46
47
Lampiran 1. Bahan-bahan yang digunakan untuk pengujian aktivitas enzim (Grossowicz et al., 1950) (a). Reagen A 1. 0,2 M bufer Tris-HCl pH 6,0 12,1 gr Tris base dilarutkan dalam 200 ml akuades, kemudian ditambah HCL sampai pH 6,0. 2. 0,1 M hydroxylamine 3,47 gr hydroxylamine dilarutkan dalam 100 ml akuades. 3. 0,01 M glutathione 1,54 gr glutathione dilarutkan dalam 100 ml akuades. 4. 0,2 N NaOH 100 ml 5. Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-glycine 100 mg CBZ-gln-gly dilarutkan dalam 0,2 N NaOH 2 ml, kemudian ditambahkan 1,0 N NaOH sampai benar-benar larut. Tambah 4 ml (1), 2 ml (2) dan 2 ml (3) dan diatur sampai pH-nya 6,0. (b). Reagen B 1. 3 N HCl 2. 12% TCA 3. 5% FeCl3.6H2O (dilarutkan dalam 0,1 N HCl) Perbandingan antara HCL : 12% TCA : 5% FeCl3.6H2O = 1:1:1.
48
Lampiran
2.
Kurva standar untuk (Grossowicz et al., 1950)
Konsentrasi L-glutamic acid γ-hydoximate (mg/ml) 0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 4 4,3
penentuan
Volume L-glutamic acid γ-hydoximate (ml) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
Contoh perhitungan kadar protein enzim transglutaminase Diketahui : absorbansi sampel = 0,498 absorbansi blanko = 0,072 X = Y – 0,024 0,374 Ditanyakan : kadar protein enzim transglutaminase Jawaban : x = sampel-blanko = 0,498 - 0,072 = 0,426 X = 0,426 – 0,024 0,374 X = 1,07486631 µmol/200 µl
aktivitas
enzim
Volume Miliq water (ml) 350 345 340 335 330 325 320 315 310 305 300 295
49
Karena pada saat pengujian aktivitas enzim dilakukan inkubasi pada suhu 37 oC selama 10 menit, maka : 1,07486631 x 1 = 0,107486631 µmol/200 µl/menit 10 Agar mendapatkan satuan aktivitas enzim tanpa angka, maka : 0,107486631 µmol/200 µl/menit x 5 = 107, 486631 µmol/µl/menit Jadi,
aktivitas
enzim
107, 486631 µmol/µl/menit.
transglutaminase
yang
dihasilkan
sebesar
50
Lampiran 3. Prosedur untuk pengukuran konsentrasi protein (metode Lowry) Perekasi Enzim Miliq water Pereaksi Lowry
Sampel (µl) Blanko (µl) 100 100 900 900 Inkubasi pada suhu kamar selama 15 menit Pereaksi Folin 3000 3000 Inkubasi pada suhu kamar selama 45 menit Ukur absorbansinya dengan panjang gelombang 540 nm (a). Pembuatan Pereaksi Lowry (Lowry A : Lowry B : Lowry C = 20:1:1) Total pereksi lowry yang dibutuhkan = 900 µl x 1 x 2 x 2 = 3.600 µl = 3,6 ml (untuk 1 sampel yang dibuat duplo) Lowry A: 100 gr Na2CO3 dalam 1 L NaOH 0,5 mmol/ml Volume Lowry A = 20 x 3,6 ml = 3,2727 ml (dilebihkan 4 ml) 22 Berat NaOH yang dibutuhkan = M NaOH x V lowry A x Mr NaOH = 0,5 M x 0,004 L x 40 = 0,08 gr NaOH Jadi, 0,08 gr NaOH dilarutkan dalam 4 ml miliqi water Berat Na2CO3 yang dibutuhkan = 100 gr Na2CO3 (I) x 4 ml NaOH (II) 1000 ml NaOH (I) = 0,4 gr Na2CO3 Jadi, 0,4 gr Na2CO3 dilarutkan dalam 4 ml NaOH 0,5 mmol/ml Lowry B : 0,5 gr NaK tartrat dalam 25 ml miliq water Volume Lowry B = 1 x 3,6 ml = 0,1636 ml (dilebihkan 2 ml) 22 Berat NaK tartrat yang dibutuhkan = 0,5 gr NaK tartrat (I) x 2 ml miliq water (II) 25 ml miliqi water (I) = 0,04 gr NaK tartrat Jadi, 0,04 gr NaK tartrat dilarutkan dalam 2 ml miliq water Lowry C : 0.25 gr CuSO4.5H2O dalam 25 ml miliq water Volume Lowry B = 1 x 3,6 ml = 0,1636 ml (dilebihkan 2 ml) 22
51
Berat CuSO4.5H2O yang dibutuhkan = 0,25 gr CuSO4.5H2O (I) x 2 ml miliqi (II) 25 ml miliq water (I) = 0,02 gr NaK tartrat Jadi, 0,02 gr NaK tartrat dilarutkan dalam 2 ml miliq water (b). Pembuatan Pereksi Folin (Folin : Miliq water = 1:10) Total perekasi folin yang dibutuhkan = 3.000 µl x1 x 2 x 2 = 12 ml (untuk 1 sampel yang dibuat duplo) Folin pekat yang dibutuhkan = 1 x 12 ml = 1,0909 ml (dilebihkan 2 ml) 11 Miliq water yang dibutuhkan = 10 x 12 ml = 10,9090 ml (dilebihkan 20 ml) 11
52
Lampiran 4. Kurva standar untuk penentuan konsentrasi protein Konsentrasi BSA (mg/ml) 0 0,6 1,2 1,8 2,4 3 3,6 4,2 4,8 5,4 6
Volume BSA (ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Volume Miliq water (ml) 1000 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
Contoh perhitungan kadar protein enzim transglutaminase Diketahui : absorbansi sampel = 0,147 absorbansi blanko = 0,012 Y = 0,2177 X + 0,0865 Ditanyakan : kadar protein enzim transglutaminase Jawaban : x = sampel-blanko = 0,147-0,012 = 0,135 Y = 0,2177 x 0,135 + 0,0865 Y = 0,1158895
53
Karena dilakukan pengenceran dengan perbandingan 1:9, maka : 0,1158895 x 10 = 1,158895 mg/100 µl 1,158895 mg x 1000 µl = 11,58895 mg/ml 100 ml 1 ml Jadi,
kadar
protein
11,58895 mg/ml.
enzim
transglutaminase
yang
dihasilkan
sebesar
54
Lampiran 5. Hasil uji pengaruh konsentrasi limbah cair surimi terhadap aktivitas enzim dengan menggunakan SPSS Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable:respon Type III Sum of Source
Squares
df
Mean Square
F
Sig.
Model
4.843
5
.969
11.691
.009
perlakuan
4.843
5
.969
11.691
.009
Error
.414
5
.083
Total
5.257
10
a
a. R Squared = ,921 (Adjusted R Squared = ,842)
respon a,,b
Tukey HSD
Subset perlakuan
N
1
kontrol
2
-.4979946525
lcs 50%
2
.4826203210
.4826203210
lcs 25 %
2
.6109625665
.6109625665
lcs 75 %
2
.7723930485
lcs 100 %
2
.9852941175
Sig.
.058
2
.485
Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = ,083. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 2,000. b. Alpha = ,05.
55
Lampiran 6. Hasil pengujian aktivitas enzim transglutaminase a). Aktivitas dari enzim transglutaminase yang dihasilkan dari media substitusi dengan penambahan limbah cair surimi Aktivitas TGase (unit/ml) Hari ke1
Kontrol 0
LCS 25% 0
LCS 50% 0
LCS 75% 0
LCS 100% 0,013
2
0,072
0,151
0,173
0,151
0,182
3
0,960
0,384
0,439
0,379
0,434
4
1,018
0,425
0,401
0,534
0,539
5
0
0,306
0322
0,482
0,551
6
0
0,379
0,361
0,571
0,603
7
0
0,611
0,483
0,772
0,985
8
0
0,550
0,499
0,597
0,861
b). Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim transglutaminase Jenis Bufer Asam asetat
Tris-HCl
Asam borat
pH 4 5 6 6 7 8 8 9
Aktv. TGase (unit/ml) 0,390 0,400 0,447 0,476 0,471 0,596 0,515 0,550
Aktivitas realtif (%) 65,43 67,23 75,08 79,91 79,12 100 86,42 92,37
c). Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim transglutaminase Suhu (oC) 25 30 37 50 60 70
Aktv. TGase (unit/ml) 0 0,461 0,559 0,851 0,377 0,340
Aktivitas realtif (%) 0 54,20 65,75 100 44,30 39,98
d). Pengaruh ketahanan panas terhadap aktivitas enzim transglutaminase Waktu pemanasan (menit) 0 20 40 60 80 100 120
Aktivitas TGase (unit/ml) 37oC 50oC 60oC 1,004010695 1,004010695 1,004010695 1,147727273 0,68315508 0 1,143048128 0,453877005 0 0,919117647 0,38368984 0 0,892379679 0,316176471 0 0,870320856 0,19986631 0 0,858957219 0,177807487 0
56
e). Pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim transglutaminase Ion logam (1 mM) Kontrol Na+ K+ Li+ Cu+ Ca2+ Zn2+ Mg2+ Fe3+
Aktv. TGase (unit/ml) 0,858 0,929 0,912 0,908 0,902 0,879 0 0,688 0,750
Aktivitas relatif (%) 100 108,26 106,31 105,84 105,06 102,41 0 80,22 87,46
f). Pengaruh inhibitor terhadap aktivitas enzim transglutaminase Inhibitor Kontrol PMSF EDTA
Konsentrasi (mM) 1 5 1 5
Aktv. TGase (unit/ml) 1,091 1,063 0,895 1,079 0,989
Aktivitas relatif (%) 100 97,43 81,99 98,89 90,63
57
Lampiran 7. Kadar protein dan aktivitas spesifik enzim transglutmainase dengan penambahan konsentrasi limbah cair surimi berbeda
58
Lamapiran 8. Komposisi bahan yang digunakan untuk melakukan SDS-PAGE A. Stock solutions 1). 2 M Tris-HCl (pH 8,8), 100 ml a. timbang 24,2 gram Tris b. tambahkan 50 ml H2O c. tambahkan HCl sedikit-sedikit sampai pH 8,8 (sekitar 4 ml) d. tambahkan H2O sampai volume total 100 ml 2). 1 M Tris-HCl (pH 6,8), 100 ml a. timbang 12,1 gram Tris b. tambahkan 50 ml H2O c. tambahkan HCl sedikit-sedikit sampai pH 6,8 (sekitar 8 ml) d. tambahkan H2O sampai volume total 100 ml 3). 10% (w/v) SDS, 100 ml a. timbang 10 gram SDS b. tambahkan H2O sampai volume total 100 ml 4). 50% (w/v) gliserol, 100 ml a. ambil 50 ml 100% gliserol b. tambahkan 50 ml H2O 5). 1% (w/v) bromofenol blue, 10 ml a. timbang 100mg bromofenol blue b. tambahkan 10 ml H2O dan stirrer sampai larut 6). Coomassie gel stain, 200 ml a. 0,2 gram coomassie blue R-250 b. 450 ml methanol c. 90 ml H2O d. 100 ml asam asetat glasial 7). Coomassie gel destain, 500 ml a. 50 ml methanol b. 50 ml asam asetat glasial c. 400 ml H2O B. Working solutions 1). Larutan A (Acrylamide stock solution), 100 ml a. 29,2 gram akrilamid b. 0,8 gram bis-akrilamid c. tambahkan 100 ml H2O dan stirrer sampai benar-benar larut 2). Larutan B (4x Separating gel bufer), 100 ml a. 75 ml 2 M Tris-HCl (pH 8,8) b. 4 ml 10% SDS c. 21 ml H2O 3). Larutan C (4x Stacking gel bufer), 100 ml a. 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 6,8) b. 4 ml 10% SDS c. 46 ml H2O
59
4). 10% ammonium persulfat, 5 ml a. 0,5 gram ammonium persulfat b. 5 ml H2O 5). Bufer elektroforesis, 1 liter (pH kira-kira 8,3) a. 3 gram Tris b. 14,4 gram glisin c. 1 gram SDS d. tambah H2O sampai total volume 1 liter 6). 5x Bufer sampel a. 0,6 ml 1 M Tris-HCl (pH 6,8) b. 5 ml 50% gliserol c. 2 ml 10% SDS d. 0,5 ml 2-merkaptoetanol e. 1 ml 1% bromofenol blue f. 0,9 ml H2O
60
Lampiran 9. Kurva standar SDS-PAGE Marker Phosphorylase B Albumin Ovalbumin Carbonic anhydrase Trypsin inhibitor α-lactabumin
BM (Dalton) 97000 66000 45000 30000 20100 14400
Log BM
A (cm)
B (cm)
Rf (A/B)
4,9867 4,8195 4,6532 4,4771 4,3031 4,1583
1,3 2,2 3,7 4,8 5,9 6,4
7,1 7,1 7,1 7,1 7,1 7,1
0,1830 0,3098 0,5211 0,6760 0,8309 0,9014
Keterangan : A = Jarak band dari sumuran B = Panjang gel sesudah di running Misal : X = Nilai dari Rf Y = Log BM Sehingga diperoleh persamaan linear : Y= -1,0908X + 5,1885 Dari persamaan tersebut, dapat dihitung berat molekul sampel sebagai berikut: 1). A = 1,4 cm, B = 7,1 cm, Rf = 0,1971 cm | BM = 94,0 kDa 2). A = 3,8 cm, B = 7,1 cm, Rf = 0,5352 cm | BM = 40,2 kDa 3). A = 6,4 cm, B = 7,1 cm, Rf = 0,9014 cm | BM = 16,0 kDa Contoh perhitungan : Diketahui : Jarak band ke-2 dari sumur (A) = 3,8 cm Panjang gel sesudah di running (B) = 7,1 cm Ditanyakan : Berat molekul pada band ke-2 Jawab : Rf = 3,8 = 0,5352 cm dimisalkan X 7,1 Sehingga dapat didapatkan nilai berat molekul pada band ke-2 dengan cara memasukan ke dalam persamaan linear Y= -1,0908X + 5,1885 adalah sebagai berikut : Y= -1,0908 (0,5352) + 5,1885 Y = 40243,11125 Dalton dibulatkan menjadi 40,2 kDa
