LABORLEIRAT A HPLC LABORATÓRIUMI GYAKORLATHOZ (ANALITIKAI KÉMIA 1.) TARTALOMJEGYZÉK:
KÖVETELMÉNYEK..................................................................................................................................... 2 A FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA ALAPJAI .................................................................................................. 2 Az elválasztás ....................................................................................................................................... 2 A készülék ............................................................................................................................................ 3 Folyadékkromatográfiás módszerek, fordított fázisú folyadékkromatográfia.................................... 5 Elúciós technikák, pH kontroll a fordított fázisú kromatográfiában ................................................... 6 Minimális követelmények a mintával, az állófázissal és a mozgófázissal szemben ............................ 7 A folyadékkromatográfia alapvető elméleti megfontolásai ................................................................ 9 FELADATOK A GYAKORLAT SORÁN........................................................................................................ 14
1
KÖVETELMÉNYEK A leirat célja, hogy a folyadékkromatográfiás gyakorlat elvégzéséhez, a gyakorlat megértéséhez szükséges alapokat rendszerezze. Készítésekor nem törekedtünk az elméleti alapok részletes magyarázatára. Az elméleti háttér részletes magyarázata megtalálható az egyetemi tankönyvekben (Dr. Pokol György - Dr. Sztatisz Janisz: Analitikai Kémia 1., Műegyetmi Kiadó; Dr. Fekete Jenő: Folyadékkromatográfia elmélete és gyakorlata, Edison House Kft.). A gyakorlat elvégzése az itt összefoglalt alapok ismerete nélkül nem lehetséges, ezért a gyakorlat előtt beugrót íratunk, melynek során öt feltett kérdésből legalább kettőre helyes választ kell adni. A beugróban csak a leiratban összefoglaltakat kérdezzük vissza. Ha a beugró nem sikerül, a hallgató nem végezheti el a gyakorlatot. Ebben az esetben az oktatóval egyeztetett időpontban pótolnia kell. A gyakorlat során végzett munkából a hallgatók jegyzőkönyvet készítenek. A jegyzőkönyv akkor fogadható el, ha a gyakorlat során egyeztetett módon, tömören és egyértelműen tartalmazza azokat az információkat, amely alapján a méréseket reprodukálni lehet. Jegyzőkönyvet egyszer lehet javítani. Ha másodjára sem sikerül elfogadható jegyzőkönyvet produkálni, a laborgyakorlatot - az oktatóval egyeztetve - meg kell ismételni. A gyakorlatra mindenki hozzon magával laborköpenyt, védőszemüveget, számológépet és vonalzót! A gyakorlat értékelése: - 5 pont kapható a beugróra (min. 2-t el kell érni a beugráshoz) - 5 pont kapható a jegyzőkönyvre a két jegy számtani közepe a végső laborjegy. A jegyzőkönyvek leadására egy hét áll rendelkezésre, utána minden megkezdett napon fél jegy levonásra kerül. Végső laborjegy csak akkor adható, ha a beugró és a jegyzőkönyv is legalább 2 pontra sikerül.
A FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA ALAPJAI Az elválasztás Folyadékkromatográfiás elválasztás során arra törekszünk, hogy az oldott állapotban lévő mintánk egyes komponenseit az alábbi elv alapján válasszuk el egymástól: Egy helyhez kötött állófázis (esetünkben szemcsés, porózus töltet a kolonnában) fölött adott összetételű folyadékot (mozgófázist, eluenst) áramoltatunk. Az elválasztandó komponensek fizikai és kémiai tulajdonságai (ionizáltság, hidrofóbicitás, polaritás), az állófázis felületi tulajdonságai (ionizáltság, hidrofóbicitás, polaritás) és mérési körülmények (mozgófázis összetétel, pH, ionerősség, 2
hőmérséklet) alapján megfelelő körülmények között olyan kölcsönhatások jönnek létre, amelyek lehetővé teszik, hogy a komponensek különböző erősséggel kötődjenek az állófázishoz.
Az
elválasztás azáltal jön létre, hogy a komponensek eltérő ideig tartózkodnak az állófázisban vagy annak felületén. A fellépő kölcsönhatások a következők lehetnek:
szorpciós kölcsönhatások: adszorpció, abszorpció
van der Waals-féle gyenge kölcsönhatások
H-hidas kölcsönhatás
sav-bázis kölcsönhatások
ionos kölcsönhatás
komplexképzés
enzim-szubsztrátum kapcsolat
A komponensek és állófázis között létrejövő szorpciós-deszorpciós folyamatok (megoszlás az állófázis és a mozgófázis között) miatt az erősen kötődő komponensek több, míg a gyengébben kötődő komponensek kevesebb időt töltenek az állófázishoz kötve. Végeredményként a különböző erősséggel kötődő komponensek időben elválasztva eluáltathatók a kolonnáról. A fent leírtakat az alábbi ábra szemlélteti.
1. ábra. A folyadékkromatográfiás elválasztás alapja. A dugószerűen injektált minta komponensei: A-C, ahol A a legerősebben kötődő-legjobban visszatartott komponens
A készülék A fent leírtakból következik, hogy az elválasztórendszer alapja a kolonna. Ez esetünkben néhány µm átmérőjű porózus szemcsékkel töltött cső. Analitikai HPLC-ben a jellemző méretek: 3-10 µm 3
szemcseátmérő, 3-4.6 mm kolonnaátmérő és 10-25 cm kolonnahossz. Maga a töltet általában különböző fémiontartalmú szilikagélből készül, melyen a kívánt felületi tulajdonságok elérése érdekében felületi módosításokat hajthatnak végre. A kolonna permeabilitása viszonylag kicsi, ezért nagy nyomásra van szükség a mozgófázis (eluens) áramoltatásához. A HPLC nagynyomású szivattyúk jellemzően 300-400 bar nyomással szemben tudnak folyadékot szállítani. A kolonna előtt szükség van egy (injektor) mintaadagoló beépítésére, mely a kívánt mennyiségű mintát (jellemzően 1-20μl) dugószerűen képes az mozgófázisba juttatni, mely aztán a kolonnára kerül. A kolonnáról eluálódó komponensek észlelése többnyire valamilyen fizikai tulajdonságuk mérésével lehetséges. Ezt a feladatot látják el a detektorok, amelyek egy mért jel-idő függvényt generálnak, amit kromatogramnak nevezünk. A modern HPLC-ben a következő detektorok alkalmazhatók:
UV, UV-VIS
fluoreszcens detektorok
elektrokémiai detektorok (amperometriás, kulometriás)
vezetőképesség mérésén alapuló detektorok
törésmutató különbség mérésén alapuló detektorok (RI)
Egyéb: radiokémiai, fényszórás mérésen alapuló, viszkozitás mérésén alapuló, polarimetriás detektorok, MS stb.
Az egyes komponensek a detektoron való áthaladáskor a kromatogramon csúcsként jelennek meg. Minden csúcshoz tartozik egy ún. retenciós idő (regisztrálás időpontja az adagolástól számítva), mely a komponens minőségére és a magassága, vagy a csúcs területe pedig a komponens mennyiségére utal. Leggyakrabban UV-detekrotokat használunk, amelyek a vizsgált komponens UV-fényelnyeléséből eredő abszorbaciát alakítják elekromos jellé. A rendszer vezérlését (áramlás, injektálás, kolonnahőmérséklet, detektálás), a kromatogrammok megjelenítését és az adatok értékelését számítógép segítségével végezzük. Az alábbi ábrán a kromatográfiás mérőrendszer felépítése látható. A gyakorlat során az egyes modulok működését részletesen megbeszéljük. Kérjük, hogy a bemutatott alkatrészeket ismertessék a jegyzőkönyvben!
4
2. ábra. A kromatográfiás mérőrendszer vázlata
Folyadékkromatográfiás módszerek, fordított fázisú folyadékkromatográfia Azt, hogy milyen kromatográfiás módban dolgozunk, a mozgófázis és az állófázis polaritásának viszonya, és a visszatartást kialakító kölcsönhatások alapján sorolhatjuk be. Kromatográfiás módszer Normál fázisú kromatográfia (NP-HPLC) Fordított fázisú kromatográfia (RP-HPLC) Hidrofil kölcsönhatású kromatográfia (HILIC) Ionkromatográfia (IC)
Állófázis minősége poláris töltet
Mozgófázis minősége apoláris
apoláris töltet
poláris
polárisabb
kevésbé poláris
kis ioncserélő kapacitású töltet Ionpár kromatográfia (MPIC) apoláris töltet Ioncserés kromatográfia (HPIC) töltéssel rendelkező töltet Ion kizárásos kromatográfia erős kationcserélő töltet (HPICE) Méretkizárásos kromatográfia nagy pórusátmérővel (SEC) rendelkező töltet (gél) Hidrofób kölcsönhatáson hidrofób felületű töltet alapuló kromatográfia (HIC)
közepes vezetésű puffer poláris oldószer + ionpárképző puffer oldat ásványi savtartalmú víz vagy víztartalmú elegy víz vagy szerves oldószer sótartalmú oldat, elválasztás során csökkenő só koncentráció
Normál fázisú elválasztás esetén a mozgófázis (pl. hexán, heptán, diklórmetán, néhány % alkohol, éter, észter) mindig apolárisabb, mint az állófázis (szilikagél, polárisan módosított szilikagél, stb.). Ilyen körülmények között apolárisabb (oldható a mozgófázisban), poláris csoportokkal rendelkező (van Hhidas, vagy dipól-dipól kölcsönhatási lehetőség a szilikagél felületével) vegyületek választhatók el. A mozgófázis (eluens) nem tartalmazhat vizet, mert deaktiválja a szilikagél kölcsönhatási helyeit.
5
Fordított fázisú elválasztás során a mozgófázis (víz + acetonitril, metanol, etanol, stb.) mindig polárisabb, mint az állófázis (apolárisan módosított szilikagél, polimer alapú állófázisok, stb.). Ilyen körülmények között hidrofób karakterű (van visszatartás az apoláris tölteteken), apoláris (+ poláris) csoportokkal rendelkező vegyületek határozhatók meg. Az apoláris csoportok lehetővé teszik a hidrofób kölcsönhatások létrejöttét az apolárisan (C4-C18 láncokkal) módosított felülettel. Sztérikus okok miatt a felületen lévő szilanol csoportok csak mintegy fele reagál módosítás során, ezért H-hidas kötőhelyek is maradnak az állófázis felületén. Ezek biztosítanak poláris szelektivitást is a töltetnek. A felület módosítása leggyakrabban úgy történik, hogy az alap szilikagél szilanolcsoportjait hosszú szénláncú klórszilánokkal viszik kondenzációs reakcióba:
3. ábra. Szilikagél felületi módosítása C18 láncokkal (fordított fázisú töltet) A módosítás után visszamaradt szilanolokat általában utószilanizálással (pl. trimetil-klórszilánnal) igyekeznek elreagáltatni. A módosított szilikagél pH tűrése általában korlátozott, ezért ügyelnünk kell a gyártó által javasolt mozgófázis pH-tartomány betartására. (Ez jellemzően pH 2-8 között van. pH 2 alatt a felületi módosítás hidrolizál le, pH 8 fölött az alap szilikagél (polikovasav) oldódik.) Jó kromatográfiás tulajdonságainak és egyszerű használhatóságának köszönhetően ezek a leggyakrabban alkalmazott töltet típusok. A gyakorlat során is fordított fázisú elválasztást fogunk végezni. Nem szabad megfeledkezni az egyéb folyadékkromatográfiás módokról sem, melyeknek kivétel nélkül fontos szerepük van: ioncserés kromatográfia, hidrofób kölcsönhatási kromatográfia, hidrofil kölcsönhatási kromatográfia, méretkizárásos kromatográfia, stb. Ezek részletesebb ismertetésétől itt eltekintünk.
Elúciós technikák, pH kontroll a fordított fázisú kromatográfiában Alapvetően két féle elúciós technikát alkalmazunk a gyakorlatban: izokratikus elúció és gradiens elúció. Izokratikus elúció során a kromatográfiás mérés alatt végig azonos összetételű mozgófázist (eluenst) áramoltatunk az állófázis felett, tehát az eluenserősség nem változik a mérés során. Minél erősebb az eluens, a komponens annál kisebb retenciós idővel eluálódik az oszlopról. Ez a módszer akkor
6
alkalmazható, ha hasonló hidrofóbicitású vegyületeket választunk el, így kedvező esetben a kromatográfia során az összes komponens a 2
Minimális követelmények a mintával, az állófázissal és a mozgófázissal szemben A minta akkor vizsgálható folyadékkromatográfiásan, ha eleget tesz az alábbi követelményeknek: -
nem tartalmaz szilárd szennyezést, ami eltömődést okozhat a rendszerben, vagy a kolonnán.
-
oldható a mozgófásban kémiai átalakulás nélkül (hamis mérési eredményre vezethet)
-
az oldhatóság mértéke megfelel a detektálás megszabta követelményeknek (pl. UV-Detektor esetén minimálisan 1-10 µg/ml)
A mozgófázissal szemben általánosan elvárt minimális követelményeket az alábbi néhány pont foglalja össze:
7
-
kis viszkozitású (kisebb nyomásesést és hatékonyabb anyagátadást biztosít ld. később Van Deemter- és Darcy-egyenlet)
-
nem tartalmazhat szilárd anyagot
-
polaritása módszerspecifikus (ld. fent, folyadékkromatográfiás módok)
-
nem károsítja az állófázist (pl. pH munkatartomány szilika alapú állófázisok esetén)
-
az oldószer fényáteresztése lehetővé teszi a detektálást (pl. UV detektálás esetén nem nyel el a felső UV -200-210nm feletti- tartományban)
-
a módszernek megfelelő tisztasággal rendelkezik (ld. fent, elúciós technikák)
-
forráspontja kellően magas (így elkerülhető a rendszerben a buborékok képződése, melyek zavarják a mérést: pulzálást okoznak a folyadékszállításban és szórják a fényt a detektorban)
-
többkomponensű oldószerrendszerek komponensei egymással jól elegyíthetőek
-
a mérés során esetlegesen alkalmazott pufferek nem válhatnak ki benne
-
lehetőleg nem toxikus
-
kedvező ár
Az állófázissal szemben tipikusan elvárható alapvető követelmények: -
mechanikailag stabilnak kell lennie, hogy a szemcsék ne roppanjanak meg az alkalmazott nyomás hatására
-
a töltetágynak homogénnek kell lennie (egyenletes áramlási csatornák a szemcsék közt: ld. később Van Deemter egyenletben az örvénydiffúzió)
-
a szemcsék átmérője kicsi legyen és kicsi legyen a szemcseátmérő eloszlása lehetőleg szűk eloszlást mutasson . Kis szemcsék az alkalmazható nyomást (Darcy-tv.), míg a nagy szemcsék az elválasztás hatékonyságát (Van Deemter-egyenlet) korlátozzák, ha szemcseátmérő eloszlás nagy, akkor heterogén töltetágy jöhet létre.
-
a szemcsék pórusméretének olyannak kell lenni, hogy ne gátolja a vizsgálandó anyagok diffúzóját. Ne tartalmazzon mikrópórusokat, mert ún. mikropórusokban dp<2 nm az anyagátadási ellenállás nagy, és széles kromatográfiás csúcsokat kapunk
-
a töltet felületének energetikailag homogénnek kell lennie (a nagyon különböző kölcsönhatási erősséget biztosító kötődési helyek száma ne legyen összemérhető, különben a csúcsalak torzul, az elválasztás romlik.)
-
módszerspecifikus követelmény: rendelkezzen a felület
a
módszernek
megfelelő
kémiai
tulajdonsággal
A fent felsorolt pontok természetesen a sikeres elválasztás szükséges, de nem elégséges feltételei. Sikeres elválasztáshoz jól kell megválasztani az állófázist (felületi tulajdonságok, geometriai paraméterek), a mozgófázist (összetétel, pH) és a mérés egyéb körülményeit (pl. hőmérséklet, injektált 8
mintamennyiség, stb.). Egyes esetekben a mérési módszer kidolgozásához, optimálásához szoftveres módszerfejlesztést is segítségül kell hívni.
A folyadékkromatográfia alapvető elméleti megfontolásai A folyadékkromatográfiás elválasztások többségében nem használunk szelektív detektorokat (pl. tömegspektrométer), ezért a mérni kívánt komponenseinket a minta egyéb alkotóitól és egymástól el kell választanunk. Az elválasztás számszerű jellemzésére az RS (resolution-felbontás) értéket használjuk, amely a kromatogramokból az alábbi módon számolható:
4. ábra. Felbontás meghatározása kromatogramból itt Δtr a retenciós idők különbsége, W1 és W2 pedig az alapvonalon mért csúcsszélesség. Ezt úgy kapjuk, hogy a csúcs inflexiós pontjaihoz érintőt szerkesztünk, amely az alapvonalból adott hosszúságú szakaszt metsz ki. RS az alábbi módon is kifejezhető: 𝑹𝒔 =
𝟏 𝜶−𝟏 𝒌 √𝑵 𝟒 𝜶 𝒌+𝟏
az egyenletet az alábbiakban bontjuk szét: 𝑡
2
az elméleti tányérszám (hatékonyság): 𝑵 = 16 ( 𝑤𝑅) , mely a csúcsszélesedéssel kapcsolatos mennyiség. Minél nagyobb N, a csúcs annál keskenyebb, annál nagyobb esély van két szomszédos csúcs elválasztására:
9
5. ábra. Hatékonyság hatása a csúcsalakra
A visszatartási tényező: 𝒌 =
𝑡𝑅 −𝑡0 𝑡0
,
(t0 a holtidő, annak a komponensnek a retenciós ideje, amelyik nem hat kölcsön az állófázissal-nincs visszatartása) amely megmutatja az állófázison és a mozgófázisban töltött idő viszonyát. Ez azért fontos, mert elválasztást elsődlegesen az állófázis szabja meg. Ha k kicsi, a komponensek nem tartózkodnak elég időt az állófázison ahhoz, hogy az különbséget tudjon tenni köztük ⟹ nincs elválasztás. Ha k túl nagy, akkor az oszlopon történő diffúzió miatt a csúcs kiszélesedik, romlik a hatékonyság és a felbontás. Általában kívánatos, hogy 1
6. ábra. a visszatartás értelmezése (itt t0-t ún. oldószerzavarás jelöli) 𝑘
A szelektivitás: 𝜶 = 𝑘2 , 1
amely megmutatja, hogy két komponens visszatartása milyen mértékben tér el. Tehát, hogy az állófázis képes-e az adott körülmények között termodinamikai szempontból különbséget tenni a két komponens között.
10
7. ábra. Ugyanazon vegyületek elválasztása különböző szelektivitású kolonnákon
Az elválasztás egyenlete alapján (RS) három tag befolyásolja az elválasztást. Az egyes tagok hozzájárulása a felbontáshoz az alábbi ábrán látható.
8. ábra. A felbontást meghatározó tényezők hatása A visszatartás nagyon hamar (már kb. k=2 mellett) többé-kevésbé konstans viselkedést mutat. Ez azt jelenti, hogy az oldószererősség változatásával k>2 fölött nem lehet érdemben befolyásolni a felbontást. N értékét a töltet paraméterei és az oszlop geometria méretei szabják meg. Az oszlop hosszának növelésével N egyenes arányban nő, viszont ebben az esetben számolnunk kell a mérési idő 11
és az oszlopon mérhető nyomásesés növekedésével. N növelése továbbá gyökös arányossággal növeli a felbontást A legnagyobb hatása a felbontásra a szelektivitásnak van. Ha tehát a módszerfejlesztésbe kezdünk, érdemes először megvizsgálni, hogy az adott állófázis képes-e egyáltalán megkülönböztetni a komponenseinket. Ha igen, akkor van értelme a hatékonyság és a visszatartás optimálásának. A visszatartást az eluenserősséggel és a hőmérséklet változtatásával tudjuk befolyásolni, míg a szelektivitást elsődlegesen a töltet felületi kémiájával másodsorban az eluens összetételével, és a hőmérséklettel. A kinetikai hatékonyságot a töltet szemcseátmérője, a kolonnahosszal és a hőmérséklettel tudjuk változtatni. A kinetikai hatékonyság változását a mozgófázis lineáris sebességének függvényében a Van Deemter összefüggés írja le. 𝑯𝑬𝑻𝑷(𝑯) = 𝑨 +
𝑩 𝑩 + 𝑪𝒖 = 𝑨 + + (𝑪𝒔 + 𝑪𝒎 )𝒖 𝒖 𝒖
H=L/N ahol HETP az elméleti tányérmagasság (height equivalent to a theoritical plate), L: oszlophossz, N: elméleti tányérszám A, B és C konstansok, u a mozgófázis lineáris áramlási sebessége (u=L /t0). Minél kisebb HETP, a csúcs annál keskenyebb, tehát HETP (H) alacsony értéken tartása kívánatos. Az első tag (A tag) csúcsszélesítő hozzájárulása a szemcsék közti egyenetlen áramlási csatornákhoz köthető. Ha a csatornák egyenetlenek, a molekulák ugyanolyan áramlási sebesség mellett eltérő hosszúságú utakat járnak be, amely zónadiszperziót okoz. Ezt szokás örvény diffúziónak is nevezni. A második tag (B tag) a hosszirányú diffúzióval kapcsolatos. Minél több időt tölt az anyag a kromatográfiás rendszerben, Fick II. törvényének értelmében annál nagyobb mértékben szélesedik a zóna. A harmadik tag (C tag) az anyagátadási ellenállással kapcsolatos. Ez a mozgófázis lamináris áramlási profiljából adódó folyadékrétegek közti diffúziós ellenállásból (Cm), valamint az állófázis felületén lévő stagnáló folyadékfilmen keresztüli diffúziós ellenállásból (Cs) adódik. A stagnáló filmben lévő és a mozgófázissal áramló molekulák lineáris áramlási sebességkülönbsége adja a zónaszélesedést. Úgy is mondhatjuk, hogy a zónaszélesítő hozzájárulás itt a diffúziós ellenállásból adódik. Amint az alábbi ábrán látszódik, a fent leírt tagok eredőjeként H minimum értéket vesz fel egy adott áramlási sebesség mellett (optimum efficiency az ábrán). Gyakorlatban ettől a tartománytól kicsit jobbra dolgozunk, mert az optimum környékén a lassú áramlás miatt a mérés túl hosszú.
12
9. ábra. A hatékonyság és Van Deemter egyenlet egyes tagjainak kapcsolata Magyarosítani Jegyezzük meg, hogy a gyakorlati tartományban a C és az A tag dominál. Mindkét tag jelentősen csökkenthető a szemcseméret csökkentésével, és a diffúziós állandó növelésével. A szemcseméret csökkentésének határt szab a Darcy-törvény:
∆𝒑 =
𝝓𝜼𝑳𝒖 𝒅𝟐𝒑
ahol Φ a kolonna áramlási ellenállásával kapcsolatos konstans, Δp a nyomásesés a kolonnán, η a mozgófázis viszkozitása, dp a töltet átlagos szemcseátmérője. A törvény szerint a szemcseméret csökkentésével a kolonna nyomásesése négyzetesen nő. Látható, hogy a nyomásesés csökkenthető a viszkozitás csökkentésével. A diffúziós állandó növelhető a viszkozitás csökkentésével. A mozgófázis viszkozitása két fontos ponton gyakorol hatást a rendszerünkre: az áramlási ellenálláson és az anyagátadáson keresztül. Ezért fontos tehát kis viszkozitású mozgófázisokkal dolgozni. A viszkozitás az elválasztási hőmérséklet emelésével tovább csökkenthető.
13
FELADATOK A GYAKORLAT SORÁN A gyakorlat során két csoport fog párhuzamosan dolgozni. Az egyik csoport elválasztási paramétereket fog számolni kapott kromatogramokból, míg a másik csoport különböző italok koffein, teofillin és teobromin tartalmát fogja meghatározni fordított fázisú folyadékkromatográfiával, kalibrációs módszer segítségével. Félidőben a két csoport cserél. A felmerülő kérdések megvitatására a gyakorlat során lesz lehetőség (ajánlott élni vele). Ez a leirat nem tartalmaz minden szükséges információt a laborjegy megszerzéséhez, a gyakorlat során a fontos, jegyzőkönyvben szerepeltetendő információkra a gyakorlatvezető fel fogja hívni a figyelmet. A gyakorlat során minden hallgató kap jegyzőkönyv fedőlapot. Ezen a fedőlapon fel van sorolva, hogy minek kell szerepelnie a jegyzőkönyvben. A gyakorlatvezetővel a részleteket egyeztetve, eszerint kell elkészíteni a jegyzőkönyvet.
14
