LAPORAN AKHIR PENELITIAN
Pengembangan Sistem Pendeteksi Aktivitas Sel Sitotoksik CDS dari Hewan Coba Pasca lmunisasi dengan Hemaglutinin (HA) Virus Influenza H5N1 dan H1N1 2009
Penyusun Laporan : 1. Ekawati Betty Pratiwi, S.Si. 2. Lydia Mursida, S.Si.
INSTITUTE OF HUMAN VIROLOGY AND CANCER BIOLOGY OF THE UNIVERSITY INDONESIA FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIA Gedung IASTf1i Lt.8. Kampus Ul Jl. Salemba 4, Jakarta 10430, Indonesia 2011
LAPORAN AKHIR PENELITIAN
Pengembangan Sistem Pendeteksi Aktivitas Sel Sitotoksik CDS dari Hewan Coba Pasca lmunisasi dengan Hemaglutinin (HA) Virus Influenza H5N1 dan H1 N1 2009,
_
--:--:� atan : }(c seh : :-; :
.-----
_
I> . ' ·•an dan peng e m biln 6adan reoeHtian
PERPUSTAKAAN
Tanggal No. lo�nk No. Klass
: ---: bO�--ti� \Q � : ·.;...
���
�-
Penyusun Laporan: 1.
Ekawati Betty Pratiwi, S.Si.
2.
Lydia Mursida, S.Si.
INSTITUTE OF HUMAN VIROLOGY AND CANCER BIOLOGY OF THE UNIVERSITY INDONESIA FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIA Gedung IASTH Lt.S. Kampus Ul Jl. Salemba 4, Jakarta 10430, Indonesia 2011
:;-
UNIVERSITAS INDONESIA FAKULTAS KEDOKTERAN Jalan Salemba Raya No. 6, Jakarta Pusat Pos Box 1358 Jakarta 10430 Kampus Salemba Telp. 31930371,31930373,3922977,3927360,3912477,3153236,Fax.: 31930372,3157288, e-mail:
[email protected]
Nomor :"2->11 H / . 2 F1.0P / PM0 . 0 0 . 32 / 012
1.)-
Febru ari 0 2 12
Lamp. : satu berkas Perihal: Laporan Akhir Penelitian Risbin lptekdok Badan Litbangkes Tahun2011
an. Ekawati Betty Pratiwi, SS
Yth. Kepala Badan Litbangkes Kementeria.n Kesehatan Rl Jl. Percetakan Negara No. 29 Jakarta
Dengna hormat, Mengacu
Surat Perjanjian Kerjasama
antara Badan Penelitian dan Pengembangan
Kesehatan (Badan Litbangkes) Kementerian Kesehatan Rl denganUniversitas lnddnesia Nomor: HK0 . 60 . 1 /1/1056/2011
dan �omor: 039/PKS/FK/UI/2011
tanggal11
Maret2011
tentang Riset Pembinaan llmu Pengetahuan & Teknologi Kedokteran (Risbin lptekdok), bersama ini disampaikan hasil penelitian akhir dari peneliti : Ekawati Betty Pratiwi, SS
Demikian kami sampaikan, atas perhatian dan kerjasamanya diucapkan terima kasih.
Tembusan: 1 . Wakil Oekan FKUI
2. Sekretaris Fakultas FKUI
3. P ara Manajer FKUI
LEMBAR PENGESAHAN RISBIN IPTEKDOK
Judul riset
1.
2011
: Pengembangan Sistem Pendeteksi Aktivitas Sel Sitotoksik CDS dari Hewan Coba Pasca Imunisasi dertgan Hemaglutinin (HA) Virus Influenza HSNl dan HlNl 2009
Periset utama
2.
a. Nama lengkap dan gelar akademik b.
Jenis kelamin
c.
Pangkat/Golongan!NIP
: Ekawati Betty Pratiwi, S.Si. : Perempuan
d. Unit Kerja
: Insitute of Human Virology and Cancer Biology (IHVCB UI)
Periset utama
3.
No
Nama Periset
Waktu Riset
Pendidikan
Qam/pekan)
terakhir
16
Sl
Waktu Riset
Pendidikan
Garn!pekan)
terakhir
16
Sl
Ekawati Betty Pratiwi
1
NIPINUP
-
4. Penset anggota No
Nama Periset Lydia Mursida
1
NIPINUP
2
Perjanjian Kerjasama Badan Litbang Kesehatan dan Universitas Indonesia
5.
a. Nomor
:
b. Tanggal
HK.06.01/1/1056/2011 : l1 Maret 2011
6.
Lama riset
:6 bulan
7.
Talmn pendanaan
:2011
8.
Total biaya riset
: Rp. 126.305.000,Jakarta, 23 Desember 2011
Mengetahui, .�.... .. �ltas/Ketua Program PascasarJana UI/ If :-;.;-:. · :.� :qe;f��Tk� · :)>·(} ·.<. . . Kepala Pusat Riset
r.�:.::��
.... �.. !: .....:._.... ... f � ��-:���"' ···' �e�n. �.r_
_
•
tr.
�;-:. ·3:�;f�:: �t Fi�QJ#7llt'( :J? �·
:-:
.,·;· : ;· . � 2 -: P : . .
.
.: "; ��:
� Pr. Ratna Sitompul, Sp.M(K)
'_.-'�"JP
19610206 198703 2 005
Periset Utama
UNIVERSITAS INDONESIA FAKU�TAS KEDOKTERAN Ialan Salemba Raya No."6, Jakarta Pusat Pos Box 1358 Jakarta 10430
Kampus Salemba Telp. 31930371, 31930373, 3922977, 3927360, 3912477, 3153236, Fax.: 31930372, 3157288, e-mail:
[email protected] Surat Pernyataan Saya yang bertanda tangan di bawah ini: Nama Lengkap
: Ekawati Betty Pratiwi, SS
Nomor lnduk Pegawai Asal lnstansi
: Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia (FKU I)
Judul Penelitian
Dengan
ini
Sistem Pendeteksi Aktivitas Sel Sitotoksik CD8 dari Hewan Coba Pasca lmmun is asi dengan Hemaglutinin ( HA) virus Influenza H5N1 dan H1N1 2009.
: Pengembangan
menyatakan
kesanggupan
untuk
menyelesaikan
penelitian
Riset
Pembinaan llmu Pengetahuan dan Teknologi Kedokteran yang telah dilakukan pada tahun 2011, sesuai dengan Surat Perjanjian Kerjasama yang ditandatangani pada tahun 2011 (perielitian tahun ke-1 ). Apabila
dikemudian
hari,
Saya · tidak
dapat
menyelesaikan penelitian
seperti
.ketentuan terse but di atas, maka seg ala akibat yang timbul dari penelitian tersebut
menjadi tanggung jawab Saya sepenuhnya dan seluruh biaya penelitian yang telah
diterima akan saya kembalikan kepada Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan. Demikian Surat Pernyataan ini Saya buat tanpa ada paksaan dan untuk dapat
dipergunakan sebagaimana mestinya .
Jakarta, 9 Februari 2012
M�ng�phui,
_ ..
'De��n
tr
f��ultas Kedokteran Ul
buat pernyataan,
X/ilflfot•
: ..
'.
.�
� Dr. dr,. .J��f�-� Sitompul, SpM(K) \_,.NIP. ·t�6·1 0206 198703 2 005 •.
Ekawati Betty Pratiwi, SS
ABSTRAK Salah
satu
parameter
dalam
pembentukan sel T CD8.
keberhasilan
pengembangan
suatu
vaksin
adalah
Aktivitas sel T CD8 selama ini diukur menggunakan gold
standard berupa pengujian chromium r elea sing assay dan ELISPOT.
Berbagai
kekw-angan dalam kedua metode tersebut memicu untuk dikernbangkam1ya suatu metode deteksi aktivitas sel T CD8 berdasarkan aktivitas fluoresens sel target. awal dalam pengembangan ini adalah konstruksi vektor plasmid
Tahap
penyandi gen
Hemaglutinin (HA) dari H5Nl dan protein penanda enhanced Green Fluoresens (eGFP).
Kedua j enis p rotein tersebut dikonstruksi sehingga dapat t ere k spre si secara
tandem dengan memanfaatkan sekuen Intemal Ribosomal Sekuens (IRES) HIV yang berada di antara
kedua
sekuen protein.
Verifikasi sekuensing terhadap hasil
pengklonaan menunjukkan bahwa gen Hemaglutinin
(HA)
H5Nl-IRES HIV-eGFP
berhasil diklona ke dalam vektor plasmid pcDNA5FRT/TO.
Pengujian transfeksi
transien terhadap seluruh klona plasmid, yaitu dengan mentransfeksikan plasmid plasmid wild type pcDNA5FRT/TO, pcDNASFRT/TO-eGFP, pcDNASFRT/TO-IRES GFP, dan pcDNASFRT/TO- H A HSNl-IRES-GFP ke dalam sel Hela menunjukkan bahwa protein Hemaglutinin dan eGFP be rh asil diekspre sik an secara tandem. Kata Kunci:
CD8, pcDNASFRT/TO-HAHSNl-IRES-eGFP, transfeksi transien.
DAFTAR ANGGOTA TIM PENELITI
1. Peneliti pertama
Nama
:Ekawati Betty Pratiwi, S.Si.
Alamat
:Institute of Human Virology and Cancer Biology of the University ofIndonesia (IHVCB-UI) Gedung IASTH Lantai 8 Kampus Universitas Indonesia Jalan Salemba 4, Jakarta 10430 Telp.: (021) 3154091, Fax: (021) 31930353 E-mail:
[email protected]
2.
Peneliti kcdua
Nama
:Lydia Mursida, S.Si.
Alamat
:Institute ofHuman Virology and Cancer Biology ofthe University of Indonesia (IHVCB-UI) Gedung IASTH Lantai 8 Kampus Universitas Indonesia Jalan Salemba 4, Jakarta 10430 Telp.: (021) 3154091, Fax: (021) 31930353 E-mail:
[email protected]
11
KATAPENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa atas segala karunia yang diberikanNya kepada penulis sehingga dapat menyelesaikan penelitian Kepada tim panel pakar risbin iptekdok
ini.
2011, dr. Fera Ibrahim, MSc, PhD,
SpMK(K), Prof. Supratman Sukowati, PhD., dr. Tri Wibawa, PhD., Drs. Tedjo Sasmono, PhD., Dra. Rintis Noviyanti, PhD., Prof. Nasrum Massi, PhD., dr. Emiliana Tjitra, DTM&H, MSc., PhD., dan Dr.dr. Cita RositaSigit Prakoeswa, SpKK(K), penulis mengucapkan terima kasih dan penghargaan sebesar-besarnya atas kesediaan dalam membimbing, menguji dan memberikan saran-saran sehingga saya dapat menyelesaikan penelitian ini. Kepada direktur dan wakil direktur PPLKVKP UI, dr. Fera Ibrahim, MSc, PhD,
SpMK(K) dan Dr.dr. Budiman Bela, SpMK(K), penulis menyampaikan terima kasih atas kesempatan dan birnbingan yang diberikan kepada penulis, sehingga penulis memiliki kepercayaan diri dalam mengerjakan penelitian. Kepada drh. Silvia Tri Widyaningtyas, Mbiomed, penulis mengucapkan rasa terima kasih yang sebesar-besarnya atas bimbingan dan dorongan semangat serta bantuan yang diberikan dalam pelaksanaan teknik laboratorium dan dalam penulisan laporan hasil penelitian. Kepada
peneliti
kedua
risbin
iptekdok
ini,
Lydia Mursida, S.Si.
,
penulis
menyampaikan rasa terima kasih untuk kerja sama dan bantuan yang diberikan selama penelitian ini berjalan. Kepada rekan peneliti di PPLKVKP, drh. Sofy meilany, Nidya
Sutanto, S.Si dan Aulia Ornella, S.Si., penulis mengucapkan terima kasih untuk segala bantuan yang diberikan dalam mengerjakan penelitian ini, juga untuk dorongan semangat yang diberikan kepada penulis. Akhir kata, penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu, memberikan doa dan semangat, hingga penelitian walaupun memang belum sempurna adanya.
Semoga penelitian ini bermanfaat bagi
pengembangan teknologi dalam ilmu dan pelayanan kesehatan. Jakarta, Februari
2012
Penulis lll
ini dapat selesai,
DAFTARISI HALAMAN SAMPUL HALAMAN JUDUL SURATPENGANTAR LEMBAR PENGESAHAN SURATPERNYATAAN ABSTRA.K
.....................................•...........•............................................................
DAfi'AR ANGGOTA TIM PENELITI
..............................................................
i
ii
KATA PENGANT AR
........................................................................................•.............
DAFTAR lSI
.....................................................................
DAFTAR GAMBAR DAFTAR TABEL
.
.................................
.•....................••....•...................•.......................•....•............
..................................................................................•...........
BAB I PENDAHULUAN
.............
.
........................
iii
iv vi
vii
Error! Bookmark not defined.
1.1 Latar Belakang ... .......... .......... . ... ....... Error! Bookmark not defined. ..
.
.
..
1.2 Tujuan Penelitian .................................... Error! Bookmark not defined. 1.3 Manfaat Penelitian. .... .
. .. .
..... ......... ................................. ..... ....... .... ........2 .
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
.
.
.
..
..•........................................................•.............
2.1 Virus Influenza A .......... ...... ........................... ..... . ..
.
.
.
3
........... .. ............. 3
...
.
.
2.2 Struktur dan Morfologi Virus Influenza A ......... ....... ... .. ....... ......... ... 3 .
2.3 Struktur dan Fungsi Hemaglutinin
.
.
.
.
..
(HA) virus Influenza A ....... ............. 4 .
2.4 Fluorescent antigen-transfected target cell CTL assay sebagai metode deteksi aktivitas sitotoksik sel CD8 ........................ .. ... .......... .
BAB III METODOLOGI
.
.
...
.............•.........................................•............................
5 7
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian . .... ........................ . . . . ........... ... ... .. .. 7 .
3.2 Metodologi Penelitian .. . . .
..
BAB IV HASIL PENELITIAN
...
.
.
.
...
.
.
.
.
.
.
...... .............................. ...... ...... . ...... . .. 7 .
.
..
.
..
..
..
........................................................................
10
4.1 Primer untuk Sekuensing dan Pengklonaan gen HA ............ . ... ... ... . . 10 .
IV
..
.
.
.
4.2 Pengklonaan gen eGFP ke dalam Plasmid Rekombinan pcDNASFRT/TO .................................................................................... 1 1 4.3 Pengklonaan gen IRES HIV ke dalam Plasmid pcDNA5FRT/TO-eGFP .......................................... ..,.............................. 13 4.4 Pengklonaann gen HA (Hemaglutinin) H5N1 dan H1N1 ke dalam vektor plasmid pcDNASFRT/TO ................................................ 14 4.5 Pengklonaan gen fusi HA-HSNI dengan eGFP ke dalam vektor pcDNASFR TITO ......................................................................... 16 4.6 Pengklonaan gen IRES HIV I-IIV e-GFP ke dalam pcDNA5FRT/TO-HAH5N1 ................................................................... 18 4.7 Transfeksi transien plasmid pcDNASFRT!fO-IRES HIV eGFP ....................................................................................................... 19 BAB V PEMBAHASAN ........ .. . . ..... .... ... ....... ........ ...... .... ..... ... . .... 20 ..
..
..
..
.
..
..
.
.
.
.
..
.
..
5.1 Pembuatan primer untuk amplifikasi dan persiapan sekuensing dan pengklonaan plasmid rekombinan ................................ 20 5.2 Pengklonaan gen eGFP ke dalam vektor plasmid pcDNASFRT/TO .................................................................................... 20 5.3 Subklona gen IRES-HIV ke dalam vektor plasmid pcDNASFRT /TO-eGFP ......................................................................... 22 5.4 Pengklonaan gen HA (Hemagutinin) H5N1 dan HIN1 ke dalam plasmid pcDNA5FRT/TO ........................................................... 23 5.5 Pengklonaan gen Hemaglutinin HlNl ke dalam plasmid pcDNA5FRT/TO-HAH1N l
...................
Error! Bookmark not defined.
5.6 Subklona eGFP ke dalam plasmid pcDNA5FRT/TOHAH5N1
.
......................
..........................
Error! Bookmark not defined.
5. 7 Subklona gen IRES HIV dan eGFP ke dalam pcDNA5FRT/TO-HAH5N1
...
.....
......
. . Error! Bookmark not defined. .
..
5.8 Transfeksi transien untuk uji fungsi IRES-HIV dalam mengekpresikan eGFP 5.9
............................
Error! Bookmark not defined.
Transfeksi pcDNA5FRT/TO-HAH5N1-IRESeGFP
.......................................................................................... ..............
BAB VI KESIMPULAN DA.N SARAN .. .. ..
6.1 Kesimpulan 6.2 Saran
...........
. .. . .
.
.............
..
.........................................
...
.. ... .... .. ...................... ...... ..... 28
.............
...
27
...........
..
.
..
.
Error! Bookmark not defined. Error! Bookmark not defined.
DAFTAR PUSTAK.A . ...... ........ ...... .... ................ . . .. . .. ..... .. .... ...... .... .. ... ....29 .
.
UCAPAN TERIMA KASIH..
.
....
..
.
.
.
..
...
.... ......... .. .................... ........ . .... .... . ............ .31 ..
v
.
.
.
.
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1: HasH isolasi plasmid pcDNASFRTffO ............................................................ 11 ·Gambar 2: Hasil ekstraksi gel dari pcDNASFRT/TO dan eGFP Error! Bookmark not defined. Gambar 3: Hasil isolasi plasmid pcDNASFRT/TO-eGFP
......
Error! Bookmark not defined.
Gambar 4: Hasil restril{Si pcDNASFRTffO-eGFP dengan Notl dan XholError ! Bookmark not def ·Gambar 5: Hasil PCR plasmid pcDNASFRTITO-eGFP dengan primer spesifikError! Bookmark n Gambar 6: Hasil isolasi plasmid pcDNASFRT/TO-IRES-GFP ......................................... 13 Gambar 7: Hasil restriksi EcoRV dan Hindlll terhadap pcDNASFRT/TOI"RESHIV-GFP . . . .. . . .....
.... .
.
.
. .. ...................................................................
. . 14
..... .
Gambar 8: Hasil restriksi plasmid pcDNASFRTITO dan fragmen HA-HSN1................ 14 Gambar 9: basil isolasi plasmid pcDNASFRT/TO-HAHSNl. ........................................... 15 Gambar 10:Hasil restriksi pcDNASFRTITO-HAHSNl dengan Hindlll.......................... 15 Gambar 11: Hasil restriksi pcDNASFRTITO-HAHSNl dcngan Kpnl............................. 16 Gambar 12: Hasil isolasi plasmid pcDNA5FRTITO-H1N1. ............................................... 16 Gambar 13: Hasil restriksi DNA vektor dan insert dengan Pstl....................................... 1 7 Gambar 14: Hasil isolasi plasmid pcDNASFRT/TO-HAH5Nl-eGFP............................... 17 Gambar 15: Hasil rcstriksi pcDNA5FRT/TO-HAH5N1-eGFP dengan Hindlll ............. 18 Gambar 16: Hasil purifikasi gel vektor dan insert untuk konstruksi plasmid rekombinan pcDNASFRTITO-HAHSNl-IRES HIV-eGFP....................... 18 Gambar 17: Hasil PCR koloni plasmid pcDNA5FRT/TO-HAH5N1-IRES HIV-eGFP 19 ..
Gambar 18: Hasil transfeksi 50 11g/ml plasmid ke dalam sci Hela .................................... 19 Gambar 19: Hasil transfel{Si 100 Jlg/ml plasmid ke dalam sel Hela.................................. 19 Gambar 20: Skema prosedur subklona gen eGFP ke dalam pcDNA5FRT/T0
............
.. .20>
Gambar 21: Skema pengklonaan gen IRES mv ke dalam vektor pcDNASFRT/TOeGFP 22 .................................................................................................................
Gambar 22: Skema pcDNA5FRTITO-HAH5Nl dan pcDNA5FRT/TO-eGFP ................25
Vl
DAFTAR TABEL
Tabel l: Daftar primer untuk sekuensing dan pengklonaan plasmid rekombinan
Vll
........
10
1
BABI
PENDAHULUAN
1.1.
LATAR BELAKANG Sampai saat ini hewan coba mencit banyak digunakan untuk menguji efektivitas
vaksin. Keberhasilan suatu vaksin untuk menginduksi kekebalan tubuh dapat dideteksi melalui beberapa parameter. Parameter pertama adalah pembentukan antibody yang dapat menetralisir antigen, sedangkan parameter yang lain adalah pembentukan sel sitotoksik CD8. Secara alamiah pada infeksi virus influenza keberadaan kedua macam kekebalan tubuh tersebut sangat diperlukan untuk mencegah infeksi. Antibodi akan menetralisir baik virus yang akan menginfeksi saluran nafas maupun virus barn yang dihasilkan sel terinfeksi. Sedangkan sel sitotoksik CD8 berperanan dalam melisiskan sel-sel pemroduksi virus. Dasar penilaian aktivitas sitotoksik CD8 adalah dengan mengukur bahan (dapat berupa sitokin; radioaktif atau fluorescent) yang dikeluarkan atau dihasilkan oleh sel target.
Metode yang banyak digunakan untuk mendeteksi aktivitas tersebut adalah
Chromium (1Cr) releasing assay. Assay ini
cukup sensitif namun memerlukan
penanganan khusus baik pada saat pelaksaan uji maupun pada saat pembuangan limbah supaya tidak membahayakan makhluk hidup dan lingkungan (Neri
et al. 2001).
Berdasar hal tersebut di atas maka dikembangkan penggunaan bahan-bahan fluorescent. Salah satu bahan fluorescent yang
tersebut adalah calcein-acetoxymethyl
( calcein
AM). Pengukuran aktivitas sel CD8 didasarkan pada pengeluaran substrat berwarna pada supernatant kultur yang diukur menggunakan peralatan tertentu (Neri
eta/., 2001).
Metode lain yang dikembangkan untuk mengukur aktivitas sel CD8 adalah mendeteksi bahan aktif yang Interferon gama
dikeluarkan oleh sel CD8 teraktivasi.
Bahan tersebut antara lain
(IFN y) dan Granzyme (Shefer-wefer et al
,
2003) yang dideteksi
dengan Elispot. Namun demikian Elispot memerlukan bahan dan peralatan khusus untuk membaca hasil uji
(Elispot reader) dengan harga relative mahal. Aktivasi CD8
pada uji-uji diatas dilakukan dengan menggunakan peptida yang harganya relative mahal.
Oleh karena itu diperlukan kecermatan saat pemilihan jenis peptide yang akan
digunakan karena kesalahan pemilihan
peptide selain menghabiskan anggaran juga
akan menimbulkan kesalahan interpretasi hasil.
Oleh karena itu beberapa peneliti telah
2
mengembangkan cara pendeteksi aktivasi CDS tanpa menggunakan peptide. Metode ini melibatkan penggunaan sel kultur yang
mengekspresikan
antigen dan protein
fluorescent seperti Green Fluorescent protein (GFP) secara bersamaan (Bonci et al, 2009). Sel CD8 akan mengenali antigen yang dipresentasikan sel dai1 kemudian akan melisiskan sel tersebut.
Sel-sel yang tidak dilisiskan akan dihitung dengan
menggunakan flowsitometri. Dalam penelitian ini akan dikembangkan sel target yang mengekspresikan antigen hemaglutinin (HA) virus influenza) dan enhanced(e)GFP secara bersamaan. Gen penyandi Antigen HA yang akan digunakan adalah gen HA virus H5Nl dan HlNl 2009 (novel H l N l ). Vektor ekspresi yang digunakan dalam ini adalah vector ekspresi mamalia pCDNA5 FRT/TO yang memiliki system on/off gene, dimana ekspresi gen rekombinan dapat diinduksi dengan suatu macam agen. Pembentukan sel target akan dlakukan dengan melakukan transfeksi vector ekspresi pembawa gen penyandi protein rekombinan pada sel Flpin293. Sel Flpln 293 mengandung sikuen DNA yang dapat berekombinasi
dengan plasmid
pCDNA5FRT/TO.
Rekombinasi
tersebut
akan
menyebabkan DNA plasmid terintegrasi di dalam kromosom sel Flpln 293. Hal ini akan mempermudab seleksi sel yang mengekspresikan protein rekombinan secara stabil. Diharapkan pada
akhir
penelitian akan diperoleh plasmid rekombinan penyandi
gen HA dan eGFP yang mampu diekspresikan secara tandem. Plasmid tersebut akan ditransfeksi transien untuk mengetahui aktivitasnya. 1.2.
TUJUAN PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan sel yang stabil mengekspresikan protein HA dan eGFP untuk digunakan dalam sistem deteksi aktivitas sel T sitotoksik. 1.3.
MANFAAT PENELITIAN
Diharapkan basil dari penelitian ini diperoleh konstruksi plasmid penyandi gen Hemaglutinin (HA) dan eGFP yang kemudian diekspresikan secara stabil dalam sel mamalia sebagai sistem deteksi aktivitas sel T CDS.
3
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Virus Influenza A Virus Influenza A merupakan salah satu genera famili famili
Orthomyxoviridae. Anggota
Orthomyxoviridae lainnya ialah virus Influenza B, C dan Thogavirus. Selain
menginfeksi manusia virus Influenza A memiliki cakupan inang yang luas meliputi unggas dan mamalia, sedangkan infeksi virus Influenza B dan C hanya ditemukan pada manusia.
Virus Influenza A dan B menyebabkan epidemi pada manusia, sedangkan
virus Influenza C biasanya menyebabkan penyakit dengan gejala flu ringan. Penamaan virus Influenza dilakukan dengan menyebutkan tipe virus (A, B atau C), tempat isolasi dan tahun isolasi, secara berurutan, sedangkan khusus untuk Influenza A disebutkan juga subtipenya (Danzig dan Fukuda
2001).
Infeksi virus Influenza A mudah menular serta bermanifestasi sebagai penyakit pernapasan akut dengan gej ala yang bervariasi dari sedang sampai be rat (Danzig and Fukuda 2001; Khanna
et al., 2008). Dibandingkan dengan virus Influenza B dan
C,
virus Influenza A bermutasi jauh lebih cepat sehingga memiliki keragaman antigenik yang lebih bervariasi sehingga berpotensi lebih tinggi dalam hal virulensi. Fleksibilitas antigenik virus Influenza A sebagai akibat lajut mutasi yang tinggi memungkinkan munculnya subtipe virus Influenza A barn yang tidak dikenali oleh imunitas suatu populasi sehingga berpotensi menimbulkan pandemi (Khanna
2.2.
et al., 2008).
S trukt ur dan Morfologi Virus Influenza A
Virus Influenza A merupakan virus RNA berenvelop. Genom virus terdiri atas
8
segmen RNA serat tunggal berpolaritas negatif dengan ujung komplementer parsial membentuk struktur tertutup (McGeoch
et a!., 1976; Desselberg 1980, Coloma et a!,
2009 ). Segmen RNA virus berasosiasi dengan beberapa monomer nukleoprotein (NP) dan satu kopi polimerase virus yang merupakan suatu heterotrimer terdiri atas subunit PB1, PB 2 dan P A (Murti
et a!, 1988; Palese et a!, 2006). Kompleks RNA virus dengan
NP dan heterotrimer polimerase disebut ribonukleoprotein (RNP). Pada analisis mikroskop elektron partikel RNP virus terlihat sebagai struktur superkoil fleksibel (Compans
et a!., 1972; Pons et al., 1969).
4
Di dalam partikel vims, RNP dilingkupi oleh suatu cangkang protein matriks (Ml) bersifat hidrofobik (Allen etal., 1980; Winter & Fields, 1980; Lamb & Lai, 1981; McCauley etal., 1 982). Di bagian luar cangkang protein matriks terdapat lapisan membran lipid yang berasal dari membran sitoplasma sel terinfeksi yang menyelubungi partikel virus pada saat pertunasan (budding) virus (Kates eta/., 1962). Pada membran lipid tersebut terdapat dua glikoprotein permukaan membentuk tonjolan (spike) yaitu hemaglutinin (HA), neuraminidase (NA) dan protein kanal membran (M2) (Sebedee dan Lamb, 1988). Hemaglutinin merupakan protein selubung virus denganjumlah molekul terbanyak yaitu kira-kira 80 persen protein selubung, diikuti oleh NA sebesar 1 7 persen, sedangkan M2 merupakan komponen protein selubung virus yang paling sedikit, yaitu 16-20 molekul per partikel virus (Nayak et al., 2009; Schroeder etal, 2004). HA terdiri atas subunit trimer identik yang berikatan dengan reseptor pada permukaan sel serta memiliki aktivitas fusi membran yang teraktivasi pada pH rendah dalam endosom saat virus masuk ke dalam sel (Wharton eta/., 1 990).
2.3.
Struktur dan Fungsi Hemaglutinin (HA) virus Influenza A
Protein hemaglutinin merupakan protein membran integral dan antigen permukaan utama virus Influenza. Protein ini berfungsi untuk pengikatan reseptor sel target dan fusi antara selubung virion dan sel target. Hemaglutinin disandi oleh segmen RNA 4 dan mengal ami tiga jenis proses pasca translasi yaitu pemisahan proteoltik, glikosilasi i
dan asilasi asam lemak. Glikoprotein HA berperan sangat penting (Garten dan Klenk, 1 999; Steinhauer, 1999). Infeksi diawali dengan pengikatan virus pada reseptor sel dan menyebabkan lepasnya RNP virus melalui fusi membran (White eta/., 1982). Aktivasi proteolitik oleh protease inang pasca translasi prekursor molekul HA menghasilkan subunit HAl dan HA2. Pada subunit HAl terdapat domain pengikat reseptor asam sialat, sedangkan terminal amino HA2 terdapat "domain fusogenik" yang memperantarai fusi antara selubung virus dan membran endosom. Aktivasi molekul HA oleh reaksi proteolitik sangat penting untuk infektivitas (Klenk etal., 1975; Lazarowitz dan Chopin, 1975) dan untuk penyebaran virus pada tubuh inang (Garten dan Klenk, 1 999). Hemaglutinin virus avirulen biasanya dapat terpisah terbatas hanya pada beberapa tipe sel, sehingga virus dapat menyebabkan infeksi lokal dalan1 saluran napas dan saluran
5
pencernaan, atau pada keduanya menghasilkan infeksi ringan atau asimtomatik. Hemaglutinin pada virus avian tipe virulen dapat terbelah pada berbagai macamjenis sel dan dapat menyebabkan infeksi sistemik sehingga dapat menyebabkan kematian pada ayam. Pada kultur jaringan, virus HA tipe virulen
dapat terbela"h tanpa protease
eksogen seperti tripsin, sedangkan pada virus avirulen hal ini tidak dapat dilakukan. Hal ini menunjukkan adanya perbedaan sensitivitas dari dua jenis HA terhadap protease seluler endogen (Bosch
et al., 1979). Penemuan ini berimplikasi bahwa kemudahan
dalam pemotongan HA merupakan salah satu penen:tu utama pada infeksi jaringan oleh Influenza avian. Perbedaan distribusi protease jaringan dan kepekaan HA terhadap enzim ini menentukan terjadinya infeksi virus.
2.4. Fluorescent antigen-transfected target cell CTL
assay sebagai metode
deteksR
aktivitas sitotoksik sel T CD8 Vaksinasi merupakan salah satu upaya untuk merangsang respon imun tubuh terhadap patogen tertentu yang dimasukkan ke dalam tubuh. Beberapa macam vaksin telah dikembangkan sampai saat ini, antara lain
attenuate d vaccine, recombinant
vaccin e, dan DNA vaccine. Di antara berbagai macam vaksin tersebut, salal1 satu yang saat ini sedang dikembangkan adalall vaksin DNA. Perkembangan vaksin DNA berawal dari keinginan untuk menghasilkan respon sel T sitotoksik terkait MHC-I dengan memahami perbedaan jalur pemrosesan
antigen intraseluler. Protein yang
disintesis pada sel-sel somatik dapat menghasilkan peptida yang berasosiasi dengan + molekul MHC-I untuk dipresentasikan pada sel limfosit CD8 (Donnelly
dkk. 2005).
Salall satu penanda keberhasilan vaksinasi adalah terjadinya induksi respon sel T yang kuat. Sel T sitotoksik (CTL) merupakan komponen kunci dalam respon imun yang diperantarai sel (cell-mediated immune response) dan berperan penting dalam perlindungan terhadap berbagai patogen. CTL diketahui memiliki peran penting dalam mengontrol infeksi HIV dan lentivirus lainnya. Oleh karena itu, penentuan terhadap aktivitas sel T sitotoksik menjadi suatu parameter penting dalam menguji efikasi kandidat vaksin maupun imunoterapi lainnya ( Bonci dkk. 2009) Dua metode uji yang umum digunakan untuk mengetahui aktivitas sel T sitotoksik pada terapi kanker atau pengujian vaksin adalah
51 Cr-release assay dan IFN-r
ELISPOT assay. Uji ELISPOT tidak secara langsung menggambarkan aktivitas sel T
6
sitotoksik (Zaritskaya dkk. 201 0). Uji 51Cr-releasing assay yang sampai saat ini masih dianggap sebagai sistem deteksi terbaik ternyata memiliki kelemahan terutama dalam hal penanganan limbah radioaktif yang dihasilkan dan mahalnya biaya yang harus dikeluarkan untuk melakukan pengujian karena waktu paruh isotop yang pendek. Uji tersebut juga memiliki sensitivitas yang rendah dan tingginya tingkat pelepasan spontan isotop dari beberapa sel tumor target (Fu
dkk. 201 0). Terbatasnya uji untuk mengetahui
aktivitas sel T sitotoksik membuat diperlukannya pengembangan terhadap sistem deteksi aktivitas se T sitotoksik. Oleh karena itu, beberapa penelitian perlu dikembangkan menggunakan bal1an fluoresence non-radioaktif
dan penggunaan sel
target tmtuk deteksi aktivitas sitotoksik sel T. Fluorescent antigen-tran sfected target cell CTL
assay (F ATTC-CTL
Assay)
merupakan salah satu teknik deteksi aktivitas sel T CD8 yang diharapkan mampu menggantikan peran dari 51 Chromium releasing assay. Inti dari Fluorescent antigen transfected target cell CTL assay adalah produksi sel yang mengekspresikan antigen tertentu yang di-coupled dengan protein fluorescent. Kuantifikasi dari assay ini diperoleh dengan flowsitometri. Baalen dkk (2008) mengembangkan sistem deteksi FATTC-CTL assay dengan menginsersikan gen penyandi protein florescent (GFP) secara in-frame dengan gen virus pada vektor ekspresi eukariot. Vektor tanpa gen sisipan digunakan sebagai kontrol negatif. Konstruk plasmid kemudian dielektroporasi sehingga masuk ke dalam sel PBMC yang merupakan sel target Penghitungan aktivitas sitotoksik dapat dilakukan
dengan melihat jumlah sel
dengan GFP yang tetap hidup dengan formula sebagai berikut: 100 X (Viable GFP
( efektor)- Viable GFP (+efektor) I Viable GFP (-efektor) -
7
BABTII METODO LOGI
3.1. \VAKTU DAN TEMPAT PENELITIAN Penelitian dilakuk:an selama 2 tahun di Laboratorium Pusat Penelitian dan :..ayanan Kesehatan Virologi dan Kanker Patologi (PPLKVKP) Fakultas Kedokteran �niversitas Indonesia. 3.2.
METODOLOGI PENELITIAN
embuatan primer. Primer akan digunakan untuk amplifikasi gen-gen HA (HS dan Nl), eGFP, IRES HIV. Pada bagian hulu primer-primer tersebut akan disisipkan situs restriksi untuk: membantu proses kloning. Selain itu juga akan didesain primer-primer yang akan digunakan untuk sikuensing.
Konstruksi plasmid bisistronik. Plasmid bisistronik merupakan plasmid yang dapat menghasilkan 2 macam protein dari satu macam messenger (m)RNA dan satu promoter. Hal ini disebabkan adanya sikeun
/nJernal Ribosomal Site (IRES) di dalam mRNA. IRES merupakan sikuen nuk:elotida dimana ribosome dapat mengawali proses barus melewati 5 'Cap mRNA.
pemidaian kodon inisiasi translasi tanpa
Proses translasi protein HA dalam konstruk: plasmid
bisistronik di penelitian ini diawali dengan menempelnya ribosome pada 5 'Cap mRNA sedangkan proses translasi protein eGFP akan dimulai saat ribosome menempel pada struktur sekunder IRES HIV Gen HA akan diklona ke dalam vector pCDNASFRT/TO. Pada bagian hilir HA akan disisipkan
Internal Ribosomal Site (IRES) HIV. Selanjutnya
pada bagian hilir IRES IDV akan disisipkan gen GFP (ilustrasi plasmid ada pada garnbar 1).
8
Promoter
Gen HA
CMV
Gambar
IRES
Gen
HIV
eGFP
1. Skema kloning vektor bisistronik yang digunakan dalam penelitian.
Ekspresi protein berada dibawah kendali promoter CMV Hemaglutinin (HA).
Internal ribosomal site (IRES) dan gen enhanced green fluorescent (eGFP).
Pcngklonaan fragmen HA ke dalam vektor pcDNA5FRT/TO. Genom HA HSN I akan diamplikasi menggunakan primer spesiflk yang mengandung situs restriksi. Setelah melalui proses restriksi dan puriflkasi, gen HA di klona ke dalam vector
plasmid
pada
situs
yang
bersesuaian.
Selanjutnya
hasil
ligasi
akan
ditransformasikan pada sel bakteri kompeten. Bakteri yang mengandung plasmid akan tumbuh pada agar yang mengandung antibiotika. Selanjutnya koloni yang tumbuh akan dipindahkan pada media cair. Plasmid yang diisolasi dari bakteri yang tumbuh di media cair akan dianalisis dengan ensim restriksi untuk menentukan ukuran plasmid, verifikasi ukuran insert ?an orientasi insert terhadap promoter. Selain itu verifikasi insert juga akan
dilakukan
dengan
teknik
PCR menggunakan
pasangan
primer
spesifik.
Selanjutnya ak.an dilakukan sikuensing untuk verifikasi kebenaran nukleotida insert. Sikuensing akan di lakukan menggtmakan primer forward dan reverse yang mencakup keselumhan insert. Hasil sikuensing akan dibandingkan dengan hasil sikuensing terdahulu untuk melihat ada tidaknya mutasi.
Genom HA virus HINI juga akan
dilakukan seperti yang telah dijelaskan diatas.
Pengklonaan eGFP kc dalam vektor pcDNA5FRT/TO Gen IRES HIV disubklona ke dalam plasmid pcDNASFRT/TO untuk menghasilkan plasmid pcDNA5FRT/TO-eGFP. Gen eGFP dan plasmid pcDNASFRT/TO direstriksi pada situs restriksi Notl dan Xhol kemudian diligasi dan ditransformasi ke dalam sel E. coli.
Veriflkasi insert dalam plasmid rekobinan akan dideteksi menggunakan analisis
restrisksi, PCR dan sikuensing. eGFP dalam proses transfeksi.
Plasmid ini akan dijadikan kontrol sel pengekspresi
9
Pengsubklonaan IRES ke dalam vektor pcDNASFRTffO-eGFP Gen IRES HIV diperoleh dengan melakukan subk.lona gen tersebut dari plasmid pKS IRES ke dalam pcDNA5FRT/TO-eGFP. Plasmid vektor dan DNA insert direstriksi pada situs Notl dan EcoRV, kemudian dligasi menggunakan T4 DNA ligase.
Hasil
ligasi ditransformasi ke dalam sel E.coli TOPIO kompeten. Klon E.coli yang tumbuh pada media Luria Bertani padat kemudian dikultur dan diisolasi plasmid. plasmid rekombinan dilakukan melalui analisis restriksi dan sekuensing.
Verifikasi Plasmid ini
juga akan dijadikan plasmid kontrol untuk mengetahui kerja IRES dalam konstruksi rekombinan yang dibuat.
Pengsubklonaan fragmen IRES-eGFP ke dalam v eldo r pcDNASFRT/TO-HA Fragmen IRES-eGFP yang telah diveriflk:asi melalui sekuensing dan disimpan dalam bentuk stok plasmid, kemudian disubklona ke dalam pcDNA5FRT/TO-HA. Baik DNA insert maupun vektor direstriksi pada situs restriksi yang bersesuaian kemudian diligasi. Klon yang tum�mh dari hasil transformasi ligasi akan diisolasi plasmid dan diverifikasi DNA sisipan dengan teknik restriksi, PCR, dan sekuensing. Plasmid ini kemudian akan dikotransfeksi bersama dengan pOG44 untuk menghasilkan stable
eel/line.
Penyimpanan plasmid dan bakteri rekombinan. Plasmid rekombinan yang dihasilkan dalam setiap tahap pengklonaan dan
telah
diverifikasi dengan analisis restriksi, PCR dan skuensing akan diisolasi dalam skala besar.
Plasmid
akan
disimpan
pada
-30.Sedangkan
bakteri
rekombinan
yang
mengandung plasmid rekombinan akan di simpan media LB mengandung 15% glycerol. Sel bakteri akan disimpan pada -80°C.
Transfeksi transien plasmid bisistronik. Plasmid rekombinan yang telah diperoleh ditransfeksikan ke dalam sel HeLa. setelah transfeksi, fluoresensi sel dilihat melalui mikroskop konfokal.
48
10
BAB IV HASIL PENELITIAN
4.1. Primer untuk sekuensing dan pengklonaan gen HA
Tahap pertama yang dilakukan dalam penelitian adalah pembuatan primer untuk amplifikasi fragmen HA (hemaglutinin) dan sekuensing keseluruhan konstruksi plasmid rekombinan. Sekuen dari primer yang telah dibuat dapat dilihat pada tabel l. Tabel 1. Daftar primer untuk sekuensing dan pengklonaan plasmid rekombinan pcDNA5FRT/TO-HA-IRES HIV -eGFP No
Primer
Sekuens
Tm
1
FRTH5REC3464R
5'-CGGCCATGATATAGACGTTG-3'
69
2
FRTH5REC2812R
5'-GGCCTCTTCTACTTGCTCTG-3'
67
3
FRTH5REC570F
5'-CCTACTTGGCAGTACATCTACG-3'
68
4
FRTH51618R
5'-CTTGTCTGCTCTTCCTCATC-3'
65
5
FRTH52672F
5'-GTGCTCCAATGGATCGTTAC-3'
68
6
FRTH53675R
5'-GTCACGAACTCCAGCAGGAC-31
70
7
FRTH5REC3133F
5'-GAAGTTCATCTGCACCACC-3'
66
8
FRTH5REC3415F
5'-GCACAAGCTGGAGTACAAC-31
64
9
CMV forward
5'- CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG- 3'
10
BHG reverse
5' -TAGAAGGCACAGTCGAGG- 3'
11
FRTH5REC1599F
5'-GATGAGGAAGAGCAGACAAGG-3'
69
12
SEQH1_305R
5 -CTGGTCTCCACGATGT AGC-3
66
13
SEQH1_753R
5 -GGTCCAGTAGTAGTTCATCC-3
14
SEQH1_540F
51-GAGCAAGAGCTACATCAACG-31
66
15
SEQHI_1510R
5'-CGTAGGTGCCGTTCTTC-3'
64
16
FRTH5REC2110F
5'-GGTACCACCATAGCAATGAG-31
66
17
FRTH5REC2422R
5'-CTAAGCTGTAGTCGGACCTTG-3'
68
I
I
I
I
61
11
18
H1_2009_1F
5'-CCGGATCC-AAAATGGCGAAGGC-3'
59
19
H1_2009Rvrs
5'-GGATCCGGGCCC-TTAAATGCAGATCCGGC-3'
65
20
H1_2009_753R
5'-GGTCCAGTAGTAGTTCATCC-3'
61
H1_2009_733F
5'-CGGATGAACTACT ACTGGAC-3'
21
.
62
4.2. Pengklonaan gen eGFP ke dalam plasmid rekombinan pcDNASFRTffO Plasmid yang akan digunakan sebagai vektor dalam penelitian adalah pcDNASFRT/TO, oleh karena itu perbanyakan plasmid pcDNASFRT/TO perlu dilakukan sebelum memulai pengklonaan. Gambar 1 menunjukk:an basil isolasi plasmid pcDNASFRT/TO.
K_et�ra:rl��= M
1-0
Gambar
.
> marka DNA 2 1og
·: P¢DNl\5FRTffO
1. Hasil isolasi plasmid pcDNA5FRT/TO
Plasmid vektor dan sisipan gen eGFP barus diisolasi sebelurn diligasi. Proses isolasi dilakukan menggunakan Low Melting Point Agarose Gel. Gambar
2
menunjukkan basil ekstraksi gel dari pcDNASFRT/TO dan fragmen eGFP.
- 23, 13 0
- r;m • 4,361
Kete:rangjn:
M
1
indIll : mllrQ DNA LambdaH
: pcDNASFRT(rONOft-XI!P' (5137 bp)
Gambar
Ketenulpn:
M
1.
__..
···::r..uu1caDNA ge:nc ruler ·:
j>cDNA31.eGFP Noli
:<.
-Xhol
2. Hasil ekstraksi gel dari pcDNA5FRT/TO dan eGFP yang
telab direstriksi dengan enzim restriksi Notl dan Xhol. (a). Hasil ekstraksi pcDNASFRT/TO, (b) Hasil ekstraksi gel fragmen eGFP.
Plasmid yang telah diligasi kemudian ditransformasi ke dalam Escherichia coli TOPl 0. Koloni yang tumbuh pada permukaan mediwn agar kemudian diisolasi untuk seleksi rekombinan. Gambar 3 menunjukkan hasil isolasi dai 30 koloni E.coli TOP 10 yang tumbuh pada medium seleksi ampisilin.
Keterang'an: : pcDNASFRT/Td wild ty� '1-30: pl�rrifd �koml:li�n · pcONASFRT/TO-eGFP wt
Gambar 3. Hasil isolasi plasmid pcDNASFRTffO-eGFP Plasmid-plasmid rekombinan yang telah diisolasi kemudian diverifikasi menggunakan pemotongan enzim restriksi untuk memastikan kebenaran DNA sisipan. Gambar 4 menunjukkan hasil restriksi plasmid pcDNASFRT/TO-eGFP dengan enzim restriksi Noti danXhoi.
Agaro��r 1),8% : 100 V ,: 90 menit Keterimgan: wt M
pcDNASfRT/TOwild type �-:Marta Otnf :
1-30: .Plasmid rekombinan ptDNASFRT/To:e:GFP
---?' : 'kemu�kina,m·e)combinqO mengandung PNA sislpa" eGFP
Gambar 4. Hasil restriksi pcDNA5FRT/TO-eGFP dengan NotI dan Xhoi
Verifikasi DNA sisipanjuga dilakukan dengan PCR menggunakan primer spesifik eGFP. Gambar 5 memmjukkan hasil PCR tersebut.
K� rangan:
'n
-
-
!P � - ..,ASrnt iT r < rh � e 't" Io I Wi _. , .. ' M- : Matka DNA 1-30:. p_lasmi!lre�omliinan pcDNA5flrr/t6�F.P {147 �p) ....-+ men'unj�kkan }I,��ran pit;a D�A yang ses�.a1 wt "
· :
Gambar 5. Hasil PCR plasmid pcDNA5FRT/TO-eGFP dengan primer spesifik eGFP
4.3. Pengklonaan gcn IRES HIV kc dalam plasmid pcDNA5FRT/TO-eGFP Plasmid pcDNA5FRTffO-eGFP yang telah diverifikasi kemudian dijadikan vektor untuk pengklonaan gen IRES HIV. Gen IRES HIV disubklona dari plasmid pBluesc riptiiKS(+) yang telah mengandung sisipan IRES HIV. Gambar 6 menunjukkan hasil isolasi plasmid pcDNA5FRT/TO-IRES-GFP.
A� 0,8%; 1QOV; 30 menit
.
.
�ete�ngan: _ wt : plasmk fv.ii id type pcDNA 5FRTfrO-eGFP 1�22 : pcO.NA5FRTitO-IRES-eGFP _
Gambar
_
_
_
6. Hasil isolasi plasmid pcDNA5FRT/TO-IRBS-GFP
14
Plasmid rekombinan pcDNASFRTrfO-IRES HIV-eGFP kemudian diverifikasi dengan pemotongan enzim restriksi yang akan mengeluarkan DNA sisipan dari vektor. Gambar 7 menunjukkan hasil pemotongan plasmid rekombinan dengan enzim restriksi
EcoRV dan Hindiii.
cGeUikiilartiid'10% ; uov ;"'tiO'me·nrt
Keterartg:tm
M 1-22 wt
·
�.matt
Gambar 7. Basil restriksi EcoRV dan Hindiii terhadap plasmid pcDNARSFRT!fO-IRES HIV-eGFP
4.4. Pengklonaan gen HA (Hemaglutinin) HSNl dan HlNl ke dalam vektor plasmid pcDNASFRT/TO Gen HA (Hemaglutinin) dari H5Nl dan HlNl diamplifikasi menggunakan primer spesifik HA yang telah diberi tambahan situs restriksi BamHI pada kedua ujungnya. Gen tersebut kemudian akan diklona ke dalam plasmid pcDNASFRT/TO yang juga telah direstriksi oleh enzim restriksi BamHI. Gambar 8 menunjukkan hasil restriksi dari DNA vektor dan DNA sisipan (HA-B5Nl).
51�7 bp 1700 bp 'HA-H5N1
Gambar 8. Basil restriksi plasmid pcDNASFRT/TO dan fragmen BA-H5Nl
DNA
insert dan vektor kemudian diligasi dengan perbandingan insert:vektor
=
3:1.
Setelah diinkubasi selama 1 6 jam pada suhu l 6°C, hasil ligasi kemudian ditransformasi ke dalam E. coli TOPlO. Koloni yang tumbuh akan diisolasi plasmid dan diverift.kasi. Gambar 9 menunjukkan hasil isolasi plasmid pcDNA5FRT/TO-HAH5Nl
�tosao}S%"; 100V�3o meni.t: "et!! rangan.:
1;;;G '� ·f)lasri'iid pcoiliAsarrfto;J1A�.H5J\11 i',� ild�wpe pcpN'A�F�tro.·
·v..re
Gambar 9. Hasil isolasi plasmid pcDNA5FRT!fO-HAH5Nl Verifikasi plasmid rekombinan dilakukan dengan memotong plasmid menggunakan enzim restriksi Hindiii. Gambar 10 menunjukkan hasil restriksi dari plasmid rekombinan.
Ketlm!ngan;· M
wt '1 2 3 4 5
: Marb DNAgen� 1'\!lef" .:pcDNA5FRT/TOWJld'type
�pcDNA!iFRT/TO w!lcHY�·direstriksl dengan HindiII
Y
: ����RT/1:0-ftAtf.:>Nl �i�JsSi.�e.npo.l)lf(�_l! : pcDNASFRT(TO-HAHSNl no.·3;direstrilcsf:denganHindJII : pcDN�FRl'/1:0-HAtiSNl no. 4-
Gambar 10. Hasil restriksi pcDNA5FRT/TO-HAH5Nl dengan Hindiii
16
Verifikasi juga dilakukan dengan memotong plasmid rekombinan dengan enzim restriksi Kpni. Orientasi DNA sisipan yang benar akan menghasilkan pita DNA berukuran 700 bp. Gambar 1 1 menunjukkan basil pemotongan dengan Kpni.
k�tef.lln&�n: M :MarbDNAt<MNI<<'
1
2 3 4 5
6
:�FirriTOwildc!YI>o : pd)N�/f�N1wf!d-M>\: PcoN/i'$FRTiro-twtsNlno.·;!'freStn<sl denii.�.KPm : pdlNA5fllT/IO-IWlSN1ho. 4d;reotritsl c�o<�Jonl'ptll :pcDNAsAtf/TO-fiAIIS!I1no.6d�clenc••rPnt
Gambar 1 1 . Hasil restriksi pcDNA5FRT/TO-HAH5Nl dengan Kpnl Plasmid pcDNA5FRT/TO juga disisipkan gen HA dari influenza HlNl. Gambar 12 menunjukkan hasil isolasi plasmid rekombinan yang disisipkan gen HA H 1N 1 .
. A4jo!OA �; 10011; 30 menlt ICetennc.en: Jill: 1.
·2
3 A 5 6
:plasmidpcDN'�AfT/IOwild�.
: pcDNASFRTf'O-H"Hll
:J>Cb.tiASnt;f�),Nl.!"'· 3 : pcDNA5FRT/TO·HAHUno U .4 : pcPNA5FRT/'IO-IW!liUno.,5
:.pcDNASFRT/10-Wd!ll
Gambar 12. Hasil isolasi plasmid pcDNA5FRT/TO-H l N 1 4.5. Pengklonaan gen fusi HA-H5Nl dengan eGFP ke dalam vektor pcDNASFRTITO Gen HA-H5Nl diklona dengan eGFP untuk memperoleh fusi protein HA-eGFP tanpa melalui sistem IRES. Gambar 1 3 menunjukkan hasil preparasi DNA vektor dan sisipan untuk proses pengklonaan.
K!erangan; o
IJ!.
1
,�.1 ��� ,A I.Oii;iiJ b�!Jj\\d l)!
/!6-wiH5Nldi..osttlk
::�tte.sfflirFro,.G J>dii"e:
Gambar 13. Hasil restriksi DNA vek:tor dan insert dengan Pstl DNA vek:tor dan sisipan kemudian diligasi, Gambar 14 menunjukkan hasil isolasi plasmid pcDNA5FRT!fO-HAH5Nl-eGFP.
Keterangan: wt
: plasmid pcDNASFRT/TO-HAHSNl
1-36
: pcDNASFRT/TO-HAHSNl-eGFP
Agarosa 0,8%; lOOV; 30 menit
Gambar 14. Hasil isolasi plasmid pcDNA5FRTff0-HAH5N1-eGFP Plasmid rekombinan kemudian direstriksi d�ngan enzim Hindiii untuk mengetahui ukuran dari plasmid rekombinan. Gambar 1 5 menunjukkan hasil pemotongan tersebut.
18
bp
lip Allilrlsa l O,S'Xi;:loov; ·30 menit l(eterangan�
M
Wt
:1-�Q
,�
M.al1\8\)�!(�n·i_li(l8 1lio$111!,
-�.pcDNAS£10'/rO direstrlksideng<SnHiridlll
;.pgjN�ffl)'[tQ�N1-eGFf di�� d"Jlgan iJ\ndi.ll
Gambar 15. Hasil restriksi pcDNA5FRTffO-HAH5Nl -eGFP dengan Hindiii
4.6. Pengldonaan gen IRES HIV-eGFP ke dalam pcDNASFRTfi'O-HAHSNl Dalam konstruksi plasmid rekombinan pcDNA5FRT!fO-HAH5N l -IRES HIV eGFP, dilakukan subklona gen IRES HIV-GFP ke dalam plasmid pcDNA5FRT!fO HAH5Nl. Gambar 16 menunjukkan hasil isolasi DNA vektor dan sisipan yang akan digunakan dalam pengklonaan.
�p·
Keteranpn:·
M 1
2
:'Marb15NAlambda Hindlll : hesiJ /T(>f!AH5 Asflrr pcll N N1d-kAdeneanEcoRV& Xhol
�uilfibsri<>�
;llasllpurifil:a•fftf� IRESHrV� iliresbil:sldenpnEcoRYaXhol
Gambar 16. Hasil purifikasi gel vektor dan insert untuk konstruksi plasmid rekombinan pcDNA5FRTffO-HAH5N l-IRES HIV -eGFP Identifikasi DNA sisipan dilakukan dengan PCR koloni menggunakan primer spesifik Gambar 17 menunjukkan hasil dari PCR koloni.
19
et K el'ln P,ri;t,t : M �rlco e�. ruler . DN.A · 1Nt ; pla,id ..,j� � /TO'IIAHSNHRBHIV-eGA' 1, 25 !:pl..mid pCONASFRT ·:p��unJulcpJtabNJi y;,'\41..,...r(�'7QQ.6� )
:c::::::>.
Gambar 17. Hasil PCR koloni plasmid pcDNA5FRT/TO-HAH5Nl-IRES HIV-eGFP 4.7. Transfeksi transien plasmid pcDNASFRT/TO-IRES HIV-eGFP Uj i fungsi IRES dalam mentranlasi gen yang berada downstream dari IRES dilakukan dengan transfeksi plasmid pcDNASFRT/TO-IRES HIV-eGFP ke dalam sel HeLa. Jumlah plasmid yang ditransfeksikan adalah 50 dan 100 J.Lg/ml. Gambar 1 8 dan 19 menunjukkan hasil transfeksi yang telah dilakukan.
: KcteR,.... ft • • c
: -ntratRI
· �� "'""'":"! ""
'""' """'"
� �� : pd)HAS(«T .,.,.,
Gambar 19. Hasil transfeksi 1 00 J.Lg/ml plasmid ke dalam sel Hela.
20
BAB V PEMBAHASAN
5.1. Pembuatan primer untuk amplifikasi dan persia pan sekuensing plasmid rekombinan Tahap awal dari penelitian ini adalah melakukan desain primer untuk amplifikasi fragmen HA I-IlNl dan primer untuk sekuensing plasmid rekombinan. Desain primer dilakukan dengan bantuan perangkat lunak PRIMER. Daftar primer yang dirancang
tmtuk sekuensing dan pengklonaan gen HA dapat dilihat pada Tabel 1 . 5.2. Pengklonaan gen eGFP ke dalam vektor plasmid pcDNASFRT!TO Gen eGFP (enhanced Green Fluorescence Protein) telah diklona ke dalam vektor ekspesi mamalia pcDNA3.1(+) di laboratorium IHVCB. Penelitian ini akan menggunakan vektor ekspresi pcDNA5FRT!fO, sehingga perlu dilakukan subklona gen eGFP ke dalam pcDNA5FRT!f0. Proses subklona dilakukan dengan mernotong gen sisipan dan vektor pada situs restriksi yang sesuai, yaitu Not! dan Xhol. Gambar 20 menunjukkan strategi subklona gen eGFP ke dalam vektor plasmid pcDNA5FRT/TO.
eGFP dikeluarkan m�l<:ilui
dati
·p£QNA3.,1
sitlis reStnicSiN oli dciil X1to1
,pcONA5FRtrro diresltiksj ·� �if!JS Not! dan XhOI ..
Gambar 20. Skema prosedur subklona gen eGFP (enhanced Green Fluorescens Protein) ke dalam vektor ekspresi pcDNA5FRT/TO.
21
Sebagai persiapan awal, vektor plasmid pcDNA5FRTfi'O ditransformasi heat
shock ke dalam Escherichia coli TOP lO [Invitrogen]. Koloni E. coli yang tumbuh kemudian direplika dan dikultur pada media Luria Bertani cair untuk diisolasi plasmid. Proses isolasi plasmid dilak:ukan menurut protokol Qiaquick spin miriiprep kit [Qiagen]. Gambar 1 . menunjukkan hasil isolasi plasmid pcDNA5FRT/TO. Plasmid pcDNASFRT/TO dan plasmid pcDNA3 . 1 eGFP kemudian direstriksi menggtmakan enzim restriksi Noti danXhoi. Restriksi dengan kedua enzim tersebut dapat dilakukan secara double digestdan meghasilkan DNA plasmid pcDNASFRT/TO yang linear (5137 bp). DNA plasmid yang telah linear dan insert eGFP kemudian dipurifikasi gel menggunakan QIAGEN gel extraction kit (Gambar 2). pcDNA5FRT/TO dan fragmen eGFP kemudian diligasi menggunakan enzim T4DNA ligase, dengan perbandingan DNA insert: vektor adalah 3: 1 . Hasil ligasi ditransfotmasi heatshock ke dalam Escherichia coli TOP IO yang telah dibuat kompeten. Sebanyak 30 koloni direplika pada medium agar Luria Bertani dan ditanam pada medium Luria Bertani cair 4 ml yang telah diberi antibiotik untuk kemudian diisolasi plasmid. Plasmid rekombinan hasil isolasi kemudian dielektroforesis gel agarosa untuk mengetahui adanya koloni yang mengandung sisipan DNA eGFP. Plasmid rekombinan yang memiliki DNA sisipan akan bergerak lebih lambat dibandingkan plasmid DNA wild-type. Perbedaan pola migrasi tersebut disebabkan karena plasmid rekombinan memiliki ukuran yang lebih berat dengan adanya sisipan DNA didalamnya (Gambar 3). Plasmid rekombinan yang memiliki pola migrasi di atas pita DNA wild type harus dianalisis lebih lanjut. Verifikasi plasmid rekombinan dilakukan dengan memotong DNA plasmid dengan enzim restriksi Notl dan Xhol. Proses pengklonaan yang
directional cloning mernudahkan dalam proses verifikasi, karena DNA sisipan yang masuk ke dalam plasmid pasti memiliki orientasi yang benar. Plasmid pcDNA5FRTfi'O-eGFP yang benar mengandung sisipan DNA eGFP akan terpotong menjadi dua fragmen, yaitu DNA vektor (5137 bp) dan DNA eGFP (747 bp). Hasil elektroforesis gel agarosa 0,8% menunjukkan terdapat 8 klon pcDNA5FRT/TO-eGFP yang menunjukkan pola pemotongan sesuai dengan yang diharapkan (Gambar 4).
22
Plasmid-plasmid rekombinan tersebut diveri:fikasi lagi dengan amplifikasi PCR menggunakan primer spesifik eGFP, yaitu eGFPF dan eGFPR. Hasil positif dari amplifikasi tersebut adalah terbentuknya fragmen DNA berukuran 747 bp yang menandakan keberadaan gen eGFP di dalam plasmid rekombinan tersebut.
Gambar 5
menunjukkan bahwa plasmid pcDNA5FRT/TO-eGFP no. 1 3 , 1 5 , 17, 2 1 , 23, 25, 27, dan 28 merupakanplasmid rekombinan yang mengandung sisipan DNA eGFP. Sebanyak 4 plasmid pcDNA5FRT/TO-eGFP yang menunjukkan hasil sesuai dengan yang diharapkan, diverifikasi akhir dengan sekuensing. Berdasarkan analisis terhadap hasil sekuensing dan analisis CLUSTAL dari keempat plasmid rekombinan tersebut menunjukkan bahwa gen eGFP berhasil masuk ke dalam pcDNA5FRT/TO (Lampiran 1). Plasmid-plasmid tersebut, yaitu no.17, 2 1 , 25, dan 28 dibuat stok dalam bentuk DNA dan stok kultur untuk dipergunakan sebagai vektor dalam pengklonaan selanjutnya. 5.3.
Subklona gen IRES-HIV ke dalam vektor plasmid pcDNA5FRT!f0-eGFP Tahapan seJanjutnya dari penelitian ini adalah pengsubklonaan gen IRES HIV ke
dalam pcDNA5FRT/TO-eGFP. Gen IRES HIV diperoleh melalui tahap restriksi gen IRES-HIV dari plasmid pKS-IRES (orientasi terbalik) yang telah tersedia di IHVCB. Pengklonaan dilakukan dengan melakukan restriksi pada pKS-IRES dan pcDNA5FRT/TO-eGFP pada situs restriksi Not! dan EcoRV. Pengklonaan melalui kedua situs restriksi tersebut akan menghasilkan plasmid rekombinan dengan orientasi fragmen IRES HIV yang benar (5'�3'). Gambar 2 1 menunjukkan skema subklona gen IRES HN ke dalam plasmid pcDNA5FRT/TO-eGFP
Gambar 21. Skema pengklonaan gen IRES HIV ke dalam vektor plasmid pcDNA5FRT/TO-eGFP.
23
Gen IRES-HIV (341 bp) kemudian diligasi ke dalam vektor plasmid pcDNA5FRTff0-eGFP (5884 bp). Hasil ligasi kemudian ditransformasi ke dalam E. coli TOPl 0 kompeten dan ditumbuhkan di atas media Luria Bertani padat. Sebanyak 22 koloni basil transformasi direplika dan dikultur pada media Luria Bertani cair 4 ml untuk diisolasi plasmid. Basil elektroforesis gel agarosa 0,8% menunjukk:an kemungkinan sebanyak 20 plasmid rekombinan mengandlmg DNA sisipan IRES HIV, hal tersebut dikarenakan terlihatnya perbedaan pola migrasi antara plasmid wild-type (pcDNA5FRT/TO-eGFP) dengan plasmid rekombinan (Gambar 6). Proses pengklonaan yang directional cloning akan menghasilkan plasmid rekombinan dengan orientasi DNA sisipan yang benar (5'7 3'), sehingga verifikasi terhadap plasmid rekombinan dilakukan dengan mengeluarkan DNA sisipan dari plasmid rekombinan. Oleh karena itu, plasmid pcDNASFRTffO-IRES-eGFP kemudian direstriksi dengan enzirn restriksi EcoRV dan Hindiii untuk diverifikasi. Hasil restriksi dari plasmid yang memiliki sisipan gen IRES HIV akan menghasilkan fragmen DNA berukuran ±300 bp. Berdasarkan visualisasi pada elektroforesis gel akrilamid 1 0%, sebanyak 1 8 plasmid menunjukk:an adanya ukuran pita DNA yang diharapkan (Gambar 7). Plasmid rekombinan pcDNA5FRT/TO-IRES-GFP no. 1 , 7, 17, dan 2 1 kemudian diisolasi skala besar kemudian diverifikasi sekuensing . Basil sekuensing dan CLUSTAL menunjukkan bahwa keempat plasmid rekombinan mengandung gen IRES HIV (Lampiran 2). Plasmid disimpan dalarn bentuk DNA dan disirnpan juga dalam bentuk stok kultur 5.4. Pengklonaan gen HA (Hemaglutinin) HSNl dan HlNl ke dalam vektor
plasmid pcDNASFRT/TO Gen HA (Hemaglutinin) dari B5Nl dan HINI diamplifikasi menggunakan primer spesifik HA yang telah diberi tambahan situs restriksi BamBI pada kedua ujungnya. Gen tersebut kemudian akan diklona ke dalam plasmid pcDNA5FRT/TO yang juga telah direstriksi oleh enzim restriksi BamHI. Gambar 8 menunjukkan basil restriksi dari DNA vektor dan DNA sisipan (HA-H5Nl). DNA insert dan vektor kemudian diligasi dengan perbandingan insert:vektor
=
3:1.
Setelah diinkubasi selama 1 6 jam pada suhu l6°C, hasil ligasi kemudian ditransformasi ke dalam E. coli TOPIO. Koloni yang tumbuh akan diisolasi plasmid dan diverifikasi.
24
Sebanyak 6 koloni E. coli TOPIO tumbuh di atas medium agar Luria Bertani. Hasil isolasi plasmid dari keenam klon tersebut menunjukkan terdapat shifting/ perbedaan pola migrasi antara plasmid rekombinan dengan plasmid wild-type (Gambar 9).
Plasmid pcDNA5FRT/TO-HAH5Nl no I , 3, 4 dan 6 terlihat lebih tinggi dibandingkan plasmid wild-type. Hal tersebut menunjukkan kemungkinan masuknya DNA insert ke dalarn plasmid. Plasmid pcDNA 5FRT/TO-HAH5Nl no. 1 , 3 , 4 dan 6 kemudian dilinierkan dengan enzim restriksi Hindiii. Pita DNA yang dihasilkan dari proses restriksi tersebut adalah pita tunggal DNA berukuran 6846 bp, sedangkan plasmid wild-type akan berukuran 5 1 37 bp (Gambar 10). Proses subklona dilakukan menggunakan satu enzirn restriksi, yaitu BamHI. Hal tersebut dapat menyebabkan gen sisipan masuk pada orientasi yang salalll terbalik (3'-75') ke dalarn vektor. Veriftkasi orientasi DNA sisipan dilakukan dengan memotong keempat plasmid pcDNA5FRTffO-HAH5Nl (no.l, 3, 4, dan 6) dengan enzim restriksi Kpnl. Plasmid rekombinan dengan orientasi benar akan merniliki tiga pola pemotongan DNA yaitu sebesar 700 bp, 43 1 bp, dan 5715 bp. Sedangkan plasmid dengan orientasi terbalik akan berukuran 594 bp, 431 bp, dan 5715 bp. Gambar 3 . 1 .2 . 1 1 menunjukkan bahwa plasmid rekombinan pcDNA5FRT/TO-HAf15N1 no. 1 , 4, dan 6 memiliki orientasi DNA sisipan yang benar. Plasmid pcDNA5FRT/TO-HAH5Nl no.4 kemudian diisolasi dalarn jumlah besar untuk diverifikasi dengan sekuensing. Hasil sekuensing menggunakan primer-primer spesifik H5Nl menunjukkan bahwa gen Hemaglutinin berhasil masuk ke dalam vektor plasmid pcDNASFRT/TO secara benar. Plasmid pcDNA5FRT/TO-HAHSN1 no.4 kemudian disirnpan dalam bentuk stok kultur pada -80°C dan stok plasmid pada -40°C untuk digunakan dalam tahap penelitian selanjutnya.
5.5. Pengklonaan gen Hemaglutinin HlNl ke dalam plasmid pcDNA5FRT/TO HAH1Nl Fragmen DNAHemaglutinin (HA-HIN l ) yang akan digunakan merupakan sekuen konsensus yag disejajarkan dari isolat-isolat HlNI yang ada di genebank. Gen tersebut diperoleh dari laboratoriurn PPLKVKP UI dan telah terangkai dalam vektor ekspresi mamalia pcDNA3 . 1 (+).
Gen Hemaglutinin (HA-HlNl) diamplifikasi dengan primer
spesifik HA-H 1N 1 yang telah diintroduksi sekuen enzim restriksi dan sekuen Kozak.
25
Gen HA-H 1N1 yang telah diamplifl.kasi kemudian direstriksi dengan enzim restriksi BamBI kemudian dipurifikasi. Proses ligasi DNA vektor dan insert dilakukan dengan perbandingan DNA insert:vektor
=
3: 1 . Transformasi campuran ligasi ke dalam sel
e.coli TOP 10 menghasilkan tumbuhnya
6 koloni E. coli pada medium agar Luria
Bertani. Keenam koloni tersebut kemudian diisolasi plasmid dan dielektroforesis pada gel agaro sa untuk mengetahui pola migrasi dari DNA plasmid. Gambar 1 2 menunjukkan bahwa keenam plasmid rekombinan yang diisolasi tidak memiliki perbedaan pola migrasi dengan plasmid wild type. Hal tersebut menunjukkan bahwa gen Hemaglutinin tidak berhasil diinsersikan ke dalam vektor plasmid. Proses ligasi perlu diulangi untuk mendapatkan plasmid rekombinan dengan sisipan gen HA-HlNl .
5.6. Subklona eGFP ke dalam plasmid pcDNA5FRTffO-HAH5Nl Fragmen
Internal Ribosome Entry Site (IRES) dari HIV yang digunakan untuk
konstruksi vektor rekombinan HA-IRES-GFP belum pernah diuji aktivitasnya. Oleh karena itu, sebagai upaya mengantisipasi kegagalan fungsi IRES dalam ekspresi eGFP pada vektor, dilakukan pegklonaan fusi gen HA H5N1 dan eGFP. Gen eGFP disubklona ke dalam plasmid pcDNA5FRT/TO-HA H5Nl pada situs restriksi Pstl. Pstl akan memotong plasmid pcDNA5FRT/TO-HAH5Nl menjadi 3 fragmen, yaitu 541 bp, 964 bp, dan 5341 bp. Fragmen HAH5Nl akan terpotong sebesar 5 1 3 bp pada bagian 3'. Restriksi fragmen eGFP pada dalam vektor pcDNA5FRT/TO akan menghasilkan 2 pola potongan DNA, yaitu sebesar 1785 bp dan 4173 bp (Gambar 22). BamHI (996)
Pstl (1196)
Notl {1045)
Xhol {1052)
Pstl {1024) Pstl (1024)
Pstl (1988)
Pstl {1988)
(b)
Gambar 22. (a) Skema pcDNA5FRT/TO-HAH5N1 dan (b) pcDNA5FRT/TO-eGFP
Plasmid pcDNA5FRT/TO-HAH5Nl dan pcDNA5FRT/TO-eGFP direstriksi dengan Pstl (Gambar 13) dan diligasi untuk menghasilkan plasmid rekombinan yang
mengekspresikan fusi protein Hemaglutinin H5Nl dan enhanced Green Fluoresence (eGFP). DNA vektor dan insert kemudian diligasi dan ditransfonnasi ke dalam E. coli TOP10. Sebanyak 36 koloni direplika dan diisolasi plasmid untuk mengetahui keberhasilan proses ligasi. Gambar 14 menunjukkan basil isolasi plasmid dari koloni-koloni E.coli basil transformasi. Sebanyak 1 5 klon menunjukkan pola migrasi di atas pita plasmid wild-type. Plasmid-plasmid yang memiliki pola migrasi di atas plasmid wild-type kemudian direstriksi dengan enzim restriksi BamHI. Plasmid dengan orientasi benar akan mengbasilkan adanya pola potongan DNA sebesar 1284 bp dan 7345 bp sedangkan orientasi salah akan mengbasilkan pola potongan DNA sebesar 1993 bp dan 6636 bp. Gambar 1 5 menunjukkan bahwa beberapa plamid memiliki pola potongan DNA dengan orientasi benar, plasmid rekombinan no.
I,
4, 15, dan 25 kemudian diisolasi ska1a besar
dan diverifikasi sekuensing. 5.7. Subklona gen IRES IDV dan eGFP ke dalam pcDNA5FRTff0-HAH5Nl
Gen IRES HIV dan eGFP yang telah terangkai dalam satu plasmid rekombinan disubklona ke dalam plasmid pcDNA5FRTTO/HA-H5N1 untuk menghasilkan plasmid rekombinan pembawa gen HA, IRES, dan eGFP. DNA vektor dan sisipan direstriksi double digest menggunakan enzim EcoRV dan Xhol (Gambar 16). DNA vektor dan insert diligasi menggunakan perbandingan 1 :3 dan sebanyak 25 klona berhasil diperoleh dari basil transformasi reaksi ligasi. Identifikasi klona dilakukan dengan verifikasi PCR dari ko1oni E.coli yang tumbuh pada medium LB agar. Pasangan primer yang digunakan dalam megidentifikasi klona adalah primer yang mengamplifikasi daerah eGFP dan vektor (GFP Forward dan BHG Reverse). Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya pita DNA berukuran ± 700 bp (Gambar 17). Tiga klona plasmid pcDNA5FRT/TO-HAH5N1-IRESHIV-eGFP diketahui mengbasilkan pita DNA yang sesuai (no. 7, 10, dan 22). Ketiga plasmid rekombinan tersebut masib memerlukan analisis lainnya, seperti sekuensing, untuk memastikan kebenaran rangkaian gen yang diinsersikan ke dalam vektor plasmid.
27
5.8. Transfeksi transien
untuk uji fungsi IRES HIV dalam mengekspresikan
eGFP Sekuen IRES HIV yang digunakan dalam penelitian belum pemah diuji fungsi. Oleh karena itu, maka dilakukan transfeksi transien pcDNA5FRTrrO:.rRES-eGFP ke dalam sel HeLa untuk menguji fungsi dari plasmid rekombinan yang telah dihasilkan. Transfeksi transien dilakukan dengan konsentrasi plasmid 10 ).lg/ml, 50 J.lg/ml, dan 100 J.lg/ml. Proses transfeksi dilakukan menggunakan elektroporator dan diirtkubasi selama 48 jam. Gambar 18 dan 1 9 menunjukkan bahwa gen IRES HIV beketj a dengan baik. Hal tersebut dilihat dari terekspresinya protein Green fluorescent pada sel yang ditransfeksi. Efisiensi tranformasi yang diperoleh tidak cukup tinggi. Hal tersebut dapat disebabkan karena tidak masuknya DNA plasmid ke dalam sel. Sehingga perlu dilakukan optimasi dalam prosedur transfeksi untuk menghasilkan efisiensi transformasi yang tinggi.
5.9. Transfeksi pcDNASFRT/TO-HAHSNl-IRES-eGFP Plasmid pcDNa5FRT/TO-HAH5N l -IRES-eGFP yang telah diverifikasi sekuensing diperbanyak dan ditransfefksi ke dalam sel Hela. Plasmid yang ditransfeksikan adalah sebanyak 50 J.lg/ml, dan waktu inkubasi adalah 48 jam. Hasil transfeksi transien menunjukkan bahwa protein HA-eGFP mampu diekspresikan secara tandem. Hal tersebut ditunjukkan dengan sel Hela yang berwarna hijau akibat fluoresensi dari protein GFP. Efisiensi transformasi yang diperoleh tidak cukup tinggi. Sehingga perlu dilakukan optimasi dan penelitian lebih lanjut mengenai efek konstruksi protein tandem dengan sistem IRES.
-
-
-
-
--
-
--- - -
-
-
28
BAB VI
KESIMPULAN DAN SARAN A. KESIMPULAN 1 . Plasmid pcDNA5FRT/TO-HAH5Nl-IRESHIV-GFP telah berhasil diperoleh. 2.
Transfeksi transien plasmid rekombinan penyandi Hemaglutinin H5Nl dan eGFP berhasil dilakukan.
B. SARAN
1 . Perlu dilakukan pengklonaan ulang gen Hemaglutinin (HA) HlNl tmtuk
menghasilkan plasmid pengekspresi protein Hemaglutinin HlNl dan green fluorescent. 2.
Perlu dilakukan verifikasi sekuensing dan uji transfeksi transien terhadap pcDNA5FRT/TO-HAH5Nl-IRESHIV-eGFP dan pcDNA5FRT!TO-HAH5Nl-eGFP.
3.
Perlu dilakukan optimasi prosedur transfeksi untuk memperoleh efisiensi transfeksi yang tinggi.
29
DAFTAR PUSTAKA
Baalen, C.A., R.A. Gruters, E.G.M. Berkhoff, A.D.M.E. Osterhaus & G.F. Rinunelzwaan. FATT-CTL assay for detection of antigen-specifiG cell-mediated cytotoxicity.
2008. Cytometry part A; 73A: 1058-1 065
Bonci, F., E. Zabogli, F. Conti, A. Merica, G. Freer, M. Bendinelli and M. Pistello.
2009.
A novel method for producing target cells and assessing cytotoxic T
lymphocyte activity in outbred hosts. BMC Biotechnology 2009,
9:18
J, Martin-Benito J. The
Coloma, R., Valpuesta JM, Arranz R, Carrascosa JL., Ortin
structure of biologically active influenza virus ribonucleoprotein complex. PloS Pathogens.
2009; 5(6): 1-10. I
Compans, R W, Content J., Duesberg PH. Structure of ribonucleoprotein of influenza virus. J. Viral.
1972; 4: 795-800.
Danzig, L & Fukuda K.
2001. Influenza. Dalam Wilson et al: Current diagnosis and
treatment in infectious diseases. McGraw-Hill, USA. Desselberg, U., Racainello V.R., Zazra J.J., Palase P. The
2001; 380-387. 3'
and
5'
terminal sequence
of influenza A, B, and C virus RNA segments are highly conserved and show partial inverted complementary. Gene.
1980; 8: 3 1 8-28.
J.J., B. Wahren & M.A. Liu. DNA vaccines: Progress and challenges. 2005 . The Journal of lnununology; 175: 633-639.
Donelly,
Growth and Maintenance of the Flp-In T-REx Cell Line. Buku manual dari Invitrogen. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/flpintrexcells_man.pdf Khanna, M., Kumar P, Chaudhary K., Kumar B , Vijayan V.K. Emerging influenza virus: A global threat.
J Biosci. 2008; 33(4): 475-482.
McGeoch, D., Fellner P., Newton C. Influenza virus genome consists of eight distinct RNA species. Proc Natl Acad Sci.
1976; 73: 3040-9.
Muri KG., Webster RG., Jones IM. Localization of RNA polymerases of influenza ribonucleoproteins by immunogold labeling. Virology.
viral
1988; 164: 562-566.
Neri, S., E. Mariani.,A. Meneghetti. ,L. Cattini., and A.Facchini.
200 1 .
Calcein
Acctyoxymethyl Cytotoxicity Assay: Standardization of a Method Allowing Additional Analyses on Recovered Effector Cells and Supernatants. Clinnical and Diagnostic Laboratory Immunology.
2001 (8):. 1 1 3 1-1 135.
30
Palese, P. Shaw M. Orthomyxoviridae : the viruses and their replication. Dalam Knipe DM, Howley PM: Fields Virology 5th edition. Lippinct William & Wilkins, Philadelphia. 2006; 1 647-1689. pcDNA™5/FRT/TO Inducible expression vector desig11ed for use with the Flp-InTM T REx™ System. Buku manual dari invitrogen. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/pcdna5frtto man.pdf. Shafer-Weaver K., T. Sayers, S Strobl, E. Derby l , T.Ulderich, M. Baseler and A. Malyguine. 2003. The Granzyme B ELISPOT assay: an alternative to the 5 1 Cr release assay for monitoring cell-mediated cytotoxicity.
Journal of Translational
Medicine 2003, 1 : 1 4 . Zaritskaya, L., M.R. Shurin, T.J. Sayers & A.M. Malyguine. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. 2010. Expert Rev. Vaccines; 8(6): 1-1 1 .
31
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Program Riset Pembinaan Ilmu Pengetahuan dan Kedokteran Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Departemen Kesehatan Republik Indonesia atas pendanaan penelitian ini.
