MINTAJEGYZŐKÖNYV A VÉRALVADÁS VIZSGÁLATA BIOKÉMIA GYAKORLATHOZ

Biokémia gyakorlat DE, ÁOK, Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet Készítette: Dr. Mótyán János András, 2015

MINTAJEGYZŐKÖNYV A VÉRALVADÁS VIZSGÁLATA BIOKÉMIA GYAKORLATHOZ Feladatok 1. 1.1 1.2

Teljes vér megalvasztása rekalcifikálással Gyakorlat kivitelezése Minta jegyzőkönyv

2. 2.1 2.2

Referenciasor készítése fehérjeméréshez Gyakorlat kivitelezése Minta jegyzőkönyv

3. 3.1 3.2

Fibrinogén jelenlétének tesztelése Gyakorlat kivitelezése Minta jegyzőkönyv

4. 4.1 4.2

Trombin-idő meghatározása és a XIII-as faktor hatásának tanulmányozása Gyakorlat kivitelezése Minta jegyzőkönyv


1. Teljes vér megalvasztása rekalcifikálással 1.1 Gyakorlat kivitelezése Eszközök - 37 °C inkubátor (blokktermosztát vagy vízfürdő), kémcsőállvány, kémcsövek, automata pipetták Anyagok - marhavér (1 térfogat 3,8 %-os trinátrium-citráthoz 9 térfogat vénás vér) - fiziológiás-sóoldat - 1 %-os CaCl2-oldat Gyakorlat kivitelezése: Az alábbi elegyet állítsa össze kémcsőben! A műanyag centrifugacsőben kiadott vérmintát a bemérés előtt óvatosan keverje meg műanyag pipettaheggyel!

1. Vér (ml)

0,400

Fiz. NaCl-oldat (ml)

1,400

CaCl2-oldat (ml)

0,200

A mintát inkubálja 37 C-on 15 percig! Percenként vegye ki a mintát a termosztátból és figyelje meg a változásokat!


1.2 Minta jegyzőkönyv Írja le a kísérlet célját: ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... Írja le a röviden a kísérlet kivitelezésének lépéseit! 1. ................................................................................................................................................... 2. ................................................................................................................................................... 3. ................................................................................................................................................... Írja le mi a szerepe a mintához adott CaCl2-nak! ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... Írja le miért üvegcsőben kell elvégezni ezt a kísérletet? ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... Eredmények és értékelés: 1. Írja le megfigyeléseit! Milyen változásokat figyelt meg az idő előrehaladtálval? ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... .......................................................................................................................................................


2. Referenciasor készítése fehérjeméréshez 2.1 Gyakorlat kivitelezése Eszközök - Eppendorf csövek, Eppendorf tartó állvány, fotométer, automata pipetták Anyagok - fiziológiás-sóoldat - fehérje standard-oldat (10 mg marha szérum albumin / ml) - Biuret-reagens (6 g K-Na-tartarát, 1,5 g CuSO4.5H2O, 30 g NaOH, 1 g KI 1000 ml desztillált vízben oldva) Gyakorlat kivitelezése: Állítsa össze Eppendorf csövekben az alábbi elegyeket! 1. Vak

2.

3.

4.

5.

-

25

50

100

150

Fiziológiás NaCl-oldat (μl)

200

175

150

100

50

Biuret-reagens (μl)

800

800

800

800

800

Fehérje standard (μl)

A Biuret-reagens bemérése után az Eppendorf csövek tartalmát rázza össze (többször fordítsa fel a csöveket)! Inkubálja a mintákat 30 percig szobahőmérsékleten! A fotométert nullázza desztillált vízre. Fotométerrel olvassa le az oldatok abszorpcióját 540 nm-en!


2.2 Minta jegyzőkönyv Írja le a kísérlet célját: ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... Írja le a röviden a kísérlet kivitelezésének lépéseit! 1. ................................................................................................................................................... 2. ................................................................................................................................................... 3. ................................................................................................................................................... Eredmények: 1. Töltse ki az alábbi táblázatot! Ábrázolja az adatokat (az x tengelyen a fehérje tartalmat, az y tengelyen az Abs540-Absvak értékeket)! 2. Határozza meg a kalibrációs egyenes meredekségét! tgα = ................................ 1. Vak Fehérje standard (ml) Fehérjetartalom (mg/cső) Abs540 Abs540-Absvak

2.

3.

4.

5.


3. Fibrinogén jelenlétének tesztelése 3.1 Gyakorlat kivitelezése Eszközök - 37 °C inkubátor (blokktermosztát), centrifuga, fotométer, Eppendorf csövek, Eppendorf tartó állvány, automata pipetták Anyagok - plazma oldat - 14 %-os Na2SO4-oldat - desztillált víz - fiziológiás-sóoldat - Biuret-reagens (6 g K-Na-tartarát, 1,5 g CuSO4.5H2O, 30 g NaOH, 1 g KI 1000 ml desztillált vízben oldva) - 1 %-os CaCl2-oldat Gyakorlat kivitelezése: a) Fibrinogén kinyerése kisózással Eppendorf csövekben állítsa össze az alábbi elegyeket! 1.

2.

3.

Plazma (ml)

0,400

0,400

—

Na2SO4 -oldat (ml)

1,000

—

—

Desztillált víz (ml)

—

1,000

—

Inkubálja a mintákat 30 percig szobahőmérsékleten! Az 1-es csőben csapadéknak kell keletkeznie. Az 1. mintát az állás után centrifugálja le (3000 rpm, 5 perc), majd a felülúszót (~1,4 ml) pipettázza át a 3. csőbe! Óvatosan mozgassa a csövet, nehogy felkeveredjen a csapadék! Az 1-es csőben maradó csapadékot ezután oldja vissza 1.4 ml desztillált vízzel!


b) A minták fehérjetartalmának meghatározása Vegyen ki kémcsövekbe az 1., 2. és 3. Eppendorf csövekben lévő mintákból az alábbi táblázat szerint! Az Eppendorf csövekben maradó elegyeket fogja felhasználni a következő (3.c fibrinogén-teszt rekalcifikálással) kísérletben.

1.

2.

3.

0,200

0,040

0,040

Fiz. NaCl-oldat (ml)

—

0,160

0,160

Biuret-reagens (ml)

0,800

0,800

0,800

Minta a 3.a) kísérletből (ml)

Inkubálás 30 percig szobahőmérsékleten, ezután fotometrálás 540 nm-en!

c) Fibrinogén-teszt rekalcifikálással Az 1., 2., 3. Eppendorf csövekben megmaradt minták mindegyikéhez adjon 0,200-0,200 ml CaCl2-oldatot, majd inkubálja 37 C-on 10 percen át! Figyelje meg a mintákat percenként és jegyezze le, hogy melyik mintában megy végbe alvadás, és mennyi időre van szükség az alvadék képződéséhez!


3.2 Minta jegyzőkönyv Definiálja a következő fogalmakat! szérum ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... plazma ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... fibrinogén ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... kisózás ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... Írja le a röviden a Fibrinogén kinyerése kisózással kísérlet lépéseit! 1. ................................................................................................................................................... 2. ................................................................................................................................................... 3. ................................................................................................................................................... 4. ................................................................................................................................................... Írja le a röviden A minták fehérjetartalmának meghatározása kísérlet kivitelezésének lépéseit! 1. ................................................................................................................................................... 2. ................................................................................................................................................... 3. ................................................................................................................................................... 4. ................................................................................................................................................... Írja le a röviden a Fibrinogén-teszt rekalcifikálással kísérlet kivitelezésének lépéseit! 1. ................................................................................................................................................... 2. ................................................................................................................................................... 3. ................................................................................................................................................... 4. ...................................................................................................................................................


Eredmények és értékelés: a) Fibrinogén kinyerése kisózással Írja le mit tartalmaznak az egyes minták (szérum, fibrinogén vagy plazma): 1.

2.

3.

b) A minták fehérjetartalmának meghatározása Töltse ki az alábbi táblázatot! A referenciaegyenes felhasználásával adja meg az 1., 2. és 3. minták fehérjetartalmát! 1.

2.

3.

Frakció Abs540 a

Abs540-Absvak

b

fehérje mennyiség/cső (mg)

c

fehérje koncentráció/cső (mg/ml)

a

az Absvak érték a 2. feladatból

b

az 1. csőben lévő fehérjetartalom (mg) = [(Abs540-Absvak)/tgα]x7 - a tgα értéke a kalibrációs egyenes alapján (meredekség) - a [(Abs540-Absvak)/tgα] megadja a csőben lévő fehérje mennyiségét (0,2 ml-re vonatkoztatva) - az 1. minta végtérfogata 1,4 ml volt, így összesen 7-szer több (1,4 ml/0,2 ml) fehérje van 1,4 ml térfogatú mintában - a 2. és 3. csőben lévő fehérjetartalom (mg) = [(Abs540-Absvak)/tgα]x35

c

fehérjekoncentráció az 1. csőben (mg/ml) = [(Abs540-Absvak)/tgα]x7x2.5 - az 1,4 ml térfogatú mintában mért fehérjemennyiség 0,4 ml plazmából származik (a 0,4 ml plazmából kisózott fibrinogént 1,4 ml vízben oldottuk fel), így 1ml plazma fehérjetartalma 2,5-szer nagyobb, mint 0,4 ml plazma fehérjetartalma - fehérjekoncentráció az 2. és 3. csövekben (mg/ml) = [(Abs540-Absblank)/tgα]x35x 2.5


1. Hasonlítsa össze az egyes minták fehérjetartalmát! 2. El tudunk-e számolni a fehérjemennyiségekkel? Igaz-e hogy 1+3=2? Miért? ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... .......................................................................................................................................................

c) Fibrinogén-teszt rekalcifikálással Töltse ki az alábbi táblázatot! 1.

2.

3.

Frakció Alvadékképződés megfigyelhető (igen/nem) Alvadékképződéshez szükséges idő (perc) 1. Hogyan magyarázza megfigyeléseit? 2. Hol ment végbe a véralvadás és mennyi időre volt szükség az alvadék képződéséhez? 3. Végbemehet-e véralvadás fibrinogén nélkül? A fibrinogén magában aktiválódhat-e? ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... .......................................................................................................................................................


4. Trombin-idő (TI) meghatározása és a XIII-as faktor hatásának tanulmányozása 4.1 Gyakorlat kivitelezése Eszközök - 37 °C-os blokktermosztát, Eppendorf csövek, Eppendorf tartó állvány, automata pipetták Anyagok - plazma oldat - desztillált víz - trombin (diagnosztikai reagens-készlet, REANAL) - 1 %-os CaCl2-oldat - urea-oldat (6 M) - 20 mM-os jódacetamid-oldat (óvatosan kezelendő!) (előkészítőtől kapják) Gyakorlat kivitelezése: a) Trombin-idő (TI) meghatározása Eppendorf csövekben állítsa össze az alábbi elegyeket! Ügyeljen arra, hogy a plazma bemérését hagyja legutoljára, így azzal indítja el a reakciót, illetve az időmérést! Egymás után egyenként indítsa a reakciókat, mert gyors!

1.

2.

3.

4.

Jódacetamid oldat (ml)

0,100

-

-

-

Desztillált víz (ml)

0,300

0,400

0,450

0,450

Trombin oldat (ml)

0,050

0,050

0,050

-

CaCl2-oldat (ml)

0,050

0,050

-

0,050

Plazma (ml)

0,500

0,500

0,500

0,500

Inkubálja a csöveket 37 C-on! Folyamatos ellenőrzéssel mérje meg mind a négy minta TI értékét! A TI meghatározása után inkubálja még az Eppendorf csöveket 10 percig! Vizsgálja meg az alvadék minőségét! b) Urea-oldhatósági teszt (XIII-as Faktor hatásának tanulmányozása) Az 1., 2., 3. és 4. Eppendorf csövekben maradt felülúszót óvatosan távolítsa el pipettával! Próbálja meg visszaoldani 1 ml 6 M-os urea-oldat hozzáadásával a keletkezett csapadékokat! Írja le megfigyeléseit!


4.2 Minta jegyzőkönyv Írja le a kísérlet célját: ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... Mi a klinikai jelentősége a trombin idő meghatározásának? ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... Mi a jódacetamid hatása? ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... Mi a XIII. faktor szerepe a véralvadásban? ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... Miért oldja az urea a „lágy” alvadékot és miért nem a térhálósított végterméket? ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... .......................................................................................................................................................


Eredmények (4A és 4B): 1.Töltse ki az alábbi táblázatot! Hasonlítsa össze az alvadékok urea-oldhatóságát a négy csőben! Eredményeit értékelve jellemezze mintáiban az alvadékképződés sebességét, az alvadék minőségét és magyarázza meg tapasztalatait! 1.

2.

3.

4.

Trombin idő (másodperc)

Alvadék minősége Alvadék beoldható-e ureával? (lágy vagy kemény alvadék)

Értékelés (4A és 4B): 1. Hol miért alakult ki lágy vagy kemény alvadék? 2. Miért különböző a trombin idő az egyes csövekben? ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... .......................................................................................................................................................

MINTAJEGYZŐKÖNYV A VÉRALVADÁS VIZSGÁLATA BIOKÉMIA GYAKORLATHOZ

Recommend Documents