Labinfo HALFJAARLIJKS INFOBLAD - NR. 6 MEI Informatieblad voor de erkende laboratoria voedselveiligheid

HALFJAARLIJKS INFOBLAD - NR. 6

MEI 2011

Labinfo Verantwoordelijke uitgever : Gil Houins

Informatieblad voor de erkende laboratoria voedselveiligheid

p. 4

Milieumanagementsysteem binnen DG Laboratoria

p. 7

Praktische invoering van PCR voor microbiologische bepalingen in het Federaal Laboratorium voor de Veiligheid van de Voedselketen in Melle (FLVVM)

p. 11

Komt atypische boviene spongiforme encefalopathie (BSE) voor in België ?

p. 17

De risicobeoordeling van GGO’s en pathogenen in België

p. 19

Speciatie van arseen in vis en andere voedingswaren

p. 23

Melk en Melkproducten

p. 28

Workshops & Symposia

FAVV AC-Kruidtuin - Food Safety Center Kruidtuinlaan 55, 1000 Brussel

NRL

N AT I O N A L REFERENCE LABORATORIES

NRL

N AT I O N A L E REFERENTIE LABORATORIA

L

RL

N AT I O N A L REFERENCE LABORATORIES

NRL

N AT I O N A L E REFERENTIE LABORATORIA

LNR

L A B O R ATO I R E S N AT I O N A U X DE REFERENCE

Labinfo Informatieblad voor de erkende laboratoria voedselveiligheid verschijnt tweemaal per jaar Redactiegroep Dirk Courtheyn, Mieke De Mits, Conny De Schepper, Alain Dubois, Marc Evrard, Alain Laure, Bert Vandenborre, Mieke Van de Wiele, Eva Wevers en Marie-Christine Wilem. Auteurs van dit nummer Geert De Poorter, Tony Vanhove, Elly Harnie, Alexandre Dobly, Jan Langeveld, Stefan Roels, D. Breyer, B. Brosius, A. De Schrijver, C.D. Do Thi, M. Goossens, A. Leunda, K. Pauwels, C. Van Droogenbroeck, B. Van Vaerenbergh, C. Verheust, M. Sneyers, P. Herman, Ludwig De Temmerman, Ann Ruttens, Nadia Waegeneers, Karen Verstraete, Koen Dereu en Jessy Claeys. Vertaling Eigen vertaling door de NRL Vertaaldienst van het Agentschap Foto’s en illustraties Aangebracht door de laboratoria Vormgeving Gert Van Kerckhove Redactieadres LabInfo p.a. D. Courtheyn FAVV AC-Kruidtuin - Food Safety Center 4de verdieping, bureel 409 Kruidtuinlaan 55, 1000 Brussel Tel.: 02.211.87.33 [email protected]

2

Editoriaal Beste lezer, We gaan de zomer tegemoet met goede vooruitzichten: de economie is volop aan het herleven en dat uit zich ook in de laboratoriumwereld: de Belgische laboratoriumwereld is aan het consolideren en het aantal analyses in de voedingssector stijgt (zowel in de autocontrole als in het controledomein). Maar we mogen niet op onze lauweren blijven rusten. We moeten met zijn allen waakzaam blijven en voortdurend investeren in nieuwe technologieën en methodieken. Laborama heeft daartoe in het begin van het jaar een goede aanzet gegeven en allerlei seminaries -al dan niet georganiseerd door de Nationale Referentie Laboratoria- laten toe aan de gemotiveerde labmedewerker om de kennis/kunde bij te schaven. Inderdaad het proces van het continu verder leren is ook binnen de laboratoriumwereld van toepassing. Naar de toekomst toe zal dit een sleutelelement worden om competente medewerkers aan te trekken en te behouden: continue vorming gekoppeld aan een goede werk/privé balans zullen voor een labo beslissend zijn om de “war for talent” te winnen. De zoektocht naar gemotiveerde medewerkers (laboranten-bachelors, masters, …) wordt moeilijker en moeilijker. Laborant kan meer en meer als een echt knelpuntberoep omschreven worden. Daarom is samenwerken binnen een goed gestructureerd laboratoriumnetwerk meer dan nodig om zoveel mogelijk informatie uit te wisselen. Na de zomer grijpt het 31ste internationale dioxinecongres plaats in Brussel. Dit gereputeerde internationale congres met honderden deelnemers biedt het alfa en omega aan in het gebied van POPs. Mis dit event niet. Ik wens u veel leesplezier met de artikels in deze zesde editie van Labinfo van het FAVV.

Geert De Poorter Directeur-generaal Laboratoria

3

Milieumanagementsysteem binnen DG Laboratoria Een van de doelstellingen van DG laboratoria in 2010 was het behalen van de EMAS-certificatie voor het FLVVM (Federaal Laboratorium voor de Voedselveiligheid Melle), het FLVVG (Federaal Laboratorium voor de Voedselveiligheid Gentbrugge) en het LFSAGx (Federaal Laboratorium voor de Voedselveiligheid Gembloux). Hiervoor werd het milieumanagementsysteem volledig geïntegreerd in het Kwaliteit-Veiligheid-Milieumanagementsysteem. Dit was noodzakelijk om te voldoen aan de EMAS-verordening 1 en aan ISO-14001 2 . De verschillende stappen die uitgevoerd zijn om te voldoen aan de EMAS-verordening en de ISO-14001 norm zijn: • Opstellen van een milieubeleid: • het milieubeleid is geïntegreerd in het beleid van DG laboratoria. • Opstellen van een milieumanagementsysteem, met o.a.: • het bepalen van de milieu-aspecten; • het bepalen van de doelstellingen aan de hand van de belangrijkste milieu-aspecten; • het nagaan of de laboratoria voldoen aan de wettelijke bepalingen en indien niet, de nodige maatregelen nemen zodat de laboratoria voldoen aan deze bepalingen; • het opstellen van een beheersysteem voor het voorkomen van een noodsituatie en om correct te handelen in geval van een noodsituatie; • het voorzien van opleidingen; • het bepalen van de verantwoordelijkheden, bevoegdheden en de bijhorende taken; • communicatie: alle personeelsleden moeten betrokken worden in het milieumanagementsysteem. Er moet ook gecommuniceerd worden met externe belanghebbenden en hiervoor is het noodzakelijk dat er jaarlijks een milieuverklaring wordt opgesteld en dat die beschikbaar is; • alle documenten gerelateerd met het Milieumanagementsysteem worden geïntegreerd in het Kwaliteit Veiligheid-Milieumanagementsysteem. Vbn. instructies, procedures, non-conformiteitenbehandeling, klachtenbehandeling, directiebeoordeling, …; • uitvoeren van interne audits. Om het milieumanagementsysteem continu te verbeteren wordt er gebruikt gemaakt van de PDCA-cyclus (Plan-Do-Check-Act cyclus).

EMAS : Eco-Management and Audit Scheme, dit is een milieubeheer- en auditsysteem van de EU voor bedrijven

1



en andere organisaties. Met EMAS kunt u het milieubeleid van uw organisatie evalueren, rapporteren en verbeteren.

ISO-14001 is een norm gelijkaardig aan de EMAS-verordening en internationaal erkend.

2

4

De milieubeheersystemen zijn in april/mei 2010 geverifieerd door een extern verificatiebureau waarbij werd besloten dat 3 laboratoria voldeden aan de norm ISO-14001. Het laboratorium FLVVM voldeed ook aan de eisen van de EMAS-verordening. Het FLVVG en het LFSAGx hadden enkele tekortkomingen met betrekking tot de wettelijke bepalingen, deze tekortkomingen werden weggewerkt en bij een nieuwe externe audit in oktober 2010 is bevestigd dat de tekortkomingen konden worden opgeheven. Het FLVVG en het LFSAGx zullen binnenkort dus eveneens kunnen pronken met het EMAS-Logo. Het FLVVT (Federaal Laboratorium voor de Voedselveiligheid Tervuren) en het LFSAL (Federaal Laboratorium voor de Voedselveiligheid Luik) passen het milieubeheersysteem reeds toe maar komen nog niet in aanmerking voor de EMAS-verificatie. Het is vanzelfsprekend dat er geopteerd wordt het certificaat ook zo vlug mogelijk te bekomen voor de twee resterende FAVV-laboratoria. Dankzij het bepalen van de milieu-aspecten zijn er reeds belangrijke doelstellingen behaald in 2010, voorbeelden zijn: • daling van het papierverbruik met 23% of 98.000 vellen papier; • daling van het waterverbruik met 8% = 207 m³, o.a. dankzij het installeren van spaarknoppen op de toiletten en sensibilisering; • aantal printers verminderen met minimum 25% per laboratorium; • aankoop en gebruik van fietsen; • verminderen van het gebruik van chemische producten; • verminderen van biologisch afval; • het gebruik van milieuvriendelijke onderhoudsproducten. De belangrijkste doelstelling voor 2011-2012 is de installatie van foto-voltaïsche panelen op de daken van de laboratoria van Melle en Gembloux. Er wordt gestreefd naar eind 2011, maar de installatie van de foto-voltaïsche panelen is afhankelijk van de vernieuwing van de daken. Op figuur 1 en 2 zijn deze plannen voor het FLVVM en het LFSAGx voorgesteld.

Figuur 1: Schets FLVVM

5

Figuur 2: Schets LFSAGx Tony Vanhove, Verantwoordelijke Milieu en Veiligheid DG Laboratoria [email protected]

6

Praktische invoering van PCR voor microbiologische bepalingen in het Federaal Laboratorium voor de Veiligheid van de Voedselketen in Melle (FLVVM) Inleiding In dit artikel wordt de invoering van real-time PCR (Polymerase Chain Reaction) voor de detectie van Salmonella spp. in het Federaal Voedingslaboratorium Melle (FLVVM) beschreven. De detectie van Salmonella spp. in voedingsmiddelen en dierenvoeders werd voorheen uitgevoerd met de ISO methode 6579:2002 “Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection of Salmonella spp.” Deze methode is arbeidsintensief en vergt meer tijd. Met de invoering van PCR werd opnieuw een stap gezet in de richting van automatisering in het FLVVM. Er werd gekozen voor het implementeren van de iQ-CheckTM Salmonella II kit van Biorad. Deze kit is AFNOR gevalideerd volgens ISO 16140: 2003 (BRD 07/06-07/04; 01/07/2004 – 01/07/2012). Op deze manier was enkel een verificatie nodig in het laboratorium. In de loop van 2008 werd de PCR methode gevalideerd in het FLVVM. Vanaf 1 januari 2009 werden bijna alle monsters door DG Controle genomen voor de detectie van Salmonella spp. geanalyseerd volgens de ingevoerde PCR methode.

PCR techniek PCR staat voor Polymerase Ketting Reactie (Polymerase Chain Reaction). Deze techniek wordt onder andere gebruikt om micro-organismen te detecteren. De eerste stap in de detectie is het laten vermenigvuldigen van het micro-organisme in een aanrijkingsmedium. Vervolgens wordt met een lyse-reagens het DNA (= deoxyribonucleïnezuur) uit de cellen geëxtraheerd. Aan het geëxtraheerde DNA wordt een PCR-mix toegevoegd. Deze mix bevat alle nodige bestanddelen voor DNA vermenigvuldiging: dNTP’s (= nucleotiden of bouwstenen van het DNA), primers (= kleine stukjes chemisch gesynthetiseerd enkelstrengig (es) DNA, complementair aan het bacterie DNA; ze vormen de startplaats van de vermenigvuldigingsreactie), DNA polymerase (= enzym), fluorescente probes, reagentia en buffers. Met behulp van het polymerase wordt via een kettingreactie een specifiek gedeelte van het micro-organisme DNA vermenigvuldigd (= doelwit-DNA). Deze reactie vindt plaats in een microtiterplaat (96-well plaat) (figuur 1) in een thermocycler (figuur 2).

7

Figuur 1 : Vullen van een microtiterplaat

Figuur 2 : Thermocycler: Chromo4TM real-time thermocycler

8

De nieuw gevormde stukjes DNA worden amplicons of amplificatieproducten genoemd. Deze worden aan de hand van een fluorescentiesignaal zichtbaar gemaakt zodat de resultaten continu en snel (in ‘real-time’) kunnen worden afgelezen. Positieve resultaten volgens PCR worden steeds bevestigd met de traditionele (ISO) methode. Om contaminatie te vermijden worden de verschillende stappen van de methode in verschillende zones uitgevoerd. Ook worden bij elke reeks negatieve en positieve controles geanalyseerd.

Validatietesten Om de PCR methode te valideren in het labo werden: • proefmonsters parallel geanalyseerd met PCR en volgens ISO 6579 (tabel 1); • aangekochte producten (verschillende matrices) besmet op het niveau van de detectielimiet en geanalyseerd met PCR. De vooropgestelde detectielimiet van de fabrikant werd behaald, namelijk < 10 cfu; • verschillende ringanalyses werden correct uitgevoerd; • verschillende stammen van Salmonella getest.

Tabel 1 : Overzicht validatieparameters proefmonsters Parameter

Omschrijving

Formule

Resultaat a+d a+b+c+d

98%

Effectiviteit

fractie juist bevonden resultaten

Gevoeligheid

fractie bevestigde positief bevonden resultaten

a a+b

94%

Specificiteit

fractie bevestigde negatief bevonden resultaten

d c+d

98%

% vals positieve

fractie onjuist positief bevonden resultaten

c a+c

11%

% vals negatieve

fractie onjuist negatief bevonden resultaten

b b+d

1%

Met: a = aantal resultaten die in het laboratorium positief zijn bevonden en ook werkelijk positief zijn (= vergelijking met de referentiemethode, ISO 6579); b = aantal resultaten die in het laboratorium negatief zijn bevonden, maar in werkelijkheid positief zijn (vals negatieve); c = aantal resultaten die in het laboratorium positief zijn bevonden, maar in werkelijkheid negatief zijn (vals positieve); d = aantal resultaten die in het laboratorium negatief zijn bevonden en ook werkelijk negatief zijn.

9

Bevindingen tijdens de validatietesten Een microtiterplaat kan afgesloten worden met caps, maar ook met klevende doorzichtige folie. Folie is goedkoper en gemakkelijker in gebruik zodat dit in de eerste testen werd gebruikt. De testen wezen echter uit dat de folie de plaat niet voldoende afsloot. Met een PCR techniek worden ook dode Salmonella spp. teruggevonden. Bij de analyse van ‘eierproducten NHC (not for human consumption)’ werden positieve resultaten teruggevonden met PCR terwijl deze niet bevestigd werden met de ISO methode. Waarschijnlijk zijn deze producten hoog besmet met dode Salmonella. Er werd besloten om dit type product in het vervolg altijd te analyseren met de ISO methode die gesteund is op het detecteren van enkel levende microorganismen. Voor de bemonstering van karkassen van varkens en runderen worden steriele bevochtigde schuursponsjes gebruikt. Na onderzoek bleek dat de buffer waarin de schuursponsjes zich bevonden zorgde voor inhibitie bij het uitvoeren van PCR (= geen vermenigvuldiging van DNA). Na deze bevindingen werd overgeschakeld op een ander type schuursponsjes.

Conclusie Algemeen kan gesteld worden dat de iQ-CheckTM Salmonella II kit van Biorad voor de detectie van Salmonella spp. met PCR voor het merendeel van de te analyseren matrices in het FLVVM een goed bevonden techniek is. Er is een tijdswinst van 2 dagen voor negatieve proefmonsters en er kunnen grotere reeksen tegelijkertijd worden ingezet door eenzelfde analist. Op 8 mei 2009 werd de accreditatie van de PCR methode behaald tijdens de BELAC audit. Elly Harnie, FLVVM [email protected]

10

Komt atypische boviene spongiforme encefalopathie (BSE) voor in België ? Retrospectieve screening van BSE-positieve runderen (1999-2010) van zeven jaar en ouder Alexandre Dobly 1, Jan Langeveld 2 en Stefan Roels 1 1 2

Nationaal referentielaboratorium voor prionziekten, CODA/CERVA Centraal Veterinair Instituut, Nederland

Prionziekten Prionziekten zijn infectieuze neurodegeneratieve ziekten die zich langzaam ontwikkelen en een dodelijke afloop kennen. De actieve agentia van deze groep van ziekten noemt men prionen. Prionziekten zijn uniek omdat een normaal cellulair gastheereiwit, prioneiwit (PrPc), doorgaans een verandering in conformatie en aggregatie gaat vertonen wat leidt tot een accumulatie van PrPd (samenhangend met de ziekte), en dit voornamelijk ter hoogte van het zenuwstelsel. Er is hierbij immers geen specifiek DNA of RNA betrokken. PrPd is gedeeltelijk resistent tegen afbraak door proteasen en het restproduct van die afbraak (PrPres) wordt in diagnosetoepassingen gebruikt als een zeer betrouwbare ziektemarker. Dat PrPres komt voor in drie (glycol)vormen : niet geglycosyleerd, gemonoglycosyleerd en gediglycosyleerd. Bij klinische gevallen, vertonen de hersenen gewoonlijk microscopische, symmetrische spongiose. Prionziekten worden daarom overdraagbare spongiforme encefalopathieën (TSE) genoemd. Deze ziekten worden bij dieren hoofdzakelijk overgedragen via de voeding en worden sinds eeuwen in schapen beschreven als scrapie. Andere voorbeelden van TSE zijn chronic wasting disease (CWD) bij herten en elanden, Creutzfeldt-Jakobziekten bij mensen (CJD), overdraagbare encefalopathie van de nerts (TME) en boviene spongiforme encefalopathie (BSE) ook bekend als gekkekoeienziekte. Bewijs voor de overdracht van BSE werd aangetroffen in diverse andere zoogdieren, o.m. in mensen, waar een variant van CJD (vCJD) wordt veroorzaakt die vooral jonge mensen treft. Terwijl bij scrapie en andere TSE’s stamvariaties werden gevonden, vertoonde BSE aanvankelijke stamhomogeniteit. De incubatietijd, het vacuolair letselprofiel en de biochemische signatuur van PrPd waren immers gelijk voor alle onderzochte gevallen. Die eenvormigheid van BSE-prionen tijdens de epidemie was wellicht te wijten aan de verontreiniging van de voedselketen met één enkele stam in het Verenigd Koninkrijk.

11

Atypische vormen van BSE Als gevolg van de uitgebreide actieve bewaking en van nieuwe onderzoekstechnieken worden sinds 2003 echter ook zeldzame varianten van BSE gemeld waarvan de meeste konden worden ondergebracht in twee nieuwe BSEtypes: H-type en L-type. Die types werden zo genoemd omdat bij Western blot studies was gebleken dat die twee atypische vormen, in vergelijking met klassieke BSE (C-type) worden gekenmerkt door een hoger of lager molecuulgewicht van de niet-geglycoliseerde PrPres (zij werden daarom H- en L-type genoemd, Fig. 1). Het L-type wordt ook boviene amyloïde spongiforme encefalopathie of BASE genoemd. Het PrPres glycoprofiel is een zeer praktische marker voor het L-type dat een veel kleiner aandeel gediglycoliseerd PrPres (<50% van alle PrPres) vertoont dan het C-type (>55% van alle PrPres, Fig. 2). Voor het H-type is een relatief hoge reactiviteit met een welbepaalde antistof (12B2) archetypisch. Een tweede kenmerk van het H-type heeft te maken met een dualistisch glycoprofiel al naargelang van de gebruikte antistof (Fig. 2). Omdat het hersengebied waar PrPres wordt afgezet drastisch kan verschillen tussen het L- en het C-type en mogelijkerwijs ook tussen het H- en het C-type ware het beter als de voortaan gebruikte bemonsteringstechnieken aan die atypische types zouden worden aangepast. Dergelijke types zijn zeer zeldzaam; wereldwijd zijn slechts 60 gevallen beschreven en die werden allemaal vastgesteld bij oude runderen (ten minste acht jaar oud), met uitzondering van één geval bij een koe van 23 maand dat niet grondig kon worden onderzocht bij gebrek aan monster. De gevallen werden in verschillende werelddelen gemeld. Zij zouden inderdaad te maken kunnen hebben met spontane “sporadische” vormen van BSE die hun oorsprong niet vinden in de verontreiniging van de voedselketen.

Figuur 1: Western blots waarbij referentiemonsters van L-, C- en H-type isolaten met elkaar worden vergeleken. Van boven naar onder stemmen de drie banden van elk monster overeen met de vormen van gediglycoliseerd, gemonoglycoliseerd en niet geglycoliseerd PrP. De verschillende reactie van het C-type in vergelijking met het H-type is zichtbaar met 12B2 antistof (a), het hogere molecuulgewicht van het H-type wordt aangetoond met Sha31 antistof (b) en de aanwezigheid van een vierde strook in het H-type wordt aangetoond met SAF84 antistof (c, pijl). Met Sha31 antistof vertoont het L-type een groter aandeel gemonoglycoliseerde strook in vergelijking met de gediglycoliseerde strook dan het C-type. Er wordt een moleculaire marker weergegeven (MM, drie pijlpunten geven positie van 20, 30 en 40 kDa weer).

12

Figuur 2: Glycoprofielen van de 39 resistente prioneiwitten (PrPres), verkregen met antistof 94B4. Aan het PrP zitten twee, een of geen koolhydraten vast. Die drie vormen worden in verschillende hoeveelheden aangetroffen in een welbepaald dier. De kleuren verwijzen naar het percentage diglycosylaatvorm. De gemiddelde glycoprofielen (met standaardafwijkingen) die met 94B4 worden verkregen voor een referentie-isolaat van het H-type en het L-type zijn aangeduid (HC en L, met een lager gediglycoliseerd percentage, <50% voor het L-type, 3 herhalingen). HB is het H-type glycoprofiel met gebruik van Sha31 antistof waarbij geen duidelijk onderscheid kan worden gemaakt. Het symbool met drie pijltjes moet de lezer helpen om de richting van elk punt naar de verschillende assen te vinden.

13

Komt atypische BSE voor in België? Het is voor de BSE-bewakingsprogramma’s van essentieel belang dat men de prevalentie op wereldschaal van die atypische vormen kan bepalen. Daarom onderzocht (retrospectief ) het Belgische nationale referentielaboratorium voor TSE’s in zijn archieven van runderen positief voor BSE, gevallen van ten minste 7 jaar oud. Op basis van de hierna vermelde criteria en technieken werden deze gevallen onderzocht met het doel uit te maken of er ook in België atypische BSE voorkwam. In het verleden, op een moment dat de moleculaire typeringtechnieken nog niet op punt stonden en vergelijking met L- en H-types nog niet beschikbaar waren, werd er in België een niet geclassificeerd geval van BSE beschreven bij een dier van 60 maand oud. Het desbetreffende monster werd ook in deze studie opgenomen. Om te beginnen werden H-, L- en C-type referentiemonsters onderzocht om de implementatie van de gebruikte technieken te valideren. In het H-type monster migreerde de niet-geglycolyseerde strook in een hogere gelpositie dan in het C-type; bovendien reageerde het H-type sterk op de 12B2 antistof, in tegenstelling tot het C- en het Ltype (Fig. 1). Het vertoonde een dualistisch glycoprofiel tussen antistof Sha31 en antistof SAF84. Verder vertoonde het H-type BSE een vierde strook met laag molecuulgewicht wanneer antistof SAF84 werd toegediend (Fig. 1, pijl). Naast het ontbreken van 12B2 reactiviteit zoals hierboven vermeld vertoonde het geanalyseerde L-type een glycoprofiel met een hoog aandeel gemonoglycolyseerde strook (Sha31: 39% vs. 17% voor het C-type, Fig. 1). Uit de analyses van 39 runderen uit het Belgische BSE-archief, kon er geen enkele indicatie gevonden worden voor aanwezigheid van een atypisch geval. De glycoprofielen van alle monsters, het belangrijkste middel om een onderscheid te maken, vertoonden een typisch C-type glycoprofiel met de gebruikelijke antistoffen, met >55% gediglycosyleerde PrPres strook. Om dit verder toe te lichten werden de glycoprofielen van de afzonderlijke monsters waaraan antistof 94B4 werd toegediend, uitgezet in Fig. 2 en vergeleken met de resultaten voor het L-type en het H-type. Op die figuur ziet men duidelijk dat de glycoprofielen van de monsters overeenkwamen met die van het C-type, dat wordt gekenmerkt door een aandeel gediglycolyseerd PrPres van 55% of meer bij gebruik van antistof 94B4; het L-type en het H-type vertoonden gediglycoliseerde aandelen van minder dan 50%. Bijgevolg vertonen alle gevallen van 7 jaar en ouder de kenmerken van C-type BSE. Ook het hierboven vermelde niet geclassifieerde geval werd aan de specifieke analyses onderworpen, maar ook dit geval was conform aan een C-type.

Bespreking De afwezigheid van atypische gevallen kan te wijten zijn aan de beperkte hoeveelheid van stalen die onderzocht werden (maar dit is geassocieerd met de beperkte aantallen door de oppervlakte van België) en kan ook mogelijk zijn als men de variabele prevalenties bekijkt die werden gevonden in andere landen zoals Frankrijk (8 L-types, 8 H-types), Polen (6 L-types, 1 H-type), Italië (3 L-types), Nederland (2 L-types, 1 H-type), Duitsland (1 L-type, 1 Htype), Verenigd Koninkrijk (2 H-types), Zwitserland (1 H-type) en Catalonië, Spanje (geen). In al die landen werden alle runderen van meer dan 7 jaar oud post mortem met behulp van gevoelige screeningmethoden getest op de aanwezigheid van BSE. In een uitgebreide studie werd de frequentie van H-type en L-type BSE in Frankrijk reeds geraamd op 1,9 en 1,7 per miljoen runderen van meer dan acht jaar oud. Dat stemt overeen met 0.41 en 0.35 atypische gevallen per miljoen onderzochte runderen. Aangezien in België sinds 1997 meer dan drie miljoen runderen werden onderzocht had men kunnen verwachten dat een of twee H-type en een L-type zou zijn gevonden (d.w.z. 1 atypisch geval per vier of vijf jaar). Het is ook mogelijk, zij het moeilijk om te bewijzen, dat atypische gevallen bij het routine bewakingsprogramma over het hoofd werden gezien als gevolg van: 1) een ongewone

14

plaats van de PrPres afzetting in de hersenen vermits ten minste de L-types een voorkeur hebben voor distributie van PrPres in het pro-encephalon en actieve bewakingsmethoden steunen op de hersenstam; en 2) een vatbaarheid van kritische epitopen van PrPres in L- en/of H-type gevallen voor de proteinasebehandeling die wordt gebruikt voor detectie in combinatie met de methode voor eerste screening (TeSeE ELISA of Bio-Rad). Wat dit laatste punt betreft is het zo dat de screeningtests werden ontwikkeld met gebruik van C-type gevallen die resistenter blijken te zijn tegen afbraak door proteinase K dan de H- en L-type gevallen. Er moet evenwel worden vermeld dat een significant aandeel van de L- en H-type gevallen werden opgespoord met gebruikmaking van dit soort capture ELISA, de test die tot in 2007 het vaakst werd gebruikt. Dit probleem in verband met de geschiktheid van screeningtests moet niettemin nader worden belicht in latere studies wanneer voldoende materiaal beschikbaar is, bijvoorbeeld bij experimenteel besmette dieren. De leeftijd van de geteste cohortes is een bepalende factor. In Polen is de rundveepopulatie bijvoorbeeld ouder dan in de andere Europese landen en dat land vertoont een hoge atypische BSE prevalentie (vooral L-types). Dat verklaart de prevalentie van atypische BSE echter niet volledig aangezien Nederland een hogere prevalentie heeft terwijl de leeftijdstructuur van de rundveepopulatie vergelijkbaar is met die in België. Voorlopig blijft de vraag naar het belang van het spontane aspect van (atypische) BSE onbeantwoord. De frequenties van atypische BSEgevallen zijn gelijkaardig aan die van sporadische ziekte van Creutzfeldt-Jakob (sCJD) bij mensen. Er werden immers atypische gevallen ontdekt in zowel landen die blootstonden aan BSE (Frankrijk, Italië, Duitsland, Nederland, enz.) als in landen met weinig blootstelling aan BSE (Zweden). Dat zet de hypothese van een sporadische oorsprong van atypische BSE meer kracht bij. Die atypische BSE gevallen kunnen ook vroeger reeds hebben bestaan en vanwege hun zeer lage frequentie onopspoorbaar zijn gebleven voor dierenartsen tot wanneer de actieve bewakingsprogramma’s werden ingevoerd en de diagnosemiddelen werden verbeterd. De oorsprong van de huidige BSE epidemie zou kunnen samenhangen met atypische BSE, vooral gelet op de eigenschappen van het L-type. Het is echter evenmin uitgesloten dat de echte bron van de epidemie is afgeleid van een C-type geval (dat ook een spontane oorsprong kan hebben gehad) en dat dergelijke gevallen dus altijd sporadisch hebben bestaan. Als dat zo is zullen C-type gevallen bij aanhoudende bewaking in oudere dieren worden vastgesteld in een stabiel sporadisch aantal. Het is mogelijk dat de hersenstam niet de eerste plaats is waar PrPres zich ontwikkelen. Wat de in deze studie gebruikte typeringstechniek betreft, is het belangrijk om aan te stippen dat de schijnbare verschillen in moleculair gewicht nuttig kunnen zijn maar vrij onnauwkeurig en onpraktisch als criteria voor de moleculaire typering van PrPres. De H-types kunnen daarmee worden onderscheiden bij vergelijking met de Ctypes (Fig. 1a). Gelet op de nauwkeurigheid van de Western blot techniek zijn de verschillen in schijnbaar moleculair gewicht van PrPres voor L-types echter te klein om zonder enige twijfel te worden opgespoord (0.3 en 0.8 kDa). De vergelijking van de glycoprofielen is steeds een valabel middel om het onderscheid te maken, nl. de aandelen van de drie vormen van PrP. L-types en C-types verschillen van elkaar door het aantal gediglycosyleerd PrPres, dat respectievelijk gelijk is aan/kleiner en groter is dan 50% van alle PrPres.

15

Conclusies Het detecteren van atypische vormen van BSE is te wijten aan de actieve bewaking, een beter inzicht in de variaties van prionstammen en efficiëntere diagnosetechnieken. Rekening houdend met de moleculaire eigenschappen is PrPres in atypische gevallen vatbaarder voor behandeling met proteinase K en is het gebied in de hersenen waar PrPres wordt afgezet alleszins verschillend voor C- en L-types. Daarom is het van essentieel belang dat de routinematige bemonstering en de analysetechnieken aan die nieuwe types worden aangepast. Omdat die nieuwe types virulenter lijken te zijn dat de klassieke types, althans in modellen met muizen, vormen zij een van de eerstvolgende uitdagingen op het gebied van prionen. Deze retrospectieve analyse van oude runderen in het Belgische BSE-archief bracht geen enkel atypisch BSE geval in die leeftijdscohorten aan het licht. Bij de studie waren 39 runderen betrokken van ten minste 7 jaar oud. Zelfs rekening houdend met de kleine omvang van België had men een paar atypische gevallen kunnen verwachten (zoals in Nederland). Het kan hier gaan om een toevallig verschil of te maken hebben met een onbekende bijzonderheid van de Belgische monsters. De resultaten helpen hoe dan ook om de prevalentie van atypische BSE op wereldschaal te ramen.

[email protected] Referentie : Dobly A, Langeveld J, van Keulen L, Rodeghiero C, Durand S, Geeroms R, Van Muylem P, De Sloovere J, Vanopdenbosch E, Roels S 2010. No H- and L-type cases in Belgium in cattle diagnosed with bovine spongiform encephalopathy (1999-2008) aging seven years and older. BMC Veterinary Research 2010, 6:26

16

De risicobeoordeling van GGO’s en pathogenen in België: het Wetenschappelijk Instituut Volksgezondheid geeft een overzicht van 20 jaar expertise binnen het domein D. Breyer, B. Brosius, A. De Schrijver, C.D. Do Thi, M. Goossens, A. Leunda, K. Pauwels, C. Van Droogenbroeck, B. Van Vaerenbergh, C. Verheust, M. Sneyers en P. Herman Wetenschappelijk Instituut Volksgezondheid (WIV-ISP), Dienst Bioveiligheid en Biotechnologie (SBB), Juliette Wytsmanstraat 14, B-1050 Brussel Bioveiligheid wordt in België gedefinieerd als de beoordeling van de potentiële risico’s voor de menselijke gezondheid en voor het leefmilieu bij het gebruik van genetisch gemodificeerde organismen (GGO’s) of pathogenen. Bioveiligheid is geboren in de tijd van Louis Pasteur en de eerste concrete maatregelen tegen het potentieel risico bij de blootstelling aan pathogene micro-organismen. Het is vervolgens uitgebouwd tot een volwaardige discipline door de definitie en de classificatie van de biologische risico’s, het bewustzijn van de potentiële risico’s verbonden aan het gebruik van recombinant-DNA-technieken en de ontwikkeling van internationaal aanvaarde principes en methodes met betrekking tot de beoordeling van biologische risico’s. De eerste Europese richtlijnen inzake bioveiligheid werden aangenomen in april 1990. Die wetten vormen de basis voor de toepassing van de bioveiligheid in België. In een complexe institutionele context koos België voor een regelgevend kader voor bioveiligheid dat op federaal en regionaal niveau harmonieus en op wetenschappelijk vlak coherent is. Het omvat bovendien alle levende (pathogene en/of genetisch gemodificeerde) organismen die een risico voor de volksgezondheid en het leefmilieu inhouden. Dat kader (bekrachtigd door een samenwerkingsakkoord) berust op een voor de federale staat en de gewesten gemeenschappelijk systeem voor de beoordeling van biologische risico’s en bestaat uit twee instanties: de Adviesraad voor Bioveiligheid en de Dienst Bioveiligheid en Biotechnologie (SBB) van het Wetenschappelijk Instituut Volksgezondheid (WIV-ISP). Twintig jaar na de implementatie van de eerste Europese richtlijnen nemen de SBB en de Bioveiligheidsraad nog steeds een centrale plaats in het Belgisch landschap van bioveiligheid en bieden ze een permanente ondersteuning aan het federaal, communautair en gewestelijk niveau maar ook aan het Europees en internationaal niveau. In 20 jaar tijd leverden deze twee instanties, met ondersteuning van eminente Belgische experten in uiteenlopende disciplines, een schat aan wetenschappelijke adviezen op die de basis vormen voor het Belgisch bioveiligheidsbeleid. De SBB wenst deze expertise en ervaring te delen door middel van een boek waarvan de publicatie in december 2010 plaatsvond. Dit boek beschrijft, door enkele historische herinneringen en aan de hand van cijfers en feiten, de 20-jarige geschiedenis van bioveiligheid in België in haar evolutieve context. Het benadrukt de voorkeurspositie die de SBB in het Belgische landschap van de bioveiligheid inneemt en beschrijft hoe de dienst van een éénpersoonsorganisatie in 1990 tot een bloeiende afdeling met 11 wetenschappers is uitgegroeid. Het toont de

17

onmisbare en erkende rol van de SBB als partner op Europees en internationaal vlak en overloopt de voornaamste communicatie- en informatieacties waaraan de SBB een bijdrage leverde om tegemoet te komen aan de behoeften van het publiek en de betrokken actoren. Het boek bevat ook een toekomstgerichte beschouwing van wat morgen de methodologie en het voorwerp van de wetenschappelijke beoordeling van biologische risico’s zou kunnen zijn. Dit historisch en beschrijvend deel wordt aangevuld door verschillende getuigenissen van mensen die op één of andere manier bij de bioveiligheid in België betrokken waren of nog steeds zijn en benadrukt hoe de expertise binnen de SBB werd ontwikkeld dankzij de onophoudelijke interactie en samenwerking met partners met verschillende achtergronden. Door dit boek, kan de lezer zich realiseren hoe de invoering van een gecentraliseerd systeem voor de risicobeoordeling van GGO’s en pathogenen België in staat stelde om een hoogstaande en internationaal erkende wetenschappelijke expertise op te bouwen, in een controversieel en snel evoluerend domein. Het gaat over een unieke combinatie die bewijst dat een centrale organisatie, gebaseerd op een multidisciplinaire expertise, georganiseerd om de uitwisseling van standpunten toe te laten met wederzijds respect, op basis van vaststaande gegevens, open voor andere disciplines en zo transparant als mogelijk, een duurzame en geloofwaardige grondslag kan geven voor het politieke en publieke debat over het gebruik van GGO’s en pathogenen.

Het Wetenschappelijk Instituut Volksgezondheid, Belgisch brandpunt voor Bioveiligheid 1990-2010 : 20 jaar risicobeoordeling van GGO’s en pathogenen 195 pagina’s. ISBN 9789074968270 (NUR-code: 884). Depotnummer : D/2010/2505/42 Beschikbaar in het Nederlands, het Frans en het Engels, in gedrukte vorm en te downloaden op de website van de SBB (www.bioveiligheid.be) Meer informatie : dr Philippe Herman, Tel : 02 6425270, email : [email protected]

18

Speciatie van arseen in vis en andere voedingswaren. In het kader van het project SPECAS (RF6205) van het Contractueel Onderzoek van de FOD Volksgezondheid, Leefmilieu en Veiligheid van de Voedselketen, werden verschillende vormen van arseen bepaald in diverse voedingsproducten. Arseen (As) is een contaminant die zowel via natuurlijke bronnen als via anthropogene bronnen in ons leefmilieu terecht komt, en zo aanleiding kan geven tot verhoogde gehalten in de voeding. Wetenschappelijk onderzoek heeft aangetoond dat dat de toxische efecten van As niet bepaald worden door de totale concentratie van het element, maar sterk afhankelijk zijn van de chemische vorm of species waarin As voorkomt. In vissen en schaaldieren bijvoorbeeld, worden zeer hoge totale As concentraties vastgesteld, maar dit is bijna uitsluitend aanwezig onder de vorm van het niet toxische arsenobetaine. In terrestrische stalen daarentegen zijn de totale As concentraties veel lager, maar is het As vaak aanwezig onder de veel meer toxische anorgansiche vormen (AsIII en AsV). Epidemiologische studies hebben aangetoond dat blootstelling aan anorganisch As kan leiden tot huid-, blaas- en longkankers. In hogergenoemde context had het SPECAS project als doel om via de analyse van een uitgebreide reeks aan voedingsproducten, een gedetailleerde blootstellingsberekening voor anorganisch As toe te laten voor de Belgische bevolking. Het project was vooral gericht op de anorganische species AsIII en AsV, en op de organische species MMA (monomethylarseenzuur), DMA (dimethylarseenzuur) en AsB (arsenobetaine). De organische arseenvormen worden wel opgenomen maar zeer weinig gemetaboliseerd en grotendeels onveranderd terug uitgescheiden. Als dusdanig zijn ze weinig belangrijk in functie van mogelijke toxische effecten. Dit betekent niet dat een bepaling ervan overbodig is. Bepaalde voedingsstoffen bevatten immers nog andere arseenvormen zoals arsenosuikers en arsenolipiden en het verschil tussen de som van de species en het totale extraheerbare arseen kan een eerste aanduiding geven van het bestaan van zulke arseenverbindingen. Vooral van de arsenosuikers wordt verondersteld dat ze wel een zekere toxiciteit kunnen hebben maar de bepaling ervan was niet voorzien in het SPECAS-project. In totaal werden 350 stalen, behorend tot verschilende voedselgroepen (zoals bepaald in de Belgische voedselconsumptiestudie), aangekocht in lokale winkels, in supermarkten en op markten. De stalen werden gereinigd volgens normale keukenpraktijken en vervolgens gemalen. Om de vijf species afzonderlijk te kunnen bepalen met zo weinig mogelijk wijzigingen werd een extractie toegepast met water in een microgolfoven. Dat bleek een goede methode te zijn voor ondermeer vis, schaal en schelpdieren, graanproducten en rijst. In de loop van het onderzoek bleek dat voor plantaardige matrices de extractie-efficiëntie onvoldoende was. Een extractie met HNO3 (0,07M) en H2O2 (30%) bleek ruim beter te voldoen maar bij een dergelijke extractie wordt AsIII geoxideerd tot AsV. Dit wordt niet als problematisch beschouwd vermits bij het bereiden van voedingswaren en tijdens de spijsvertering oxidaties en reducties ook mogelijk zijn en de verhouding tussen beide vormen kan wisselen. Het is trouwens ook te verwachten dat een toekomstige wetgeving op totaal en vooral op anorganisch arseen zal gebaseerd zijn zonder onderscheid van species. Totale As concentraties in de gehomogeniseerde stalen werden bepaald m.b.v. ICP-MS (VARIAN 820) na mineralisatie met HNO3. De chromatografische scheiding en kwantificatie van de 5 species gebeurde via HPLC-ICP-MS via gebruik van een anionenuitwisselingskolom (Hamilton PRP-X100). De mobiele fase bestond uit een gradient van ammoniumcarbonaat en H2O.

19

Het totale arseengehalte in de onderzochte zeevis varieert van 630 µg kg-1 (zalm) tot 25095 µg kg-1 (schol) en in schaal- en schelpdieren van 104 µg kg-1 (scampi) tot 16908 µg kg-1 (krab). Zoetwatervissen bevatten ruim minder totaal arseen en de gehalten variëren van 30 µg kg-1 (paling) tot 1702 µg kg-1 (forel). In rivierkreeftjes variëren de gehalten tussen 126 en 171 µg kg-1. Doorgaans is het anorganische arseengehalte in zeevis kleiner dan 1% van het totaal en het overgrote deel van arseen komt voor als arsenobetaïne (AsB). Binnen eenzelfde soort kan het AsB-gehalte varieren van het enkelvoudige tot het dubbele en zelfs voor bepaalde soorten tot het 10-voudige en tussen de soorten is een verschil met een factor 500 mogelijk. Bij de schaal- en schelpdieren komt wel anorganisch arseen voor, echter in lage concentratie (doorgaans < 1 µg kg-1), al werden in garnaal toch gehalten tot 21 µg kg-1 gevonden en uitzonderlijk werd een concentratie tot 98 µg kg-1 anorganisch arseen vastgesteld in mosselen. De oorsprong van arseen in mariene organismen is vermoedelijk vooral zeewier, als basis van de mariene voedselketen. Enkele stalen zeewier, bestemd voor consumptie, werden geanalyseerd en bevatten gemiddeld 23000 µg kg-1 (in droge stof ) waarvan gemiddeld 135 µg kg-1 (DS) anorganisch was. Dit is dan ook zeer waarschijnlijk de reden waarom riviervis vrij weinig arseen bevat en waarom gekweekte soorten zoals zalm, forel en scampi afwijken van de rest. Dit heeft vermoedelijk veel te maken met de voeding van de dieren. Het anorganische arseengehalte in de zeewierstalen die onderzocht werden, is niet bijzonder hoog te noemen gezien de resultaten op droog materiaal zijn uitgedrukt. Bij de risicoanalyse is echter met zeewier geen rekening gehouden omdat er geen consumptiegegevens beschikbaar zijn. Vermoedelijk bevatten de zeewieren ook vrij veel arsenosuikers, die mogelijk ook bijdragen tot de toxiciteit. Zeewier kan aldus een zeker risico inhouden maar het vergt nog verder onderzoek. Vlees en vleesproducten bevatten vrij weinig totaal arseen (doorgaans < 10 µg kg-1). Wegens de lage totaalgehalten werd geen systematisch speciatie-onderzoek doorgevoerd met uitzondering van enkele testen. Daaruit bleek dat enkel organische species konden gedetecteerd worden. Granen en graanproducten bevatten, in vergelijking met vis, vrij weinig totaal arseen maar het komt hoofdzakelijk onder anorganische vorm voor en door het belangrijke aandeel dat granen innemen in ons voedselpakket, zijn deze de belangrijkste bron van anorganisch arseen in onze voeding. De totale gehalten variëren van 17 µg kg-1 (Basmati rijst) tot 363 µg kg-1 in volkorenrijst (zie figuren 1 en 2). De meeste planten nemen relatief weinig arseen op maar rijst maakt hierop een uitzondering. De wortels nemen vooral AsIII op en deze gereduceerde vorm is in akkerland vrij weinig voorhanden. In de rijstpaddy’s die onder water staan, zijn de bodemomstandigheden vermoedelijk reducerend en is er meer opname. Ook het bevloeiingswater speelt een belangrijke rol. In heel wat rijstgebieden is het grondwater vrij rijk aan anorganisch arseen. Dat is vermoedelijk de reden waarom Basmati rijst, die in de bergen wordt gekweekt en zeer zuiver water krijgt, opvallend lagere arseengehalten vertoont.

20

Figuur 1: Gemiddelde concentraties van arseen-soorten in verschillende soorten rijst en ontbijtgranen met rijst

Figuur 2: Gemiddelde concentraties van arseen-soorten in brood en verschillende graanproducten

Drinkwater is in heel wat gebieden van de wereld een zeer belangrijke bron van anorganisch arseen. Voor ons drinkwater zijn er geen problemen want de gehalten zijn zeer laag (gemiddeld 0.11 µg L-1), zowel in het leidingwater als in mineraal water. Bepaalde putwaters zouden op natuurlijke wijze aangerijkt kunnen zijn met anorganisch arseen. Indien dergelijke waters gebruikt zouden worden om dranken te bereiden, dan zou dat problemen kunnen geven. Dit werd echter niet vastgesteld. In frisdranken, bier en zuiveldranken werden lage totale arseengehalten gevonden en werd geen speciatie uitgevoerd. Opvallend is wel dat wijn behoorlijk wat arseen kan bevatten. In enkele wijnen werden totale gehalten tot ongeveer 25 µg L-1 gevonden en daarvan was 75 % anorganisch. De oorsprong van het arseen is niet duidelijk. In consumptiedruiven werden geen verhoogde arseengehalten vastgesteld. Vrijwel alle groenten bevatten weinig (< 10 µg kg-1) tot zeer weinig (<1 µg kg-1 ; bloemkool, tomaat, witloof ) totaal arseen en daarvan is ongeveer de helft anorganisch. Vermoedelijk bevatten een aantal groenten ook arsenosuikers, wat nog verder onderzoek vergt. Een uitzondering vormen de champignons die drie maal meer totaal arseen bevatten dan de meeste groenten. Het is echter vooral organisch arseen (90%) zodat het risico zeer beperkt is. In verschillende fruitsoorten werd eveneens zeer weinig arseen terug gevonden. Appels en peren bevatten weinig en citrusvruchten zeer weinig anorganisch arseen. In de groep voedingssupplementen zijn het vooral deze die bereid zijn op basis van zeewier die voor problemen kunnen zorgen. Er zijn voor deze voedingssupplementen geen consumptiegegevens beschikbaar en zodoende werden ze niet opgenomen in de risicoanalyse. Voor deze voedingssupplementen bestaat er wel een reglementering die gebaseerd is op totale gehalten. In voedingssupplementen is doorgaans het merendeel van het aanwezige arseen onder anorganische vorm. De gemiddelde dagelijkse inname van totaal As in België, voor een persoon van 70 kg, werd op basis van de bekomen gegevens berekend op 1.04 µg kg-1lichaamsgewicht d-1. Dit komt goed overeen met schattingen gemaakt door EFSA. Het merendeel van deze inname is te wijten aan de inname van arsenobetaïne. De gemiddelde dagelijkse inname van anorganisch arseen bedraagt 0.11 µg kg-1lichaamsgewicht d-1. De grootste bijdrage aan anorganisch As wordt geleverd door de consumptie van rijst en wijn. Hoge verbruikers van deze voedingsmiddelen hebben een additionele inname van anorganisch As tot 0.06 µg kg-1lichaamsgewicht d-1. Personen met een dieet dat vooral gebaseerd is op rijst hebben een gemiddelde Asi inname van 0.22 µg kg-1lichaamsgewicht d-1. Voor de risico-evaluatie werd als basisscenario de berekende inname aan anorganisch arseen (Asi) vergeleken met de vroegere PTWI van 15 µg kg-1lichaamsgewicht (i.e. 2.1 µg kg-1lichaamsgewicht d-1) die geldig was tot februari 2010. Daarnaast werden de Benchmark Dose Limit BMDL01 waarden van EFSA (0.3-8 µg kg-1lichaamsgewicht d-1) en de BMDL05 waarde van JECFA (3 µg kg-1lichaamsgewicht d-1) als leidraad gebruikt. Tegenover elk van deze referentiewaarden werd de blootstellingmarge (‘Margin of exposure’, MOE) berekend. Ten opzichte van de voormalige PTWI is de MOE 20 voor de gemiddelde Belg. In vergelijking met de benedengrens van de BMDL01-waarden is de blootstellingsmarge zeer klein (1.4-2.7) zowel bij gemiddelde consumenten als bij hoge of extreem hoge rijstverbruikers. Voor de andere scenario’s varieert de blootstellingsmarge tussen een factor 10 en een factor 73. In verband met de risico-evaluatie is het op dit ogenblik nog niet duidelijk welke waarden in in aanmerking moeten genomen worden in verband met een “veilige blootstellingsmarge”. Ludwig De Temmerman, Ann Ruttens, Nadia Waegeneers (CODA, Tervuren) [email protected]

22

Melk en Melkproducten Pathogene E. coli, een voedselpathogeen in opmars. Shiga toxine producerende E. coli (STEC) zijn voedselpathogenen die ernstige ziekte kunnen veroorzaken bij de mens. Ze vormen binnen de voedselgerelateerde zoönosen de vierde meest voorkomende groep in België, maar wat betreft de humane symptomen zijn ze één van de meest gevreesde. Runderen vormen als asymptomatische drager het belangrijkste reservoir. Besmetting naar de mens gebeurt veelal door de inname van besmette voedselproducten afgeleid van runderen, waaronder melk en melkproducten. Een brede waaier aan serogroepen is in staat om deze humane infecties te verwekken, maar de voornaamste zijn O26, O103, O111, O145 en O157. De STEC bacterie dankt zijn ziekteverwekkende vermogen aan een combinatie van virulentie-eigenschappen. De voornaamste zijn: de productie van shiga toxines type I en II, die verantwoordelijk zijn voor het aantasten van de nieren, de eiwitten gecodeerd op de LEE locus, verantwoordelijk voor de modificatie en intieme hechting aan de darmwandcellen, en het enterohemolysine, dat een rol speelt in de bloedafbraak. De combinatie van deze manifestaties heeft een complex ziektebeeld tot gevolg, het hemolytisch uremisch syndroom (HUS). In België worden jaarlijks gemiddeld 50 humane STEC infecties gerapporteerd, waarvan 50% veroorzaakt wordt door de serogroep O157 en een 20-tal patiënten HUS ontwikkelt (EFSA, 2009). Voedingsproducten afgeleid van runderen liggen doorgaans aan de basis van humane infecties, alsook rauwe groenten en drinkwater. Door faecale contaminatie van karkassen, irrigatie water of tijdens het melken, kan de STEC bacterie binnentreden in de voedselketen. In het kader van het monitoring programma voor voedingsmiddelen op de Belgische markt in 2009, werd geen E. coli O157 aangetroffen in kaas, boter en room stalen, behalve voor rauwmelkse geitenkaas werd één staal positief bevonden (Anonymus, 2010). In een studie van De Reu et al. (2004) en niet gepubliceerde resultaten van De Reu et al. (2009) werden anderzijds in respectievelijk 0.7 % en 0.8 % van de Belgische rauwe hoevemelk monsters E. coli O157 aangetroffen. Voor voedingsmiddelen liggen de prevalenties typisch tussen 0-2%, zoals blijkt uit rapporteringen van de Europese Unie van 2005-2007 (EFSA, 2009). Doch, afhankelijk van de toegepaste methode kunnen resultaten sterk variëren. Indien men moleculaire detectie methoden toepast, gebaseerd op het detecteren van genetisch materiaal van de pathogeen, bekomt men zeer hoge prevalenties tussen 5 – 30% voor rauwe melk en kaas (Jordan et al., 2010; Fach et al., 2001; Pradel et al., 2000; Vernozy et al., 2005). Maar, het detecteren van STEC DNA in een staal, wijst niet automatisch op de aanwezigheid van een levend, virulent organisme. Evenmin werd aangetoond dat de gedetecteerde virulentie genen zich binnen één organisme bevinden. Dit geldt ook voor de isolaten, die vaak geen combinatie van de stx en LEE genen bevatten en in dat geval als relatief weinig virulent worden beoordeeld. Mogelijks biedt dit een verklaring voor het minder voorkomen van humane STEC infecties. Dat voorzichtigheid bij (rauwmelkse) zuivelproducten aangewezen is, blijkt duidelijk uit een voorval in oktober 2007 waarbij vijf kinderen ernstige nierschade opliepen na het eten van hoeve-ijs dat besmet was met STEC. Niet de serogroep O157, maar serogroepen O26 en O145 werden geïsoleerd. De niet-sorbitol-fermenterende (NSF) O157 stammen zijn het meeste bestudeerd. Voor deze groep is namelijk een internationaal gestandaardiseerde isolatiemethode voor levensmiddelen en diervoeders (ISO 16654) beschikbaar, die fungeert als gouden standaard. De methode is gebaseerd op fenotypische kenmerken van het organisme, zoals verhoogde resistenties en enzymatische eigenschappen. Via een klassieke cultivering wordt de NSF O157 stam geïsoleerd in ca. 4 dagen. In eerste instantie wordt het staal selectief aangerijkt met toevoeging van antibiotica

23

(novobiocine), gedurende 6 u bij een relatief hoge temperatuur (41,5°C). Vervolgens wordt immunomagnetische scheiding (IMS) toegepast op het aangerijkte staal. Hierbij worden E. coli cellen met serogroep O157 aan magnetische parels gehecht m. b. v. antilichamen (zie figuur 1). Vervolgens worden de parels op twee selectieve agar media gebracht, waaronder CT-SMAC, dat selectieve (galzouten, kristal violet, cefixime en telluriet) en electieve (sorbitol en BCI-glucuronide) componenten bevat om E. coli O157 te isoleren en te herkennen. Bevestiging van verdachte kolonies wordt verkregen met de indol- en agglutinatie-test. Indien geen E. coli O157 isolaat verkregen wordt, dient de isolatie procedure herhaald te worden voor het 24u-aangerijkte staal. Als alternatief voor deze arbeidsintensieve methode erkent het FAVV het gebruik van een reeks alternatieve methoden, met name Rapid’E. coli O157:H7, VIDAS ECO, VIDAS UP E. coli O157 including H7, IQ-Check E. coli O157:H7, GeneDisc E. coli O157:H7, HQS E. coli O157:H7, BAX E. coli O157:H7 MP, BAX Real-Time PCR Assay E. coli O157:H7 en MICROSEQ E. coli O157:H7. Met de klassieke isolatie methode Rapid’E. coli O157:H7 wordt sneller een resultaat verkregen en zijn minder agar media vereist. De VIDAS systemen steunen op een immunologische detectie van de pathogeen, de IQ Check, GeneDisc, HQS, MICROSEQ en BAX systemen op een DNA-detectie van de pathogeen m. b. v. PCR, en enkel bij positieve resultaten dient een isolatie procedure uitgevoerd te worden. Kortom, de klassieke ISO cultuur methode is omslachtig en gevalideerde alternatieven zijn beschikbaar. Maar, specifieke voor- en nadelen zijn verbonden aan elke methode.

Figuur 1: Dynal staal mixer voor het bevorderen van de binding van STEC bacteriën uit het aangerijkte voedingsstaal aan immunomagnetische parels die gecoat zijn met specifieke antilichamen.

24

Momenteel is er geen internationale standaard methode voorhanden voor de detectie en isolatie van STEC stammen die niet tot de serogroep O157 behoren. Dit, vanwege het gebrek aan uniforme fenotypische eigenschappen. Onderzoekers hanteren verschillende aanrijkingsmedia met toevoeging van selectieve componenten alsook IMS voor de voornaamste serogroepen (O26, O103, O111 en O145). PCR-gebaseerde methoden werden beschreven voor de detectie van de voornaamste virulentie genen of serogroepen in stalen. Verschillende agar media werden beschreven, waaronder ramnose-MacConkey Agar, enterohaemolysin agar of de bodem ontwikkeld door het ILVO (Instituut voor Landbouw en Visserij Onderzoek) en de Universiteit Gent en beschreven door Possé et al (2008) voor STEC O26, O103, O111 en O145 (zie figuur 2). Verder worden nog een hele reeks alternatieve methoden gehanteerd, zoals de kolonie-hybridisatie of serologische isolatie technieken. Opnieuw kunnen we stellen dat aan elke methode voor- en nadelen gekoppeld zijn, maar in tegenstelling tot E. coli O157, werd voor de andere STEC serogroepen nog geen gestandaardiseerde methode ontwikkeld.

Figuur 2: Isolatie medium voor STEC O26, O103, O111, O145 en SF O157, zoals beschreven door Possé et al. (2008).

25

Referenties: • The EFSA Journal. 2009. 223, 211-221. • Anonymus, 2010. Trends and Sources; Report on zoonotic agents in Belgium, 2008-2009. 39-42. • De Reu, K., Grijspeerdt, K., Herman, L. 2004. A Belgian survey of hygiene indicator bacteria and pathogenic bacteria in raw milk and direct marketing of raw milk farm products. Journal of food safety. 24, 17-36. • Fach, P., Perelle S., Dilasser, F., Grout, J. 2001. Comparison between a PCR-ELISA and the vero cell assay for detecting Shiga toxin-producing Escherichia coli in dairy products and characterization of virulence traits of the isolated strains. Journal of Applied Microbiology. 90, 809–818. • Jordan, K., Murphy, M., Lynch, M. J. 2010. Verocytotoxigenic Escherichia coli O157, O111, O26, O103, O145 in Irish dairy cattle and raw milk: prevalence and epidemiology of emergent stains. Submitted to World Dairy Summit Auckland, 2010. • Pradel, N., Livrelli, V., De Champs, C., Palcoux, J. B., Reynaud, A., Scheutz, F., Sirot, J., Joly, B. Forestier, C. 2000. Prevalence and characterization of Shiga toxin-producing Escherichia coli isolated from cattle, food, and children during a one-year prospective study in France. Journal of Clinical Microbiology. 38, 1023-1031. • Vernozy-Rozand, C., Montet, M. P., Berardin, M., Bavai, C., Beutin, L. 2005. Isolation and characterization of Shiga toxin-producing Escherichia coli strains from raw milk cheeses in France. Letters in Applied Microbiology. 41, 235-241. Karen Verstraete en Koen De Reu (ILVO T&V, Melle) [email protected] en [email protected]

Normatieve en wettelijke ontwikkelingen Nieuwe IDF- FIL (International Dairy Federation – Fédération International de Laiterie) normen in 2009-2010 (verschenen tussen 9 oktober 2010 en 14 maart 2011) (Last update website 26th October 2010) Normen: Nieuwe: • ISO 26462|IDF 214:2010 - Milk - Determination of lactose content – Enzymatic method using difference in pH • ISO 29981|IDF 220:2010 - Milk products - Enumeration of presumptive bifidobacteria - Colony count technique at 37 degrees C • ISO 2962|IDF 033:2010 - Cheese and processed cheese products -Determination of total phosphorus content - Molecular absorption spectrometric method Vervallen in 2010: • IDF 027:1964 - Determination of the ash content of processed cheese products. • IDF 098A:1985 - Milk - Determination of protein content Amido Black dye-binding method (routine method) • IDF 102A:1989 - Dried milk - Guideline for the detection of neutralizers. • IDF 112A:1989 - Butter - Determination of water dispersion value • IDF 114:1982 - Dried milk - Assessment of heat class - Heat-number reference method

26

Andere nuttige IDF publicaties: • • •

Bulletin of the IDF No. 447/2010 - New Applications of Mid Infra-Red Spectrometry for the Analysis of Milk and Milk Products Bulletin of the IDF No. 446/2010 - The World Dairy Situation 2010 Bulletin of the IDF No. 445/2010 - A common carbon footprint approach for dairy - The IDF guide to standard lifecycle assessment methodology for the dairy sector

Koen De Reu (ILVO-T&V) [email protected] Jessy Claeys (ILVO-T&V) [email protected]

27

Workshops & Symposia Datum

Onderwerp

Plaats

Meer informatie (website)

23-27/05/2011

IDF/ISO Analytical Week,

Lyon, France

http://www.idf-iso-analytical-week.org

24/05/2011

Mycotoxins: Challenges and Perspectives

Ghent, Belgium

www.mytox.be

24/05/2011

63rd International Symposium on Crop Ghent, Protection Belgium

http://www.iscp.ugent.be/

6-7/06/2011

Recent developments in measurement Lisbon, uncertainty; Portugal The revised EURACHEM/CITAC guide

http://eurachem2011.fc.ul.pt/additional-information.php

09/06/2011

Mass Spectrometry in Food and Feed

Ghent, Belgium

http://voeding.kvcv.be/

12-17/06/2011

15th Gordon Research Conference on Mycotoxins & Phycotoxins

Waterville, Maine, USA

http://www.grc.org/

19-22/06/2011

4th International IUPAC Symposium for King’s College Trace Elements in Food (TEF-4) in Aberdeen, Scotland

http://www.abdn.ac.uk/tef-4/

19-22/06/2011

Second Saskatoon International Validation Workshop for Regulatory Analyses of Residues in Foods (SaskVal Workshop)

Saskatoon, Saskatchewan, Canada

www.SaskVal.ca

19-22/06/2011

SafePork Conference 2011 9th International Conference on the Epidemiology and Control of biological, chemical and physical hazards in pigs and pork

Maastricht, The Netherlands

http://www.safepork.org/

26-30/06/2011

The 4th Congress of European Microbi- Geneva, ologists, FEMS 2011 Switzerland

www.kenes.com/fems/

6-8/07/2011

Euro Food Chem XVI Translating food chemistry to health benefit

Gdansk, Poland

http://www.eurofoodchemxvi.eu/

24-25/07/2011

International Food Microbiology Conference

Chipping Campden, UK

24-29/07/2011

10th International Conference on Mercury as a Global Pollutant,

Halifax, Nova Scotia, Canada

http://mercury2011.org/com/

1-6/08/2011

13th International Conference on Trichinellosis

Changchun, P. R. China

International Commission on trichinellosis (ICT); will be organized by Pr Liu Mingyuan in Jilin University, Changchun, P. R. China http://www.ict13.org/

07-12/08/2011

57th ICoMST Ghent, International Congress of Meat Science Belgium and Technology

28

http://www.icomst2011.be/

21-25/08/2011

23rd. International Conference of the World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology (WAAVP)

Buenos Aires, Argentina

21-25/08/2011

DIOXIN 2011, Brussels, 31st International Symposium on Halo- Belgium genated Persistent Organic Pollutants POPs’ Science in the Heart of Europe

http://www.dioxin2011.org/ [email protected]

28/08-1/09/2011

16th International Workshop on Vancouver, Campylobacter, Helicobacter & Related Canada Organisms

http://www.chro2011.com/Contact_Us.php

5-9/09/2011

First international workshop on the food and environmental safety assessment of genetically modified animals

Buenos Aires, Argentina

http://www.agrobiotecnologia.gov.ar/gmanimal2011/

18-21/09/2011

125th AOAC Annual Meeting & Exposition

New Orleans, Louisiana

http://www.aoac.org/meetings1/125th_annual_mtg/ main_2.htm

21-23/09/2011

7th NIZO Dairy Conference - Flavour and Texture: Innovations in Dairy

Papendal, The Netherlands

http://www.nizodairyconference.com/index.asp

22-23/09/2011

Sixteenth Conference on Food Microbiology

Brussels, Belgium

http://www.ilvo.vlaanderen.be/bsfm/activities

27-29/09/2011

3rd MONIQA International Conference

Varna, Bulgaria

The theme “food safety and consumer protection” will form the overarching focus of the conference, bringing together food scientists from research and industry, socio-economists and policy makers. The conference will allow the MoniQA project to present its results and the plans for further developments of MoniQA as an association and will also provide ample room for discussion with stakeholders. Related EU projects will be invited to contribute and a special session will focus on food safety in Bulgaria. Including poster presentations and exhibitions, the conference will give an in-depth look at the following thematic areas: Mycotoxins/Phycotoxins, Food Allergens, Chemical Contaminants, Microbiological Contaminants, Food Additives and Processing Toxicants, Emerging Issues. http://varna2011.moniqa.org/

15-19/10/2011

IDF World Dairy Summit,

Parma, Italy

http://www.wds2011.com

26-28/10/2011

GMCC-11: Coexistence 2.0: Achieving Coexistence of Biotech, Conventional & Organic Foods in the Marketplace & Organic Foods in the Marketplace

Vancouver, Canada

http://gmcc-11.com/

29

http://www.waavp2011-argentina.com.ar/

1-4/11/2011

5th International Symposium on Recent Advances in Food Analysis (RAFA 2011)

Prague, Czech Republic

www.rafa2011.eu

31/01-1/02/2012

Second International Symposium on Hyphenated Techniques for Sample Preparation (HTSP-2)

Bruges, Belgium

http://www.ordibo.be/htc/

1-3/02/2012

Twelfth International Symposium on Hyphenated Techniques in Chromatography and Hyphenated Chromatographic Analyzers (HTC-12)

Bruges, Belgium

http://www.ordibo.be/htc/

20-24/05/2012

IDF International Symposium on Cheese Ripening and Technology

Madison, Wisconsin, USA

http://www.idfcheeseus2012.com/

19-21/06/2012

IDF/INRA International Symposium on Spray Dried Dairy Products

St. Malo, France

http://www.fil-idf.org/Public/SiteEventType. php?ID=23123

June 2012

2nd Global conference on GMO analysis

Como, Italy

http://mbg.jrc.ec.europa.eu/home/

30/09-3/10/2012

126th AOAC Annual Meeting & Exposition

Las Vegas, NV

http://www.aoac.org

Autumn 2012

Fourth international conference on Feed Safety

Beijing, P.R. China

http://www.feedsafety.org/

03-09/11/2012

IDF World Dairy Summit

Cape Town, South Africa

http://www.fil-idf.org/Public/SiteEventType. php?ID=23123

October 2013,

IDF World Dairy Summit,

Yokohama, Japan

http://www.fil-idf.org/Public/SiteEventType. php?ID=23123

30

31

RL

N AT I O N A L REFERENCE LABORATORIES

NRL

N AT I O N A L E REFERENTIE LABORATORIA

LNR

L A B O R ATO I R E S N AT I O N A U X DE REFERENCE