L O G O
DNA ISOLATION Riandini Aisyah 2010
Relevance of DNA isolation Isolation of DNA is often the first step before further analysis DNA profiling (forensics) Cloning Disease diagnosis DNA sequencing Genetically modified organisms (GMO) - agriculture, Pharmaceutical Environmental testing, bioterrorism
Structure of the cell Structure of the cell Plasma membrane and membranes of organelles nuclear Envelope included DNA located in nucleus A lot of proteins around Mitochondrial DNA
Extraction of genomic DNA Cell collection Add Lysis buffer to cells to break open cell and nuclear membranes and release nuclear contents Digest sample with protease to degrade proteins Precipitate DNA with cold alcohol in high salt
Lysis buffer Lysis buffer : 50 mM Tris-HCI, pH 8.0 to maintain the pH of the solution at a level where DNA is stable 1% SDS (sodium dedoxyl sulfad) to break open the cell and nuclear membranes, allowing the DNA to be released into the solution (SDS also denatures and unfolds proteins, making them more susceptible to protease cleavage)
Why add protease? Protease destroys nuclear proteins that bind DNA and cytoplasmic enzymes that breakdown and destroy DNA Protease treatment increases the amount of intact DNA that is extracted
Adding salt The addition of NaCI allows the DNA molecules to come together instead of repelling each other, thus making it easier for DNA to precipitate out of solution when alcohol is added Na+ ions bind to the phosphate groups of DNA molecules, neutralizing the electric charge of the DNA molecules Our protease solution already contains salt
Precipitation of DNA DNA does not dissolve (larut) in alcohol Addition of cold alcohol makes the DNA clump together and precipitate out of solution Precipitated DNA molecules appear as long pieces of fluffy (soft,light), stringy (sprt kawat), web-like strands Microscopic oxygen bubbles “aggregate” together, as the DNA precipitates The larger, visible air bubbles “lift” the DNA out of solution, from the aqueous into the organic phase The DNA in the glass vial can last for years
Extraction of DNA basically consists of four major steps : • Preparation of a cell extract • Purification of DNA from cell extract • Concentration of DNA samples • Measurement of purity and DNA concentration
[email protected]
1. Preparation of a cell extract: To extract DNA from a tissue/cells of interest, in this experiment the heart muscle of rats, the cells have to be separated and the cell membranes have to be disrupted. The "Extraction buffer" helps in carrying out these processes. Chemicals such as EDTA (Ethylene Diamine Tetra Acetate) which removes Mg2+ ions that are essential for preserving the overall structure of the cell membrane, and SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) which aids in disrupting the cell membranes by removing the lipids of the cell membranes are included in the extraction buffer. Having lysed the cells, the final step in the preparation of a cell extract is removal of insoluble cell debris. Cell debris and partially digested organelles etc. can be pelleted by centrifugation leaving the cell extract as a reasonably clear supernatant.
[email protected]
2. Purification of DNA from cell extract In addition to DNA the cell extract will contain significant quantities of protein and RNA. A variety of procedures can be used to remove these contaminants, leaving the DNA in a pure form. The standard way to de-proteinize a cell extract is to add phenol or a 1:1 mixture of phenol:chloroform. These organic solvents precipitate proteins but leave the nucleic acids in aqueous solutions. The aqueous solution of nucleic acid can be removed with a pipette. The effective way to remove RNA is with the enzyme ribonuclease, which will rapidly degrade these molecules into ribonucleotide subunits.
Isolation of DNA
[email protected]
3. Concentration of DNA samples The most frequently used method of concentration is ethanol precipitation. In the presence of salt and at a temperature of -20 °C or less, absolute ethanol will efficiently precipitate polymeric nucleic acids. With a concentrated solution of DNA one can use a glass rod to pull out the adhering DNA strands while for dilute solutions precipitated DNA can be collected by centrifugation and redissolving in an appropriate volume of water.
[email protected]
Gel Electrophoresis Apparatus
[email protected]
Gel Results
[email protected]
4. Measurement of purity and DNA concentration DNA concentrations can be accurately measured by UV absorbance spectrometry. The amount of UV radiation absorbed by a solution of DNA is directly proportional to the amount of DNA sample. Usually absorbance is measured at 260 nm, at which wave length an absorbance of 1.0 corresponds to 50 µg of double-stranded DNA per ml. UV absorbance can also be used to check the purity of a DNA preparation. With a pure sample of DNA the ratio of the absorbancies at 260 nm and 280 nm (A260/A280) is 1.8. Ratios of less than 1.8 indicate that the preparation is contaminated, either with protein or with phenol.
[email protected]
UV Absorption Spectrum of DNA
[email protected]
DNA Labeling with Dyes
[email protected]
Cesium Gradient Centrifugation
[email protected]
DNA Melting
[email protected]
Heating anc Cooling of DNA (Thermocycler)
[email protected]
DNA Hybridization
[email protected]
Plot From DNA Analyzer
[email protected]
[email protected]
Recognition sequences of a few restriction endonucleases Enzyme designation
Recognition sequence
Escherichia coli
EcoRI
GA
G AATTC
Escherichia coli
EcoRII
-C
Haemophilus influenzae
HindII
PY-C
GTPPy PuAC
Haemophilus hemolyticus
HhaI
CC
GCG C
Bacillus subtilus
BsuRI
GC
G CC
Brevibacterium albidum
BaII
GC
Thermus aquaticus
Taql
TA
Organism
CCAGG
TGG CCA T CGA
Arrows indicate the sites of enzymatic attack. Underlines indicate the site of methylation (modification). G = guanine; C = cytosine; A = adenine T = thymine; Pu = any purine; Py = any pyrimidine. Only the 5’ 3' sequence is shown.
[email protected]
[email protected]
Isolasi DNA bakteri Sejumlah kecil dari total DNA, termasuk Ti plasmid dan DNA kromosom dari Agrobacterium disiapkan dengan metode Kado dan Liu (41). Sel-sel ditumbuhkan semalaman dalam L-Broth pada suhu 28° C hingga densitas optik 0.8 pada 600 nm dan dijadikan pelet melalui sentrifugasi pada 2.5 k x g selama 7 menit. Pelet sel disuspensikan dalam 1 ml larutan penyangga E (40 nM Tris-asetat, pH 7.9, mengandung 2 mM EDTA).
Sel-sel tersebut dihancurkan dengan cara menambahkan 2 ml larutan penghancur (3% SDS dalam 50 mM Tris-NaOH, pH 12.6), dan dicampur dengan pengadukan singkat. Larutan tersebut dipanaskan pada suhu 65° C selama 10 menit dalam water bath dan ditambahkan dua volume larutan fenol: kloroform (1:1, v/v). Larutan tersebut diemulsi dengan cara mengocoknya secara singkat, dan emulsi tersebut dipecah dengan sentrifugasi (3.5 kx g, 15 menit, 4° C). Fase cair bagian atas dialirkan ke dalam tabung baru dan DNA dijadikan pelet dengan menambahkan 0.1 volume natrium asetat 3 M (pH 4.8) dan 2.5 volume etanol. DNA dalam bentuk pelet disuspensi kembali dalam 100 ml larutan penyangga TE (Tris-HCl 10 nM, pH 8.0, mengandung EDTA 1 mM).
Plasmid lainnya, seperti pUC18, prosedur lisis alkalin SDS (68).
diisolasi dengan
Sel bakteri dikultur semalaman dalam media LB atau TB yang mengandung antibiotik yang sesuai. Kultur tersebut (1.5 ml) disentrifugasi dan peletnya disuspensi dalam 100 µl larutan penyangga (Tris-HCl 50mM, pH 8.0, mengandung glukosa 50 mM dan EDTA 10 mM). Setelah disimpan dalam es selama 5 menit, suspensi tersebut ditambahkan dengan 200µl larutan penghancur (NaOH 0.8 M, Triton X-100 4%), dicampur dengan cara dibalik beberapa kali dan ditempatkan dalam es selama 5 menit. Kemudian, ditambahkan 150 µl natrium asetat 3 M (pH 4.8) dan ditempatkan dalam es selama 5 menit.
Campuran itu disentrifugasi pada suhu ruangan selama 5 menit. Supernatannya dituangkan dalam tabung microcentrifuge bersih, dan ditambahkan 1 volume (450 µl) isopropanol, dicampur dengan cara membalik tabung beberapa kali, diikuti dengan inkubasi dalam suhu ruangan selama 5-10 menit. Larutan tersebut disentrifugasi pada 13 k x g selama 10 menit untuk mengubah plasmid DNA menjadi pelet. Setelah pengeringan, plasmid DNA disuspensi kembali dalam 50 µl larutan TE. Jika perlu, RNA yang mengkontaminasi pada endapan dihilangkan dengan prosedur berikut. DNA plasmid dilarutkan dalam 900 µl larutan TE, kemudian ditambahkan 100 µl Rnase A (dipanaskan, 100 µg/ml).
Larutan tersebut diinkubasi pada suhu 37° C selama 30 menit, dan kemudian disentrifugasi untuk menghilangkan bahan yang tidak dapat larut. Larutan polietilen glikol 6000 (20% dalam NaCl 2.5 M, 600 µl) ditambahkan ke dalam supernatan. Setelah inkubasi dalam es selama dua jam, larutan tersebut disentrifugasi pada 13 k x g selama 5 menit. Endapannya dilarutkan dalam 500 µl larutan TE dan diekstrak dengan fenol, fenol:kloroform (1:1, v/v) dan kloroform, masing-masing satu kali. Setelah itu, DNA dalam lapisan air diendapkan dengan etanol.
Sel-sel bakteri dikultur hingga jenuh dalam 100 ml medium LB. Sel-sel tersebut dijadikan pelet dengan sentrifugasi 3.5 k x g selama 10 menit, dan kemudian disuspensi kembali dalam 9.5 ml larutan penyangga TE. Suspensi bakteri ditambahkan dengan 0.5 ml SDS 10% dan 50 µl proteinase K (20mg/ml), dicampur rata dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37° C. NaCl (5 M, 1,8 ml) dan larutan CTAB/NaCl (1.5 ml) ditambahkan, diaduk perlahan dan diinkubasi pada suhu 65° C selama 20 menit. Campuran itu ditambahkan dengan kloroform:isoamilalkohol dengan volume yang sama (24:1, v/v) dan disentrifugasi pada 3.5 k x g selama 10 menit pada suhu ruangan, sampai lapisan-lapisannya terpisah. Lapisan bagian atas dipindahkan ke tabung bersih menggunakan pipet polietilen berpori lebar.
DNA dijadikan pelet dengan penambahan 0.6 volume isopropanol dan disentrifugasi pada 8 k x g selama 5-10 menit. Pelet DNA dicuci dengan etanol 70%, dikeringkan dan disuspensi kembali dalam 4 ml larutan penyangga TE, diikuti dengan penambahan 4.3 g CsCl dan 200 µl ethidium bromida (10mg/ml). Campuran itu kemudian dialirkan ke tabung centrifuge yang dapat ditutup rapat (sealable centrifuge tube) dan diputar dalam rotor vertikal selama 18 jam pada 600 k x g pada suhu 15° C. Dibawah sinar UV pita DNA kromosomal yang ada dalam tabung centrifuge dipindahkan dengan menggunakan alat suntik dan diekstraksi dengan campuran TE:isoamilalkohol (1:1, v/v). Kemudian, larutan DNA dipisahkan dengan dialisis (dialyzed) semalaman dengan 2 liter larutan penyangga TE.
Elektroforesis Gel Agarose Elektroforesis gel Agarose dilakukan menurut metode yang telah dilaporkan(15). Baik gel agarose 0.8% ataupun 1% dapat digunakan, tergantung pada ukuran DNA yang akan dipisahkan. Digunakan sistem larutan penyangga dengan kadar garam rendah terbuat dari Tris-asetat 40 mM (pH 7.9) dan sodium EDTA (larutan penyangga TAE) 2mM. Semua proses elektroforesis diperlihatkan pada sebuah aparatus horizontal dan dilakukan dengan daya 100 V selama 1-3 jam. Setelah elektroforesis dan pewarnaan dalam larutan ethidium bromida (0.5 µg/ml), gel tersebut difoto di bawah sinar UV dengan kamera Acmel CRT M-0885D (Polaroid), yang dilengkapi dengan filter UV jingga.
