infect Control Hosp Epidemiol. 1999; 20(6):408-411.
8.
Muto CA, et al. SHEA guideline for preventing nosocomial transmission of multidrug-resistant strains of Staphylococcus aureus and Enterococcus. Infect Control Hosp Epidemiol. 2003; 24(5):362-386.
9.
Association for Professionals in Infection Control & Epidemiology, Inc (APIC). National prevalence study of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in U.S. healthcare facilities. Executive summary. June 25, 2007.
10.
Klevens RM, et al. Invasive methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in the United States. JAMA. 2007; 298(15):1763-1771.
11.
Witte W. Nosocomial and community MRSA infections. EH ONLINE. http://www.europeanhospital.com/topics/article/4288.html. Accessed November 7, 2008.
12.
Calfee DP, et al. Strategies to prevent transmission of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in acute care hospitals. Infect Control Hosp Epidemiol. 2008; 29(suppl 1):S62–S80.
13.
Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395.
14.
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections. Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29-A3. Wayne, PA:CLSI, 2005.
15.
International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 51st Edition. 2010.
05548900001-06CS
31
Doc Rev. 5.1
Informace k revizi dokumentu Doc Rev. 5.1 05/2012
Změna překladu záhlaví části HODNOCENÍ NEKLINICKÝCH FUNKČNÍCH PARAMETRŮ.
Doc Rev. 5.0 05/2011
Do oddílu PŘEPRAVA A SKLADOVÁNÍ VZORKŮ byla přidána informace o tom, že vzorky odebrané pomocí tamponů Liquid Stuart skladované při 15 až 25 °C jsou stabilní až 5 dní, při 2 až 8 °C až 5 dní, při -15 až -25 °C až 1 měsíc. Do tohoto oddílu byla rovněž přidána informace o tom, že vzorky odebrané pomocí gelových tamponů Amies (s aktivním uhlím nebo bez něho) jsou stabilní při 15 až 22 °C až 4 dny. Do oddílů POŽADAVKY NA SKLADOVÁNÍ A MANIPULACI, PŘÍPRAVA ZPRACOVANÝCH VZORKŮ A KONTROL a ZPRACOVÁNÍ VZORKŮ A KONTROL byly přidány informace o tom, že zpracované vzorky a negativní kontroly připravené pomocí tamponů Liquid Stuart a gelových tamponů Amies (s aktivním uhlím nebo bez něho) jsou stabilní až 1 den při teplotě 15 až 25 °C nebo až 5 dní při teplotě 2 až 8 °C nebo až 12 měsíců při teplotě -15 až -25 °C. Do oddílu KLINICKÉ VÝSLEDKY byla přidána tabulka srovnávající test LightCycler® MRSA Advanced, druhý test NAAT schválený FDA a přímou detekci kultury.
Doc Rev. 4.0 04/2011
Kapitoly POŽADAVKY NA SKLADOVÁNÍ A MANIPULACI a PŘÍPRAVA ČINIDEL byly aktualizovány a uvádí, že: Pracovní Master Mix musí být připraven čerstvý a použit do 24 hodin od přípravy. Jestliže pracovní Master Mix není použit ihned po přípravě, musí být skladován v temnu při teplotě 2 až 8 °C maximálně po dobu 24 hodin. Pokud máte jakékoliv dotazy, kontaktujte prosím místního zástupce společnosti Roche.
05548900001-06CS
32
Doc Rev. 5.1
Lyzační souprava LightCycler® Advanced a test LightCycler® MRSA Advanced vyrábí: Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ 08876 USA Člen Roche Group
Roche Diagnostics (Schweiz) AG Industriestrasse 7 6343 Rotkreuz, Switzerland Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Straße 116 68305 Mannheim, Germany Roche Diagnostics S.L. Av. de la Generalitat, 171-173 E-08174 Sant Cugat del Vallès Barcelona, Spain Roche Diagnostica Brasil Ltda. Av. Engenheiro Billings, 1729 Jaguaré, Building 10 05321-010 São Paulo, SP Brazil
Roche Diagnostics 201, boulevard Armand-Frappier H7V 4A2 Laval, Québec, Canada (For Technical Assistance call: Pour toute assistance technique, appeler le: 1-877 273 3433) Roche Diagnostics 2, Avenue du Vercors 38240 Meylan, France Distributore in Italia: Roche Diagnostics S.p.A. Viale G. B. Stucchi 110 20052 Monza, Milano, Italy Distribuidor em Portugal: Roche Sistemas de Diagnósticos Lda. Estrada Nacional, 249-1 2720-413 Amadora, Portugal
ROCHE, LIGHTCYCLER, FASTSTART, MAGNA LYSER, MRSA ADVANCED, LC a AMPERASE jsou obchodní známky společnosti Roche. ROCHE RESPONSE CENTER je servisní známka společnosti Roche. BD CULTURESWAB je obchodní známka společnosti Becton, Dickinson and Company. BEPANTHEN je obchodní známka společnosti Bayer Healthcare. BRIJ je obchodní známka společnosti Croda International, PLC. COPAN TRANSYSTEM je obchodní známka společnosti Copan Diagnostics, Inc. INFECTOPYODERM je obchodní známka společnosti Infectopharm GmbH. KWIK-STIK je obchodní známka společnosti MicroBioLogics, Inc. MICROSOFT, WINDOWS, VISUAL STUDIO a SQL SERVER jsou obchodní známky společnosti Microsoft. OTRIVEN je obchodní známka společnosti Novartis. TURIXIN je obchodní známka společnosti GlaxoSmithKline. Kyaninová barviva v tomto produktu podléhají patentovým právům GE Healthcare BioSciences Corp. a Carnegie Mellon University a jsou licencovány společnosti Roche pouze za účelem výzkumu a jako součást diagnostických sad in vitro. Jakékoliv použití takových sad pro jiné účely než pro výzkum nebo in vitro diagnostiku vyžaduje poskytnutí sublicence od společnosti GE Healthcare Biosciences Corp., Piscataway, New Jersey, U.S.A. a Carnegie Mellon University, Pittsburgh, Pennsylvania, U.S.A. Copyright 2012, Roche Molecular Systems, Inc. Všechna práva vyhrazena. 05/2012
(05446082001-05ENGL)
Doc Rev. 5.1
05548900001-06CS
05548900001-06
33
Doc Rev. 5.1
