Fehérjekromatográfia Bobály Balázs BME‐VBK, Szervetlen és Analitikai Kémia Tanszék, HPLC csoport
2015
Tematika 1. Bevezető 2. Molekulaszerkezetből adódó, eltérő kromatográfiás alapjelenségek 3. Heterogenitás jellemzésére szolgáló kromatográfiás módszerek Sok empirikus adat lesz, csak az alapelveket kell megtanulni!
1. Miért kell a fehérjéket analizálni? - Biológiai rendszerek működésének megértése koncentráció/szerkezet/aktivitás időbeli/térbeli változása - Hatásos fehérjealapú gyógyszerek előállítása szerkezet-funkció-aktivitás kapcsolat megértése, hatóanyag/termék minőségének ismerete: hatásosság/immunogenitás
1. Miért kell a fehérjéket analizálni? 2012-ben a TOP 10 forgalmú gyógyszerből 7 fehérje alapú! Autoimmun betegségek, arthritis, rák, diabetes, stb…
Market 2012 Sales ($ billion)
Active ingredient
Small molecule/ Biologics
Indication(s) Rheumatoid arthritis
01
Humira
9.5
Adalimumab
Monoclonal Antibody
02
Enbrel
8.4
Etanercept
Fusion protein
Autoimmune disease
03
Seretide
8.0
Salméterol
Small molecule
Asthma
04
Remicade
7.7
Infliximab
Monoclonal Antibody
Rheumatoid arthritis
05
Mabthera
6.9
Rituximab
Monoclonal Antibody
Leukemias
06
Crestor
6.7
Rosuvastatine
Small molecule
Hypercholesterolemia
07
Lantus
6.1
Insuline
Protein
Diabetes
08
Herceptin
6.1
Trastuzumab
Monoclonal Antibody
Breast cancer
09
Avastin
6.0
Bevacizumab
Monoclonal Antibody
Various cancers
10
Sortis
5.6
Atorvastatine
Small molecule
Hypercholesterolemia
TOTAL
71.0 (+ 33% vs 2004) 4
1. Miért kell a fehérjéket analizálni? Nehézségek: -A minták általában összetettek: szövetek, testfolyadékok, sejtkultúra szükség van a mátrix egyszerűsítésére -Adott szekvenciával definiált fehérjemolekulák is nagymértékű heterogenitást mutatnak: mutációk (pl. aminosavcsere a láncban) transzlációs módosítások (pl. foszforiláció, glikoziláció) környezeti hatások (pl. oxidáció, aggregáció) - A nagyfokú variabilitás miatt nem érhetőek el homogén analitikai standardek Kismolekula szalicilsav 138 Da
Peptid triptorelin 1311 Da
Fehérje HGH 22125 Da
mAb Cetuximab 150 kDa
ADC Brentuximab‐vedotin 150 kDa
összetettség 5
1. Mit is jelent a variabilitás esetünkben? - Egy aspektus, a glikoziláció
Egy mAb fő glikoformái. PNGase-F: cukrok hasítása a fehérjéről Jelölés 2-aminobenzamiddal HILIC-UV-MS
6
1. Mit is jelent a variabilitás esetünkben? - És a többiek…
Óra anyaga óra
óra megemlítjük
7
1. Miben segítenek az elválasztástechnikai módszerek? -
Mátrix egyszerűsítése: analitikai (pl. MS vizsgálatok)/preparatív céllal (további vizsgálatok) Heterogenitás jellemzése: megfelelő módszer megválasztása Mennyiségi meghatározás: referenciaanyag megválasztása alapvető
Technikák: -
elektroforézis (2D-gél, CGE, cIEF, CEC, CZE)
-
folyadékkromatográfia 1. (SEC, IEC, RP, HIC, HILIC): analitikai módszerek
-
folyadékkromatográfia 2. (HIC, AC, IEC): preparatív módszerek
-
„tömegspektrometria” (ionok elválasztása)
-
GC: NEM!! SFC: NEM!!
2. Fehérjék általános folyadékkromatográfiás tulajdonságai eltérések a kismolekuláktól – méret és diffúzió
kismolekula
közepes méretű molekula (peptid)
makromolekula (fehérje)
MW [Da]
<1000
1000-5000
>5000
Dh (Å)
5-10
10-15
>10-15
Dm [cm2/s] konformáció
10-5 jól definiált
5*10-6 „rugalmas” molekula
5*10-7 statisztikus eloszlású (környezet)
J. Pharm. Biomed. Anal. 54 (2011) 482.
A hidrodinamikai átmérő nő a molekulasúllyal: Meghatározza a töltet pórusméretét
A diffúziós állandó csökken a molekulamérettel: Meghatározza a mérés sebességét az anyagátadási ellenállás növekedése miatt
2. Fehérjék általános folyadékkromatográfiás tulajdonságai eltérések a kismolekuláktól – méret és diffúzió Kismolekula dp (Å) 60-100
C‐tag nagyon megnő (Dm miatt)
közepes méretű molekula (peptid)
makromolekula (fehérje)
100-150
150-500 (ált. 200-300)
Kompromisszum: Rs vs. mérési idő
2. Fehérjék általános folyadékkromatográfiás tulajdonságai eltérések a kismolekuláktól – méret és diffúzió B‐tag kisebb: diffúziós úthossz (kék nyilak) ~5% C‐tag kisebb: diffúziós úthossz (piros vonalak) ~5% A‐tag kisebb: találgatások ~30‐40%
Rszemcse Rmag
C‐tag csökkentése=hatékonyság növelése B‐tag: elhanyagolható
Nemporózus töletetek: ‐Nagy hatékonyság ‐Kis terhelhetőség ‐Kis visszatartás Csak indokolt esetben: ha a felületi kölcsönhatás kinetikája lassú és így kisebb a hatékonyság Kis szemcseméret, héjszerű, nagyobb pórusméretű töltetek, magasabb hőmérséklet
2. Fehérjék általános folyadékkromatográfiás tulajdonságai eltérések a kismolekuláktól – méret és diffúzió
Halo
Kinetex
12
2. Fehérjék általános folyadékkromatográfiás tulajdonságai eltérések a kismolekuláktól – méret és diffúzió
13
2. Fehérjék általános folyadékkromatográfiás tulajdonságai eltérések a kismolekuláktól – méret és diffúzió
Molekulaméret csökkentése: (bővebben fehérje MS) ‐Nagyobb hatékonyság ‐Variabilitás jobban elemezhető‐kis különbsége relatíve nagyobbak lesznek
Peptid térképezés (peptide mapping) ‐Fehérje emésztése (proteolízis) pl. tripszinnel → 0.5‐2kDa peptidek ‐RP, vagy HILIC kromatográfia, UV+MS detektálás ‐Szekvenálás, peptidek azonosítása, fehérje azonosítása, általános minőségi ellenőrzés ‐Hátrány: hosszas minatelőkészítés (automatizálható), összetett kromatogram ‐Előny: kis molekulaméret miatt jobb elválasztás, több információ
15
Limitált proteolízis ‐Fehérje emésztése (proteolízis) pl. papainnal → Fc+Fab fragmensek ‐RP, IEX, HIC, vagy HILIC kromatográfia, UV(FL)+MS detektálás ‐Variánsok azonosítása, általános minőségi ellenőrzés ‐Hátrány: nagyobb molekulaméret, mint triptikus peptidek esetén ‐Előny: gyors mintaelőkészítés, egyszerűbb kromatogram C‐term. lizin variánsok: Fc + nK (n=0‐2)
N‐term. glutamin (Q)‐ piroglutamát (pE) variánsok: Fc + nK (n=0‐2)
16
2. Fehérjék általános folyadékkromatográfiás tulajdonságai eltérések a kismolekuláktól - visszatartás kismolekula: a megoszlás (visszatartás) jól szabályozható a mozgófázis összetétellel: alkalmazható izokratikus elúció (nagyobb szelektivitás hasonló vegyületek esetén). fehérje: sztöchiometrikus kiszorítás - Z számú szolvens molekula szükséges az elúcióhoz: I/O viselkedés
~1% változás φ-ben eldöntheti, hogy k≈0, vagy k≈∞ gradiens elúció szükséges!
2. Fehérjék általános folyadékkromatográfiás tulajdonságai eltérések a kismolekuláktól - adszorpció, csúcsterület, kinetikai hatékonyság, visszatartás Intakt mAb
1200 1000
HC
Intakt mAb
50mM formate pH3 25mM formate pH3 10mM formate pH3 0.1% TFA
LC
EU
800 600 400 200 0 2.5
3.0
3.5
4.0 Time (min)
4.5
5.0
5.5
Nagyon eltérő viselkedés lehet, ami nem jelezhető előre!
T; P együtt, egyes esetekben hektikusan változtatják a krom. viselkedést→konformáció változás 19
2. Fehérjék általános folyadékkromatográfiás tulajdonságai eltérések a kismolekuláktól – adszorpció, M, pI, hidrofóbicitás
Adszorpció mértéke: - Mérési körülmények oldaláról: T, Cadditív, P, kolonna, stb… - Molekula oldaláról: ??? Valószínűleg a kölcsönható felület minősége a döntő: konformációfüggő (mérési körülmények)20
2. UHPLC előnyei továbbra is fennállnak!
RP‐peptidtérképezés
21
3. Fehérjék heterogenitásának vizsgálatára szolgáló folyadékkromatográfiás technikák
22
Óra anyaga óra
óra megemlítjük
23
3. Mit hoznak a konyhára az egyes LC módszerek? - Méretkizárásos kromatográfia (SEC): aggregátumok, fragmensek és kismolekulák elválasztása a natív fehérjétől - Ioncserés kromatográfia (IEC): anion és kation töltésvariánsok elválasztása - Fordított fázisú kromatográfia (RP): oxidált/redukált variánsok, valamint fragmensek elválasztása - Hidrofil kölcsönhatáson alapuló kromatográfia (HILIC): RP-re nagyjából ortogonális, főleg peptidek esetén használható - Hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia (HIC) alternatív RP, ADC-k jellemzése Gyógyszeripari környezetben a megfelelő jellemzéshez különböző módszerek együttes alkalmazása szükséges. A feladat komplexitása miatt nem elvárás az exakt jellemzés, de az elérhető legrészletesebb, koherens információval kell rendelkezni.
RPLC • Minőség ellenőrzés •Oxidált variánsok, aminosav variánsok • Általános jellemzés kromatogram alapján • Denaturáló
SEC
IEX
• Aggregáció
• Töltés heterogenitás
• Fragmensek
• Nem denaturáló
• Nem denaturáló
HILIC
HIC
• Általában peptidek, glikánok jellemzése
• Hidrofóbicitás
• RP‐re ortogonális
• ADC‐k jellemzése
• Denaturáló
• Denaturáló 25
3. LC módszerek – SEC (bioaktív forma izolálása lehetséges) -
Aggregáció/fragmensek: terápiás hatékonyság változása, immunreakció
-
Kiváltó ok: fizikai/kémiai behatások, tárolás
-
Elválasztás hidrodinamikai rádiusz alapján (nem MW!)
-
-
teljes kizárás 2-3 nagyságrend
repulzió adszorpció
teljes áteresztés
Főleg diol fázisok: ne legyen adszorpció! dp: 3-20 µm, dc: 4.6-8 mm, L: 30 cm mérési idő: 20-30 min
Eltérések a kalibrációs görbétől: - adszorpció - elektrosztatikus repulzió - konformációs változások pH≈pI beállítása 50-100mM puffer + 50-100mM só 5-10% MeOH/MeCN
- Ált. nem MS kompatibilis pórusméret (Å) MW (kDa) példa 100-150 10-100 Interferon 200-300 100-500 mAb 500-1000 >500 PEGilált f.
3. LC módszerek – SEC (bioaktív forma izolálása lehetséges)
1: monomer (Interferon, ~19 kDa) 2: dimer (~38 kDa) 3: nagyobb aggregátumok
főcsúcs(mAb, ~150 kDa) 2: dimer (~300 kDa) 1: nagyobb aggregátumok
Aggregátumok jellemzése: ‐moltömeg meghatározása fényszórás detektorral (nehéz, sok a hibalehetőség) ‐moltömeg meghatározása off‐line MS‐sel (egyszerű, lassú) ‐moltömeg meghatározása on‐line SEC‐MS‐sel (egyszerű, gyors, kevés tapasztalat: MS barát körülmények)
3. LC módszerek – IEC (bioaktív forma izolálása lehetséges) - Elsősorban erős kationcserélő töltetek: nemporózus, szilika/polimer, vagy gyanta - 5-10 µm-es szemcsék, kolonnahossz nem kulcskérdés Rs szempontjából - pH
Töltésvariánsok (aminosavcsere/transzlációs módosítás) elválasztása pH vagy só gradiens alkalmazásával Ioncserélő (kation v. anion) tölteten A töltet töltése ellentétes a variánsok töltésével!
3. LC módszerek – IEC (bioaktív forma izolálása lehetséges) Ioncserélő gyanta
Kationcserélő
Erős kationcserlő
Gyenge kationcserélő
SCX
WCX
Acide fort
szulfonát ‐ SO 3 ‐
Acide faible
karboxilát ‐ CO 2‐
Anioncserélő
Base forte
Erős anioncserélő
Gyenge anioncserélő
SAX
WAX
Kvaterner ammónium ‐ NR 4 +
Mozgófázis pH: - töltet töltött állapotban legyen -fehérje ellentétes töltésű legyen -mAb-ok: pI ált. 7-9, enyhén savas pH, kationcsere
Base faible
amin ‐ NHR 2 +
29
3. LC módszerek – IEC (bioaktív forma izolálása lehetséges) Kationcserés kromatográfia
Főcsúcs
Bázikus variánsok
Savas variánsok
pI alacsony (savas)
pI magas (bázikus)
30
3. LC módszerek – IEC (bioaktív forma izolálása lehetséges) Kationcserés kromatográfia
Csúcsfelbontás növelhető az oszlophossz és a gradiensidő növelésével Nem lehet előre megmondani, hogy melyik kolonna lesz a jó. F,G,H,I: négy különböző kolonna; 1,2,3,4: különböző mAb‐ok 31
3. LC módszerek – IEC (bioaktív forma izolálása lehetséges) pH gradiens
J. Pharm. Biomed. Anal. 102 (2015) 282.
-
Szelektivitás egyes esetekben változik Sógradiens mellett ált. nagyobb a hatékonyság Sógradiens mellett ált. mérsékelt adszorpció Sógradiens egyszerűbben megvalósítható
só gradiens
J. Pharm. Biomed. Anal. 102 (2015) 33.
3. LC módszerek – IEC (bioaktív forma izolálása lehetséges) Só és pH gradiens elválasztás is tervezhető! Vizsgáljuk, hogy a kromatográfiás paraméterek változásának hatására hogy „vándorolnak” a csúcsok a kromatogramon (kísérleti terv), majd megkeressük az optimális körülményeket A „kritikus pár” felbontását kell figyelni! Faktorok itt: Gradiens idő pH
33
LC módszerek – RP (bioaktív forma izolálása ált. nem lehetséges) -
Fragmensek, oxidált/redukált variánsok, peptidtérkép: főként minőségellenőrzési vizsgálatokban
-
Elválasztás: főként hidrofób, kisebb mértékben poláris szelektivitás alapján (állófázisfüggő)
-
Kapcsolható MS-sel!
-
Robusztus, nagy felbontó erő jellemzi
-
Alapvető körülmények: - 200-300 Å C4-C18, bifenil, stb… - héjszerű (hatékonyág) - T: 50-90°C - MeCN gradiens (0,1% trifluorecetsav) - 200-400 µl/min (2.1 mm i.d.)
Problémák: - ált. denaturáló körülmények: aktív formában nem frakcionálható a fehérje (SEC, IEX OK.) - magas hőmérséklet: hődegradáció veszélye -
konformáció nagyon függ a mérési körüményektől (additívek, P, T): adszorpció, retenció változhat
A nagy hatékonyság érzékeny az anyagátadási ellenállásra: nagy MW→kis Dm Limitált proteolízissel jelentősen javítható (az adszorpciós hajlam is)
LC módszerek – RP (bioaktív forma izolálása ált. nem lehetséges) Filgrastim (18,8 kDa) variánsok, BEH300 1.7 µm, 50*2,1 mm LC-GC Eur. 25 (2012) 540.
red
ox nat
Papain emésztmény Fc+Fab variánsok
ox
DTT redukció LC+HC variánsok
J. Pharm. Biomed. Anal. 70 (2012) 158.
LC módszerek – RP (bioaktív forma izolálása ált. nem lehetséges)
A fehérjék érzékeny molekulák! A magas hőmérséklet, a savas mozgófázis és a hosszú mérési idő együtt degradálhatják a mérés közben! „szellemcsúcsok”, helytelen mérési eredmények!
36
3. LC módszerek – HIC (bioaktív forma izolálása lehetséges) -
Hidrofób az állófázis felületete
-
Kezdeti magas sókoncentrációval „kisózzuk” a fehérjéket az állófázis felületére
-
A sókoncentráció csökkentésével megtörténik a deszorpció/elúció
-
Főként preparatív elválasztásokban használják: bioaktív RP
-
Nagyon érzékeny a fehérje felületi hidrofóbicitásának változásaira
Analitikai elválasztásban: pH≈pI, 50mM puffer + 1-2 Mm sógradies nemporózus töltet (polimer/módosított szilikagél), kis szemcseméret, kis kolonnatérfogat
3. LC módszerek – HIC: ADC-k jellemzése (bioaktív forma izolálása lehetséges) -
Ha a kapcsolás (linker) és a konjugált drog neutrális, egyébként IEC
-
Igéretes módszer antitest-drog konjugátumok jellemzésére: érzékeny a felületi hidrofóbicitás változására (Drug-Antibody Ratio: DAR – nagymértékben befolyásolja a szer hatékonyságát)
-
Eddig kevés a tapasztalat…
3. LC módszerek – HIC: ADC-k jellemzése (bioaktív forma izolálása lehetséges) A kismolekula konjugációja extra variabilitást visz a már amúgy is komplex analátba
39
3. LC módszerek – AC
-
Rendkívül sokféle állófázis, igényre szabható ($)
-
Főbb típusok: - immunaffinitás (antigén megkötése immobilizált antitesttel, vagy fordítva) - immobilizált fémion affinitás (IMAC): Co/Cu/Ni: hisztidintartalmú fehérjék Fe/Zn/Ga: foszfopreoteinek - lektin: glikoproteinek - stb…
-
Adott fehérje kinyerése további vizsgálatra, vagy mátrix tisztítása zavaró fehérjéktől.
-
Kolonnában, SPE, vagy spin-cartridge-ként is elérhető
3. LC módszerek – frakcionálás fehérje és peptid szinten Humán plazma fehérjék (Alb, IG depletálva)
Transzferrin triptikus emésztmény HILIC: glikopeptid dúsítás
RP: nincs glikoform elválasztás
Helyspecifikus glikoziláció minor glikoformokra is - Megfelelő szelektivitás kiválasztása - Frakciószedés, mintaelőkészítés, analízis - Minor komponensek szelektív dúsítása, „tetszőleges” mértékben.
Összefoglalás‐ Fehérjekromatográfia: Komplex, érzékeny minták Összetett elemzés Sok empirikus paraméter a módszer fejlesztésben Sok kihívás, izgalmas Nagy piac Munkalehetőség 42
