1 Lampiran 1. Metode analisis kolesterol, asam lemak dan Vitamin A A. Metode Analisis Kolesterol (Kleiner dan Dotti 1962). Diambil sampel dua telur pa...
Lampiran 1. Metode analisis kolesterol, asam lemak dan Vitamin A A. Metode Analisis Kolesterol (Kleiner dan Dotti 1962). Diambil sampel dua telur pada setiap ulangan. Delapan belas sampel dianalisis kolesterolnya dengan metode Liebermann Buchner (Kleiner dan Dotti,1962).Cara kerjanya sebagai berikut: Sebanyak 0.1 mg kuning telur diaduk di dalam tabung reaksi bersama 10 ml alkohol eter sampai homogen. Kemudian di sentrifuse dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Setelah itu dipindahkan ke dalam gelas piala serta dipanaskan kedalam penangas pengangaaas air sampai kering. Ekstraknya di larutkan dalam kloroform sedikit demi sedikit sambil dilakukan pemindahan ke dalam tabung reaksi sampai volume 10 ml. Lalu ditambahkan asam asetat anhidrid sebanyak 2ml dan 4 tetes asam sulfat pekat diaduk sampai warna hijau. Larutan tersebut disimpan selama 15 menit di dalam ruang gelap. Selanjutnya dilakukan pembacaan dengan menggunakan spectrofotometer sehingga didapat nilai absorben sampel. Nilai kolesterol didapatkan dari perhitungan dengan rumus: Kolesterol (mg)= Absorben sampel Konsentrasi standart Absorben standar Berat sampel B. Analisis Asam Lemak Telur (Metode Folch 1957). Pada minggu ke 9 percobaan, 2 butir telur tiap ulangan dikumpulkan kemudian masing-masing ditimbang dan dipecahkan. Kuning telur dipisahkan dari putih telur dan kemudian kuning telur tersebut disatukan. Sebanyak 6 sampel kuning telur yang disatukan dan dianalisis kandungan asam lemak. Analisa asam lemak dilakukan dengan Gas kromatografi. Fase diam kolom dalam analisis ini adalah OV 275.25% 80/100 Chromosap WAW DEGS OV 20/200 dengan temperature 2750C. Standar asam lemak diperoleh dari Supelco USA. Gas N2 digunakan untuk fase gerak dengan kecepatan 20 ml/menit, gas H2 dan O2 dengan kecepatan alir 20 ml/menit dan 260 ml/menit. Metil ester asam lemak dari standard dan contoh sampel diberikan ke kolom sebanyak 0.5µl. Perhitungan RF dan kuantitas asam lemak RF = area SI x asam lemak (mg) SI (mg) area asam lemak Konsentrasi asam lemak = A x RF x C (mg/g sampel) B D Keterangan : A : berat Si yang ditambahkan (mg) B : berat sampel (g) C : area asam lemak D : area SI RF : respon factor C. Analisis Vitamin A Kandungan Vitamin A pada kuning telur dilakukan dengan menggunakan High Performance Liquid Chromotography (HPLC). Ekstraksi sampel dan standar eksternal untuk anlisa vitamin A adalah sebagai berikut:
0,5 g sampel atau standar eksternal ditambah 400 l sodium askorbat dan divortex selama 10 menit, kemudian di tamah dengan 2 ml KOH, divortex selama 10 detik. Selanjutnya dilakukan saponifikasi dengan menyimpan pada waterbath dengan suhu 80 0C selama 30 menit, lalu disimpan pada Icebath selama 2 menit ke dalam campuran ditambahakan 3 ml heksan dan dikocok selama 10 detik. Campuran tersebut disimpan dalam lemari es sampai lapisan organik dan air terpisah. Selanjutnya diambil 2,6 ml lapisan heksan (supernatan) dan dipisahkan dalam tabung lain (A). Kemidian sisanya ditambahkan lagi sampai lapisan organik dan air terpisah dan dimasukkan kedalam tabung (B). Selanjtnya supernatan (Tabung A) dicuci dengan 4,6 ml asam asetat 5% dan lapiasan organik dipindahkan sebanyak yang bisa diambil, lalu dikeringkan dengan aliran nitrogen, lalu terakhir dilarutkan dalam 3 ml fase mobil sebelum diinjeksikan 50 l dalam HPLC sistem. Pembuatan standar eksternal retinil palmitat adalah sebagai berikut. 1. Stock Standard Solution : 10 mg/ml retinil palmitat dalam heksan. Satu g retinil palmitat (USP Reference Standard) dilarutkan dalam 100 ml heksan, dikocok sampai larut sempurna. 2. Intermediate Standard Solution : 2 ml stock standard solution dipipet dan dimasukkan dalam 250 ml volumetric flask lalu diencerkan dengan 250 ml heksan. 3. Working Standard Solution: sekitar 1,6 g/ml retinil palmitat. Dua ml intermediate standard solution,(2) dipipet dan dimasukkan dalam 100 ml volumetric flask dan diencerkan dengan heksan. Untuk mengukur konsentrasi dari working standard, intermediate standard solution diambil 2 ml dan diencerkan dengan heksan dalam 50 ml volumetric flask. Kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometri C Std = [ A325/(2 x ƹ x b] x 104 C Std : Konsentrasi standar A325 : Absorbansi working standard solution ƹ : 996, konsentrasi palmitat dan retinil palmitat dalam heksan pada panjang gelombang 325 nm B : 1 cm, (kuvet) Perhitungan kandungan vitamin A menggunakan standar eksternal adalah sebagai berikut. [ Beta karoten/ Retinol] : L1 x S x V L2 B [ Beta karoten/ retinol] : Konsentrasi beta karoten/retinol (µg/g) L1 : Luas peak sampel yang memiliki waktu retensi yang sama dengan waktu retensi standar eksternal beta karoten/retinol dilihat dari kromatogram HPLC. L2 : Luas peak standard beta karoten/retinol S : konsentrasi standard beta karoten/ retinol (µg/ µl atau mg/ml) V : Volume akhir yang siap disuntikkan pada HPLC B : Berat sampel yang diekstrak
Skor Kuning Telur Between 0.100 Groups Within Groups 0.433 Total 0.534 Haugh Unit Between 0.003 Groups Within Groups 0.008 Total 0.011 Berat Putih Telur Between 6.600 Groups Within Groups 29.673 Total 36.274 Persentase Between 4.637 Berat Putih Telur Groups Within Groups 21.810 Total 26.447 Berat Kuning Telur Between 9.218 Groups Within Groups 29.589 Total 38.807 Persentase Between 21.316 Berat Kuning Telur Groups Within Groups 126.976 Total 148.292 Berat Kerabang Between 0.337 Groups Within Groups 0.520 Total 0.857 Persentase Between 0.564 Berat Kerabang Groups Within Groups 0.611 Total 1.175 Tebal Kerabang Between 0.000 Groups Within Groups 0.004 Total 0.004 IndeksTelur Between 5.267 Groups Within Groups 58.083 Total 63.351
Jumlah kuadrat Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total
