LAMPIRAN Lampiran 1. Pembuatan reagen-reagen untuk tahapan ekstraksi DNA a. Reagen FeCl3 200 mM Bahan-bahan yang dibutuhkan : FeCl3
2,7 g
Akuades
5 ml
Cara pembuatan : FeCl3 dilarutkan ke dalam akuades yang telah disterilisasi menggunakan autoklaf selama 15 menit. b. Reagen SDS 20% Bahan-bahan yang dibutuhkan : SDS
10 g
Akuades
50 ml
Cara pembuatan : SDS dilarutkan ke dalam akuades yang telah disterilisasi menggunakan autoklaf selama 15 menit. c. Reagen NaCl 2 M Bahan-bahan yang dibutuhkan : NaCl
11,7 g
Akuades
10 ml
Cara pembuatan : NaCl dilarutkan ke dalam akuades yang telah disterilisasi menggunakan autoklaf selama 15 menit. d. Reagen TE 1X (Tris 10 mM, EDTA 1 mM)
bio.unsoed.ac.id
Bahan-bahan yang dibutuhkan : Tris-HCl
1,576 g
EDTA
0,2922 g
Akuades
1l
Cara pembuatan : Tris-HCl dilarutkan kedalam 800 ml akuades kemudian dihomogenkan dan diatur pH sampai 8. EDTA ditambahkan ke dalam larutan. Akuades ditambahkan 21
hingga volume larutan 1 l. Larutan TE 1X disterilisasi menggunakan autoklaf 15 menit. e. Reagen kloroform : isoamil alkohol (24:1) Bahan-bahan yang dibutuhkan : Kloroform
24 ml
Isoamil alkohol
1 ml
Cara pembuatan : Kloroform 24 ml dicampurkan dengan isoamil alkohol 1 ml kemudian dihomogenkan dengan cara dikocok.
bio.unsoed.ac.id
22
Lampiran 2. Elektroforesis gel agarosa a. Pembuatan TAE 50X Bahan-bahan yang dibutuhkan : Tris base
242 g
Asam asetat glasial
57,1 ml
EDTA 0,5 M (pH 8)
100 ml
Akuades
sampai 1 l
Cara pembuatan : Semua bahan dicampurkan dan dihomogenkan dengan hotplate dan stirrer. TAE 50X yang sudah homogen disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit. b. Pembuatan gel agarosa 1,5% Bahan-bahan yang dibutuhkan : Agarosa
6g
TAE 1X
40 ml
DNA Fluorosafe
4 µl
Cara pembuatan : Agarosa dimasukkan ke dalam TAE 1X lalu dihomogenkan menggunakan hotplate dan stirrer. Campuran yang telah homogen dibiarkan hingga hangat kemudian ditambahkan DNA fluorosafe. Gel dituangkan ke dalam cetakan yang telah dipasang selotip pada kedua ujungnya dan diberi sisir pembuat sumuran. Selotip dan sisir pembuat sumuran dilepas setelah gel memadat dan gel siap digunakan. c. Persiapan running elektroforesis Cara kerja : Tangki elektroforesis diisi dengan TAE 1X. Gel agarosa yang telah memadat dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis. Pastikan gel agarosa dalam posisi
bio.unsoed.ac.id
terendam TAE 1X. Sampel dicampurkan dengan loading dye 6X dengan perbandingan antara sampel dan loading dye 5:1. Satu per satu sampel dimasukkan ke dalam sumuran. Tutup pengaman tangki elektroforesis dipasang kemudian disambungkan kabel listrik antara tangki dengan adapter. Pastikan pemasangan kabel positif dan negatif tidak terbalik. Adapter dinyalakan kemudian atur voltase pada 100 V, kuat arus 400 mA dan waktu 50 menit. Tombol run ditekan untuk memulai running. 23
Lampiran 3. Pembuatan reagen denaturing gradient gel electrophoresis a. Larutan 40% acrylamide/bis (37.5:1) Bahan-bahan yang dibutuhkan : Acrylamide
38.93 g
Bis-acrylamide
1.07 g
Akuades
sampai 100 ml
Cara pembuatan : Semua bahan dicampurkan dalam botol gelap dan dihomogenkan dengan cara dikocok. Larutan disimpan pada suhu 4oC.
b. Larutan 0% denaturan gel acrylamide/bis 8% Bahan-bahan yang dibutuhkan : 40% Acrylamide/Bis
20 ml
50x TAE buffer
2 ml
dH2O
78 ml
Cara pembuatan : Semua bahan dicampurkan dalam botol gelap dan dihomogenkan dengan cara dikocok. Larutan disimpan pada suhu 4oC.
c. Larutan 100% denaturan gel acrylamide/bis 8% Bahan-bahan yang dibutuhkan : 40% Acrylamide/Bis
20 ml
50x TAE buffer
2 ml
Formamide (deionized)
40 ml
Urea
42 g
Akuades
sampai 100 ml
Cara pembuatan :
bio.unsoed.ac.id
Semua bahan dicampurkan dalam botol gelap dan dihomogenkan dengan cara dikocok. Larutan disimpan pada suhu 4oC.
d. Ammonium persulfate 10% Bahan-bahan yang dibutuhkan : Ammonium persulfate
0.1 g
Akuades
1.0 ml 24
Cara pembuatan : Semua bahan dicampurkan dalam tabung microcentrifuge 1,5 ml dan dihomogenkan dengan cara tabung dibolak-balik 20 kali.
e. Pembuatan gel akrilamid/bis dengan konsentrasi denaturan 25% dan 60% Denaturing Solution 100% 0% Volume total
25% 5 ml 15 ml 20 ml
60% 12 ml 8 ml 20 ml
bio.unsoed.ac.id
25
Lampiran 4. Pre-heating running buffer TAE 1X Cara kerja : a. Tangki elektroforesis diisi dengan 7 l buffer TAE 1X. b. Temperature control module diletakkan di atas tangki elektroforesis. Arus listrik disambungkan ke temperature control module dan nyalakan alat, pemanas dan pompa (gambar 7.1).
Temperature control module
Power Pompa
Tangki elektroforesis
Pemanas
Gambar 7.1. Proses pre-heating buffer TAE 1X c. Pengaturan suhu diatur menjadi 60oC dan ditunggu hingga buffer mencapai suhu yang diinginkan.
bio.unsoed.ac.id
26
Lampiran 5. Perakitan alat cetakan parallel gradient gel Cara kerja : a. Clamp, glass plate dan spacer dipersiapkan ditempat yang rata dan bersih. Pastikan glass plate yang lebih panjang berada di bawah dan kedua glass plate dipisahkan oleh spacer membentuk sandwich (gambar 7.2).
Clamp
Glass plate
Spacer Gambar 7.2. Posisi clamp, glass plate dan spacer yang akan dirakit
b. Clamp dipasangkan pada kedua ujung sandwich (gambar 7.3). Clamp dikencangkan dengan cara memutar screw yang ada di atas clamp.
Screw
bio.unsoed.ac.id
Gambar 7.3. Proses pemasangan clamp pada sandwich
c. Sandwich diletakkan pada salah satu alignment slot dari casting stand. Pastikan aligment slot telah diberi grey sponge. Clamp dikendorkan dan alignment card dimasukkan ke dalam cetakan gel untuk mengatur spacer berada ditempat yang tepat (gambar 7.4). Clamp dikencangkan kembali.
27
Casting stand
Alignment card Grey sponge Gambar 7.4. Pengaturan posisi spacer pada sandwich dengan alignment card
d. Alignment card dikeluarkan dari cetakan gel. Cetakan gel diisi dengan akuades steril untuk memastikan cetakan tidak bocor. Apabila cetakan masih bocor maka penyusunan cetakan gel diulangi dari awal kembali. e. Cetakan yang sudah baik dilepaskan dari casting stand untuk mengeluarkan akuades steril kemudian dipasang kembali pada casting stand.
bio.unsoed.ac.id
28
Lampiran 6. Mencetak parallel denaturing gradient gel Cara kerja : a. Gradient delivery system dirakit (gambar 7.5).
Gambar 7.5. Gradient delivery system yang telah dirakit
b. Low density solution (gel 25% denaturan) dan high density solution (gel 60% denaturan) disiapkan dalam tabung disposable 50 ml. DCode Dye solution 100 µL ditambahkan pada high density gel. Ammonium persulfat 40 µL dan TEMED 40 µL ditambahkan ke dalam Low density gel dan high density gel kemudian dihomogenkan dengan cara dikocok. c. Low density solution dan high density solution dimasukkan ke masing-masing syringe. Pastikan tidak ada gelembung udara yang terperangkap. Syringe ditekan hingga gel solution mencapai ujung long tygon tubing. d. Masing-masing syringe dipasang kembali pada gradient delivery system. Long tygon tubing kedua syringe dipasang pada Y-fitting short tygon tubing. Ujung needle diletakkan di atas bagian tengah cetakan gel (gambar 7.6).
Needle
bio.unsoed.ac.id
Y-fitting
Short tubing
Long tubing
Gambar 7.6. Proses penuangan gel ke dalam cetakan 29
e. Cam diputar perlahan untuk memintahkan gel ke dalam cetakan. Setelah gel berada pada cetakan, sisir pembuta sumuran dipasang di atas cetakan (gambar 7.7).
Sisir
Gambar 7.7. Pemasangan sisir pada gel yang telah dituang
f. Gel dibiarkan memadat sekitar 60 menit. Setelah gel memadat, sisir dilepas dari cetakan dan gel beserta cetakannya dilepas dari casting stand. Gel siap dielektroforesis.
bio.unsoed.ac.id
30
Lampiran 7. Denaturing gradient gel electrophoresis Cara kerja : a. Sandwich berisi gel dan core diletakkan pada permukaan yang datar dan bersih. b. Sandwich berisi gel dipasang pada core (gambar 7.8).
Core
Gambar 7.8. Pemasangan sandwich pada core c. Temperature control module dimatikan ketika buffer mencapai suhu 60oC. Temperature control module dipindahkan pada DCode lid. Core berisi sandwich diletakkan pada tangki elektroforesis dengan posisi bulatan merah berada pada sisi kanan dan bulatan hitam pada sisi kiri. d. Sumuran dibersihkan dengan buffer untuk menghilangkan sisa gel yang tidak terpolimerisasi. Sampel dimasukkan ke dalam sumuran menggunakan mikropipet secara hati-hati. e. Temperature control module dipasang kembali pada tangki elektroforesis kemudian power, heater dan pompa dinyalakan (gambar 7.9).
bio.unsoed.ac.id
Gambar 7.9. Posisi core yang telah dimasukkan pada tangki DGGE
31
f. Kabel disambungkan pada adapter kemudian power dinyalakan. Voltase diatur pada 130 V kemudian tekan tombol run untuk memulai elektroforesis.
bio.unsoed.ac.id
32
Lampiran 8. Pewarnaan gel dengan etidium bromida Cara kerja : a. Sumber arus listrik dimatikan setelah elektroforesis selesai dilakukan. Temperature control module diletakkan pada DCode Lid Stand (gambar 7.10).
Gambar 7.10. Posisi temperature control module pada DCode lid stand
b. Core berisi sandwich diambil dan diletakkan pada permukaan yang rata. Sandwich dilepaskan dari core (gambar 7.11).
bio.unsoed.ac.id Gambar 7.11. Proses pelepasan sandwich dari core
c. Kedua clamp dilepaskan dari glass plate. Glass plate yang pendek dilepas secara perlahan-lahan. Kedua spacer dilepaskan dan gel dimasukkan ke dalam baki yang berisi 250 ml buffer TAE 1X dan 25 µL EtBr 10 mg/ml. Gel diwarnai selama 15 menit. 33
d. Gel yang telah diwarnai diambil dan dimasukkan ke dalam baki berisi 250 ml TAE 1X selama 20 menit untuk proses destaining. e. Gel diambil kemudian diletakkan pada UV transilluminator untuk didokumentasikan.
bio.unsoed.ac.id
34
Lampiran 9. Spesifikasi peralatan dan bahan SPESIFIKASI PERALATAN DAN BAHAN No . 1.
Nama Alat
Merek/Tipe
Kegunaan
Tempat
Gelas ukur
Iwaki PYREX
Mengambil dan menakar larutan dengan volume tertentu Menyimpan dan menghomogenkan reagen Menyimpan sampel sedimen mangrove dan menyimpan reagen Mengukur pH
Lab. Mikrobiologi
2.
Labu Erlenmayer Iwaki PYREX
3
Botol
-
4.
pH indicator strips Timbangan Analitik
Merck
6
Cool box
Harvest
7.
Hot Plate
Stuart
8.
Magnetic Stirer
Stuart
9
Sarung tangan karet
Safeguard
10.
Autoklaf
Hirayama
11
Masker
IBS
5.
OHAUSS
Menimbang bahan dengan berat maksimal 0,1 g – 200 g Menyimpan sampel pada saat pengambilan di lapangan Memanaskan larutan Menghomogenkan larutan Melindungi tangan pada saat bekerja dan mencegah kontaminasi Mensterilisasi dengan uap panas bertekanan Melindungi diri dari bahan-bahan kimia berbahaya dan mencegah kontaminasi Meletakkan sampel pada saat diisolasi DNA Tempat preparasi sampel pada saat akan mengisolasi DNA Membantu
bio.unsoed.ac.id 12
Biologix
13
Tabung mikrosentrifuge 1,5 ml Tabung reaksi
14.
Water bath
Heidolph
Iwaki PYREX
35
Lab. Mikrobiologi Lab. Mikrobiologi
Lab. Mikrobiologi Lab. Mikrobiologi
Lab. Mikrobiologi
Lab. Mikrobiologi Lab. Mikrobiologi Lab. Mikrobiologi
Lab. Mikrobiologi Lab. Mikrobiologi
Lab. Mikrobiologi Lab. Mikrobiologi
Lab.
15.
Alumunium foil
Klim pak
16
Tabung disposable 50 ml
Falcon
17
Mikropipet 1001000 µL
Eppendorf
18
Mikropipet 20200 µL
Eppendorf
19
Mikropipet 0,510 µL
Eppendorf
20
Tip biru
Biologix
21
Tip kuning
Biologix
22
Tip putih
Biologix
23
Alat elektroforesis
CBS Scientific EPS 300X
24
UV transilluminator Nano spektrofotometri
MultiDoc-It 120 Imaging System Implen
26
Tabung PCR 0,2 ml
Biologix
27
Alat PCR
28
Alat DGGE
Thermal Cycler Techne (TC5000) Biorad
29
Vorteks
IKA MS3 Digital
30
Kertas Parafilm
M-Parafilm
25
melisiskan sel Sebagai penutup erlenmayer , reagen dan botol sampel Menampung dan meracik reagen DGGE Mengambil larutan dengan volume 100-1000 µL Mengambil larutan dengan volume 20200 µL Mengambil larutan dengan volume 0,5-10 µL Mengambil larutan dengan volume 100-1000 µL Mengambil larutan dengan volume 20200 µL Mengambil larutan dengan volume 0,5-10 µL Memisahkan DNA berdasarkan ukuran dan bentuk Visualisasi hasil elektroforesis Mengukur kuantitas dan kemurnian DNA Meletakkan sampel yang akan diamplifikasi Mengamplifikasi fragmen DNA target Memisahkan DNA berdasarkan urutan basanya Menghomogenkan larutan dan proses beadbeating Mencampurkan sampel DNA dengan loading dye
bio.unsoed.ac.id
36
Mikrobiologi Lab. Mikrobiologi
Lab. Biosains
Lab. Biologi Molekuler Lab. Biologi Molekuler Lab. Biologi Molekuler Lab. Biologi Molekuler Lab. Biologi Molekuler Lab. Biologi Molekuler Lab. Biologi Molekuler Lab. Biologi Molekuler Lab. Terpadu
Lab. Biologi Molekuler Lab. Terpadu
Lab. Biosains
Lab. Biologi Molekuler Lab. Mikrobiologi
No.
Nama Bahan
Spesifikasi
1.
Sedimen Mangrove
-
2 3 4 5
Buffer Tris-HCl Asam asetat glasial EDTA FeCl3
Powder Cair Powder Powder
6
SDS
Powder
7 8 9 10 11 12
Kloroform Isoamyl alcohol Akuades Alkohol absolut Alkohol 70% NaCl
Cair Cair Cair Cair Cair Powder
13
Agarosa
Powder
14 15
DNA fluorosafe EtBr
Cair Cair
16
Primer 27F
Cair
17
Primer 1540R
Cair
18
Primer 968F-GC
Cair
19
Primer 1406R
Cair
20
Akuabides
Cair
21
Kappa PCR master mix
Cair
22
Akrilamid
Powder
23
Bis-akrilamid
Powder
24 25 26 27
UREA Formamide TEMED Ammonium persulfat
Powder Cair Cair Powder
28
Biorad Dye solution
Kegunaan Sebagai sampel untuk penelitian Sebagai buffer Sebagai sumber elektrolit Sebagai anti DNAse Sebagai pengikat asam humat Merusak dinding dan membran sel bakteri Menghilangkan protein Menghilangkan protein Sebagai pelarut reagen Mengendapkan DNA Mencuci DNA dari lemak Mengendapkan DNA Membuat gel untuk elektroforesis agarosa Mewarnai DNA Mewarnai DNA Mengamplifikasi fragmen DNA target Mengamplifikasi fragmen DNA target Mengamplifikasi fragmen DNA target Mengamplifikasi fragmen DNA target Mengencerkan DNA Mengamplifikasi fragmen DNA target Membuat gel akrilamid untuk DGGE Membuat gel akrilamid untuk DGGE Sebagai denaturan DNA Sebagai denaturan DNA Memadatkan gel akrilamid Memadatkan gel akrilamid Membuat gradasi warna pada gel akrilamid Sebagai pemberat DNA Sebagai penentu ukuran DNA
29
Cair bio.unsoed.ac.id Loading dye Cair
30
Marka DNA 100 bp
Cair
37
