LightCycler® SeptiFast Test MG A LightCycler® 2.0 készülékhez való használatra (1415001 és nagyobb sorozatszámok)
In vitro diagnosztikai célra. AZ ALÁBBIAKKAL VALÓ HASZNÁLATRA:
LightCycler® SeptiFast Kit MG
54 Tests
SeptiFast Lys Kit MG
100 Tests
SeptiFast Prep Kit MG
10 Tests
SeptiFast Software Set
REF : 04 469 046 001 REF : 04 404 432 001 REF : 04 404 459 001 REF : 04 705 220 001
A FELHASZNÁLÁS CÉLJA A LightCycler® SeptiFast Test MG egy in vitro nukleinsav-amplifikációs vizsgálat a SeptiFast Master List (SML) listán megadott mikroorganizmusokból származó bakteriális, illetve gomba DNS kimutatására és azonosítására humán K-EDTA-s vérben LightCycler® 2.0 készülék segítségével. A vizsgálat a klinikai megjelenéssel, elfogadott mikrobiológiai vizsgálatokkal és/vagy egyéb laboratóriumi markerekkel együtt olyan betegek gondozásában nyújthat segítséget, akiknél szepszis vagy más bakteriális/gomba véráram-fertőzés gyanúja merült fel. A VIZSGÁLAT ÖSSZEGZÉSE ÉS MAGYARÁZATA A leginkább bacteriaemia és/vagy fungaemia okozta szepszis a kórházi mortalitás és morbiditás fő okainak egyike. A szepszissel kapcsolatos morbiditás és mortalitás csökkentésében a megfelelő antibiotikus terápia és a kezelés minél előbbi megkezdése kritikus tényezők. Az intenzív terápiás osztályokon a kezdettől inadekvát antibiotikus terápiával kezelt betegek hányada jelentős, 11–46% (1,2,3). A kórházakban rendszerint legalább 48 órát vesz igénybe a bakteriális/gomba kórokozó(k) azonosítása és gyógyszerérzékenységük meghatározása haemokultúrákból (1). Molekuláris diagnosztikai eszközökkel végzett gyors kórokozó-kimutatás elősegítheti a bacteriaemia/fungaemia gyors diagnózisát, és a megfelelő antibiotikum-terápia korai adását, ugyancsak csökkentve a széles spektrumú antibiotikumok túlzott használatát (4,5). A LightCycler® SeptiFast Test MG olyan mikroorganizmusok kimutatására szolgál, amelyek az összes véráram-fertőzések mintegy 90%-át okozzák (1,6). Míg a mikrobiológiai módszerek élő mikroorganizmusokat mutatnak ki, ez a vizsgálat élő és élettelen mikroorganizmusokat, valamint szabad mikrobiális DNS-t egyaránt kimutat. A target fajokat a SeptiFast Master List (SML) sorolja fel az 1. táblázatban. Ezeket a fajokat a LightCycler® SeptiFast Test MG segítségével belső vizsgálatok és/vagy klinikai kísérletek során pozitívként detektálták. Ezen fajok némelyike a leggyakrabban inadekvát módon kezelt fajok közé tartozik: Enterococcus spp.; E. coli; Candida spp.; Klebsiella spp (6). Továbbá az SML target fajok némelyikének korai azonosítása azért is fontos, mert ezek a legnehezebben kezelhető fertőzéseket okozzák: Acinetobacter spp., Stenotrophomonas spp., Enterococcus spp., Candida spp., Pseudomonas spp. (6). Egy mintán belül egynél több faj is kimutatható. Tehát a valós idejű PCR egy kiegészítő eszköz a korai klinikai döntéshozás elősegítésére. 1. táblázat: SeptiFast Master List (SML)
Gram (-) Escherichia coli
Gram (+)
Gombák
Staphylococcus aureus
Candida albicans
Klebsiella (pneumoniae/oxytoca)
CoNS1
Candida tropicalis
Serratia marcescens
Streptococcus pneumoniae
Candida parapsilosis
Enterobacter (cloacae/aerogenes)
Streptococcus spp.2
Candida glabrata
Proteus mirabilis
Enterococcus faecium
Candida krusei
Pseudomonas aeruginosa
Enterococcus faecalis
Aspergillus fumigatus
Acinetobacter baumannii 3 Stenotrophomonas maltophilia 1
Koaguláz negatív Staphylococcusok (a CoNS csoportba tartozó fajok a 8. táblázatban vannak felsorolva). 2 A Streptococcus spp. csoportba tartozó fajok a 8. táblázatban vannak felsorolva. 3 Gyakran A. calcoaceticus-A. baumannii (Acb komplex) elnevezésű fajokat nem mutatja ki (8).
1
AZ ELJÁRÁS ALAPELVEI A LightCycler® SeptiFast Test MG 3 fő lépésből épül fel: • Minta-előkészítés a mechanikai feltárással és DNS-tisztítással együtt • A target DNS valós idejű PCR-amplifikálása 3 párhuzamos reakcióban (Gram-pozitív baktériumok, Gram-negatív baktériumok, gombák), majd a specifikus hibridizációs próbákkal történő kimutatás • A minták és kontrollok automatikus azonosítása Minta előkészítése A minták mechanikus feltárása a SeptiFast Lys Kit MG és a MagNA Lyser készülék segítségével történik. A SeptiFast Prep Kit MG segítségével a mintákat magas hőmérsékleten való inkubálás során roncsolják egy proteáz és egy olyan chaotrop feltáró puffer segítségével, amely szabaddá teszi a nukleinsavakat, és megvédi a szabaddá vált DNS-t a vérben lévő DNázoktól. Belső kontroll (IC) meghatározott térfogata kerül a feltáróreagenssel együtt hozzáadásra valamennyi mintához. Az IC a targetszekvenciák kötő régióival identikus primer kötő régiókkal bíró szintetikus kettős szálú DNS-molekulákat tartalmaz. Az IC egyedi H próba kötő régiókat tartalmaz, amelyek lehetővé teszik az amplifikált IC megkülönböztetését a target-specifikus amplikontól. A kötő puffer hozzáadását követően a keverék egy üvegszálas szűrőbetéttel ellátott centrifugaoszlopba kerül. A humán genom és a bakteriális/gomba DNS az üvegszál felületéhez kötődik. A nem kötődött anyagok, mint sók, fehérjék és egyéb sejtfragmensek két mosási lépés során kerülnek eltávolításra. A mosási lépések befejezését követően az adszorbeált nukleinsavakat magas hőmérsékleten eluálják. Az elutátumokon PCR-analízist végeznek. Valós idejű PCR-amplifikáció és kimutatás A targetszekvencia kiválasztása A baktérium- és gombafajok differenciálására target régióként az internal transcribed spacer (ITS) régiót jelölték ki. Ez az egyetlen kópiájú géneknél nagyobb fokú analitikai érzékenységet nyújt, mivel a baktériumok és gombák genomjában számos operon található. Továbbá az ITS fajspecifikusabb, mint a riboszomális RNS-ek, és ezért a legalkalmasabb fajok közti differenciálásra. Valamennyi Gram-negatív és Gram-pozitív baktérium esetén a 16S és 23S riboszomális DNS-szekvenciák között, valamennyi gomba esetén pedig a 18S és 5,8S riboszomális DNS-szekvenciák között helyezkedik el. Amplifikáció A PCR-amplifikálás előtt az amplikonszennyezés kockázatát AmpErase (uracil-N-glikoziláz) enzim használatával csökkentik. Az enzim felismeri és katalizálja az olyan DNS-szálak megsemmisítését, amelyek dezoxiuridint tartalmaznak, a dezoxitimidint tartalmazókét viszont nem. A mintákat LightCycler® kapillárisokban (100 µl) MG lévő „hot-start” Taq polimerázt tartalmazó amplifikáló elegyhez adják, ahol a PCR-amplifikálás megtörténik. Az adott faj minden egyes targetja amplifikálódik vagy általános vagy specifikus primerek segítségével. Egy targetkeverék párhuzamosan amplifikálódik a reagens kontrollokban (RC). A PCR-termékek valós idejű kimutatása H próbák segítségével Az amplikon két specifikus H próba segítségével fluoreszcens technikával mutatható ki. Ezek a fluoreszcens festékkel jelölt H próbák az amplifikált fragmens belső szekvenciájához hibridizálnak az amplifikálási ciklus annealing fázisában. A kibocsátott fluoreszcenciát a LightCycler® 2.0 készülék a négy különböző detektáló csatorna egyikén méri. Az amplifikálás befejeztével az olvadási görbe elemzése történik. Az olvadási hőmérséklet TM függ a hosszúságtól, a szekvenciától, valamint a próba és a target DNS közti homológia mértékétől. A próbák az egy csatornán belül kimutatott fajok differenciálására szolgálnak azok TM értékei révén. A minták és kontrollok automatikus azonosítása A minták és kontrollok olvadási hőmérsékleteinek (TM) elemzését a mellékelt azonosító szoftver (SeptiFast Identification Software) végzi el, és egy eredménylap kerül kinyomtatásra. A munkafolyamat során történő szennyeződés tartományába eső alacsony koncentrációjú Staphylococcus (CoNS) és Streptococcus fajok nem jelennek meg eredményként. Ha Staphylococcus aureus pozitív eredményt kap, azt követően mecA rezisztencia vizsgálat megfontolandó. A részleteket illetően tanulmányozza a LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG mellékelt használati utasítását (P/N: 04 488 814 001). REAGENSEK SeptiFast Lys Kit MG
P/N: 04 404 432 001 100 teszt
LM (feltáró mátrix) üveg/kerámia gyöngyök
100 x
SeptiFast Prep Kit MG
P/N: 04 404 459 001
[1] LB (feltáró puffer) < 50% guanidin-tiocianát trisz-HCl puffer 20% Triton X-100
10 teszt 20 x 1500 µl
Ártalmas
[2] PK (proteináz K) 2% proteináz K glicerin
2 x 850 µl Ártalmas
[3] BB (kötő puffer) < 50% guanidin-tiocianát trisz-HCl puffer 20% Triton X-100
10 x 1000 µl Ártalmas
2
SeptiFast Prep Kit MG
P/N: 04 404 459 001
[4] IRB (gátlás eltávolító puffer) < 50% guanidin HCl trisz-HCl puffer < 40% etanol
10 teszt 10 x 1800 µl
Ártalmas
[5] WB (mosópuffer) < 0,2% nátrium-klorid trisz-HCl puffer < 80% etanol
10 x 1600 µl Tűzveszélyes
[6] EB (eluáló puffer) trisz-HCl puffer
10 x 400 µl
BET (vérextraháló csövek)
1 x 50
FC (szűrőoszlopok)
2x5
LightCycler® SeptiFast Kit MG
P/N: 04 469 046 001
54 teszt
[1a] RM 1a (reakciókeverék 1a) 3 U/µl FastStart Taq polimeráz < 0,1% AmpErase (uracil-N-glikoziláz) enzim
3 x 27 µl
[1a] RM 1b (reakciókeverék 1b) < 1% Brij < 0,1% magnéziumoldat < 0,1% dNTP trisz-HCl puffer
3 x 620 µl
[2] DM G+ (kimutatási keverék Gram-pozitív) < 0,001% primer, próbák G+ < 1% Brij trisz-HCl puffer
3 x 126 µl
[3] DM G- (kimutatási keverék Gram-negatív) < 0,001% primer, próbák G< 1% Brij trisz-HCl puffer
3 x 126 µl
[4] DM F (kimutatási keverék gomba) < 0,001% primer, próbák F < 1% Brij trisz-HCl puffer
3 x 126 µl
[5] RC G+ (reagens kontroll Gram pozitív) <0,001% DNS kontroll templát G+ EDTA trisz-HCl puffer
1 x 330 µl
[6] RC G- (reagens kontroll Gram-negatív) <0,001% DNS kontroll templát GEDTA trisz-HCl puffer
1 x 330 µl
[7] RC F (reagens kontroll gomba) <0,001% DNS kontroll templát F EDTA trisz-HCl puffer
1 x 330 µl
[8] IC (belső kontroll) <0,001% DNS in process kontroll templát G+, G-, F EDTA trisz-HCl puffer
5 x 100 µl
[9] NC (negatív kontroll) < 35% polietilén-glikol 10000 trisz-HCl puffer
10 x 1600 µl
SeptiFast Software Set v1.1
P/N: 04 705 220 001
SeptiFast Identification Software v1.1 SeptiFast Macro v1.0 SeptiFast mecA Macro v1.0 SeptiFast MCC Macro v1.0 SeptiFast Proof Files v1.1
3
1x
FIGYELMEZTETÉSEK ÉS ÓVINTÉZKEDÉSEK Általános figyelmeztetések és óvintézkedések • In vitro diagnosztikai célra. • Csak humán K-EDTA-s vérmintákhoz. • Ne pipettázzon szájjal. • Ne egyen, igyon vagy dohányozzon a laboratórium területén. Viseljen púdermentes, egyszer használatos védőkesztyűt, védőruhát és szemvédőt a minták és a készlet reagensei kezelése közben. A minták és a tesztreagensek kezelését követően gondosan mosson kezet. • Ne öntse össze a különböző gyártási tételekből származó reagenseket. • Ne keverje a különböző készletekből származó reagenseket, a master mixhez szükségeseket kivéve. • A fel nem használt reagensek, hulladék és minták kezelésének összhangban kell lennie a megfelelő országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásokkal. • Ne használja a készletet a lejárati idő után. • Az anyagok biztonsági adatlapjai (MSDS) igény esetén hozzáférhetők a Roche helyi képviselőjétől. • A mintákat fertőzőként kell kezelni a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (8) és a CLSI Document M29-A (9) előírásoknak megfelelő biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva. Minden munkafelületet és kesztyűt alaposan tisztítson meg és fertőtlenítsen DNS-dekontamináló reagenssel (pl. LTK-008™). Győződjön meg arról, hogy a kesztyűk ellenállóak a DNS-dekontamináló reagenssel szemben. • Viseljen szemvédőt, védőruhát és egyszer használatos védőkesztyűt bármely reagens kezelése közben. Ezen reagensek bőrrel, szemmel és nyálkahártyákkal való érintkezése kerülendő. Ha mégis előfordul érintkezés, azonnal mossa le nagy mennyiségű vízzel. Ellenkező esetben égő érzés előfordulhat. Ezen reagensek kiömlése esetén szárazra törlés előtt vízzel hígítsa. • A feltáró puffer (LB) és kötő puffer (BB) bőrrel, szemmel és nyálkahártyákkal való érintkezése kerülendő. Ha mégis előfordul érintkezés, azonnal mossa le nagy mennyiségű vízzel, ellenkező esetben égés történhet. A kiömlött reagenseket feltörlés előtt hígítsa fel vízzel. Az LB és BB pufferek ne kerüljenek kapcsolatba hipoklorit (fehérítő) oldattal. Az ilyen keverékből erősen mérgező gáz fejlődhet. • A laboratóriumi munkafolyamatnak egyirányú módon kell zajlania, kezdve a preamplifikálási területtől a posztamplifikálási (amplifikálási/kimutatási) területig haladva. A preamplifikálási műveletek a reagens-előkészítés és a minta-előkészítés. Valamennyi preamplifikálási művelethez tartozó felszerelést és eszközt jelölni kell, és tilos használni más művelethez vagy más munkaterületre átvinni. Valamennyi munkaterületen kesztyűt kell viselni, és a terület elhagyása előtt le kell venni. A reagens és kontroll kezeléséhez használt felszerelést és eszközöket tilos használni minta-előkészítési műveletekhez, amplifikált DNS vagy más target DNS-forrás pipettázásához vagy feldolgozásához. A posztamplifikálási műveletekhez tartozó felszerelést és eszközöket mindenkor a posztamplifikálási munkaterületen kell tartani. • A master mixben jelen lévő AmpErase enzim csökkenti az amplikonszennyezés kockázatát. Ugyanakkor a pozitív kontrollokból és pozitív klinikai mintákból származó szennyeződés csak helyes laboratóriumi gyakorlattal és ezen Használati utasításban meghatározott eljárások gondos betartásával kerülhető el. Specifikus figyelmeztetések és óvintézkedések a LightCycler® SeptiFast Test MG használatához A LightCycler® SeptiFast Test MG target organizmusaiból származó DNS jelen van a környezetben. Az ilyen, környezeti DNS kimutatásából származó álpozitív eredmények (DNS-szennyezés) elkerülése érdekében szükséges DNS-szennyezéstől mentes munkafolyamat biztosítása. Különösen a kezelő személy lehet DNS-szennyezés forrása, mivel az emberi bőrt és felső légutakat olyan különböző mikroorganizmusok népesítik be, amelyek a LightCycler® SeptiFast Test MG target organizmusai is [pl. Streptococcusok és koaguláz negatív Staphylococcusok (CoNS)]. Az alábbi szabályok ajánlások a DNS-szennyezés elkerülésére. LightCycler® SeptiFast Test MG reagensek és egyszer használatos eszközök • A LightCycler® SeptiFast Test MG reagensek és egyszer használatos eszközök MG minőségűek. • Az MG termékeket bakteriális és gombákból származó nukleinsavak nagyon érzékeny kimutatására tervezték. Szabadalmazott gyártási eljárásokat fejlesztettek ki annak érdekében, hogy kizárják az ilyen jellegű vizsgálatokat zavaró DNS-szennyezést. • Kerülje a reagensfiolák szükségtelen kinyitását és lezárását. Ruházat és kesztyű • Viseljen púdermentes kesztyűt a teljes munkafolyamat alatt. • Ne hagyjon fedetlen bőrfelületet, viselje a kesztyűt a labor köpeny ujjára húzva. • Szennyeződés esetén azonnal cseréljen kesztyűt, vagy kezelje DNS-dekontamináló reagenssel (pl. LTK-008™; a kesztyűnek ellenállónak kell lennie a DNS-dekontamináló reagenssel szemben). • Felvételkor ne érjen a kesztyűk tenyér részéhez és az ujjakhoz. A lamináris áramlású fülke gondozása • A munkaállomás felületeinek tisztítását lamináris áramlás mögött végezze DNS-dekontamináló reagenssel minden egyes minta-előkészítést követően. MEGJEGYZÉS: Győződjön meg arról, hogy a felszerelés ellenálló a DNS-dekontamináló reagenssel szemben. • Rendszeres időközönként takarítson le minden felületet a lamináris áramlású fülkén belül (oldalfalak, alsó tálca alatti terek, padlótálca). • Ha több felhasználó használja a lamináris áramlású fülkét, biztosítsa annak DNS-mentességét. • Kapcsolja be az UV-fényt és a levegőáramot legalább 30 percre a munka előtt. • Kapcsolja ki az UV-fényt, amíg dolgozik. A PCR-munkaállomás gondozása • A PCR-munkaállomás munkafelületeinek tisztítását DNS-dekontamináló reagenssel végezze el minden egyes PCR-üzembeállítást követően. • Rendszeres időközönként takarítsa le a PCR-munkaállomás valamennyi felületét. • Kapcsolja be az UV-fényt legalább 30 percre a munka előtt. Kapcsolja ki az UV-fényt, amíg dolgozik. MEGJEGYZÉS: A lamináris áramlású fülke és PCR-munkaállomás UV-lámpájának cseréjét a gyártó utasításai szerint végezze. Munkaeszközök és fogyóeszközök kezelése • A LightCycler® SeptiFast Test MG vizsgálathoz használt specifikus fogyóeszközöket és munkaeszközöket hagyja a lamináris áramlású fülkében, ha lehetséges. • A munka megkezdése előtt sugározzon be minden darabot UV-fénnyel legalább 30 percig. • Csak DNS-mentes egyszer használatos anyagokat használjon (pl. MG minőség. Lásd a Szükséges, de nem biztosított anyagok c. fejezetet.) Csak egyszer használja azokat. • A kapillárisok lezárásához használjon kupakozó eszközt (a kezelési utasításokat illetően tanulmányozza a LightCycler® 2.0 készülék Felhasználói kézikönyvét). • Kapilláris törése esetén kérjük, tanulmányozza a LightCycler® 2.0 készülék Felhasználói kézikönyvét („Karbantartás” fejezet).
4
Óvintézkedések pipettázáskor • Csak a lamináris áramlású levegőszűrő alatt nyissa ki a reagensfiolákat, pipettahegyes dobozokat és kapillárisdobozokat. • A lamináris áramláson kívül ne használja ugyanazokat a pipettahegyeket és kapillárisokat. • Ne érjen nyitott fiola pereméhez vagy csavarmenetéhez. Pipettázáskor a fiolát a pereme alatt érintse. • Ne érjen nyitott kapilláris pereméhez. • Rendezze a műveletek során használt valamennyi eszközt logikai sorrendbe a lamináris áramlás alatt (kerülje az összevissza történő pipettázást). • Ha kifröccsenés fordul elő, fejezze be az aktuális munkalépést, és utána azonnal takarítsa le munkaterületet DNS-dekontamináló reagenssel (pl. LTK-008™) TÁROLÁSI ÉS KEZELÉSI KÖVETELMÉNYEK SeptiFast Lys Kit MG • • •
15–25 °C között tárolandó. Csak egyszer nyissa ki a fiolákat. Tilos újra felhasználni őket. A lejárati idő után ne használja fel azokat.
SeptiFast Prep Kit MG • • • • •
15–25 °C között tárolandó (tilos lefagyasztani vagy hűtőben tárolni). A PK-t legfeljebb 3-szor nyissa ki. A többi fiolát csak egyszer nyissa ki, és a fel nem használt reagenseket dobja ki. Ne használjon különböző gyártási tételekből származó reagenseket egy extrakciós futtatáson belül. A lejárati idő után ne használja fel azokat.
LightCycler® SeptiFast Kit MG • • • • • • • •
-15 ° és -25 °C között tárolandó. Sötét helyen tárolandó. A master mixeket ([1a], [1b] és [2] vagy [3] vagy [4] keverékét) legfeljebb 3 napig 2–8 °C között tárolja. A RC-t használat után legfeljebb 10 napig 2–8 °C között tárolja, vagy minden egyes használat után fagyassza le azonnal -15 ° és -25 °C közé. A RC-t legfeljebb 6-szor nyissa ki. A többi fiolát csak egyszer nyissa ki, és a fel nem használt reagenseket dobja ki. Ne használjon különböző gyártási tételekből származó reagenseket egy PCR-futtatáson belül. A lejárati idő után ne használja fel azokat.
A KÉSZLET TARTALMA SeptiFast Lys Kit MG
P/N: 04 404 432 001 100 teszt
SeptiFast Prep Kit MG
P/N: 04 404 459 001 10 teszt
LightCycler® SeptiFast Kit MG
P/N: 04 469 046 001 54 teszt
SeptiFast Software Set v1.1 (egy alkalommal mellékelve) P/N: 04 705 220 001 SZÜKSÉGES, DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK Megvásárolhatók a Roche-tól LightCycler® 2.0 készülék és a Software 4.05.415
03 531 414 201
LightCycler® kapillárisok MG (100 µl)
03 612 066 001
LC mintatárcsa-centrifuga 2.0
03 709 582 001
MagNA Lyser készülék (230 V)
03 358 976 001
LightCycler® Multicolor Compensation Set
04 484 355 001
SeptiFast hűtőblokk
04 555 864 001
Megvásárolhatók más gyártóktól Kilendülő fejes centrifuga 15 ml-es csövekhez min. 4200 g ülepítőerejű VWR International (pl. Eppendorf) 521-0076 • 1x centrifuga 5810 521-0061 • 2x illesztőelem (1 pár) 15 ml-es csövekhez kúpos fenékkel 521-0044 • 1x kilendülő fejes rotor min. 4200 x g Centrifuga (pl. Eppendorf) • 1x MiniSpin®
VWR International 521-0012
2 termo keverő (pl. Eppendorf) • 2x Thermomixer Comfort benne • 1x termoblokk 24 x 2,0 ml-es fiolákhoz és • 1x termoblokk 8 x 15 ml-es fiolákhoz
VWR International 460-1112 460-1116 460-1120
Cső/palack átforduló keverő (pl. Stuart Scientific) • 1x átforduló keverő • 1x vortex
VWR International 445-5210 444-1372
5
DNS-mentes fiolák és hegyek (pl. MG egyszer használatos anyagok, greiner bio-one) • 5 ml-es szűrőhegyek MG • 1 ml-es szűrőhegyek MG • 100 µl-es szűrőhegyek MG • 20 µl-es szűrőhegyek MG • 1 ml-es szérumpipetta MG • 1,5 ml-es csövek MG
greiner bio-one 940525MG 750289MG 772289MG 774289MG 700371MG 616202MG
DNS-dekontamináló reagens (pl. biodelta GmbH) • LTK-008™ set
biodelta GmbH 200-000
Pipetta 1–5 ml-es (pl. Thermo Life Sciences) • 1x Finnpette 1–5 ml-es
VWR International 613-2541
Pipetta 10–1000 µl-es (pl. Eppendorf) • 2x referencia 100–1000 µl • 2x referencia 10–100 µl • 1x referencia 2–20 µl (csak mecA vizsgálathoz)
VWR International 613-3650 613-3649 613-3647
Lamináris áramlású fülke (pl. Cleanair) • BioSafety Cabinet EF 4E
VWR International 135-0055
PCR-munkaállomás (pl. Safety Cabinet Solutions Ltd.) • Biocap Passive DNA PCR Cabinet
VWR International 135-6576
Pozitív kontrollanyag • Más gyártó által biztosítva vagy a felhasználó laboratóriumában előállítva (lásd az Ajánlás a pozitív kontrollanyagok készítésére c. szakaszt). A MINTA LEVÉTELE, TRANSZPORTJA ÉS TÁROLÁSA MEGJEGYZÉS: Valamennyi mintát és kontrollt fertőzések átvitelére alkalmasként kell kezelni. A minta levétele A LightCycler® SeptiFast Test MG kizárólag K-EDTA-s vérmintákhoz való használatra alkalmas. A vért K-EDTA alvadásgátlót tartalmazó steril csövekbe kell levenni. A minta transzportja és tárolása A teljes vér transzportja meg kell feleljen a kóroki ágensek transzportjára vonatkozó országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásoknak (10). A teljes vér -15 ° és -25 °C vagy 2–8 °C között legfeljebb 3 napig, 15–25 °C között pedig legfeljebb 4 óra hosszat transzportálható/tárolható. Az eluátumok stabilitása A feldolgozott mintát közvetlenül a DNS-tisztítás után használja fel. Ha szükséges, tároljon egy a mecA vizsgálat céljára előkészítendő kis részletet (további részleteket illetően kérjük, tanulmányozza a LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG készletet). Az eluátumok -15 ° és -25 °C között legfeljebb 30 napig, vagy 2–8 °C között legfeljebb 8 napig, 15–25 °C között pedig legfeljebb 4 óra hosszat tárolhatók. HASZNÁLATI UTASÍTÁS Mielőtt a minta és kontroll előkészítését megkezdené A LightCycler® 2.0 készülék és PCR-munkaállomás előkészítése Színkompenzáció:
•
Használja a LightCycler® Multicolor Compensation Set-et (P/N: 04 484 355 001). Ha a színkompenzáció-fájl lejárt, akkor készítsen egy új fájlt. A részleteket illetően kérjük, tanulmányozza a LightCycler® Multicolor Compensation Set mellékelt használati utasítását.
A SeptiFast Identification Software (SIS) telepítése:
A frissítések telepítése során ellenőrizze, hogy van-e újabb információ adva a termékhez. 1. Jelentkezzen be a LightCycler® adatállomásra rendszergazdaként. 2. Helyezze be a SeptiFast Software Set CD-t a LightCycler® adatállomás CD-meghajtójába. 3. Első alkalommal történő telepítéskor: Abban az esetben, ha a Microsoft .NET 1.1 keretrendszer nincs telepítve, a SIS beállításának megkezdésekor emlékeztetve lesz annak telepítésére. A Microsoft .NET 1.1 keretrendszer telepítése kötelező, különben a SIS nem fog megfelelően működni. 4. A SIS telepítéséhez nyomja meg az
gombot, kövesse a telepítő varázslót. 5. Ha csak egy felhasználó fog dolgozni a LightCycler® adatállomáson, válassza, hogy <just me>, ha egynél több felhasználó fog dolgozni a LightCycler® adatállomáson, válassza, hogy <everyone>. 6. Erősítse meg a <Setup succeeded> üzenetet az megnyomásával (a SIS mostantól az asztalon lévő ikonjával indítható). 7. Az *.ixo fájlok adatmappája: automatikusan létrejön. A SIS helyes telepítésének ellenőrzése (a LightCycler® SeptiFast Test MG és a LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG:
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
Valamennyi biztonsági fájlt a SeptiFast Software Set CD-ről a program automatikusan a mappába másolja. Kattintson duplán a SIS ikonra az asztalon, nyomja meg a <Start> gombot. Jelölje ki a biztonsági fájlt a mappából (SeptiFast Proof 1.0.ixo vagy SeptiFast mecA Proof 1.0, rendre). Jelölje meg a “NO” választ arra, hogy a LightCycler® eredménylap tartalmazza-e a <User Developed or Modified Test Method> jelzést. A program automatikusan elemzi a fájlt, és megjeleníti az adatokat. Nyomtassa ki a jelentést. Nyissa meg és nyomtassa ki a vonatkozó PDF-fájlokat (SeptiFast Proof v1.1.pdf vagy SeptiFast mecA Proof v1.1.pdf, rendre). A kinyomtatott jelentésnek és a kinyomtatott proof.pdf fájlnak meg kell felelnie egymásnak. Ha nem, akkor lépjen kapcsolatba a Roche helyi képviselőjével. 9. Végezze el a 3–8. lépéseket a második biztonsági fájllal.
6
A SIS eltávolítása:
1. 2. 3. 4. 5.
Jelentkezzen be a LightCycler® adatállomásra rendszergazdaként. Kattintson a <Start> gombra a LightCycler® adatállomás tálcáján. Válassza ki a <Settings - Control Panel - Add/Remove Programs> pontot. Megjelenik az aktuálisan telepített programok listája, kattintson a <SIS>-re. Válassza, hogy , és erősítse meg, hogy .
A SeptiFast makrók telepítése:
1. Telepítse a makrókat a SeptiFast Software Set CD-ről. 2. Egy makró telepítéséhez kérjük, tanulmányozza a LightCycler® 2.0 készülék Felhasználói kézikönyvét („in vitro diagnosztikai célra”). A lamináris áramlású fülke és PCR-munkaállomás előkészítése 1. Gondosan takarítsa ki és dekontaminálja a lamináris áramlású fülkét és a PCR-munkaállomást (pl. LTK-008™ segítségével). 2. Legalább 30 percre kapcsolja be: a lamináris áramlású fülke UV-lámpáját és levegőáramát, a PCR-munkaállomás UV-lámpáját. 3. Kapcsolja ki az UV-fényt, amíg dolgozik. 4. Nyissa ki a LightCycler® SeptiFast Kit MG-t és vegyen elő: • 1 fiola IC és 1 fiola NC kontrollt, és hagyja őket felolvadni 2–8 °C hőmérsékleten egy, a minta-előkészítéshez használt állványban (nem tartozék). • 1 fiola RM 1a, RM 1b, DM G+, DM G-, DM F, RC G+, RC G-, RC F reagenseket, és hagyja őket felolvadni SeptiFast hűtőblokkban a minta előkészítés során 2–8 °C között. 5. Kapcsolja be: Termo keverő 1 (15 ml-es csövekhez) és állítsa be 56 °C-ra, termo keverő 2 (1,5 ml-es csövekhez) és állítsa be 70 °C-ra. 6. Helyezzen megfelelő mennyiségű EB fiolát (1 fiola per minta/NC) a termo keverő 2-be (70 °C). 7. Tegye a vérvételi csöveket vagy minta fiolákat átforduló keverőbe, és keverje 30 percig. Dolgozza fel őket azonnal. Minta és kontroll előkészítése MEGJEGYZÉS: Valamennyi műveleti lépést a lamináris áramlású fülkében végezzen el. Ajánlás a pozitív kontrollanyagok készítésére • A minta-előkészítési eljárás megkezdése esetén valamennyi lépést végre kell hajtani. • A pozitív kontrollanyagokat más gyártóktól is meg lehet vásárolni. • Amennyiben a felhasználó laboratóriumában készülnek, jellemző klinikai izolátumokat kell kiválasztani a helyi előfordulás és a klinikai jelentőség szerint. Ezen izolált telepeket fel kell oldani, és körülbelül 300 CFU/ml koncentrációnak megfelelően be kell oltani negatív vérbe. • Pozitív kontrollnak, ATCC anyag 33592, egy methicillin-rezisztens S. aureus használható, amely megteremti annak a lehetőségét, hogy az eluátumot pozitív kontrollként lehessen használni a LightCycler® SeptiFast Test MG és a LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG vizsgálatokhoz (P/N: 04 488 814 001) is. • A törzset 18–24 óra hosszat 28–37 °C között tenyésztették véres agaron (5% birkavér), és reszuszpendálták 0,5 McFarland-nak megfelelően (~1,5x108 CFU/ml). Ezt a szuszpenziót kell beoltani negatív vérbe 300 CFU/ml végső koncentrációnak megfelelően. Előfeltárás SeptiFast Lys Kit MG segítségével MEGJEGYZÉS: Olvassa el gondosan a MagNA Lyser készülék Felhasználói kézikönyvét. 1. Használjon 1 megfelelően felcímkézett LM fiolát minden egyes mintához, illetve NC-hez. 2. Nyissa ki a fiolát és vigyen át 1500 µl vérmintát vagy NC-t. 3. Zárja le szorosan a csövet. MEGJEGYZÉS: Ne a kupak tetején jelölje meg a csöveket. 4. Végezzen elő feltárást a mintákon a MagNA Lyser készülékben 70 másodpercig 7000 rpm fordulatszámon. 5. Hagyja a fiolákat a készüléken kívül állni 10 percig. Centrifugálni tilos! Minta-előkészítés SeptiFast Prep Kit MG segítségével. MEGJEGYZÉS: Valamennyi reagensnek tiszta oldatnak kell lennie. Ha csapadék képződött, melegítse fel az oldatot (max. 37 °C-ra). Rázza finoman, amíg a csapadék feloldódik. 1. Mérjen 150 µl PK-t a BET 1-be. 2. Mérjen 1 ml előfeltárt mintát vagy NC-t a BET 1-be. Kerülje el a szilárd feltáró mátrix vagy hab pipettázását. 3. Tegye fel a kupakot, és röviden vortexelje. 4. Adjon hozzá 10 µl IC-t. Használjon új pipettahegyet minden egyes mintához, illetve NC-hez. 5. Adja hozzá 2 fiola LB tartalmát, tegye rá a kupakot és azonnal vortexelje alaposan. 6. Inkubálja 15 percig 56 °C-on óvatos keverés közben (pl. 500 rpm Eppendorf termokeverővel). MEGJEGYZÉS: A BET 1-ben lévő valamennyi folyadékot le kell fedni az inkubáló eszközzel. 7. Adja hozzá 1 fiola BB tartalmát, tegye rá a kupakot és vortexelje. 8. Tegyen FC-t a BET 2-re. Ne érjen az FC belső oldalához vagy kivezető nyílásához. 9. Pipettázza a minta-előkészítő keverék felét a BET 1-ből az FC szűrőjére (kb. 2,7 ml). 10. Tegye rá a kupakot és centrifugálja le a BET 2-FC szerelvényt 1900 x g-n 1 percig. 11. Pipettázza a minta előkészítő keverék maradékát a BET 1-ből az FC szűrőjére (kb. 2,7 ml). Használjon új pipettahegyet minden egyes mintához, illetve NC-hez. 12. Tegye rá a kupakot és centrifugálja le a BET 2-FC szerelvényt 1900 x g-n 3 percig. 13. Tegyen FC-t a BET 3-ra. Dobja ki a BET 2-t átáramoltatással. 14. Mérje egy fiola IRB tartalmát a BET 3-ban lévő FC szűrőjére. 15. Tegye rá a kupakot és centrifugálja le a BET 3-FC szerelvényt 4200 x g-n 2 percig. 16. Mérje egy fiola WB tartalmát a BET 3-ban lévő FC szűrőjére. 17. Tegye rá a kupakot és centrifugálja le a BET 3-FC szerelvényt 4200 x g-n 10 percig. 18. Tegyen FC-t a BET 4-re. Dobja ki a BET 3-at átáramoltatással. 19. Centrifugázza a BET 4-et 4200 x g-n 1 percig. 20. Tegyen FC-t a BET 5-re. Dobja ki a BET 4-et. 21. Pipettázzon 300 µl előmelegített EB-t (70 °C) az FC közepére.
7
22. Tegye rá a kupakot, és inkubálja 5 percig szobahőmérsékleten. 23. Centrifugázza 4200 x g-n 2 percig. 24. Dobja ki az FC-t. Vigye át az eluátumot 1,5 ml-es fiolákba (pl. greiner bio-one szérumpipettákkal). Kerülje a cső falával való érintkezést. Reagens-előkészítés LightCycler® SeptiFast Kit MG segítségével MEGJEGYZÉS: Javasoljuk, hogy valamennyi műveleti lépést a minta-előkészítési helytől elkülönített PCR-munkaállomáson végezzen el. 1. Vegye ki a SeptiFast hűtőblokkot a reagens fiolákkal a hűtőszekrényből, szennyezésmentesítse DNS-dekontamináló reagenssel (pl. LTK-008™), és vigye át a PCR-munkaállomásra. 2. Röviden vortexelje a felolvadt reagenseket (kivéve RM 1a), és centrifugálja le őket (ha csapadék képződött, melegítse fel az oldatot 37 °C-ra 5 percig, és keverje óvatosan, amíg a csapadék fel nem oldódik). 3. Helyezze a felolvadt reagenses és az eluátumos fiolákat a SeptiFast hűtőblokk kijelölt pozícióiba. 4. Nyissa ki az RM 1b, RM 1a, DM G+, DM G- és DM F fiolákat. 5. Pipettázzon 600 µl RM 1b-t az RM 1a-ba, keverje meg óvatosan fel-le pipettázással. 6. Master mix MM G(+), MM G(-) és MM F létrehozásához pipettázzon 200 µl reakciókeveréket 1a-ból mindegyik DM G+, DM G- és DM F fiolába; keverje meg óvatosan fel-le pipettázással. A PCR-reakciók előkészítése 1. Helyezze a szükséges számú kapillárist a SeptiFast hűtőblokkba, 3 kapillárist az RC-k számára (1, 2, 3 pozíciók), 3 kapillárist az NC eluátum számára (4, 5, 6 pozíciók), 3 kapillárist minden egyes mintaeluátum számára (7 és afeletti pozíciók). 2. Pipettázzon 50 µl MM G(+)-t a felső sor minden egyes kapillárisába. 3. Pipettázzon 50 µl MM G(-)-t a középső sor minden egyes kapillárisába. 4. Pipettázzon 50 µl MM F-t az alsó sor minden egyes kapillárisába. 5. Nyissa ki az első minta eluátum fiolát. Kezdje a SeptiFast hűtőblokk jobb oldalán lévő fiolával. 6. Pipettázzon 50 µl mintaeluátumot az MM G(+), MM G(-) és MM F oldatokat tartalmazó három kapilláris mindegyikébe. MEGJEGYZÉS: Minden pipettázási lépés után cserélje le a hegyet. 7. Kupakozó eszköz segítségével zárja le a három kapillárist (a LightCycler® 2.0 készülék tartozéka; a használatot illetően kérjük, tanulmányozza a LightCycler® 2.0 készülék Felhasználói kézikönyvét). 8. Folytassa a maradék mintaeluátumokkal az 5–7. lépésekben leírtak szerint. Pipettázza az NC-eluátumot utoljára a 4, 5 és 6 pozíciókban elhelyezkedő kapillárisokba. 9. Nyissa ki az RC G+-t. 10. Pipettázzon 50 µl-t az 1 pozíciójú kapillárisba. 11. Zárja le a kapillárist, majd zárja le az RC G+-t. 12. Pipettázzon RC G- és RC F kontrollokat rendre a 2 és 3 pozíciójú kapillárisokba a 9–11. lépésben leírtak szerint. 13. Vigye át valamennyi kapillárist a sorszámaik szerint a LightCycler® mintatárcsába. 14. Centrifugálja le a LightCycler® mintatárcsát LC mintatárcsa-centrifuga 2.0 segítségével. 15. Helyezze a LightCycler® mintatárcsát a LightCycler® 2.0 készülékbe. A maradék reagensek és eluátumok tárolása 1. Címkézze fel a fel nem használt MM G(+), MM G(-) és MM F oldatokat a fennmaradó reakciószámokkal és dátummal. Helyezze a fiolákat a SeptiFast hűtőblokk megfelelő pozícióiba. 2. A master mix MM 2–8 °C között legfeljebb 3 napig tárolható. A következő futtatáshoz szükséges munkaoldat-térfogat biztosításához a tárolt master mix (MM) friss MM oldattal feltölthető Ez az oldat azonnal felhasználandó. 3. Címkézze fel a mintaeluátumokat és az NC-t a futtatási sorszámmal és dátummal, és tárolja a javaslatnak megfelelően. 4. Dobja ki valamennyi üres reagensfiolát. LightCycler® 2.0 készülék betöltése és működtetése MEGJEGYZÉS: A LightCycler® 2.0 készülék működtetése egy, a DNS-tisztítástól és a munkaoldatok elhelyezésétől elkülönített helyiségben javasolt. 1. Indítsa el a „SeptiFast_1.0_04469046001” vagy újabb SeptiFast makrót (kérjük, tanulmányozza a LightCycler® 2.0 készülék Felhasználói kézikönyvének „Roche-makró végrehajtása” c. fejezetét). MEGJEGYZÉS: Ha a felhasználó kijelentkezett, ne folytassa a futtatást. Kezdjen el egy új futtatást egy új névvel. MEGJEGYZÉS: Ne használja az mezőt. Ha szeretné a vizsgálat tételszámát hozzáadni a futtatáshoz, szúrja be ezt az adatot a mintaszerkesztő megfelelő mezőjébe. 2. Olyan néven mentse a futtatást, amely lehetővé teszi az egyértelmű azonosítást (pl. felhasználó neve és dátum). 3. Csökkentse a minták számát az alapértelmezett betöltési listából, ha 7-nél kevesebb mintára van szükség. Törölje egy minta mind a 3 kapillárisát a listában, nem csupán 1-et vagy 2-t a 3 párhuzamos vizsgálatból. Ha véletlenül túl sok kapillárist törölt, ne adja hozzá azokat, hanem kezdje az eljárást az elejétől. 4. Lehetséges, hogy a betegspecifikus adatokat adja meg az alapértelmezett beállítás helyett [pl. G(+) ahelyett, hogy G(+) <minta 1>]. A SIS helyes mintafelismerésének biztosítására egy mintalista 3 párhuzamos vizsgálatán belül a szövegnek azonosnak kell lenni. Vagy hagyja meg az alapértelmezett beállítást, és ha szükséges, akkor az adatbevitelhez használja a pontot. 5. Ha egyszer valamennyi mintaspecifikus információt megadta, folytassa a készletvarázslóval, és indítsa el a LightCycler® 2.0 készülék futtatását. MEGJEGYZÉS: Ne módosítsa a G(+), G(-), F előtagokat. Ne módosítsa a reagenskontrollok [pl. G(+) #RC#] és a negatív kontrollok [pl. G(+) #NC#] elnevezését. 6. A futtatás befejezése után ellenőrizze a folyadék szintet a kapillárisokban (egy adott kapillárisra nézve az eredmények érvénytelenek, ha a térfogat a kapillárisban változik.
8
Csúcsészlelés és automatikus mintaazonosítás Az analízismodulok általános magyarázata MEGJEGYZÉS: Ne kezdje meg az adatelemzést a LightCycler® 2.0 készülék futása közben. • A manuális TM hívás 12 TM-hívás modult (3 vizsgálat, 4 csatorna) igényel. Az abszolút mennyiségi meghatározás modulok nem igényelnek kézi vezérlést. • Manuális TM-hívás a TM sávok segítségével legfeljebb 6 csúcs esetén végezhető. • Mindegyik analízismodul TM sávja a SeptiFast makróban van megszabva. • Az olvadási csúcs ablakban a kiválasztott grafikonok valamennyi görbéje megjelenik. • Lehetőség van a TM sávok kijelölésére, illetve a kijelölés törlésére jelző nélkül. • Mindegyik analízismód alapvonala a SeptiFast makróban van meghatározva. • Ne módosítsa az alapvonalakat, és ne törölje a kijelölésüket. Ha véletlenül módosította, írja be a helyes értéket a 3. táblázat alapján: Alapvonalértékek. • Ha egynél több kapilláris van aktiválva, akkor az ellenőrző ablakban az első kapilláris beállításai vannak feltüntetve. • A sávok közti váltás valamennyi aktivált kapillárist érinti. MEGJEGYZÉS: Ne módosítsa az alábbi beállításokat: , , , <Method>, <Show Shoulders>, vagy . • A beállítás kiválasztható. • A csúcsok, mint az alapvonal feletti maximumok vannak definiálva. A vállak nem csúcsok. • Kivétel az RC G-, csatorna 610 (lásd 1. ábra, 2. grafikon) és 670, valamint RC F, csatorna 705. • Az 1. grafikonon a két bal oldali csúcs maximum, és indexvonallal kijelölendő. • A 2. grafikonon a csúcsok egyike (pl. a második) vállként jelenik meg, de ugyanúgy kijelölendő. • A 3. és 4. grafikonon az egyik csúcs hiányzik. Három indexvonal helyett csak kettőt kell aktiválni. 1. ábra: RC G-, CH 610 1. grafikon
•
2. grafikon
3. grafikon
4. grafikon
A TM indexvonalakkal a kijelölést az érvényes TM tartományokon belül kell elvégezni (lásd 2. táblázat). 2. táblázat: Érvényes csúcsok TM tartományai CH 610
CH 640
CH 670
CH 705
Alacsony TM Magas TM Alacsony TM Magas TM Alacsony TM Magas TM Alacsony TM Magas TM [°C] [°C] [°C] [°C] [°C] [°C] [°C] [°C]
•
G(+)
48
53
49
64
49
59
45
65
G(-)
52
66
55
69
48
65
57
62
F
56
61
44
58
49
62
51
62
Az alapvonal értékek az alábbi táblázat szerint vannak meghatározva, és tilos azokat módosítani. (Ha véletlenül mégis módosítaná, írja vissza a táblázat szerinti eredeti értéket, különben a futtatás jelzőt kap.) 3. táblázat: Alapvonalértékek CH 610
CH 640
CH 670
G(+)
0,159
0,027
0,061
CH 705 0,027
G(-)
0,234
0,001
0,236
0,065
F
0,196
0,033
0,111
0,059
A TM sávok beállítása 1. A futtatás befejezése után a vizsgálati varázsló kiírja, hogy . 2. Tegye alulra az ablakot (ne nyomja meg a gombot). 3. Ügyeljen arra, hogy a TM és alapvonalértékek láthatóak legyenek. 4. Kattintson az analízismodulra [pl. TM-hívás G(+) 610]. 5. Áttekintés nyeréséhez aktiválja a vizsgálat valamennyi pozícióját [pl. G(+)]. 6. Kattintson csak a G(+) #RC# pozícióra. 7. Állítsa be a TM sávokat az alapvonal feletti csúcsmaximumokra, ne felejtsen el koncentrálni csak az érvényes TM tartományra (lásd 2. táblázat: Érvényes csúcsok TM tartományai). Ha nincs csúcs az alapvonal felett, a TM sávot törölni kell (megszüntetni az aktiválást a megfelelő kis négyzetben). Egy adott kapilláris TM-hívásának végére csak csúcs maximumok maradhatnak TM sávokkal. Néhány esetben az E. faecium (G+, CH 705, TM 51,8–55,9) és a C. albicans (F, CH 640, TM 53,4–57,5) alacsony koncentrációi megjelenhetnek mint a megfelelő IC csúcsok vállai (G+, CH 705, TM 45,5– 49,6; F, CH 640, TM 44,8–48,0). Ezeket a vállakat jelölje ki TM sávok – TM 53,9 (G+, CH 705) és TM 55,5 (F, CH 640) – segítségével.
9
8. Áttekintés nyeréséhez aktiválja a következő pozíciót [pl. G(+) #NC#] a G(+) #RC#-vel együtt. (Az automata skálázás a legmagasabb csúcsra fog beállni). 9. Aktiválja csak a kiválasztott pozíciót [pl. G(+) #NC#]. (Az automata skálázás a negatív kontroll háttércsúcsaira fog beállni. Az alapvonal adott esetben többé már nem látható.) 10. Folytassa a csúcsdetektálást az 5–7. lépésekben leírtaknak megfelelően. 11. Az egyik vizsgálat [pl. TM-hívás G(+) 610] analízisének befejezését követően folytassa a következővel a 4–10. lépésekben leírtaknak megfelelően. A TM-hívás befejezése 1. Váltsa a vizsgálati varázslót a monitor közepére, és nyomja meg a gombot. 2. A jelentést a program automatikusan létrehozza és kinyomtatja. 3. A futtatást a program automatikusan elmenti. 4. Exportálja az *.ixo fájlt a mappába. 5. Ellenőrizze az eredménylapon az esetleges jelzőket, és hogy a üzenet megjelent-e. 6. Jelző előfordulása vagy a futtatás állapotára vonatkozó más üzenet megjelenése esetén a futtatás érvénytelen, és valamennyi mintát újra kell vizsgálni. Automatikus csúcsazonosítás a SeptiFast Identification Software (SIS) segítségével 1. Kattintson duplán a SIS ikonra az asztalon, nyomja meg a <Start> gombot. 2. Válassza ki a futtatást a mappából, és töltse be a *.ixo fájlt. 3. Válassza ki a „Yes” vagy „No” választ attól függően, hogy a LightCycler® eredménylap tartalmazza-e a <User Developed or Modified Test Method> jelzőt. 4. A *.ixo fájlt a program automatikusan feldolgozza, és az adatokat egy eredménylapon megjeleníti. 5. Nyomtassa ki a SIS eredménylapot. EREDMÉNYEK Az eredmények értékelése A SeptiFast Identification Software (SIS) JELZŐKET és MEGJEGYZÉSEKET hozhat létre a SPECIMEN ablakban úgymint: RUN FLAGS, ASSAY FLAGS és FLAGS (lásd alább). A kezelő személynek meg kell néznie, hogy a kinyomtatott jelentés(ek)en van-e bármelyik ablakban FLAGS vagy COMMENTS. 2. ábra: Specimen ablak Specimen SeptiFast sample 1
Assay
Data
Result
G(+)
<species>
G(-)
\
F
\
Flags
Comment
További információ szerezhető a RUN FLAGs és az ASSAY FLAGs COMMENT mezőiből. A minta eredményei A <species> nevek a RESULT mezőben azt jelzik, hogy a minta pozitívnak bizonyult az adott mikroorganizmusra. A megfelelő csúcsok nyers adatai a DATA mezőben vannak feltüntetve: csatorna (CH), olvadáspont (TM), csúcsmagasság (PH) és metszéspont (CP1). A RESULT mezőben lévő \ szimbólum azt jelenti, hogy a faj meghatározott feltételeinek megfelelően nem volt kimutatható analit. 1 A CP csak a G(+) csatorna 610, 640 számára van feltüntetve. mecA vizsgálat Ha Staphylococcus aureus pozitív eredményt kap, azt követően mecA rezisztencia vizsgálat megfontolandó. A részleteket illetően kérjük, tanulmányozza a LightCycler® SeptiFast mecA Kit MG mellékelt használati utasítását (P/N: 04 488 814 001). Futtatás validálása A futtatás validálást a SeptiFast Identification Software (SIS) végzi. Az érvénytelen futtatásokat automatikusan kiírja és A teljes futtatást meg kell ismételni. A jelzőkhöz tartozó megjegyzések és a vonatkozó magyarázatok az alábbiakban vannak felsorolva.
jellel megjelöli.
4. táblázat: Futtatásvalidáláshoz tartozó jelzők Megjegyzések1
Magyarázat
ASSAY FLAG
NC: IC not detected
Az NC-ben sem target, sem IC nem kimutatható
ASSAY FLAG
NC: < CH …, TM …, PH …, CP2 …>,< species > Az NC-ben faj mutatható ki
ASSAY FLAG
NC: more amplicons detected
Ráadás jelző, ha több, mint 3 amplikon mutatható ki az NC-ben
ASSAY FLAG
RC: No amplicon: <species>
Az RC egy vagy több amplikonja nem mutatható ki
ASSAY FLAG
RC: more amplicons not detected
Ráadás jelző, ha az RC több, mint 3 amplikonja nem mutatható ki
SPECIMEN FLAG
IC not detected
Sem target, sem IC nem mutatható ki.
1
A rendszerhibák a Hibaelhárítás szakaszban vannak felsorolva. 2 A CP csak a G(+) csatorna 610, 640 számára van feltüntetve.
10
MINŐSÉG-ELLENŐRZÉS Egy negatív kontrollt (NC) és egyet-egyet a 3 reagenskontrollból (RC) minden futtatás során a 3 párhuzamos vizsgálat [G(+), G(-), F] mindegyikének tartalmaznia kell. Az NC és RC kontrollokat meghatározott pozíciókba kell elhelyezni, ahogy az A PCR-reakciók előkészítése c. szakaszban le van írva. Pozitív kontrollként egy házon belüli pozitív anyag futtatása javasolt a teljes munkafolyamaton keresztül (lásd a Nem biztosított anyagok c. szakaszt). A SIS meghatározza az IC, NC és RC eredményeket. Amennyiben a kontrollok nem felelnek meg az adott specifikációknak, valamennyi mintaeredmény jelzőt kap a SPECIMEN ablakban. Ellenőrizze a kinyomtatott eredménylapon a SPECIMEN ablakban a jelzőket és megjegyzéseket, hogy meggyőződjön arról, hogy a futtatás érvényes. Negatív kontroll (NC) Az NC negatív kell legyen, ugyanakkor annak belső kontrollja pozitív. Amennyiben az NC nem felel meg ezen feltételeknek, a vizsgálat valamennyi mintaeredménye jelzőt kap. A teljes futtatást meg kell ismételni. Reagenskontrollok (RC) Minden RC pozitív kell legyen az adott RC target amplikonjára. Amennyiben az RC nem felel meg ezen feltételnek, a vizsgálat valamennyi mintaeredménye jelzőt kap. A teljes futtatást meg kell ismételni. Pozitív kontroll A pozitív kontroll pozitív kell legyen. Ha a házon belüli pozitív anyagok vagy külső pozitív kontrollok nem felelnek meg ennek a feltételnek, a teljes futtatás érvénytelen. A SIS nem tüntet fel jelzőt. Belső kontroll (IC) A belső kontroll pozitív kell legyen valamennyi negatív mintában és a negatív kontrollban is. Amennyiben az IC nem felel meg ezen feltételnek, a minta eredménye jelzőt kap. Érvénytelen kontrollok esetén ismételje meg a teljes eljárást (minta- és kontroll-előkészítés, amplifikálás és kimutatás mind a 3 vizsgálat esetén). Ha a kontrollok következetesen érvénytelenek, vegye fel a kapcsolatot a Roche helyi szervizével. HIBAELHÁRÍTÁS 5. táblázat: A RUN FLAGS COMMENTS mezőjében, illetve a SIS nyomtatott lapon megjelenő rendszerhibák. Rendszerüzenet (a SIS nyomtatott lap jelző részében látható)
Lehetséges ok
Javító intézkedés
User Developed or Modified Test Method
A futtatás érvénytelen; a lehetséges okok a Nyissa meg az eredeti *.ixo fájlt a LightCycler® LightCycler® 2.0 készülék Felhasználói szoftverben, és ellenőrizze az alapvonal értékeket kézikönyvében vannak ismertetve. Lehetséges, a 3. táblázat szerint. Mentse és exportálja újra a fájlt. hogy a makró alapértelmezett beállításait (pl. alapvonalak, futtatási protokoll stb.) módosították.
CCC File Name: Multiple CCC used!
Két vagy több színkompenzáció-fájl aktív egy vagy több analízismodulban.
Válassza ki a megfelelő színkompenzációt és számolja újra.
Color Compensation has expired on DD-Month-YY
A színkompenzáció-objektum hat hónaposnál régebbi.
Hozzon létre egy új színkompenzáció-objektumot.
Invalid Macro
Nem megfelelő makró lett alkalmazva
Keresse meg a megfelelő makrót a LightCycler® szoftverben és/vagy a SeptiFast Software Setben.
Invalid Baseline
Lehetséges, hogy az alapvonalértékeket véletlenül módosították
Nyissa meg az eredeti *.ixo fájlt a LightCycler® szoftverben, és ellenőrizze az alapvonal értékeket a 3. táblázat szerint. Mentse és exportálja újra a fájlt.
Invalid Control Tube
Egy vagy több tévesen elnevezett kontroll
Nyissa meg az eredeti *.ixo fájlt a LightCycler® szoftverben, és ellenőrizze a kontroll elnevezések megfelelő begépelését a mintaszerkesztőben. Módosítson az alapértelmezett nevekre, mentse és exportálja újra a fájlt.
Missing Sample Tube
Egy vagy több tévesen elnevezett mintakapilláris vagy hiányzó mintakapillárisok
Nyissa meg az eredeti *.ixo fájlt a LightCycler® szoftverben, és ellenőrizze a minta elnevezések megfelelő begépelését a mintaszerkesztőben. Módosítson az alapértelmezett nevekre, mentse és exportálja újra a fájlt.
Invalid LightCycler® SW Version
Nem megfelelő LightCycler® szoftververziót alkalmaztak az eljáráshoz
Nyissa meg a LightCycler® szoftvert és ellenőrizze, hogy megfelelő-e a verziószám.
No Manual TM Calling
Nem volt manuális TM-hívás elvégezve (nincs minta és nincs analízis modulban). A makró befejezte analízis nélkül
Nyissa meg az eredeti *.ixo fájlt a LightCycler® szoftverben, és végezzen manuális TM-hívást. Mentse és exportálja újra a fájlt.
+ additional run flags
5-nél több futtatási jelző került észlelésre
Kísérelje meg az egyes ismertetett jelzők megoldását, végezze el újra a SIS analízist.
Invalid CCC File Name
Két vagy több színkompenzáció-fájl aktív egy vagy több analízismodulban.
Válassza ki a megfelelő színkompenzáció-fájlt, és számolja újra.
Amennyiben egy vagy több minta hiányzik a SIS eredménylapon, ellenőrizze: 1) nincs-e egy minta három vizsgálati kapillárisának bármelyike tévesen elnevezve, azaz a vizsgálatspecifikus előtagok (G+, G-, F) tévedésből törölve lettek, vagy 2) nincs-e egy vagy több mintakapilláris tévesen elnevezve, vagy nincsenek-e hiányzó kapillárisok. A javításhoz nyissa meg az eredeti *.ixo fájlt a LightCycler® szoftverben, és ellenőrizze a minta elnevezések megfelelő begépelését a mintaszerkesztőben. Módosítson az alapértelmezett nevekre, mentse és exportálja újra a fájlt.
11
ELJÁRÁSSAL KAPCSOLATOS KORLÁTOZÁSOK • A vizsgálatot csak K-EDTA alvadásgátlóval gyűjtött humán vér használatára validálták. Más típusú minták vizsgálata téves, álnegatív vagy álpozitív eredménnyel járhat. • A megbízható eredmény a megfelelő mintalevételen, -transzporton, -tároláson és -feldolgozáson múlik. • A terméket csak a LightCycler® SeptiFast Test MG vizsgálat munkafolyamatára speciálisan kiképzett személy használhatja. • A LightCycler® SeptiFast Test MG vizsgálat 1000–30 000 WBC/µl tartalmú vérmintán végezhető el. • A mikroorganizmusok jelenlegi nevezéktana főleg fenotípusos osztályozáson alapul (biokémiai és fiziológiai tulajdonságok), és lehetséges, hogy nem mutat azonosságot a genetikai meghatározással. • Ritka esetekben a nagy mennyiségű Streptococcus spp. target DNS-t tartalmazó minták álnegatív eredményt adhatnak. • Bár a primerek és a próbák az internal transcribed spacer (ITS) régió nagyfokban konzervált régióhoz lettek tervezve, a H próbák targetspecifikus olvadási hőmérsékletét (TM) befolyásolhatják a mikrobafajok szekvenciáiban megtalálható véletlenszerű eltérések. NEM KLINIKAI ÉRTÉKELÉS Zavarást okozó anyagok Az alábbi anyagok nem zavarják a bakteriális és gomba DNS kimutatását ebben a vizsgálatban. 6. táblázat: Zavarást okozó anyagok Szám
Márkanév
Hatóanyag
Gyártó
1x Cmax
3x Cmax
Egység
1
Piperacillin®
Piperacillin
Hexal
4,0
12,0
mg/ml
2
Fortum®
Ceftazidim
GlaxoSmithKline
0,50
1,5
mg/ml
3
Zienam®
Imipenem/Cilastatin
MSD Sharp & Dohme
0,27
0,67
mg/ml
4
Tazobac®
Piperacillin/Tazobactam
Wyeth Pharma
0,75
2,3
mg/ml
5
Ciprobay®
Ciprofloxacin
Bayer
33,3
100,0
µg/ml
6
Vancomycin®
Vancomycin
Lilly
83,0
250,0
µg/ml
7
Refobacin®
Gentamicin
Merck
80,0
240,0
µg/ml
8
Zyvoxid®
Linezolid
Pfizer
0,10
0,30
mg/ml mg/ml
9
Sobelin®
Clindamycin
Pfizer
0,30
0,90
10
InfectoClont®
Metronidazol
Infectopharm
83,3
250,0
µg/ml
11
Diflucan®
Flukonazol
Pfizer
0,13
0,39
mg/ml
12
Cancidas®
Caspofungin
MSD Sharp & Dohme
8,3
25,0
µg/ml
13
Amphotericin B®
Amphotericin B
Bristol-Myers Squibb
20,0
60,0
µg/ml
14
Novalgin®
Metamizol
Aventis Pharma
0,83
2,5
mg/ml
15
Dexahexal®
Dexametazon
Hexal
1,3
4,0
µg/ml
16
ARA-cell®
Cytarabin
cellpharm
63,3
190,0
µg/ml
17
Arterenol®
Norepinephrin (noradrenalin)
Aventis Pharma
4,8
14,4
µg/ml
18
Aquo-Trinitrosan®
Nitroglicerin
Merck
1,3
4,0
µg/ml
19
Heparin-Natrium-5000ratiopharm®
Heparin
ratiopharm
0,83
2,5
I.U./ml
Analitikai érzékenység A LightCycler® SeptiFast Test MG analitikai érzékenységét az egyes analitokból készített hígítási sor (100, 30 és 3 CFU/ml egészséges donoroktól származó EDTA-s vérben) találati arány analízise révén elemezték (lásd 7. táblázat). 30 CFU/ml minimum érzékenységet tapasztaltak valamennyi faj esetén, kivéve a következőket: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae és Streptococcus mitis (100 CFU/ml).
12
7. táblázat: Találati arány analízissel vizsgált fajok Target
Pozitívok száma/összes vizsgálat
Target
Pozitívok száma/összes vizsgálat
Koncentráció [CFU/ml] Acinetobacter baumannii
1 2
100
30
3
8/8
12/12
11/20
Koncentráció [CFU/ml] Klebsiella pneumoniae
100
30
3
8/8
12/12
17/20 16/20
Aspergillus fumigatus
8/8
12/12
20/20
Proteus mirabilis
8/8
12/12
Candida albicans
8/8
12/12
12/20
Pseudomonas aeruginosa
8/8
12/12
5/20
Candida glabrata
8/8
12/12
10/20
Serratia marcescens
8/8
12/12
19/20
Candida krusei
8/8
12/12
8/20
Staphylococcus aureus
8/8
12/12
8/20
Candida parapsilosis
8/8
12/12
7/20
Staphylococcus epidermidis1
8/8
1/12
0/20
Candida tropicalis
8/8
12/12
9/20
Staphylococcus haemolyticus1
8/8
0/12
0/20
Enterobacter aerogenes
8/8
12/12
16/20
Stenotrophomonas maltophilia
8/8
12/12
18/20
Enterobacter cloacae
8/8
12/12
12/20
Streptococcus pneumoniae
8/8
7/12
1/20
Enterococcus faecalis
8/8
12/12
15/20
Streptococcus agalactiae2
8/8
7/12
0/20
Enterococcus faecium
8/8
12/12
17/20
Streptococcus pyogenes2
8/8
9/12
4/20
Escherichia coli
8/8
12/12
20/20
Streptococcus mitis2
8/8
9/12
0/20
Klebsiella oxytoca
8/8
12/12
14/20
Az 1. táblázat SML listáján a CoNS csoportba tartozó fajok. Az 1. táblázat SML listáján a Streptococcus spp. csoportba tartozó fajok.
Analitikai specificitás Inkluzivitás Az ITS targetrégió állandóságának és homogenitásának igazolására Európa (Dél-, Közép-, Észak-), Japán és az Egyesült Államok számos földrajzi régiójából származó klinikai izolátumot vizsgáltak. Összesen 1709 izolátumot karakterizáltak mikrobiológiai módszerekkel, és vizsgáltak a LightCycler® SeptiFast Test MG segítségével [lásd 1. táblázat SeptiFast Master List (SML)]. Az Egyesült Államokban és Japánban levett minták között nem szerepelt Aspergillus fumigatus, Candida krusei és Staphylococcus haemolyticus. A Streptococcus spp. és a koaguláz negatív Staphylococcus (CoNS) csoportokon belül a 8. táblázatban feltüntetett fajok bizonyultak pozitívnak a LightCycler® SeptiFast Test MG vizsgálat során. A Japánban levett minták között nem szerepelt Aspergillus fumigatus és Candida krusei. 8. táblázat: Rendre a Streptococcus spp. és a koaguláz negatív Staphylococcus (CoNS) csoportokba tartozó fajok, amelyek a LightCycler® SeptiFast Test MG vizsgálat során pozitívnak bizonyultak Streptococcus spp.
Koaguláz-negatív Staphylococcus (CoNS)
S. agalactiae
S. hominis subsp. novobiosepticus
S. anginosus
S. pasteuri
S. bovis
S. warneri
S. constellatus
S. cohnii subsp. urealyticum
S. cristatus
S. hominis subsp. hominis
S. gordonii
S. lugdunensis
S. intermedius
S. cohnii subsp. cohnii
S. milleri
S. capitis subsp. ureolyticus
S. mitis
S. capitis subsp. capitis
S. mutans
S. caprae
S. oralis
S. saprophyticus
S. parasanguinis
S. saprophyticus subsp. saprophyticus
S. pneumoniae
S. xylosus
S. pyogenes
S. epidermidis
S. salivarius
S. haemolyticus
S. sanguinis S. thermophilus S. vestibularis S. viridans Eltérő eredményeket az összes eredmény kevesebb, mint 1,2%-ában nyertek.
13
• • • •
143 Enterobacter (aerogenes/cloacae) törzsből 6 darab ITS régióját tekintve identikus volt Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) törzzsel, és mint Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) lett értékelve. ACitrobacter freundii és a Salmonella enterica lehetséges, hogy ITS régiójukat tekintve identikusak rendre a Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) és az E. coli fajokkal, és ezért mint Klebsiella (pneumoniae/oxytoca), illetve E. coli lesznek értékelve. 160 Streptococcus viridans törzsből 14 darab ITS régióját tekintve identikus volt Streptococcus pneumoniae törzzsel, és mint S. pneumoniae lesz értékelve. Ritka esetekben a Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) lehetséges, hogy nem kimutatható, ha egy a targetszekvencián belüli mutáció az olvadáspont eltolódását okozza.
Exkluzivitás 9. táblázat: Valamennyi vizsgált faj negatívnak bizonyult Actinobacillus actinomycetemcomitans
Corynebacterium jeikeium
Aeromonas hydrophila
Cryptococcus neoformans
Neisseria meningitidis
Bacillus cereus
Gemella haemolysans
Pantoea agglomerans
Bacteroides fragilis
Haemophilus influenzae
Peptostreptococcus magnus
Bartonella henselae
Histoplasma capsulatum
Porphyromonas gingivalis
Bordetella pertussis
Legionella pneumophila
Prevotella denticola
Borrelia burgdorferi
Listeria monocytogenes
Propionibacterium acnes
Burkholderia cepacia
Moraxella (Branhamella) catarrhalis
Proteus vulgaris
Campylobacter jejuni
Morganella morganii
Yersinia enterocolitica
Cardiobacterium hominis
Mycobacterium fortuitum
Clostridium perfringens
Mycobacterium tuberculosis
14
Mycoplasma pneumoniae
VÁSÁRLÓI INFORMÁCIÓ Ezen termék megvásárlása lehetőséget biztosít a vásárlónak humán in vitro diagnosztika keretében nukleinsav-szekvenciák amplifikációjára és kimutatására. A termék megvásárlásával e specifikus használati jogon kívül semmilyen más jogosítványra, szabadalmi jogra vagy más engedélyre nem tesz szert. HIVATKOZÁSOK 1. Kollef M, et al. Inadequate antimicrobial treatment of infections, Chest 1999, 115: 462-474. 2. Garnacho-Montero J, et al. Impact of inadequate empirical antibiotic therapy on the outcome of patients admitted to the ICU with Sepsis, Crit Care Med. 2003, 31(12): 2742-51. 3. Byl B, et al. Impact of Infectious Disease Specialists and Microbiological Data on the Appropriateness of Antimicrobial Therapy for Bacteremia, Clin Infect Dis 1999: 29: 60-66. 4. Suttorp N. “Changing populations and future trends in the management of serious infections” from: AIM website (www.infectionacademy.org). 5. Peterson LR, et al. Towards targeted prescribing: will the cure for antimicrobial resistance be specific, directed therapy through improved diagnostic testing?, J Antimicrob Chemother 2004, 53: 902-5. 6. Harbarth S, et al. Inappropriate initial antimicrobial therapy and its effect on survival in a clinical trial of immunomodulating therapy for severe sepsis, Am J Med. 2003, 115: 529-535. 7. Houang, E.T.S., et al. Significance of Genomic DNA Group Delineation in Comparative Studies of Antimicrobial Susceptibility of Acinetobacter spp. Antimicrob Agents Chemother, Apr. 2003, p. 1472-1475. 8. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395. 9. Clinical Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids, and Tissue. Approved Guideline. CLSI Document M29-A Villanova, PA:CLSI, 1997. 10. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition. 2000. 704 pp.
15
" Distributed by
Gyártva Németországban: Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ 08876 USA
Roche Diagnostics Indianapolis, IN 46256 USA (For Technical Assistance call the Roche Response Center toll-free: 1-800 526 1247)
Roche Diagnostics H7V 4A2 Laval, Quebec (For Technical Assistance call: Pour toute assistance technique, appeler le: 1-877 273 3433)
Roche Diagnostics (Schweiz) AG CH-6343 Rotkreuz
Roche Diagnostics F-38240 Meylan
Roche Diagnostics GmbH D-68298 Mannheim, Germany
Distributore in Italia: Roche Diagnostics SpA Piazza Durante 11 I-20131 Milano
Roche Diagnostics S.L. E-08006 Barcelona
Distribuidor em Portugal: Roche Farmacêutica Química, Lda P-2700 Amadora
C Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Németország, +49 621 7590
A ROCHE, a LIGHTCYCLER, az MGRADE, a MAGNALYSER, a FASTSTART, a HYBPROBE, a SEPTIFAST és az AMPERASE a Roche védjegye. A ROCHE RESPONSE CENTER a Roche szolgáltatási védjegye. Az Amphotericin B® a Bristol-Myers Squibb Company bejegyzett védjegye. Az Aquo-Trinitrosan® a Merck & Co., Inc. bejegyzett védjegye. Az ARA-cell® a cell pharma GmbH bejegyzett védjegye. Az Arterenol® az Aventis Pharma Ltd. bejegyzett védjegye. A Cancidas® az MSD Sharp & Dohme GmbH bejegyzett védjegye. A Ciprobay® a Bayer AG bejegyzett védjegye. A Dexahexal® a Hexal AG bejegyzett védjegye. A Diflucan® a Pfizer Inc. bejegyzett védjegye. A Fortum® a GlaxoSmithKline bejegyzett védjegye. A Heparin-Natrium-5000-ratiopharm® a ratiopharm International bejegyzett védjegye. Az InfectoClont® az Infectopharm GmbH bejegyzett védjegye. Az LTK-008™ a biodelta, ZTB GmbH védjegye. A MiniSpin® az Eppendorf bejegyzett védjegye. A Novalgin® az Aventis Pharma Ltd. bejegyzett védjegye. A Piperacillin® a Hexal AG bejegyzett védjegye. A Refobacin® a Merck & Co., Inc. bejegyzett védjegye. A Sobelin® a Pfizer Inc. bejegyzett védjegye. A Tazobac® a Wyeth Pharmaceuticals AG bejegyzett védjegye. A Vancomycin® a Lilly Pharma Holding GmbH bejegyzett védjegye. A Zienam® az MSD Sharp & Dohme GmbH bejegyzett védjegye. A Zyvoxid® a Pfizer Inc. bejegyzett védjegye.
© 2007, Roche Molecular Systems, Inc. Minden jog fenntartva. 2/2007
(04623886001-02ENGL) 04822617001-02
16
