LAPORAN AKHIR PENELITIAN
Aktivitas AHa Terpineol Sebagai Kandidat Antikanker Pada Cell
Line MCF-T dan T47D: SitotoksiSitas, Kambatan Proliferasi dan Pacuan Apoptosis
Tang�?;al
\S30
No. Joduk : No. Klass :
Nama Penyusun Lapo nrn-: _ ._ .... Puguh lndrasetiawan, S.Farm., M.Sc., Apt. Rasuane Noor, S.Si., M.Sc. Damiana Sapta C., S.Si.
Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada
2012
•
t
-
\]"\f\\J---
-
------- -
LAPORAN AKHIR
Aktivitas Alfa Terpineol Sebagai Kandidat Antikanker Pada- Cell Line MC-F--7 dan- T4-7D-: Sit�toksisitas, Bambatan Proliferasi dan Pacuan Apoptosis
disusun oleh
Puguh lndrasetiawan, S.Farm., M.Sc., Apt. Rasuane Noor, S.Si., M.Sc. Damiana Sapta C., S.Si.
Tanggal
14 Februari 2012
Mengetahui, Ketua Program Studi Ilmu Kedokteran Dasar dan Biomedis Fakultas
Universitas Gadjah Mada
ii
•
-
KATAPENGANTAR
Puji syukur tim penulis panjatkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa yang telah melimpahkan Rahmat dan Karunia-Nya sehingga laporan dengan judul .. Aktivitas Alfa Terpineol Sebagai Kandidat Antikanker Pada
Cell Line MCF-7
dan T47D: Sitotoksisitas, Hambatan Proliferasi dan Pacuan Apoptosis" dapat diselesaikan. Dengan selesainya laporan ini tidak terlepas dari bantuan semua pihak, baik
secara
langsung maupun tidak langsung. Pada kesempatan ini, tim penulis
juga mengucapkan terima kasih kepada: 1. Prof. Dr. Mustofa, Apt., M.Kes. selaku Ketua Program Studi llmu Kedokteran
Dasar
dan
Biomedis
Program
Pascasarjana
Fak:ultas
Kedokteran UGM atas kesempatan yang diberikan kepada tim penulis sebagai pembimbing yang telah meluangkan waktunya dan memberikan banyak masukan guna lebih sempurnanya penulisan laporan ini. 2.
Dr. Med., dr. Indwiani Astuti yang telah meluangkan waktu, pikiran dan tenaganya dalam rangka membantu tim penulis menyelesaikan laporannya.
3. Prof. dr. Sofia Mubarika, M.Med.Sc., Ph.D. yang telah meluangkan waktunya dan memberikan banyak masukan guna lebih sempumanya penulisan laporan ini. 4. Dr. dr. Ety Nurwening Sholikhah, M.Kes. yang telah memberikan bantuan dan masukan kepada tim penulis dalam rangka tercapainya laporan ini.
iii
5. Litbangkes
lewat
program
HK.03.05/11393/2011
yang
hibah telah
Risbin
lptekdok
memberikan
2011
nomor
kesempatan pagi
tim
penulis untuk mengikuti program tersebut dan pendanaannya. 6. Prof. Ir. Arief Budiman, M.S., D.Eng.
dari
Fakultas Teknik Jurusan
Teknik Kimia yang telah menyumbangkan senyawa alfa terpineol dan memberikan masukan dan bantuan kepada tim penulis selama proses penulisan tesis.
7. Juanna N ursanthi dan Rurnbiwati dan segenap staf bagian Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada atas bantuannya selama penelitian dan s uasana laboratoriumnya yang hangat dan menyenangkan. 8.
Luthfi Rusyadi, SKM., M.Hum.Kes., M.Sc. dan dr. Maya Esther Wullur Moningka, M.Sc. dimana tim penulis berbagi suka dan duka bersama selama penelitian.
9.
Didik Setiawan, M.Sc., Apt. dan dr. Hajid Rahmadianto selaku rekan sejawat tempat berbagi ilmu dan berdiskusi selama proses penelitian dan penulisan laporan.
10. lbu Masri ani atas bantuannya memecahkan hal yang tidak pemah tim penulis pikirkan sebelumnya pada masa awal penulisan proposallaporan. 11. Segenap Dosen dan Staf Prodi IKD dan Biomedis Program Pascasarjana FK UGM yang telah memberikan ilmu pengetahuan dan bimbingannya kepada tim penulis. Yogyakarta, Februari 2012 Tim Penulis
iv
•
t
INTISARI Latar Belakaog: Kanker payudara merupakan kanker dengan insidensi yang tertinggi untuk wanita di seluruh dunia termasuk Indonesia. Terapi obat-obatan sintetik yang'beredar·- sebagai first choice memberikan·banyak"efek·sam ping ·yang tidak baik untuk: tubuh. Alfa terpineol
merupakan altematif senyawa dari alam
yang berpotensi sebagai agen antikanker berdasarkan penelitian sebelumnya pada banyak ·kultur-·sel-· kanker dan ·belurn- pemah dilakukan· penelitian-·pad a- kultur- sel MCF-7 dan T47D yang merupakan perwakilan dari kanker payudara.
Tujuao Peoelitiao: Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi dari alfa terpineel-· pada-·ranah-·sitotoks-isitas, - hambatan · proliferasi- - dan ·- pacuan - apeptosis
pada sel MCF-7 dan T47D. Metode Peoelitian: Jenis penelitian ini adalah eksperimental semu dengan post
·test-with'contro/:group'design. Aktivitas·sitotoksik ·dari- alfa-terpineol,ditentukan dengan uji MIT assay. dimana nilai ICso digunakan sebagai parameter sitotoksisitas. Kematian set diamati dengan metode uji pengecatan ganda menggunakan- - etidium- ·bromida- - akridin- orange- dan- .Anntmin V. ·E fek antiproliferasi dari alfa terpineol ditentukan dengan metodejlowcytometry. Basil: Senyawa alfa terpineol mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap sel T47D
dan ·MCF7,dengancnilai,ICso'Sebesar-yaitu-masing-masing-·B-5:JiM 'dan-76;79'Jl.M�
Senyawa alfa terpineol dengan pengamatan pewamaan fluorokrom etidium bromida dan acridine orange menginduksi apoptosis pada sel T47D dan MCF7. akan--tetapi-·dengan · pengujian ·rnetode- ane;,Un- V jumlah -·sel,·hidup-·lebih-·banyak dibandingkan yang apoptosis. Senyawa alfa terpineol berpengaruh pada siklus sel ada cenderung terjadinya akumulasi pada fase GO/G I terhadap sel sel T47D. ·Kesimpulaw. Alfa--terpineol-·memiliki- potensi- untuk ditelitHebih-· dalarn- sebagai· kandidat antikanker antiproliferasi .
karena
memiliki
efek
sitotoksik.
proapoptosis
Kata kunci: Alfa terpineol; MCF-7; T47D; Sitotoksisitas: Efek antiproliferasi; efek proapoptosis
v
•
t
dan
C. LEMBAR DATA PERSONILPENELITI 1. Peneliti Utama
Nama
Gelar
PUGUH'INDRASETIAWAN
Tempat Lahir
METRO
\ 15 JANUARJ 1987 Taoggal Lahir
Jabatan
S.Farm., M�Sc., Apt Kelamin
LAKJ-LAKI GoIongan
MAHASISWA PASCASARJANA
-
Bagian I Divisi -
Institusi Asal
UNIVERSITAS GADJAH MADA Telepon
Faksimile
(0274) 631185
(0274)631185
Alamat Korespondensi Pos
JALAN FARMAKO, SEKIP UTARA. YOGY AKARTA 55281 Alamat e-mail
[email protected] T-elepoa Rumalt-
Telepoo' Geaggam
(HP) 08562850683
-
Kualifikasi Akademik Tahun
Institusi
Gelar
2008
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS GADJAHMADA
SARJANA FARMASI
Taboo
Institusi
Gelar
2009
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS GADJAHMADA
APOTEKER
Tahun
Institusi
Gelar
2011
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS GADJAHMADA
MASTER OF
vi
•
t
SCIENCE
2. Peneliti 1
Nama
Gelar
RASUANE NOOR
S.Si., M.Sc.
I ;:����J�r-1982
Tempat:l.-abirSUKANANTI
Jabatan
-KelaminLAKI-LAKI
Golongao
-
MAHASI&WA-PASCASARJANA
Bagian I Divisi
-
lnmtosi matUNIVERSITAS GADJAH MADA
(0274)'6Jngs Telepon
.(0274)•6J1'Ig5 Faksimile
Alamat Korespondensi Pos JALAN'FARMAKo;-SEKIP'UTARA,
YOGYAKARTAJ'S-28-l
Alamat e-mail
[email protected] ·Telepon Rumab
Telepon Genggam
-
(BP)
081540951682
Kualifikasi Akademik Taboo
Institusi
Gelar
2006
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS
SA.RJANA SAINS
..
LAMPUNG JURUSAN BIOLOGI
2011
Tabun
Institusi
Gelar
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS GADJAH MADA
MASTER OF
vii
•
t
SCIENCE
3. Peneliti 2 Nama
�-
DAMIANA SAPTA CANORASARI �mpat-- I.abir-
Yokyakarta
Gelar
S.Si
-Tanggal' L-abir-
·Kelamin-
23-09-2-1986
PEREMPUAN
Jabatan
Golongan
MAHASIS-WA-FASCASARJANA
-
Bagian I Divisi
BIOLOGI MOLEKULER UGM ·Institusi itsa-1·
UNIVERSITAS GADJAH MADA Telepon
Faksimile
(0274)--6311�5
-(0274!63TI�5 Alamat Korespondensi Pos
JALAN'FARMAKO;"SEKIP'UTARA,
YOOYAKARTA-55--281-
Alamat e-mail damiana.candrasari(a)1m1ail.com Telepon Rumah
Telepon Genggam
(HP)
081578061531
Kualifikasi Akademik
2009
Tabun
Institusi
Gelar
FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS GADJAH MADA
S.Si
viii
•
t
DAFTARISI
HALAMAN JUDUL ............................................................... . HALAMAN PENGESAHAN . . .. . . . . . . .. . . .. . .. . .. . . . . . .. . . . .. . .. . . . . .. .. . . ......
ii
KATA PENGANTA R . . . . . . . . . . . . . . ..................................................
iii
INTISARI .............................................................................
v
DAFfAR ANGGOTA TIM PENELITI........................................................
vi
DAFfAR lSI . . .. .. .. .. . . . . . .. .. . .. . .. .. . .. . . .. . . . .. .. . . . .. .. . .. . . .. . .. . .. .. .. .. . .. . . .
ix
DAFfAR GAMBAR . ..... .... ... .... . .... ...... ..... .. . ... .. ...... .......... ......
xi
DAFfAR TABEL . . . . . . . . .. . . . . .. . . .. .. . .. . . . . .. . .. . . . . .. . . . . .. . . . . .. . ... . .. . .. . .....
xiii
DAFfAR LA.MPIRAN . . .. . .. . . . . .. .. . .... . .. .. .. . .. .. .. .. . ... . . .. ... . . .. .. . . . . . . . .
xiv
A. Latar Belakang . . . . ........................ . ........ ........................................ . B. Tujuan Riset .................... ............... ...........................................
4
C. Manfaat Riset .. .. . . .. .. . .. . .. . . .. .. . .. .. .. .. . .. . . . .. .. . . . .................................
4
D. Metode Riset .............................................................................................
5
I.
Jenis dan Rancangan Riset . . . . . ... .. . ....... .. .. . . .. . .. .... ........
5
ll.
Bahan dan Alat . .. .. . .. .. . ...... . . . .. .. .. .. .... . . . . .. . .. .. .. .........
5
III. Jalannya Riset . . ...... ... .............. .... . . . ...... .............. ...
7
N. V ariabel Penelitian .. .. .. .. .. . . . .. . . ... . . . .. .. . . . .. .. . . . . .... . .....
13
In. Analisis Data ......................... . . .......................... ....
13
E. Hasil Riset .................................................................................................
14
F. Pembahasan................................................................................................
25
G. Kesimpulan ............................................................................. ...................
30
IX
•
H . Saran..........................................................................................................
31
Daftar Pustaka........... ... . ........ .... ..... ...... ...... . .... ... . .... . . . . . . .
32
Lampiran..... ..... .. . .. .... .. ... . . . . .. . .. . .. . .. . . . . . . .... .. . . . .... . . . . . . .. . . . . . . . . . . ...
35
.
.
.
.
.
X
•
t
.
.
.
.
.
DAFTAR GAMBAR
Gambar l. Skema Pengisian Mikrok:ultur untuk uji Sitotoksik:..................
9
Gambar 2. Skema Pengisian Mikrokultur untuk uji Apoptosis..................
10
Gambar 3. Gambaran sel kanker payudara (a) MCF7
dan
(b) T47D
yang hidup confluent pada dasar sumuran sel hidup ditunjukan panah warna hitam sel mati ditunjukan panah warna merah. diamati dibawah mikroskop inverted dengan perbe saran l OOx.. ........
.......... ...........
..
.....•••..•.•••.......•••.•.•.••••...••
15
Gam bar 4. Kristal formazan yang terbentuk setelah pemberian reagen yellow MTT
dengan
dan diink:ubasi selama 24 jam. Sel diamati
mikroskop
inverted
dengan
perbesaran
100
kali.............................................................................................
16
Gambar 5. Proses reduksi reagen MIT ((3-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5difeniltetrazolium bromida) menjadi kristal formazan oleh enzim mitokondrial reduktase yang ada pada sel yang hidup (Brescia & Banks, 2009)....... . .. .. .. .... .. .. .. .. .. .. . . . . .. . .. .. .....
16
Gambar 6. Graflk rerata persentase penghambatan senyawa uji pada se) kanker T47D sesudah inkubasi 24 jam dengan menggunakan metode MIT ass�................................................................
19
Gambar 7. Graflk rerata persentase penghambatan senyawa uji pada sel kanker MCF7 sesudah inkubasi 24 jam dengan menggunakan metode MIT ass�............................................... . .. . . . . ..... ... .
xi
•
t
19
Gambar
8.
Hasil uji apoptosis terhadap set
MCF7 (a
dan b) dan T47D (c
dan d) setetah inkubasi setama 24 jam dengan larutan alfa terpineol (b dan d) dan kontrot (a dan c). Set hidup ditunjukan panah warna hitam dan set yang mengatami apoptosis ditunjukan panah warna merah. Pengamatan pada mikroskop fluoresensi dengan perbesaran 1 OOx................. ..... Gambar
9. Graflk rerata distribusi
fase siklus set
T47D
21
setelah di beri
perlakuan a-terpineol sesudah inkubasi 24 jam dianalisis dengan menggunakanjlowcytometry....................................... GambarlO. Ilustrasi
pembacaan
profil
siklus
sel
dengan
metode
jlowcytometry............................................................................
xii
•
24
30
DAFfAR TABEL
Tabel 1.
Rerata persentase penghambatan pertumbuhan seJ kanker T47D seteJah perlakuan
dengan senyawa uji selama 24 jam
menggunakan metode MIT assay.............................. ....... .... Tabel2.
17
Nilai rata-rata presentase penghambatan sel T47D dan nilai IC50 dari senyawa alfa terpineol dan doksorubisin pada sel T47D setelah diuji dengan metode MIT assay ..................
Tabel 3.
18
Rerata persentase sel hidup dan mati pada set kanker T47D
setelah perlakuan dengan alfa terpineol selama 24 jam dengan pengamatan flowcytometry dengan menggunkan reagen anexin V.. .. . ... .. .. .. .. .. .. . .. .. .. .. .. . ... .. . . .. .. . .. .. . .. ... .
Tabel 4.
22
Rerata persentase sel hidup dan mati pada sel kanker MCF7 setelah perlakuan dengan alfa terpineol selama 24 jam dengan pengamatan flowcytometry dengan menggunakan re agen annexin V....
................. ................. ......................... . . ..
.
Tabel 5.
.
Rerata distribusi fase sikJus sel setelah
perlakuan
dengan
alfa
22
T47D setelah perlakuan terpineol
selama
24
Jam................................................. ..... ........... ...........
XIII
t
23
DAFfAR LAMPIRAN Lampiran
1
Persentase
penghambatan
pertumbuhan
set
kanker
payudara T47D setelah pemberian bahan uji dengan masa inkubasi
24
jam
menggunakan
metode
MIT
assay.............................................................................. Lampiran 2
Persentase
penghambatan
pertumbuhan
sel
35
kanker
payudara MC7 setelah pemberian bahan uji dengan masa inkubasi 24 jam menggunakan metode MIT assay . . ... . . ...
XIV
•
t
36
A. Latar Belakang
Kanker masib merupakan masalah kesehatan utama di dunia, baik negara maju maupun negara berkembang. WHO dan Bank Dunia pada tahun 2005 memperkirakan setiap tahun, 12 juta orang di seluruh dunia menderita kank:er dan 7,6 juta di antaranya meninggal dunia. Jika tidak dikendalikan, diperkirakan 26 juta orang akan menderita kanker dan I7 juta meninggal karena kanker pada tahun 2030. Kejadian ini akan terjadi lebih cepat di negara miskin dan berkernbang (International Union Against Cancer IUICC, 2009). Pada tahun 2009 di Amerika Serikat, dilaporkan 1,479,350 terdiagnosa menderita kank:er dan 562.340 orang meninggal karenanya (Jamal, 2009). Di Indonesia Kank:er merupakan penyebab kematian utama disamping penyakit kardiovaskular dan penyakit kerena infeksi serta merupakan penyebab kematian nomor tujuh (5,7%) setelab stroke, TB, hipertensi, cedera, perinatal, dan DM. Jumlah penderita kanker di indonesia terus bertambah dengan prevalensi 4,3 per I 000 penduduk. Kasus kanker paling banyak di indonesia adalah kanker payudara, kank:er Ieber rahim/servik, kulit dan paru (Depkes, 2009). Data pasien kanker rawat inap di rumah sakit sejak tahun 2004 hingga 2008, kanker payudara menempati urutan pertama, kemudian kanker servik dan kanker bati (Depkes RI, 2009). Berdasarkan data Sistem Informasi Rumah Sakit (SIRS) tahun 2007 pada pasien kanker, kanker payudara menempati urutan pertama pada pasien rawat inap di seluruh RS di Indonesia (16,85%), djsusul kanker leher rahim (J 1, 78%). Kanker tertinggi yang diderita wanita Indonesia adalah kanker payudara dengan angka kejadian 26 per 100.000 perempuan, disusul kanker Ieber rahim dengan 16 per I 00.000 perempuan. Tingginya insiden dan mortalitas penderita kanker saat ini salah satunya disebabkan tingkat keberhasilan dalam pengobatannya relatif rendah, meskipun berbagai metode penyembuhan dapat dilakukan meliputi pembedahan, penyinaran, imunoterapi, dan kemoterapi. Dari masing metode yang telah dilakukan memiHki kelemahan masing-masing sehingga angka keberhasilannya 1
•
t
masih rendah (Hoffinan, 1999). Sehingga perlu di upaya pengentasan kanker secara optimal dengan menghambat dan mematikan pertimbuan kanker secara selektif serta tanpa menimbulkan efek samping (Goldie, 2001). Berbagai strategi telah dilak:ukan dalam penemuan antikanker salah satunya yaitu mengisolasi senyawa aktif dari bahan alam. Indonesia yang merupakan negara terkaya kedua di dunia memiliki biodeversitas hayati melirnpah dan terdiri 137,1 hektar berupa kawasan hutan, sehingga terus diekplorasi dalam menemukan senyawa-senyawa alam (Arfita & Budiman, 2010, Budiman, 2010). Salah satu senyawa alam yang saat ini banyak diteliti dan dikembangkan ada1ah golongan terpenoid, karena adanya efek antikanker terpenoid terhadap sel kanker (Zhou, 2005). Salah satu golongan terpenoid yang didapat dari bahan alam adalah Terpineol (Anon� 1989). Terpineol dapat dihasilkan dari berbagai tanaman seperti kayu putih
(Me/a/euca leucadendra), pinus (Pinus sp.) dan jeruk nipis (Citrus aurantifo/ia)
dari alfa pinen yang diambil dari
(Anonim, 1989). Terpineol dapat disintesis
ekstrak getah pohon Pinus merlcusii (Roman-Aguirre, et a/. 2005). Sintesis alfa terpineol dari Pinus merkusii yang tumbuh di Indonesia berhasil dilakukan oleh Budiman (2010). Senyawa alfa terpineol dilaporkan sebagai senyawa alam yang berpotensi sebagai antikanker,
yang
terbukti
dengan
menghambat pertumbuhan
dan
menginduksi kematian sel tumor melalui mekanisme yang melibatkan inhibisi aktivitas NF-kB (Hassan et a/. 2010). berperan
dalam
regulasi
NF-kB merupakan
pada ekspresi gen
untuk
faktor transkripsi yang apoptosis,
replikasi,
tumorigenesis, imflamasi dan penyakit autoimun. NF-kB dapat terstimulasi dengan adanya gr owth faktor, cytokine, lymphokine, radiasi, pharmac ol ogic
agent, and stres (Kumar eta/., 2005). Abnormalitas sel kanker terjadi perubahan yang mendasar pada sel yang berproliferasi melebihi batas pertumbuhan normal dan tidak terkendali. Hal tersebut
akibat
angiogensis
dan
adanya
gangguan
penekanan
regulasi
apoptosis
dalam
siklus
(Berterman
&
sel, peningkatan Macleod,
2000).
2
•
t
..
Tumorigenesis adaJah proses multistep sebagai basil gangguan jalur-jalur penting sel, seperti apoptosis, sildus set dan perbaikan kerusakan DNA (Hanahan & Weinber, 2000). Sel MCF-7 merupakan salah satu model sel kanker payudara yang banyak digunakan dalam penelitian. Set MCF-7 memiliki karakteristik antara lain resisten agen kemoterapi mengekspresikan reseptor estrogen (ER +), overekspresi Bcl-2 dan tidak mengekspresikan caspase-3. Sel MCF-7 mengekspresikan reseptor estrogen alfa (ER-a), resisten terhadap doxorubisin (Zampieri eta/., 2002; Onuk:i eta/., 2003; Prunet eta/., 2005).
Se1 kanker payudara T47D mengekspresikan protein p53 yang termutasi. Missence mutation teljadi pada residu 194 (dalam zinc-binding domain, L2),
sehingga p53 tidak dapat berikatan dengan response element pada DNA. Hal ini mengakibatkan berkurang bahkan hilangnya kemampuan p53 untuk regulasi sik1us sel. Sel T47D merupakan sel kanker payudara ER!PR-positif(Schafer eta/. , 2000). Induksi estrogen eksogen mengakibatkan peningkatan proliferasinya (Verma et al., 1998). Sel T47D merupakan sel yang sensitif terhadap doksorubisin (Zampieri eta/., 2002). Apoptosis merupakan kematian sel-sel tunggal, suatu bentuk kematian seJ yang telah dirancang bangun untuk mengeliminasi sel-sel inang yang tidak dikehendaki, mela1ui aktivasi seri kejadian suatu set produk gen yang bertanggung jawab, yang terkoordinasi dan terprogram secara internal Pada dasarnya apoptosis dianggap bertanggung jawab untuk proses fisiologik dan patoJogik. Dalam proses patologik, apoptosis mempunyai peran yang besar pada kematian sel tumor(Hanahan & Weinber, 2000). Gambaran spesifik apoptosis adalah hidrolisis yang melibatkan beberapa anggota keluarga proteinase sistein yaitu caspase. Aktivasi apoptosis baik jalur ekstrinsik maupun jalur intrinsik akan berujung pada aktivasi caspase-3 sebagai caspase eksekutor. Apabila caspase-3 telah teraktivasi terjadi determinasi tak terhindarkannya kematian set (commit to suicide), akan terjadi apoptosis (Reed, 2000).
3
•
Banyak metode terapi baru dikembangkan dengan tujuan menstimulasi apoptosis pada sel kanker (Reed, 2002) ditujukan untuk memicu apoptosis dengan mengaktivasi kaskade apoptosis. Namun pada sel-sel kanker, dengan be:rbagai mutasi yang tetjadi, dapat menghindari kaskade apoptosis ini. Gagalnya regulasi siklus sel pada sel kanker menyebabkan pertumbuhan sel yang tidak terkendali (Kumar eta/., 2005).
Senyawa alfa terpineol yang disentesis dari tanaman Pinus merkusii asli Indonesia belum pernah dikaji aktivitasnya pada sel
MCF-7 dan T47-D. Sel
MCF-7 dan T47-D merupakan representasi dari kanker payudara dengan reseptor estrogen positif dan negatif. Riset ini dilakukan untuk mengkaji efek antikanker dari terpineol pada sel
MCF-7 dan T47-D dengan melihat sitotoksisitas,
hambatan proliferasi dan pacuan apoptosis.
Kajian hambatan proliferasi
dilakukan dengan melihat profil siklus sel.
B.
Tujuan Riset
Tujuan umum I.
Mengkaji aktivitas alfa terpineol terhadap Cell Line MCF-7 dan T47D.
Tujuan khusus
1. ·Mengkaj i aktivitas sitotoksik alfa terpineol· terhadap Celt- Line MCF-7 dan T47D. 2:
Mengkaji penganih alfa terpineol terhadap proses apoptosis Cell Line MCF-7 atau T470.
-3�
·Mengkaji· pengaruh alfa terpineol terhadap siklus sel Cell Line -MCF.:t atau T47D.
C.
Manfaat Riset
I. Mengembangkan senyawa alam sebagai obat baru untuk terapi kanker payudara.
4
•
I
2.
Memberikan
informasi
berupa
data
pendahuluan
mengenai
aktivitas
sitotoksik dan apoptosis senyawa alfa terpineol dan pengaruhnya terhadap siklus sel pada
3.
Cell Line MCF-7 atau T47D.
Memberikan dasar infonnasi ilmiah mengenai mekanisme kerja. antikanker senyawa
alfa terpineol dan mengkaji lebih lanjut titik: tangkap intraseluJer
yang menimbuJkan efek antikanker.
D. Metode Riset
I.
Jenis dan Rancangan Riset
Riset ini merupakan riset eksperimen kuasi dengan mengunakan rancangan percobaan
post test with control group design untuk melihat aktivitas alfa
terpineol pada kultur set T47D dan MCF-7
dengan menguji
sitotoksisitas,
pengaruhnya pada siklus set dan apoptosis. II.
Bahan dan Alat
1.
Bahan reset
a. Alfa terpineol
51% yang diperoleh dari koleksi Prof. Ir. Arief Budiman, M.S.,
D.Eng, Fakultas Teknik Jurusan Teknik Kimia, Universitas Gadjah Mada b. Sebagai pembanding Alfa terpineol sintetik: dari pasaran (Nacalai®) c.
Kultur sel kanker payudara T47D dan MCF-7 diperoleh
dari
Fakultas
Kedokteran Universitas Gadjah Mada. d.
Doxorubicin "EBEWE" (Ebedoxo, Ebewe Pharma)
e.
Kultur Sel : serbuk media RPMJ
1640 (Gibco®), Fetal bovine serum (FBS)
I 0% (Gibco®), Amfoterisin B (Gibco®), Penisilin Gibe®), Tripsin EDTA
+ Streptomisin
(Penstrep;
0,25% (Gibco®), kertas saring 0,2 JU1l (Whatman®),
4-(2-hydrocyethy/)-piperazine-ethane) sulphonic acid (HEPES) (Sigma Aldrich®), Natrium bikarbonat (Nacalai Tesque),
Phosphate Buffer Saline
(PBS) (Invitrogen®) . f.
Uji aktivitas sitotoksik: medium komplit (media RPMl +
Amfoterisin
0,5%
+
FBS
10%), pereaksi yellow MTT ((3-(4,5-
5
•
1640 + Penstrep 2%
I
dimetilthiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium
bromida)
(Bio
Basic
Inc.®),
Sodium Dodesil Sulfat (SDS) (Merck®)), Asam Klorida (Merck®) g.
Uji pengecatan ganda untuk pengamatan apoptosis: Etidium bromida (Promega Corp.), Akridin Orange (Sigma-Aldrich®), medium komplit (media RPMI 1640 + Penstrep 2%
+ Amfoterisin
0,5% + FBS 10%), pereaksi
yellow MIT ((3-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium bromida) (Bio Basic Inc.®), Sodium Dodesil Sulfat (SDS) (Merck®)). h. Uji aktivitas siklus sel :
Phosphat Buffer Saline (PBS) l x (Invitrogen®),
Media komplit (media RPMI 1640
pereaksi
10%),
yellow
+ Penstrep 2% + Amfoterisin MIT
0,5%
+ FBS
((3-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-
difeniltetrazolium bromida) (Bio Basic Inc.®), Sodium Dodesil Sulfat (SDS) (Merck®)), Tripsin-EDTA 0,25% (Gibco®), Propidium Iodida Dickinson®), Rnase,
mix (Becton
Propidium iodide, Triton-X, PBS, fenol, isopropanol,
NaOH, HCL, dan Spritus.
2.
Alat Reset
a.
Uji
aktivitas
sitotoksik
dan
uji
apoptosis
:
tangki
nitrogen
cair
(BioCane™ 47), Penangas air, lnkubator C� (Heraeus HERAcell), lemari
laminar airflow (Labconco Purifier Class 11 Biosafety Cabinet),
lemari es pendingin (National NR-B22AF Deodonizer), plat mikrokultur 96 sumuran (SPL®), (TCF)
75
2 cm
Beaker glass 1 L (Pyrex®), tissue culture flask
(Iwaki®),
screw-capp ed conical tube (Becton
Dickinson®), botol kaca steril 250 mL (Schott-Duran®), Mikropipet 10, 20, 200,
1 000 �(Gilson®), inverted microscope (Olympus CKX41 dan
Carl Zeiss Axiovert 25C), hemositometer (Assistant Germany), gelas objek (Sail Brand®), penyampur (Thermolyne Maxi Mix II), mikroskop cahaya (Nikon YSlOO), cover slip (NUNC®), tip kuning, putih dan biru. b.
Uji aktivitas siklus sel
�
plat 6 sumuran (SPL®), Mikropipet 10, 20, 200,
1000 �(Gilson®), Tabung sentrifuga 1,5 ml (Eppendorf®), Rak tabung kecil,
Sentrifugator (Eppendorf Centrifuge 5415D), Inkubator C02
6
t
(Heraceus
HERAcell),
Penangas
air,
FACS-Calibur
(Becton-
Dickinson®), penyampur (ThermolyneMaxi Mix II). m.
Jalannya
riset
Penelitian ini akan dilaksanakan melewati tahapan sebagai berikut :
I . Alfa terpineol dengan konsentrasi 51% (3,309 M) diambil sebanyak 3,02J.1L. Setelah itu ditambahkan medium komplit (MK) sampai volume l mL (larutan stok). 500 J,1M merupakan konsentrasi tertinggi yang digunakan untuk uji sitotoksisitas. Sedangkan konsentrasi lainnya lebih rendah dari 500 t.tM yaitu 450 ; 400 ; 350; 300; 250; 200; 150; 100 dan 50 j.t.M. Sepuluh konsentrasi ini
digunakan pada uji sitotoksisitas (MIT assay) untuk mendapatkan nilai IC50• 2. Uji sitotoksik dengan terpineol pada sel T4 7D danMCF-7 dengan MTT assay a.
Pembuatan media RPMI 1640
Serbuk media RPMI 1640 dil arutan dalam aquabides 800 ml dalam labu Erlenmeyer 1 L, ditambah dengan natrium bikarbonat 2 g dan HEPES 2 g, ditambahkan akuabides sampai 1L, diaduk dengan magnetic stirer. Larutan dibuat dengan pH antara 7,2-7,4 dengan menambahkan 1M NaOH atau atau 1 M HCl. Larutan dimasukan ke dalam botol tertutup dan steril dengan
disaring menggunakan filter 0,2 1.1m dalam laminar aiiflow. Medium diberi label dan disimpan dalam lemari es suhu 4° C. Untuk membuat media RPMI 1640, disiapkan sebanyak 100 ml media RPMI1640 komplit yang berisi FBS
1 0%, penisilin-streptomisin 2% dan fungison 0,5%. b. Pengaktifan sel T47D dan MCF-7 Sel diambil dari tangki nitrogen cair, lalu dicairkan dalam waterbath pada suhu 3r C sampai mencair, kemudian disemprot alkohol 80%. Proses setelahnya dilakukan di dalam LAF (Laminar Air Flow). Sel dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi yang berisi 1 0 ml medium RPMJ 1640 dan di sentrifugasi dengan kecepatan 1200 rpm selama lima menit. Supernatan dibuang, endapan yang terbentuk ditambah dengan 1 mL media komplit (MK). Suspensi sel dimasukan dalam TCF dengan media penumbuh yang
7
•
mengandung FBS 20% dan sel diamati dibawah inverted microscope. TCF yang berisi sel diinkubasi dalam inkubator C02 5 % pada suhu 3f> C dan dengan tutup yang dilonggarkan. c. Pembiakan sel T47D dan MCF-7 Sel diamati setiap hari dengan inverted microscope dan media penumbuh diganti setiap hari. Apabila pertumbuhan sel telah berwarna kuning dan sel telah memenuhijlask, selanjutnya sel didistribusikan ke dalam beberapa TCF. Dalam laminar airflow, media lama dibuang dan sel yang melekat di semprot pelan-pelan dengan media baru. Suspensi sel yang didapat dimasukan ke dalam beberapajlask, disirnpan dalam inkubator C02 5 % pada suhu 3t>C dengan tutup flask dilonggarkan. d. Panen sel T47D dan MCF-7 Diamati kondisi sel, panen dilakukan pada
saat
sel sudah mencapai 80%
konfluen. Media komplit lama dibuang menggunakan pipet Pasteur. Kultur sel lalu dicuci satu sampai dua kali menggunakan 5 mL PBS lx, setelah itu ditambahkan 400 J1L tripsin EDTA 0,25% secara merata, lalu diinkubasi di dalam inkubator C02 selama kurang lebih tiga menit. Ditambahkan 5 mL MK untuk menginaktfkan tripsin EDTA 0,25% yang sebelurnnya ditambahkan. Dilakukan resuspensi sel dengan pipet agar sel terlepas (tidak menggerombol). Diamati dengan seksama keadaan sel dengan bantuan mikroskop, dilakukan resuspensi ulang bila terdapat sel yang rnasih menggerombol. Dihitung jumlah sel pada empat bidang pandang hemositometer, lalu sel dipindah pada conical tube. Jumlah sel yang akan digunakan disesuaikan dengan kebutuhan: i. Uji sitotoksisitas (MTT assay)= 10.000 sel I mL 11.
iii.
Uji pengecatan ganda (apoptosis)
=
50.000 sel I mL
Ujijlowcytometry (siklus sel) = 500.000- 1.000.000 sel I mL
e. Preparasi bahan uji
Alfa terpineol diencerkan dengan media kompJit sehingga diperoJeh konsentrasi 500 ; 450 ; 400 ; 350 ; 300 ; 250 ; 200 ; 150 ; I 00 dan 50 JiM. f.
Uji sitotoksik dengan
M1T assay
Uji sitotoksik dilakukan dengan menggunakan mikrokultur 96 sumuran. Jum1ah_ sumu.nm. dibagi menjadi. 8 baris.-(A� B�C.D,E,F,G�H). Tiap. barjs -
.
terdapat 12 sumuran (no, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12).skema pengisian - mikmkultw: dapatdilihat pada gambar. L I
2
3
4
5
6
7
8
9
10
A
T
T
p
p
D
D
s
s
M
M
B
T
T
p
p
D
D
s
s
M
M
c
T
T
p
p
D
D
s
s
M
M
D
T
T
p
p
D
D
s
s
M
M
E
T
T
p
p
D
D
s
s
M
M
F
T
T
P
p
0-
D·
s
·s
M
M
G
T
T
p
p
D
D
s
s
M
M
H
T
T
p
p
D
D
s
s
M
M
·
·
11
12
Gambar 1. Skema pengisian mikrokultur untuk uji sitotoksik - Keterangan': T ; media + MCF-7 I T47-D +senyawa alfa terpineol dari ekstrak Pinus merkusii -p ; media�+ ·MCF-7-/ T47-l)=+--senyawa- alfa-terpineohintetik dari-Nacalai® S ; media + MCF-7 I T47-D (kontrol set) M;media Masing-masing sumuran pada microplate diisi suspensi sel MCF-7 dan T47-D sebanyak 1
X
104 set yang terlalut pada media kultur {RPMI) 1640. Sel
kemudian diinkubasi (starvasi) 24 jam di dalam inkubator C02 5% pada :suhu 37°C. Setelah inkubasi, media setiap sumuran dibuang, lalu diganti dnegan media baru yang mengandung FBS 10% dan diberi perlakuan sesuai dengan skema pada gambar 1. Mik:rokultur tersebut kemudian diinkubasi kembali selma 24 jam dalam inkubator C02 5% pada suhu 3rc. Setelah itu media dibuang, lalu setiap sumuran ditambah dengan 100).11 sodium dodecyl sulfate (SDS) J 0% dalam HCL 0,01% kemudian microplate digoyang pada suhu kamar selama 5 menit, lalu di bungkus dnegan alumonium foil, dan diinkubasi
9
•
t
pada suhu kamar selama semalam. Mikrop/ate tersebut kemudian dibaca absorbansinya mengunakan
ELISA reader pada panjang gelombang 595nm.
Persentase viabilitas sel di peroleh dengan rumus : a.bsorbansi sel sampel- absorbansi kontrol media absorbansi kontrol sel - absorbansi kontrol media
Uji apoptosis pada senyawa terpeneol terhadap sel
g.
x
lOO%
T47-D dan MCF-7
Larutan uji untuk uji apoptosis dibuat dengan membuat larutan stok, yang terdiri sari 50 mg etidium dan 15 mg acridine orange, kemudian dilarutkan dalam 1 ml etanol 95% dan ditambahkan dengan akuades 49 mi.
Larutan srtok diambil 1 ml,
kemudian diencerkan dengan PBS dengan perbandingan larutan stok : PBS
=
1:100. 1
2
3
4
s
A
Tt
Tu2
Ttt4
D
K
· u-
Tt
Tta
Tv4
o-
K
c
Tt
Tta
Tv4
D
K
D
T,
T,a
T114
D
K
6
Gambar 2. Skema pengisian mikrokultur untuk uji apoptosis. Keterangan :
alfa terpineol dari ekstrakP.- Merkurii dengan t-ICso alfa terpineol dari ekstrak P. Merkusii dengan 0,50 IC50 T114 : alfa terpineol dari ekstrak P. Merkusii dengan 0,25 ICso D : doksorubisin
T1 : T112:
K
: kontrol sel
Mikrokultur diisi dengan langkah langkah sebagai berikut : Masing masing sumuran yang akan diisi, di beri diisi dengan cell line MCF-7 dan jumlah sel 2
x
T47-D dan
kolom 1-4 baris
medium sebanyak 500 f.ll dengan
5 1 0 sellmi. Mikrokultur diinkubasi dalam inkubasi dalam
inkubator C�. 3rc, selama 24 jam. Kemudian terpineol,
coverslip,
kolom ldan 2 ditambahkan
a-
kolom 3 doksorubisin dengan konsentrasi 4IC50 - 0,25 IC50•
10
mik:rokultur diinkubasi kembali selama 24 jam, dalam inkubator c� Setelah
37°C.
2 jam media kultur dibuang (dengan dipipet), coverslip diambil dan
diletkan pada kaca objek. Kemudian coverslip ditetesi dengan larutan
etidium
bromide-acridine orange sebanyak 5- 10).11. Preparat diamati dengan mikroskop fluoresen dengan perbesaran
100 - 200x. Nukleus sel utuh yang berwarna orange
dengan kondensasi kromatin adalah sel yang mengalami apoptosis Janjut. Jumlah sel yang mengalami apoptosis dihitung setiap
h.
100 sel pada 3 lapangan pandang.
Pengamatan profil siklus sel T47D dan MCF-7 denganflowcytometry Sel diambil dari inkubator C�, diamati kondisi sel, digunakan kultur sel
dalam kondisi 70-80% konfluen untuk dipanen. Jumlah sel dihitung dan dibuat pengenceran sel sesuai dengan kebutuhan protokol. Penghitungan sel jumlah sel yang dibutuhkan untuk 6 well plate adalah 7 x
J.l]). Transfer sel ke dalam
sumuran
105
seVsumuran (7xl0S sel I
6 well plate, masing-masing
1000
1000 ).11 (untuk
perlakuan dan untuk kontrol sel). Keadaan
sel
diamati
di
mikroskop
untuk
melihat
distribusi
sel.
Dokumentasikan dengan kamera. Inkubasi sel dilakukan di dalam inkubator selama semalam (agar sel pulih kembali setelah panen). Jika dalam waktu semalam kondisi sel belum pulih, ganti media dan sel diinkubasikan kembali. Selalu amati kondisi sel sebelwn perlakuan. Setelah sel normal kembali, segera buat seri konsentrasi terpineol untuk perlakuan. Seri konsentrasi terdiri dari dua konsentrasi: volume
-1/2
IC50 dan IC50• Untuk masing-masing konsentrasi sampel buat
500 �·
Konsentrasi sampel dibuat dua kaJi konsentrasi untuk perlakuan, karena di dalam sumuran akan mengalami pengenceran oleh sampel.
Ambil
plate yang
telah berisi sel dari inkubator. Buang media sel dengan menggunakan pipet Pasteur secara perlahan-lahan. Cuci dengan
500 J.l) PBS ke dalam semua sumuran
yang terisi sel. Buang PBS dengan pipet Pasteur secara perlahan-Iahan. Masukkan seri konsentrasi sampel ke dalam sumuran, kemudian ditambahkan
11
•
I
500 J.l)
500 J.l) media
kultur (MK.). Untuk kontrol sel: Tambahkan
1000 J.L) MK ke dalam sumuran.
DiJakukan inkubasi di dalam inkubator C02 selama
24 jam. Menjelang akhir
waktu inkubasi, dokumentasikan kondisi 5et untuk setiap perlakuan dengan kamem. Reagen
j/owcytometry adalah PI mix, untuk satu sampel dibubuhkan
sebanyak 1 mL I I 000.000 sel. Dibuat untuk empat sampel, kemudian diungkus dengan aluminium foil. Siapkan dua buah tabung kecil untuk satu jenis perlakuan. Diambil media dari sumuran dengan mikropipet
1 ml, ditmnsfer ke tabung pertama, jika kurang,
dimasukkan ke tabung kedua. Sentrifugasi dengan kecepatan tiga menit. Media dibuang dengan
cara
2000 rpm selama
dituang. diisikan masing-masing
500 J.ll
PBS ke dalam sumuran. Diambil PBS dengan mikropipet dan ditmnsfer ke dalam tabung pertama. Dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan
2000 rpm selama tiga
menit. PBS dibuang dengan cara dituang, kemudian diulangi pencucian dengan PBS (tahap 5-8) sekali lagi. ditambahkan
150 J.L) tripsin-EDTA 0,25%, kemudian
diinkubasi dengan inkubator selama tiga menit. ditambahkan masing-masing
1 ml
MK, kemudian diresuspensi sampai sel lepas satu per satu dan diamati di mikroskop. Setelah sel terlepas satu-satu, dilakukan tmnsfer ke tabung pertama dan kedua.
Ditambahkan kembali
500 J.ll PBS ke dalam sumuran untuk
mengambil sisa sel, kemudian ditransfer ke dalam tabung kedua. Dilakukan sentrifugasi untuk semua tabung
dengan kecepatan 2000
rpm selama tiga menit,
kemudian MK/PBS dibuang dengan cara dituang dan dilakukan resuspen pellet sel dengan masing-masing
500 J.l.] PBS dingin. Suspensi sel digabungkan ke dalam
kedua tabung. Tabung kosong dibilas dengan PBS, kemudian ditransfer ke tabung pertama. Tabung pertama disentrifugasi dengan kecepatan menit,
kemudian
PBS dibuang
dengan
2000 rpm selama tiga
cara dituang. Diambahkan
reagen
jlowcytometry masing-masing 400 J.d, kemudian diresuspen sampai homogen. Tiap tabung dibungkus dengan alumuniumfoi/, lalu diberi penandaan pada bagian atasnya. Dilakukan inkubasi di
waterbath 37°C selama J 0 men it.
Dilakukan
resuspen lagi sebelum ditransfer ke jlowcyto-tube. Transfer suspensi sel ke dalam
12
flowcyto-tube dilakukan melalui filter (kain niJon I kain kaca) menggunakan mikropipet 1 mi. Pembacaan dilakukan dengan flowcytometer FACS Calibur untuk mengetahui profit cell cycle. Deteksi dilakukan terhadap 20.000 sel.
Data flowcytometry dianalisis dengan program Cell Quest untuk melihat distribusi sel pada fase-fase daur sel sub G, (apoptosis), S, GM, dan sel yang mengalami poliploidi. Penghambatan daur se1 yang terjadi dapat diketahui dengan membandingkan antara efek perlakuan lanltan uji dengan kontrol.
Variabel Penelitian
IV. 1.
Variabel Bebas
Variabel bebas yang diteliti adalah alfa terpineol dengan 8 seri konsentrasi. 2.
Variabel Terikat a
Efek sitotoksik melalui persentase hambatan populasi sel.
b.
Efek hambatan proliferasi melalui profil siklus sel.
c.
Efek apoptosis melalui kematian sel akibat apoptosis.
V. 1.
Analisis Data
Uji sitotoksik dengan MTT assay
Persentase viabilitas sel di peroleh dengan rumus :
lldsorbwi k�rtrcl- ab;oNarsi meeia] - (aisorba1Si ssl£aMps -abtoroof!Si tleeia) (M<SM.�a1Si {m�trol Sfl- ab:or�m me4ia)
Data
persen
viabilitas
sel
tersebut
digunakan
untuk
X :O�
menghitung
IC50
menggunakan persamaan regresi probit antara logaritma konsentrasi dengan persen viabiJitas sel.
2.
Ujrapoptosis senyawa tecpiileort erliadap sel T47D dim MCF:7
Nukleus sel utuh yang berwama orange dengan kondensasi kromatin adalah seJ yang mengalami apoptosis lanjut. Jumlah sel yang mengalami apoptosis dihitung setiap total 100 sel yang diamati.
3.
Pengamatan profil siklus sel T470 dan MCF-7 denganjlowcytometry
13
t
Data flowcytometry dianalisis dengan program cell quest untuk melihat distribusi set pada fase-fase daur sel sub G1 (apoptosis), S, G2/M, dan sel yang mengalami poliploidi.
Penghambatan daur sel yang terjadi dapat diketahui dengan
membandingkan antara efek perlakuan larutan uji dengan kontrol secara statistik pada fase Go/G1 dan GM.
E. Basil Riset
Penelitian yang dilakukan pada sel line kanker payudara yaitu MCF7 dan T47D dengan pemberian senyawa uji yaitu alfa terpineol dari ekstrak getah pohon
Pinus merkusii. Senyawa alfa terpineol basil dari ekstraksi getah pohon pinus diperoleh dari Prof. Ir. Arief Budiman, M.S., D.Eng. dari Laboratorium Teknik Kimia Universitas Gadjah Mada. Pada penelitian ini dilakukan uji sitotoksik. uji apoptosis dan profiJ sikJus sel. Uji sitotoksik dilakukan dengan menggunakan metode MIT assay, dengan memberikan senyawa alfa terpineol pada kultur sel kanker payudara yaitu MCF7 dan T47D
selama 24 jam. Kontrol obat yang
digunakan adalah senyawa alfa terpineol sintetik dari pasaran (Nacalai®) dan doksorubusin
("EBEWE").
Uji
apoptosis
dilakukan
dengan
pemeriksaan
morfologi sel MCF7 dan T47D yang diinkubasi selama 24 dengan pemberian senyawa alfa terpineol, diwamai dengan etidium
bromida
dan
menggunakan senyawa fluorokrom
acridine orange,
kemudian
diamati menggunakan
mikroskop fluoresen. Uji sikJus sel menggunakan reagen jlowcytometry yaitu propidium iodide, RNAse,
triton-:X, PBS, dibaca dengan menggunakan
flowcytometer FACS Cali bur.
1.
Senyawa alfa terpineol menunjukan aktivitas sitotoksik terbadap sel
kanker payudara MCF7 dan T47D in vitro
Sel kanker payudara MCF7 dan T47D ditumbuhkan pada media RPM! 1640, selanjutnya diberikan perlakuan dengan senyawa alfa terpineol. Set kultur
14
•
I
T47D yang hidup memiliki gambaran gepeng lonjong (trapezoid), memenuhi dan menempel pada
dasar sumuran
(Gambar I),
sedangkan sel
bentuk yang yang tidak teratur. Sel kultur MCF7 diberi
perlakuan
berbentuk
dan
bulat, cenderung tersebar,
kultur MCF7 memiliki
T47D yang mati setelah soliter dan tidak
menepeJ
pada dasar sumuran (Gambar 1).
(b)
(a) Gambar 3.
MIT
Gambaran sel kanker payudara (a) MCF7 dan (b) T47D yang hidup confluent ·pada- dasar- - sumuran - sel - hidup- ditunjukan ·panah - -warna hitam sel mati ditunjukan panah warna merah. diamati dibawah mikroskop inverted dengan perbesaran 1 OOx. assay digunakan
sebagai metode untuk mengetahui aktivitas
-sitotoksik-dari- senyawa·· alfa-·terpineol -yang·· diujikan -pada- set
T 470'dan
MCF7.
Inkubasi dilakukan selama 24 setelah pemberian alfa terpineol, setelah itu dilakukan'penambahan' reagen-yeIIow- MT'F. Yellow
MTI ((3-(4;S�dimetilthiazol-
2-yJ)-2,5-difeniltetrazoJium bromida) adalah senyawa tetrazoJ kuning yang dapat masuk'ke dalam set
hidup- -dan- -direduksi
oteh ·enzim mitokondrial-reduktaw. Hal
itu akan menyebabkan perubahan warna
MTr
(kristal formazan) (Doyle, eta/;, 2001 ). Jumlah
dari kuning menjadi biru gelap kristal - formazan
yang terbentUk
melambangkan jumlah mitokondria dan tentu saja sel yang hidup (Freimo ser, et a/., 1999). Jumlah selhidup - berbanding lurus dengan intensitas wama biru gelap yang
terbentuk, semakin banyak sel yang hidup maka akan semakin intens warna
biru
ge lap yang
teramati.
Data yang
didapatkan
dari uj i
MIT assay
15
•
t
berupa
absorbansi dari tiap sumuran yang dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 595 run.
)''"� .-' \_/':� \ #\ ...
ml1othonc!rtal
l'llductase
Br
Gambar 5.
Proses reduksi reagen M1T ((3-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-difuniltetrazolium -bromida)- menjadi· kristal -fonnazan- -oleh enzim mitokondrial reduktase yang ada pada sel yang hidup (Brescia & Banks, 2009)
Data basil absorbansi dihitung persentase penghambatan pertumbuhan sel. Persentase penghambatan perturnbuhan sel didapatkan dengan membandingkan set yang hidup pada perlakuan senyawa a-terpineol dengan set yang hidup pada kelompok tanpa perlakuan senyawa a-terpineol. Persentase penghambatan sel MCF7 dan T47D setelah pemberian senyawa a-terpineol dan obat pembanding yaitu senyawa alfa terpineol sintetik (Nacalai®) dan doksorubisin masa inkubasi 24 jam secara lengkap ditunjukan pada Lampiran 1 dan 2. Nilai rerata persentase penghambatan sel MCF7 dan T47D setelah perlakuan dengan senyawa a-terpineol obat pembanding yaitu
senyawa alfa terpineol
' "'
sintetik
(Nacalai®)
dan
doksorubisin ("EBEWE'') dilakukan dengan metode MIT assay setelah inkubasi 24 jam ditunjukan pada Tabel 1 dan 2.
Tabel l .
pertumbuhan sel kanker T47D setelah dengan senyawa uji" selama -2'4 jam menggumikan metode
Rerata persentase penghambatan
pertakuan
MIT ass ay.
-K{)nsentrasi BahaD' Uji
Alfa terpineol
!l!M}
450,00
Hambatan (o/o±
ICso
-so}
(11M)
96,0 ± 0,74
400,00
92,78 ±0,.68
350;00
89;66 .±1>22
300,00
77,25±0,96
250,00
62,68±2,33
2oo;oo ·
-58�91±0;74•
150,00
52,48±1,66
100,00
41,04±9,03
50,00
17,89± 6,79
1 72,40
doxorubisin
Alfa terpineol Sintetik
83,38±1,03
"86;-20·
-69,30±1-,23-
43,10
60,57±0,89
21,60
44,67± 1,44
10�80-
42;25±0;67
5,40
39,87±1,62
3000,00
98,02±,97
2800,00
79,59± 1,78
2600,00
46,64±2,67
2400;00
44;91±4,41
2200,00
50,10±3,05
2000,00
35,5 1±2,77
1 800;00 -
2 1 ,82±0;98
1600,00
24,95±1,95
17
•
1 35,00
1 7,89
2248jOI -
Tabel 2. Rerata persentase penghambatan pertumbuhan sel kanker MCF7 setelah perlakuan dengan senyawa tiji- selama -24jam menggumikan metode -Mrf · ass ay.
Baban Uji
Konsentrasi
(J.tM)
-alfa,te_rp_ine_Ql_
doksorubisin
-3f2,50 1 56,25 78�00 39,00 19,50 9;75 172,40 86,20 43, 10 21,60 10j80 5,40 2,70 -1,30 12500,00
Alfa terpineol · sintetik
Hambatan
(o/o± SD)
6250;00 3 125,00 1 1 56,30 780,00 390,00
96,51±2,f2" 88,81±3,92 4 7,0.3;1:2,14 8,07±0, 13 5,14±1,46 4;04±2;48 88,24±7,73 7 1,00±4,38 54,82±3,89 50,59±5,14 -44;80%4,6640,70±3,00 4 1 , 1 9±4,78 3'5-;78±2;23 97,25± 1,56 77,58 ±8,41 37,25±3,03 26,75± 1 ,64 5,25±0,75 2,67±0,80
ICso (J.tM)
76,79
6,10
2991,37
120
-··-----·----
---
---
------
----
100 c l!
80
10 -.a
E .. ..c c 5: ..
t_
y=
;29.;88x + 12.31
' 60
R-2 = 0.928
+
alfa terpineol
•
ooxo
alfa terpineol 95%
40
-- Linear (alfa terpineol) --Unear (OOXO)
20
-- Linear (alfa terpineol 95%)
0
--.
1
0
2
3
4
konsentrasi (uM; log base 10)
Gambar 6. Grafik rerata
persentase- penghambatan senyawa uji pada. sel kanker T47D sesudah inkubasi 24 jam dengan menggun� -metode MTI assay.
--------
-- ---·--·-----
---------
--120 ,-------- --
100
+
alfa terpineol
80
•
doxorubicin
c
:!
Ill
.a
E Ill ..cc Ql � Ill Q.
60
alfa terpineol sintetik -- Linear (alfa terpineol)
-- Linear (doxorubicin)
·-.------,
s
L
--Linear (alta terpineol sintetik}
konsentrasl (uM; log base 10) ·-------------··--·--
Gambar 7.
Grafik rerata persentase penghambatan senyawa uji pada sel kanker MCF7 sesudah inkubasi 24 jam dengan menggunakan metode MIT assay.
19
I
Hubungan antara konsentrasi
senyawa alfa terpineol dan senyawa obat
doksorubisin dengan persentasi penghambata.n pertwnbuhan sel kanker payudara -MCF7· aan T47D· sesudah iriktibasi 24· jam dengan menggunakan metoae··MTr assay ditunjukan pada Gambar 4 dan 5. Aktivitas sitotoksik antikanker senyawa alfa terpineol dinyatakan dengan nilai ICso berdasarkan data hubungan antara konsentrasi bahan uji dengan persentase penghambatan sel kank:er. NiJai ICso ditentukan dengan menggunakan analisis probit pada perangkat lunak: SPPS. Nilai rerata IC50 dari bahan uji alfa terpineol dan obat doksorubisin setelah inkubasi 24 jam pada sel MCF7 dan T47D dengan metode MTT assay dapat diJihat pada Tabel 1 dan 2. Untuk mengetahui apakan ada perbedaan bermakna antara IC50 senyawa alfa terpineol dai ekstrak pohon Pinus merkusii, alfa terpineol sintetik dan obat doksorubisin terhadap sel MCF7 dan T47D mak:a akan dilakukan dengan uji ANOVA dengan CI (confidence index) sebesar 95%. Dari hasiJ analisis terdapat berbeda bermakna antara ICso perlakuan senyawa alfa terpineoL alfa terpineol sintetik dan obat doksorubisin. Tidak berbeda bermakna antara doksorubisin terhadap sel MCF7 dan T47D. 2.
Senyawa a-terpineol memicu apoptosis
MCF7 dan T47D
pada sel kanker payudara
Uji apoptosis yang digunakan adalah pem eriksan a dengan menggunakan senyawa fluorokrom etidium bromida dan acridine orange, dan kemudian diamati morfologi sel menggunakan mikrosk op fluoresen (Reiss MC 80) sehingg a diperoleh data nominal. Acridine orange dapat menembus membran sel nonnal dan bila berikatan dengan DNA men gimisikan fluoresen berwarna hijau, sedangkan etidium bromida hanya bisa menembus membran yang telah rusak. Etidium bromida mengemisikan warn a orange ketika berikatan dengan DNA/RNA. Bila dilihat dengan mikrosko p fluoresen, sel yang hidup menunjukan warna hijau terang dengan struktur yang utuh. Sel yang mengalami apoptosis 20
I
lanjut menunjukan nukleus berwarna orange dengan kondensasi kromatin (Eisel et
al., 2000). Sel yang mengalami apoptosis dapat dilihat pada Gambar 4.
(c) Gambar 8.
(d)
Hasi1 uji apoptosis terbadap sel MCF7 (a dan b) dan T47D (c dan d) setelah inkubasi selama 24 jam dengan larutan alfa terpineol (b dan d) dan kontrol (a dan c). Set hidup ditunjukan panah wama hitam dan sel yang mengalami apoptosis ditunjukan panah wama merah. Pen_gamatan pada mikroskop fluoresensi den_gan_ perbesaran lOOx.
Hasil uji apoptosis setelah inkubasi pada sel MCF7 dan T47D dengan senyawa uji alfa terpineol selama 24 jam ditunjukan pada gambar 7, hasil tersebut menujukan bahwa terjadi proses apoptosis pada sel set MCF7 dan T47D dengan senyawa uji alfa terpineol. Pengamatan sel yang apoptosis dan nekrosis dapat dilakukan dengan menggunak.an metode jlowcytometry dengan menggunakan reagen annexin-V. Hasil pengamatan tersebut dapat dilihat pada tabel 4 dan 5. 2.\
•
t
Tabet 3.
Rerata persentase set hidup dan mati pada sel kanker T47D setetah perlakuan dengan alfa terpineol selama -�4- jam dengan pengamatan tlowcytometry dengan menggun!can reagen anexin V.
(pM).
sel hidup
seJ Apoptosis
Kontrol Sel
0
3,47±0, 16
94,96± 0,3 1
1,58± 0,27
Alfa terpineol
135(1C50)
3,16±0,05
95,00± 0,15
1,85± 0,10
Alfa terpineol
2248,01 (1C50)
3,26±017
- 93, 18± 0,14
3,56±0,25
sintetik
Rerata persentase sel hidup dan mati pada set kanker MCF7 setelah perlakuan dengan alfu terpineol selama 24· jam dengan pengamatan tlowcY!om�dengan men�reagen anexin.
0
3,-89±0,26
94,57±0,09
1,:54±0,23
Alfa Terpineol
76,79 (1C50)
15,87±0, t7
83,12±0,21
1±0,08
Alfa Terpineol sintetik
299t,37 (IC50 )
5,18±0,11
93,16±0,17
1,66±0,13
Kootrol Sel
3.
PersentasejwnJah set(%)± SD
set Nekrosis
Perlakuan
Tabet 4.
-K�trasi
Senyawa alfa terpineol menunjukan hambatan aktivitas sildus sel
terbadap sel kanker payudara MCF7 dan T47D
Analisis f/owcytometry digunakan untuk mengetahui penghambatan siklus sel pada kanker payudara MCF7 dan T47D
dengan perlakuan senyawa
a
terpineol. Data yang diperoteh merupakan data nominal berupa histogram hubungan antara jumlah sel (sumbu y) dengan intensitas fluorosensi (sumbu x) intensitas fluorosensi yang dihasilkan DNA. Data kemudian dianalisis untuk memperoleh data rasio berupa distribusi sel pada fase siklus sel G1, S, GVM. Penghambatan siklus sel yang tetjadi dapat dibandingkan dengan membandingkan anatara perlakuan lauratan uji dengan kontrol.
22
•
I
Penghambatan siklus sel dipengaruhi oleh ekspresi berbagai protein yang bertanggung jawab pada masing-masing fase. Fluorochrome adalah senyawa yang dapat mengabsorbsi cahaya kemudian mengimisikannya menjadi warna yang berbeda, umumnya dengan panjang gelombang yang lebih panjang.
Florochrome
DNA sangat diperlukan dalam menganalisis siklus sel, dalam penelitian ini digunakan propidium iodide (PI) yang dapat berinteraksi dengan basa untai ganda
RNA namun tidak dapat menembus
DNA dan
siklus sel terdiri
dari
sel utuh. Reagen PI untuk analisis
senyawa yang dapat membuat membran sel menjadi lebih
penneabel (umumnya digunakan suatu deteJjen, triton
X) serta RNAse agar RNA
terdegradasi sehingga PI hanya berikatan dengan DNA saja. Intensitas flourensi yang dihasilkan oleh inti sel proposional dengan jumlah DNA,
jlowcytometry
akan menampilkan histogram hubungan antara jumlah sel dengan intensitas fluoresensi tersebut. Set apoptosis mengalami fragmentasi DNA sehingga jumJah DNA dalam inti set akan relatif sangat sedikit dibandingkan sel nonnaJ. Set apoptosis terdeteksi di puncak sub G1 (Givan, 2001) Setelah
inkubasi 24 jam teJjadi akumulasi sel T47D
pada perlakuan alfa terpineol pada konsentrasi 78
J.LM menunjukan persentasi
lebih tinggi dibandingkan alfa terpineol pada konsentrasi tanpa perlakuan. Tabel distribusi fase set T47D
pada fase GO/G l
39J.LM dan sel kontrol
setelah perlakuan dengan alfa
terpineol dan kontrol yang dibaca dengan jlowcytometry terlihat pada Tabel 4.
Rerata distribusi fase siklus set
Tabel 5:
T47tr
setelah perlalruan
perlakuan dengan alfa terpineol selama 24jam Koosentrasi
(JIM)
SUbG;-6,
Go-G,
tlSejum1abse JSefl e P J(%)± SD G2·M S
KontroJ Sel
0
3,057 :1: 0,668
38,173 :1: 1,045
19,350± 0,210
33,053 :1: 1,458
6,.950 ±0,442
AIfa
135 (TC50)
3,1 1 0 ± 0,316
56,890 ± I,925
,343±0,718 15
18,837::1: 0,679
,529 6,197± 0
Terpineol
61,5(0,5 IC50)
2,367 :1: 0,203
50,977 ± I,605
18,387 ±0,345
24,623 ± 0,962
4,150:1: 0,286
Do'ksorubisln
17,89 (IC50)
6,103 ± 0,386
36,123 ± 1,273
26,970 ± 0,426
22,277 ± 0,592
,280 ± 0,816 9
Pada gambar 5 menunjukan graftk rerata basil analisis akumulasi fase-fase siklus sel
T470 denganjlowcytometry setelah ditanam pada
perlakuan
pemberian
alfa terpineol
selama 24 jam.
23
•
t
6
sumuran dengan
IC5o
alfa terpineol
menunjukan akumulasi sel pada sub fase Go/G1 sedangkan dengan Yz IC50 pada fase Go/Gt. alfa terpineol dengan ICso pada sub fase Go/G1 yang kemungkinan selnya sudah banyak yang mengalami apoptosis. 60
+------:m
50 ..-. '$. '-'
""" --"'-" jo +--.c nt
33.053
Jo +---IO -
·
terpineol ICSO
.
i
-f
:
- 10
-t
alfa telJ)ineol l/2 ICSO
---
--
+--'r"fl�
0 subGO{WJGl
1
s
siklus sel �---Fase --Gambar 9.
I
G2/M
Grafik rerata distribusi fase siklus sel T47D setelah di beri perlakuan a-terpineol sesudah inkubasi 24 jam dianalisis dengan menggunakanj/owcytometry.
Untuk mengetahui apakah terdapat perbedaan yang bermakna antara hambatan siklus sel fase GO-G I, dengan fase S, G2-M, dan sub-GI pada siklus sel akan di lakukan uji statistik menggunakan ANOVA dua jalur.
Perlakuan dengan alfa
terpineol pada konsentrasi 135 J.tM (setara dengan nilai IC50) menunjukkan akumulasi jumlah sel yang lebih tinggi pada fase Go/G1 (56,890 %) dan akumulasi jumlah sel yang Jebih rendah pada fase G2/M (18,837 %) daripada kontrol sel (38, 173% dan 33,053% secara berurutan). Senyawa dikatakan menghambat proliferasi sel apabila terjadi kenaikan akumulasi jumlah sel pada fase Go/G1 dan penurunan akumulasi jumlah sel pada fase G2/M dibandingkan dengan kontrol selnya. Hasil uji statistik dengan metode analyss i of varian (ANOVA) menunjukkan adanya perbedaan yang bennakna antara perlakuan a! fa terpineol pada konsentrasi
135 J,lM (setara dengan ICso) den gan kontroJ seJ baik pada fase Go/G1 dan G2/M (ke
dua fase tersebut merupaka n penanda aktivitas antipr oliferasi set). Sedangkan pada fase sub Go/G1 tidak did apatkan perbedaan yang ber makna antara perlakuan dengan alfa terpineol (konse ntrasi 135 J!M setara dengan IC50) dengan kontrol sel.
F. Pembabasan
Aktivitas sitotoksik alfa ter pineol terhadap
sel kanker payudara T47D dan MCF7 ditentukan dengan metode MIT as'say. Metod e ini merupakan metode analisis kolorimetri kuantit atif yang cepat, presisi dan bebas senyawa radiOOktif (Mossman, 1983). Didapatkan persentase penghambatan sel yang selaras dengan kenaikan konsentrasi alfa terp ineol yang digunakan
(dose-dependent man.ner)
Konsentrasi terendah alfa terp ineol (50 !lM) mampu mengh ambat populasi sel T47D sebanyak 1 7,89o/o, sed angkan pada konsentrasi tert n i ggi (450 JAM), alfa terpineol mampu menghambat populasi set T47D sebanyak 96,03%. Pada sel MCF7 konsentrasi terendah 9,75 p.M menghambat sebany ak 4,04%, konsentrasi tertinggi 3 12,50 menghabat seb anyak 96,51%. Nilai ICso senyawa alfa terp ineol dari ekstrak pohon pin us terhadap sel T47D dan MCF7 yaitu rnasing -masing 135 J.tM dan 76,79 J,tM. Hasil statistika menunjukan basil berbeda ber makna, hal ini rnenyatakan bah wa senyawa alfa terpineol dari ekstrak pohon pin us lebih merniliki nilai toksisi tas lebih tinggi pada sel MCF7 dibandingkan sel T47 D. Penelitian yang dilakukan oteh Hassan et a/. (2010) menunjukkan bahwa pada sel kanker paru-paru NCI-H69, nilai IC50 didapatkan konsentrasi alfa terp ineol sebesar 260 j.!M. Penggunaan doksorubisin seb agai kontrot positif untuk alfa terpineol mernberikan perbedaan toksisit as yang bermakna secara statistik (p value <0, 00 I). Hal ini rnembuktikan bahwa doksorubisin tebih toksik den gan IC50 sebesar 1 7,89 J.tM pada sel T47D dan 6,1 0 J.tM pada sel MCF7. Nilai IC50 adalah konsentrasi yang dibutuhkan suatu senyaw a (atau campuran senyawa) untuk menghambat 50% populasi sel (Food and Dru g Administration, 2000).
25
•
t
Senyawa pembanding lainnya yaitu senyawa Alfa terpineol sintetik yang dijual di pasaran (Nacalai®). NiJai ICso dari alfa terpineol sintetik pada sel T47D dan MCF7 masing-masing sebesar 2248,01 JtM dan 2991,37 JLM. Hal ini berarti Alfa terpineol
dari
ekstra.k pohon pinus lebih toksik dari pada Alfa terpineol
sintetik (Nacalai®). Alfa terpineol yang digunakan pada penelitian ini mempunyai konsentrasi sebesar 51% dan perJu kajian Ianjut mengenai apakah aktivitas sitotoksik akan meningkat sejalan dengan meningkatnya kemumian alfa terpineol yang digunakan. Berdasarkan kriteria yang dikeluarkan oleh American National Cancer Institute (1990), suatu senyawa yang belum murni dikatakan memiliki aktivitas sitotoksik hila memiliki nilai ICso dibawah 30 JJg/mL. Bila dilakukan konversi, nilai ICso yang dimiliki oleh alfa terpineol (135 JtM) adalah 20,82 JJ.g/mL terhadap set T47D dan 6,10 J1M pada set MCF7. Oleh karena itu, alfa terpineol dengan konsentrasi 51% termasuk kategori yang potensial sebagai kandidat senyawa antikanker. Nilai ICso tidak hanya digunakan untuk mengetahui aktivitas sitotoksik dari senyawa alfa terpineol, namun juga digunakan untuk penelusuran mekanisme aksi dari senyawa tersebut dalam menyebabkan kematian atau modulasi siklus sel. Apoptosis adalah salah satu mekanisme yang diharapkan pada pengembangan senyawa yang berpotensi sebagai antikanker (Ribble, et a/., 2005). Uj i pengecatan ganda dengan menggunakan etidium bromida I akridin orange merupakan metode yang dipilih dalam penelitian kali ini dikarenakan kemudahan, kecepatan dan akurasinya (Ribble, et kematian
sel
menunjukkan
bahwa
pada
a/., 2005). Hasil pengamatan
kelompok
kontrol
set
semua
berfluoresensi hijau. Hal ini menandakan bahwa pada kelompok kontrot set tidak dijumpai adanya kematian set, Perlakuan dengan alfa terpineol dengan konsentrasi 135 J1M (setara dengan nilai ICso) pada sel T47D dan pada sel MCF7 76,79 J1M menunjukan bahwa dari populasi set yang diamati berwarna orange kemerahan. Set T47D dan MCF7 yang mengalami apoptosis awal dapat diamati sebagai set dengan inti yang berwarna hijau dengan kromatin yang terkondensasi atau terfragmentasi, sedangkan saat
26
•
I
memasuki fase akhir apoptosis, inti sel akan berwarna orange dengan kromatin yang terkondensasi dan ter:fragmentasi (Renvoize, et aJ.. 1997; Ribble, et a/., 2005). Dijumpai sel yang intinya berwarna orange dan terbentuk badan-badan apoptotik disekililingnya akibat pemberian alfa terpineol. Fragmentasi DNA merupakan penanda karakteristik akhir dari terjadinya apoptosis setelah munculnya aktivasi dari protein caspase. Protein DFF40 bertanggung jawab terhadap fragmentasi DNA setelah sebelumnya DFF45 (yang mengikat DFF40) dibelah oleh protein caspase-3 I 7 (Liu, et a/., 1999). Sel T47D merupakan kultur sel yang memiliki protein caspase-3 (mediator utama proses terjadinya apoptosis). Aktivasi jalur caspase juga memicu terjadinya pemotongan protein-protein penting lain seperti PARP (Poly-ADP-ribose polymerase) yang bertugas sebagai DNA repair enzyme (Mooney, et al., 2002). Salah satu metode lain yang lebih obyektif adalah dengan pemberian annexin V. Metode ini didasarkan pada penggunaan protein annexin V yang Z+ ditambahkan gugus fluorokrom, dimana dengan adanya ca akan mengikat fosfatidilserin (salah satu fosfolipid membran plasma). Fosfatidilserin berada pada bagian dalam membran plasma pada sel hidup, namun pada saat apoptosis akan membalik ke permukaan luar (van Engeland, et al., 1998). Pengikatan annexin V biasanya dikombinasikan dengan reagen PI (propidium iodida). Kombinasi annexin V dengan PI membuat metode ini dapat membedakan sel yang hidup, tahap awal apoptosis, tahap akhir apoptosis dan sel yang mengalami nekrosis (Darzynkiewicz, et al., 2009). Metode ini membutuhkan proses berkelanjutan seperti pelepasan sel dari sumuran (detaching), pencucian (washing) dan pemindahan set (transferring). Prosedur-prosedur tersebut mempunyai kelemahan yaitu dapat merusak membran sel dan mengubah distribusi populasi sel yang hidup, mengalami apoptosis dan I atau nekrosis (Ribble, et a/., 2005). Willingham (1999) menyatakan bahwa dalam mengamati proses apoptosis in vitro, tidak ada satupun metode tunggal yang memiliki spesifitas dan sensitivitas yang sempurna. Metode yang paling spesifik (meski relatif subyektif) adalah pengamatan langsung dengan mikroskop (cahaya atau fluoresen) untuk mendeteksi perubahan bentuk nukleus pada tahap awal apoptosis. Umumnya pengamatan apoptosis
27
t
dilakukan dengan lebih dari satu macam metode, misalnya pengamatan mo.rfologi dilakukan dengan pengecatan ganda etidium bromida - akridin orange, sedangkan pemastian data kuantitatifuya dengan metode annexin V. Dari basil pengujian dengan menggunakan metode annexin V menunjukan bahwa dengan perlakuan alfa terpineol dari pohon pinus dan alfa terpineol sintetik teJjadi akumulasi set pada fase hidup dibandingkan dengan set yang mengalami apoptosis dan nekrosis. Sel yang hidup pada T4 7D dengan persentase masing masing sebesar 95,00% dan 93, 18% sedangkan pada kontrol 94,96, sedangkan sel MCF7 dengan persentase masing-masing sebesar 83, 1 2% dan 93,16% sedangkan pada kontrol 94,57 %. Pada sel MCF7, sel yang mengalami apoptosis sebesar 1 % dengan perlakuan alfa terpineol
dari
pohon pinus dan 1,5% pada alfa terpineol
sintetik, sedangkan sel yang nekrosis 15,87% dengan perlakuan alfa terpineol dari pohon pinus dan 5,18% pada a1fa terpineol sintetik. Dari hasil statistika dapat disimpulkan bahwa perlakuan dengan menggunakan senyawa alfa terpineol dari ekstak getah pohon pinus dan alfa terpineol sintetik tidak memacu apoptosis, tetapi lebih teJjadi akumulasi di set hidup.
Tetapi pada sel MCF7 dengan
perlakuan alfa terpineol pinus, sel mengalami nekrosis lebih tinggi dibandingkan kontrol. Pacuan apoptosis merupakan salah satu mekanisme yang diharapkan dalam pengembangan senyawa antikanker (Stankovic,
et a/.,
20 I I ). Apoptosis
merupakan mekanisme seluler yang berguna untuk mengeliminasi kerusakan kerusakan ireversibel pada sel tanpa mengakibatkan timbulnya inflamasi (Galati,
et a/.,
2000; Paus,
et a/.,
1993). Meskipun demikian, Renvoize,
et a/.
(1997)
menyatakan bahwa bisa jadi dalam satu kultur set dengan perlakuan yang sama akan teJjadi sel-sel yang mengalami apoptosis dan nekrosis secara bersamaan. Pemahaman mengenai mekanisme kematian sel seperti apoptosis dapat dijadikan dasar dalam mendesain terapi yang tepat untuk pasien penderita kanker (Kerr, 1994). Peningkatan sitotoksik yang terjadi dengan pemberian Senyawa a-terpineol dapat disebabkan oleh modulasi siklus sel maupun induksi apoptosis. Madulasi siklus set dibuktikan dengan pengamatan profit siklus sel untuk melihat distribusi set bela pada masing-masing fase akibat perlakuan.
28
•
t
Pengamatan terhadap profil siklus set menggunakan metode j/owcytometry pada sel T47D dengan perlakuan alfa terpineol menunjukkan adanya peningkatan jumlah sel pada fase Go/Gt dan penurunan·jumlah sel pada fase G2/M secara signiftkan terhadap kontrol sel. Didapatkan jumlah akumulasi sel T47D pada fase Go/Gt akibat pemberian alfa terpineol dengan konsentrasi 135 JJM (setara dengan nilai IC50) sebesar 56,890 %, sedangkan pada kontrol sel didapatkan akumulasi sebesar 38,173 % pada fase yang sama. Didapatkan jumlah akumulasi sel T47D pada fase G2iM akibat pemberian alfa terpineol dengan konsentrasi 135 fJM (setara dengan nilai ICso) sebesar 18,837 %, sedangkan pada kontrol sel didapatkan akumulasi sebesar 33,053 % pada fase yang sama.
Hassan,
et a/.
(20 1 0) menyatakan bahwa alfa terpineol menghambat
proliferasi set kanker melalui jalur NF-KB. NF-KB merupakan sa1ah satu faktor transkripsi yang berperan mengatur proliferasi sel dan apoptosis. Protein ini berada dalam kondisi inaktif, Iaten dan terikat dengan IKB di dalam sitoplasma pada hampir semua sel, ketika set menerima suatu sinyal ekstraseluter, maka NF KB dengan cepat akan
memasuki nukleus dan akan mengaktifkan gena-gena yang
mendukung proliferasi dan pertumbuhan set (Gilmore, 201 1). Siklus sel diatur dengan ketat oleh sekelompok kompleks protein yang dinamakan kompleks CDK-cyclin. Masing-masing kompleks ini sangat berperan dalam memindahkan siklus sel dari fase satu ke fase yang lainnya CDK-1 merupakan protein yang sangat berperan dalam siklus sel, hilangnya protein ini menyebabkan kematian embrional pada saat pembetahan set yang pertama (Malumbres & Barbacid, 2009). Alfa terpineol diketahui mampu menghambat proliferasi set kanker limfoma U937-GTB pada fase Go!Gt. Akumulasi set pada fase tersebut tentu saja
akan berakibat pada menurunnya jumlah set pada fase setelahnya (S, G2
dan
M)
(Hassan., et al., 2010). Hal yang sama dijumpai pada set T47D yang diberikan perlakuan dengan alfa terpineol, peningkatan akumulasi sel yang terjadi pada fase Go/G1 diikuti dengan turunnya akumulasi sel pada fase selanjutnya S, G2 dan M).
29
•
t
MS M1
Gambar 10. Ilustrasi
pembacaan
profit
siklus
set
dengan
metode
flowcytometry
Set yang dianalisis dengan metode jlowcytometry dimasuk.kan dalam tiga kategori, yaitu sel yang memiliki komplemen DNA yang belum tereplikasi (fase G1), sel yang memiliki komplemen DNA yang seluruhnya telah tereplikasi (fase G2) dan set yang memiliki jumlah komplemen DNA diantara keduanya berada pada fase S (Alberts,
et al., 2008).
G. Kesimpulan
Dari penelitian yang telah dilakukan maka dapat diambil kesimpulan sebagai berikut: 1.
Senyawa alfa terpineol mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap sel T47D dan MCF7 dengan nilai ICso sebesar yaitu masing-masing 135
2.
Senyawa
J,tM dan 76,79 )JM.
alfa terpineol dengan pengamatan pewarnaan fluorokrom etidium
bromida dan acridine orange menginduksi apoptosis pada set T47D dan MCF7,
akan tetapi dengan pengujian
metode anexin
V jumlah set hidup lebih
banyak dibandingkan yang apoptosis. 3.
Senyawa alfa terpineol berpengaruh pada siklus sel ada cenderung terjadinya akumulasi pada fase GO/G l terhadap set sel T47D.
30
•
t
H. Saran 1.
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut menggunakan senyawa a-terpineol
dengan tingkat kemumian lebih tinggi karena dalam penelitian ini kemurnian yang digunakan baru 51%. 2.
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengkaji mekanisme kerja antikanker senyawa a-terpineol pada titik tangkap intraseluler yang menimbulkan efek antikanker, serta bagaimana efek sel normal.
31
t
Daftar Pustaka
Alberts, B., Johnson, A, Lewis,
J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. 2008.
Molecular- Biology of The Cell; Fifth Edition, Gar�and- Science, New
York. Anonim. 1989. The Merck Index, 1 1 th edition. Merck & Co., United States. 9103.
Arifta,
T.A. and Budiman, A 2010. Simulation Study on Production of Alpha Terpineol From Alpha Pinen Isolated from Turpentin Using Reactive Distillation Column : To Be Presented at Regional Symposium on Chemical Engineering. RSCE Bankok.
Budiman; A. 20U); Sintesa- Senyawa· Antikanker Terpentin dari Hasil Hutan -Non Kayu (Terpentin), Laporan Penelitian Intesif Ristek. Perpustakaan Nasional Jakarta. Bestennan, J.M., & Macleod, A.R. 2000. Targeting Gene Regulator for Cancer Therapy. Mud Drug Disc. 51-58. Chrysomali. E, Nikitakis- NG, TosioS--K, Sauk -JJ, P.apanicolau SI. 2003. Immunohistochemical Evaluation of Cell Proliferation Antigen Kl-67 and Apoptosis-related Protein Bcl-2 and Caspase-3 in Oral Granular Cell T-umor,- .QraiSur.g-Orai-Me.J-OralPatlwl0r-alRadiolEndo:96;�512 ..
Darzynkiewicz, Z., Robinson, J.P., Roederer, M. (Eds.), 2009. Essential Cytometry Methods. Elsevier Inc., Oxford. DeFillippis, R.A., Goodwin, E.C., Wu, L., DiMaio, D., 2003, Endogenous Human Papillomavirus E6 and E7 Proteins Differentially Regulate - P-roliferation, Senescence, -and Apoptosis-·in- Hela- Cerv1cal- Carcinoma. Cells, Journal ofVirology, Vol.77, no.2, 1 5 5 1 - 1 563. Depkes RI .. 2009. Profll Kesehatan Indonesia 2008. Departemen Kesehatan - R.epublik· Indonesia, Jakarta, Doyle, A., Griffith, J.B. 2000. Cell and Tissue Culture for Medical Research. John WiJley & Sons LTD., New York. Food
and Drug Administration. 2000. IC50 Versus EC50. http://www.fda.gov/ohnn s/dockets/ac/00/slides/362 1 s l dlsld036.htm. Diakses- pada tanggal- 3 1- Oktober 20H .
Fremoiser, F.M., Jakob, C.A., Aebi, M., Tuor, U., 1999. The MIT [3-(4,5 Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazo lium Bromide] assay is a fast and reliable method for colorimetric determination of fungal cell densities. Appl. Environ. Microbiol. 65(8):3727-3729 Fr.eshney Rl. 2000. Culture ofAnima/Cells: A Manua/.ofBasc i Techniques,- 4-th edi., Wiley-Lies, Canada.
32
•
Galati, G., Teng S., Moridani, M.Y., Chan, T.S. dan O'Brien. 2000. Cancer che-mopreveBtion and · apoptosis mechanisms- · inducee - by dietary polyphenolics. Drog. Metabol. Drog. Interact. 1 7(1-4):31 1 -49. ·
Ghadek WJ, Kotala V, K uchtickovas MD, Horky. 2002. Induction of Apoptosis in- -Human- Cervix·-·CarciMma - - Ce/1- During- Therapy by Cisplatin, presented at the International Symposium on Predictive Oncology and Intervention Strategies; Paris, France; February 9-12, 2002; in the sootion .on- Apoptosis - Molecular- Mechanisms, Gilmor� T. 2011. NF-KB Transcription Factors. Available in http:// www.bu.edu/nf-kb/. Diakses pada tanggal 3 1 Oktober 201 1 . Givan, A.L. 2001. Flowcytometry: First Principle. Second edition. Wiley-Liss, New York Goldie J.H., 2001. Drug resisten in cancer: A Perspective, Cancer and Metataksis Rev, 20: 63-68 Hanahan, D., - dan - W.einberg, -�A 2000� The Hallmark of. cancer rev.iew. Cell. 100; 57-70.
Hassan SB, Gali-Muhtasib H, Goransson H dan Larsson R. 2010. Alpha ough' Supressing ·'ferpineeh A-Potential-Anticancer- Agent, which- Acts thr NF-KB Signal1ing. Anticancer Research 30(6): 191 1-1919. Hoffinan, E.J., 1999. Cancer and Search For Selective Biochemical Inhibitors, CR-C �, Booa-Raton; London -
-
-
-
Jemal A, Siegel R, Ward E, Hao Y,Xu J, dan. Statistics. Cancer J Clin 2009; 59:225-249.
Thun
M J. 2009. Cancer
K err, J.F.R., Winterford, C.M., Harmon, B.V. 1994. Apoptosis, it's significance in cancer and cancer therapy. Cancer 73(8):2013-2026. Liu, X., Zou, H., Widlak, P., Garrard W., Wang, X. 1999. Activation of apoptotic endonuclease DFF40 (caspase-activated DNase or Nuclease). J. Bioi. Chem. 274(20):13836-13840. Malumbres, M. dan Barbacid, M. 2009. Cell cycle, CDKs and cancer: a changing paradigm. Nat. Rev. Cancer 9: 153-166. Mooney, L.M., Al-Sakk:ai, K .A., Brown, B.L., Dobson, P.R.M. 2002. ApoptotiC mechanism in T47D and MCF�7 human breast cancer cells. Br. J. Cancer 2002(87) :909-9 17 Onuki, R., K awasaki, H., Baba, T., dan Taira, K., 2003, Analysis of A Mitochondrial Apoptotic Pathway Using Bid-Targeted Ribozymes in Human MCF7 Cells in the Absence of A Caspase-3-Dependent Pathway, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 13 {2): 75-82. Paus, R., Rosenbach, T., Haas, N., Czametski, B.M. 1993. Patterns of ce1l death: the significance of apoptosis in dermatology. Exp.- Dermatol, 1993(-2-):3� 11.
33
•
t
Prunet, C., Lemaire-Ewing, S., Menetrier, F., Neel, D., dan Lizard, G., 2005, Activation, of Caspase-3-Dependent- and- -Independent-i>athways During-7-Ketocholesterol- and 7P-Hydroxycholesterol-Induced Cell Death: A Morphological and Biochemical Study, Journal of Biochemical and
Molooular- Toxicology; 19{5):- -3-l-1""326, Reed JC. 2000, Mechanisms of Apoptosis. American Journal ofPatlwlogy (l57) 141 5-30.
1998. Apoptosis: identification of dying cells. Cell Boi. i Toxicol. 14:1 1 1-120.
Renvoize, C., Biola, A., Pallardy, M., Breard, J.
Ribble, D., Goldstein, N.B., Norris, D.A., Shellman, Y.G.
2005. A simple
technique for quantifying apoptosis in 96-well plates. BMC Biotechnol. 5( 12) : 1 -7. Roman-Aguierre, M., De Ia Torre-Saenz, L., Fores, W.A., Robau-Sanchez, A., and Elguezabal, A.A. 2005. Synthesis of Terpineol from a-pinene by
-homogeneous.acid .catalysis.-Catalysis-T-Oda,l07-l08: 310-314.Schafer, J.M., Lee, E.S., O'Regan, R.M., Yao, K., dan Jordan, V.C., 2000, Rapid Development ofTamoxifen-stimulated Mutant p53 Breast Tumors (T47D) in Athymic Mice, Clinical Cancer Research,
6, 4373-4380
Stankovic, M.S., Gurcic, M.G., Zizic, J.B., Topuzovic, M.D., Solujic, S.R., Markovic, S.D. 20 lL T .eucrium, plant Species- .as .natural-sources .ofnov.eL anticancer compounds: antiproliferative, proapoptotic and antioxidant properties. /nJ. J. Mol. Sci. 201 1(12):4190-4205.
Van de Velde, c.m:, Bosman, F.T. · wagener, D.J:T.
1 999-. Onkologi:
Terjemahan Arjono, Aryandono, T Snarto, Hesudoputro. H.K Kank:er RSUP Dr. Sarjito, Yokyakarta. .•
van
.•
Panitia
Engeland, M., Nieland, L.J.W., Ramaekers, F.C.S., Schutte, B., Reutelingsperger, C.P.M. 1998. Annexin V- affinity assay: A review on an . apoptosis detection. system. based on. phosphatidylserine. exposure.
Cytometry 3 1 : 1 -9. 2009.
WHO.
Cancer.
ctshootsl 29-7/en/indeK. htmihttp://www;wbo1nt/mediaoontre/fafs. Zampieri
,
L., Bianchi, P., Ruff, P., dan Arbuthnot, P., 2002, Differential
modulation by estradiol of P-glycoprotein drug resistance protein expression in cultured MCF7 and T47D breast cancer cells, Anticancer Res., 22(4):2253-9.
Zhou YD; K--im-YP, Mohammed KA, Jones-OK,
Muhammad I, Dunbar DC dan
Nagle DG. 2005. The Terpenoid Tetrahydroisoquinolone Alkaloids Emetine, Klugine, and isocephaline Inhibit the Activation of hypoxia
Inducible-Factor--1 - (HIF--1-) in Breast Tumor Cells. JNat Prod 68( 6):947950.
34
•
t
L AMPIRAN
Persentase penghamb atan pertumbuhan sel kanker payudara T47D setetil:h peniberian bil:han ujl dengan masa itiktibasi 24 jam menggunakan metode MIT assay Bahan uji Konsentrasi Persentase Penghambatan {J!M)
Lampiran 1.
Ulangan 1
rerata 2
3
Alfa terpineol
450,00
95,51
96,88
95,71
96,03
400,00
92,39
93,56
92,39
92,78
350,00
89,27
91 ,03
88,69
89,66
300,00
76,79
76,60
78,35
77,25
250,00
64 ,3 1
63,73
60,02
200;00- -59;24· "59A3- -s&,o7
doxorubisin
atfa-terpineol sintetik
62,68 -s&,9I·
·
1 5 0,00
54,36
5 1,24
51,83
52,48
100,00
5 1,05
38,57
33,50
41,04
- so�oo - ·t 2;43
25�-
rs-,75 ·
1 7;89 ·
1 72,40
83,98
83,98
82,19
83,38
86,20
70,60
69, 15
68,15
69,30 60,57
43,10
59,68
61,46
60,57
21,60
45,86
45,08
43,07
44,67
l0i80
42,18- 42;96- 41�62
42-,25
5,40
38,28
39,84
41,51
39,87
3000,00
97,12
97,89
99,04
98,02
2800,00
80,42
80,81
77,54
79,59
2600,00
44,91
45,30
49,71
46,64
2400;00
49;33
40;50
44�9 1
2200,00
44�91 -
52,40
51,25
46,64
50, 1 0
2000,00
34,74
33,21
38,58
35,51
1 800,00
20,73
22,07
22,65
21,82
1600,00
22,84
25,34
26,68
24,95
35
•
t
Lampiran 2. Persentase penghambatan pertumbuhan sel
kanker payudara MC7 24 - jam
setelah pemberian · bahan uji deHgan· · masa- inkubasi menggunakan metode MTT assay ·
Bahan uji
Konsentrasi
·
·
Persentase Penghambatan
(J.lM) rerata
Ulangan
Alfa terpineol
3 12;5() 156�5 78,00 39,00 1 9,50 · 9,75 1 72,40 86,20
1 3 98;72 91�9T 45,87 7,52 6,79 6;-6186,99 75,79
43;W· - 59�tsdoksorubisin
Alfa··terpineolsintetik
2 1 ,60 10,80 5,40 2,70 ·1 }30- 12500,00 6250,00
55,82 46,30 43,12 46,67 38,27 99,00 83,75
2 94,5() 90,09 49,72 8,44 4,59 h65 81,21 70,01 -s-t-;7150,40 48,54 41,63 39,02 35;10 96,75 81,00
96;33 84,40 45,50 8,26 4,04 3j8-5 - 96,51 67,21 -53;5-s45,55 39,58 37,34 37,90 33,9896,00 68,00
96;51 88,81 47,03 8,07 5,14 4�04 88,24 71,00 - 54�g2 50,59 44,80 40,70 41,19 35;78 97,25 77,58
3 125,00
35,50 40,75 35,50 1 1 56,30 26,50 25,25 28,50 786�00 - 5,25 6�00 4�50 390,00 1,75 3,25 3,00
37,25 26,75 5,25 2,67
36
I -
--
�
�
•
