Lampiran 1. Pengambilan Sampel Daun Rhizophora mucronata Lamk. dari Kawasan Wisata Alam Angke Kapuk, Jakarta Utara. a. Stasiun Pengambilan Sampel Daun Rhizophora mucronata Lamk. No
Stasiun
1
Stasiun 1
Plot
Kualitas Air
S : 06° 06’ 14.9” E : 106° 44’ 10.8”
2
Stasiun 2
S : 06° 06’ 15.3” E : 106° 44’ 10.5”
3
Stasiun 3
S : 06° 06’ 11.4” E : 106° 44’ 07.4”
S : 06° 06’ 12.6” E : 106° 44’ 05.9” Suhu : 33° C pH : 7.49 Salinitas : 27-28 ‰
b. Lokasi Pengambilan Sampel Daun Rhizophora mucronata Lamk.
Stasiun 1
Stasiun 2
66
Stasiun 3
67
Lampiran 2. Pembuatan Serbuk Kering Daun Rhizophora mucronata Lamk.
Sampel Basah
Sampel Dihaluskan
Sampel Kering
Serbuk Kasar
Sampel Diayak
Serbuk Halus Daun Rhizophora mucronata Lamk.
68
Lampiran 3. Ekstraksi Daun Rhizophora mucronata Lamk. dengan Metode Maserasi Bertingkat
Proses Maserasi
Pemisahan Filtrat
Pemasangan
dan Residu
Labu Evaporasi
Filtrat n-heksan Hasil Maserasi ke- 1, ke-2, dan ke- 3
69
Filtrat Etil Asetat Hasil Maserasi ke- 1, ke-2, dan ke- 3
Filtrat Butanol Hasil Maserasi ke- 1, ke-2, dan ke- 3
Proses Evaporasi
70
Lampiran 4. Perhitungan Nilai Rendemen Ekstrak Daun Rhizophora mucronata Lamk. a.
b.
c.
71
Lampiran 5. Pembuatan Larutan Stok dan Pengenceran pada Uji In Vitro
A. Larutan Stok Ekstrak n-heksan/Ekstrak Etil Asetat/Ekstrak n-butanol 10.000 ppm dalam Akuades Steril Konsentrasi Ekstrak 10.000 ppm =
x
x 10 ml
= 100 mg = 0,1 g = ekstrak 0,1 g dilarutkan hingga 10 ml B. Pengenceran Konsentrasi Ekstrak n-heksan/Ekstrak Etil Asetat/Ekstrak nbutanol dari Larutan Stok 10.000 ppm Konsentrasi 1000 ppm V1 x M1
= V2 x M2
10 ml x 1000
= V2 x 10.000
V2
= 1 ml
1 ml dari larutan stok Ekstrak n-heksan/Ekstrak Etil Asetat/Ekstrak n-butanol 10.000 ppm ditambah akuades steril hingga 10 ml Konsentrasi 100 ppm V1 x M1
= V2 x M2
10 ml x 100
= V2 x 10.000
V2
= 0,1 ml
0,1 ml dari larutan stok Ekstrak n-heksan/Ekstrak Etil Asetat/Ekstrak nbutanol 10.000 ppm ditambah akuades steril hingga 10 ml Konsentrasi 10 ppm V1 x M1
= V2 x M2
10 ml x 10
= V2 x 10.000
V2
= 0,01 ml
0,01 ml dari larutan stok Ekstrak n-heksan/Ekstrak Etil Asetat/Ekstrak butanol 10.000 ppm ditambah akuades steril hingga 10 ml
72
C. Larutan Kloramfenikol 30 ppm Konsentrasi 30 ppm = = 0,3 mg = 0,0003 g = kloramfenikol 0,0003 g dilarutkan dalam 10 ml
Pengenceran Ekstrak n-heksan
Pengenceran Ekstrak Etil Asetat
Larutan konsentrasi dihomogenkan
73
Lampiran 6. Pembuatan Media Nutrien Agar Laut (NA Laut) 1. Siapkan erlenmeyer yang sudah steril 2. Masukkan Nutrien Agar (NA) sebanyak 7 gram ke dalam 250 ml air laut yang sudah steril. 3. Letakkan erlenmeyer yang sudah berisi NA laut tersebut ke atas hot plate, panaskan sampai mendidih sambil diaduk dengan menggunakan magnet stirrer. 4. Setelah mendidih, Nutrien Agar Laut diangkat kemudian ambil magnet stirrer. Nutrien Agar Laut siap digunakan.
Media Nutrien Agar Laut
74
Lampiran 7. Pembiakan Bakteri Vibrio harveyi 1. Siapkan stok koloni bakteri Vibrio harveyi awal. 2. Siapkan media Nutrien Agar (NA) laut. 3. Siapkan cawan petri yang sudah steril, kemudian masukkan media NA laut ke dalam cawan petri. 4. Tunggu media NA laut sampai berbentuk agar. 5. Setelah terbentuk agar, ambil koloni bakteri Vibrio harveyi pada media stok dengan menggunakan jarum ose (1-2 ose) dan oleskan ke media NA laut. 6. Kemudian tutup kembali cawan petri media NA laut dan media stok koloni bakteri Vibrio harveyi. 7. Media NA laut pembiakan bakteri Vibrio harveyi dimasukkan ke dalam inkubator dengan temperatur 37° C sedangkan media stok koloni bakteri Vibrio harveyi dimasukkan ke dalam lemari pendingin. 8. Tunggu sampai 1-2 hari biakan bakteri di inkubator. 9. Pembiakan berhasil dapat dilihat dari permukaan media berwarna putih. 10. Pembiakan siap digunakan dan apabila belum dipakai masukkan ke dalam lemari pendingin. Semua proses yang dilakukan berada di ruang laminar dan aseptis, hal ini dilakukan untuk menjaga setiap perlakuan tidak terjadi kontaminasi.
Bakteri Vibrio harveyi yang telah diremajakan
75
Lampiran 8. Pembuatan Larutan Bakteri Vibrio harveyi Kepadatan 107 CFU/ml 1. Isolat bakteri uji dengan kepadatan 107 sel bakteri yang telah dikultur diambil dengan menggunakan jarum ose (2-3 ose) kemudian dilarutkan ke dalam air laut steril sebanyak 10 ml. 2. Bandingkan larutan bakteri yang telah dilakukan dengan larutan Mc Farland. Larutan Mc Farland 0,5 terdiri dari: 0,05 ml larutan BaCl2 + 9,95 ml larutan H2SO4
Perbandingan kekeruhan Larutan Bakteri dengan Mc Farland 0,5
76
Lampiran 9. Proses Uji In Vitro
(a)
(b)
(a) Proses Penambahan Larutan Bakteri sebanyak 0,1 ml (b) Larutan Bakteri diratakan dengan Menggunakan L glass
Perendaman paper disk pada masing-masing konsentrasi ekstrak
Paper disk diangin-anginkan sebelum diletakkan pada media NA yang telah dioleskan larutan bakteri Vibrio harveyi
77
Lampiran 10. Pengukuran Besar Zona Hambat pada Uji In Vitro
Pengukuran Besar Zona Hambat dengan Menggunakan Jangka Sorong
a. Zona Hambat Ekstrak n-heksan
10 ppm
100 ppm
1000 ppm
10.000 ppm
78
b. Zona Hambat Ekstrak Etil Asetat
10 ppm
100 ppm
1000 ppm
10.000 ppm
c. Zona Hambat Ekstrak Butanol
10 ppm
100 ppm
79
1000 ppm
10.000 ppm
d. Zona Hambat Kontrol Positif
Kloramfenikol (Kontrol +)
80
Lampiran 11. Pengenceran Konsentrasi Ekstrak Butanol Daun Rhizophora mucronata Lamk. pada saat LC50 Larutan Stok Ekstrak Butanol 10.000 ppm dalam 300 ml Air Laut Konsentrasi Ekstrak 10.000 ppm =
x
x 300 ml
= 3000 mg = 3 g = ekstrak 3 g dilarutkan dalam 300 ml air laut Pengenceran Konsentrasi Ekstrak Butanol dari Larutan Stok 10.000 ppm
Konsentrasi 1000 ppm V1 x M1
= V2 x M2
300 ml x 1000
= V2 x 10.000
V2
= 30 ml
30 ml dari larutan stok Ekstrak butanol 10.000 ppm ditambah air laut hingga 300 ml
Konsentrasi 100 ppm V1 x M1
= V2 x M2
300 ml x 100
= V2 x 10.000
V2
= 3 ml
3 ml dari larutan stok Ekstrak butanol 10.000 ppm ditambah air laut hingga 300 ml
Konsentrasi 10 ppm V1 x M1
= V2 x M2
300 ml x 10
= V2 x 10.000
V2
= 0,3 ml
0,3 ml dari larutan stok Ekstrak butanol 10.000 ppm ditambah air laut hingga 300 ml
81
Pengenceran Ekstrak Butanol
Pengamatan Mortalitas Udang Windu pada Saat LC50
82
Lampiran 12. Mortalitas Udang Windu pada Saat LC50 48 jam Menggunakan Ekstrak Butanol Daun Rhizophora mucronata Lamk. Konsentrasi Waktu
Kontrol
10 ppm
100 ppm
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
15 menit
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
30 menit
-
-
-
-
-
-
-
-
1
-
1 jam
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
2 jam
-
-
-
-
-
-
-
-
1
1
4 jam
-
-
-
-
-
-
1
-
4
-
6 jam
-
-
-
-
-
-
-
-
-
4
8 jam
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
16 jam
-
-
-
-
-
1
2
1
-
1
24 jam
-
-
-
-
-
1
1
1
-
-
48 jam
-
-
-
-
-
-
1
1
-
-
Total
-
-
-
-
-
2
5
3
6
6
Dedah
1000 ppm
10000 ppm
Keterangan: dalam setiap akuarium terdapat 6 ekor benih udang windu
83
Lampiran 13. Hasil Perhitungan LC50 dengan Menggunakan EPA Probit EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5
LC5048_Penaeusmonodon_EkstrakButanol
Conc.
Number
Number
Exposed
Resp.
Proportion
Observed
Responding
Proportion
Adjusted
Responding
for Controls
Predicted Proportion Responding
10.0000
12
0
0.0000
0.0000
0.0030
100.0000
12
2
0.1667
0.1667
0.1380
1000.0000
12
8
0.6667
0.6667
0.7137
10000.0000
12
12
1.0000
1.0000
0.9867
Chi - Square for Heterogeneity (calculated) =
0.411
Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level)
Mu
=
2.658747
Sigma =
0.604690
Parameter
Estimate
Std. Err.
=
5.991
95% Confidence Limits
--------------------------------------------------------------------Intercept
0.603124 1.139670 ( -1.630629,
2.836878)
Slope
1.653740 0.416391 (
2.469867)
0.837612,
Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000
84
LC5048_Penaeusmonodon_EkstrakButanol Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Point
Exposure Conc.
95% Confidence Limits Lower
Upper
LC/EC 1.00
17.867
0.646
61.680
LC/EC 5.00
46.142
3.950
123.948
LC/EC 10.00
76.520
10.157
183.629
LC/EC 15.00
107.658
18.932
242.951
LC/EC 50.00
455.772
192.028
1087.165
LC/EC 85.00
1929.515
852.930
11109.386
LC/EC 90.00
2714.677
1127.719
20721.266
LC/EC 95.00
4501.962
1669.646
53311.152
LC/EC 99.00
11626.200
3353.197
326115.875
85
Lampiran 14. Konsentrasi Ekstrak Butanol Daun Rhizophora mucronata Lamk. pada saat Uji In Vivo Berdasarkan hasil dari LC50 didapat nilai konsentrasi yang digunakan adalah 455,772 ppm, maka: A. Kontrol 0%
= (tanpa perendaman ekstrak)
B. Konsentrasi 25% = 455,772 x 0,25
= 113,943 ppm
C. Konsentrasi 50% = 455,772 x 0,5
= 227,886 ppm
D. Konsentrasi 75% = 455,772 x 0,75
= 341,829 ppm
E. Konsentrasi 100% = 455,772 x 1
= 455,772 ppm
Larutan Ekstrak Butanol Untuk Perendaman Udang Windu Saat In Vivo
Tata Letak Penempatan Akuarium Saat Uji In Vivo
