PUVOD A IDENTIFlKACE RYB RODU CARASSIUS V EVROPE POMoci MOLEKULA.RNE-GENETICKYCH DAT Origin and Identification of Fishes of the Genus Carassius in Europe as Revealed by Molecular Data Analyses L. KALOUS, V. SLECHTOVA .JR., 1. BOHLEN, I. DOADIUO
ABSTRACT Three members of the genus Carassius are known from Europe. but ta.;'(on identity, identification and the impact of introduction ofAsian populations are poorly understood. In the present study we report on the sorting of representative populations across Europe and Asia according to mtDNA data. The three identification lineages clearly refer to the groups gibelio, carassius and auralus. The distinct species level ofC auratus and C gibelio is demonstrated by the close ties between Asian and European representatives ofC gibelio in respect to C. auratus. A II analyzed wild populations of Carassius from the Iberian Peninsula turned out to be derived from domesticated C. auratus. A single sample from the River Chrudimka contained a mitochondrial haplotype that was most similar to Japanese C langsdorfi, which may be the result of a direct introduction afthis lineage from Asia.
UVOD
Problematika Pllvodu a nazvoslovi ryb rodu karas (Carassius), pi'edevsim ryb i'azenych fonruilne do druhu "karas sti'ibfitY (Carassius auratus)" (Barns & Oliva, 1992), byla jiz zminovana di'ive, napi'. Kalous & Bohlen (2002). Z karasu vyskytujicich se v Evrope je karas ohecny (Carassius carassius) morfologiCh)' dobi'e rozlisitelny, ackoliv bYva casto zamenovan s karasem sti'ibntYm, napi'. kresba karase sti'ibi'iteho v publikaci "Ryby" (PospiSil & Hisek). Rozi'eseni ot<:izky puvodu ryb ze skupiny oznacovane dosud formaIne jako Carassius auratus a jejich rozSii'eni v Evrope vyzaduje peClivou analyzu, ktera by poskytla jednoznacna data pro vyvozeni nejpravdepodobnejsich zaveril, ktere se aZ dosud opimly spiSe 0 spekulace. Pn pouziti klasick-ych ichtyologickych metod, jako jsou napr. metody morfologicke, je tento problem nei'esitelnY. To dokladaji data uvedena napi'. v pradch Henseia (1971) a Vasiljeva-ove (1990). Cytologicke metody, jako nap!'. metody studia chromozomu jsou vzhledem k jejich vysokemu poctu a dosud nezruime vatiabilite karyotypu a dalSich chromozomovych markeru velmi zdlouhave a narocne (penaz et al.,1979, Boron, 1994, Zhou et ai., 2001). V Evrope se vyskytujici karasi z okruhu C auratus maji 3 ploidni Urovne: jako diploidni jsou oznacovani jcdinci se 100 chromozomy, jako triploidni s pnbliine 150 chromozomy a tetraploidni s pfiblizne 200 chromozomy. Je vsak nutno si uvedomit, ze jedinci se 100 chromoz6my, kten se rozmnozuji vylucne bisexurune, jsou evolucne tetraploidniho puvodu, chovaji se vsak jako ostatni diploidni pohlavne se mnoZici fomlY (Ollno 1970) Studovani karasi z Pyrenejskeho poloostrova byly doposud pouze diploidni stejne jako domestikovani karasi zlati pocMzejid z akvarijnich a bazenovYch chow v Cesku (Collares-Pereira & da Costa, 1999, Kalous nepubL). To by nasvoocovalo tomu, ze v zapadnim srredomon se dosud vyskytuje pouze zdivocelci (ferilni) forma karase zlateho (Carassius auratus), zatimco ve sti'edni a vychodni Evrope pi'evazuji formy polyploidlliho hybridniho komplexu karase sti'ibi'iteho (Carassius 'gibelia' ), zi'ejme puvodem z dalneho vychodu (Bolcik & Ziman, 1978; Lusk el al.,1998).Tento vYchodoasijskJ puvod je predpokladan, skutecny dUkaz vsak chybi. Nektel'i autofi take vyslovuji domnenku 0 autochtonnim puvodu pfinejmensim nekterych forem (Hensel, 1971), opet bez skutecneho dt'ikazu. Metoda sekvenace mitochondri:ilni DNA a je povazovana za velmi ucinnou metodu ph studiu genealogickych vZtallu (Avise et aI., 1979, Moritz et aI. , 1987) a muze napomoci porozumet puvodu a rozsireni ryb rodu Carassius v Evrope. Jednim z nejuniverz:ilnejsich a nejvice pouzivanych tiseku mitochondrifllni DNA, zejmena v nimci l'adu C.ypriniformes, je gen pro cytochrom b. Analyza prave tohoto useku byla v predkiadane studii pouzita pro zodpovezeni nasledujicich zakladnich otazek:
1. 2. 3.
Jaky je piivod expanzni fonny? IdentifIkace ryb rodu Carassius na Pyrenejskem poloostrove Jake jsou fylogeneticke vztaby mezi evropsk)'mi a asijsk)'mi formami.
MATERIAL A METODIKA Material pro geneticke analyzy byl ziskan z vlastnich odlov!l nebo byl poskytnut zalmllicnimi kolegy. Zahmuje 37 jedincii z 19 populaci pochazejicich z 19 oblasti Evropy a Asie. Podrobnejsi informace tykajici se materialu jsou uvedeny v Tab. I. Z kazd6ho jedince byl odebran vzorek tkane (cast ploutve, svalova tkan, sup ina), ktery byl at do izolace DNA fIxovan v 96% Cistem ethanolu. Jaderrui DNA byia izolovana metodou "fenol-chlorofonn" (Sambrook et al. 1989). Cytochrorn b mtDNA byl amplifIkovan za pouiiti primeru GLUD-GL: 5'- TGA CTT GAA (AG)AA CCA (CT)CG TTG (Palumbi, 1996) a H16460: 5' .- CGA (CT)CT TCG GAT T AC AAG ACC G (Bermingham, 69
per. com.).PCR reakce v 50 ~l objemu obsahovalalO mM Tris-HCl, 50 mM (NH4)2S04, 0.1% Triton X-lOG, 1.2 ai 1.8 mM MgCl2, 10 umol od kazdeho nukleotidu, 2.5 U rekombinantni Taq polymerasy (vsechny pouzit6 chemikalie od firmy Top-bio) a 25 pmol od kazdeho primeru. Profil PCR reakce sestaval z: 1) iniciacni denaturace ph 94°C po dobu 2 minut, 2) pet cyklu, z nichZ kaidy zahrnoval denaturaci pi'i 94°C po 45 sec., rumealing pi'i 50°C po 45 sec. a elongacni krok ph 75°C po dobu 90 sec., 3) 30 cyklu sestavajicich z denaturace pi'i 94°C po 45 sec., rumealingu pi'i 52°C po 45 sec. a elongace ph noc po 90 sec., 4) PCR reakce byla zakoncena finalni elongaci pi'i 72°C po dobu 5 minut. Produkty peR reakce byly precisteny ethanolovou precipitaci a nasledne pouzity pro sekvenacni reakci s pouZitim BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Kit v 3.1 (PE Applied Biosystems) presne podle mivodu vYrobce. Produkty sekvenacni reakce byli opet pr-ecisteny ethanolovou precipitaci. Pro sehenaci byl pouiit pristroj ABI Prism 3100 Genetic Analyser (Perkin Elmer). Analyzovany fragment rnitochondrialni DNA kaideho vzorku byl sekvenovan z obou (3' as') koncu za pouziti vYse zminenych primeru. Chromatogramy byly sesazeny pomoci pocitacoveho programu SeqManII (souMst programoveho baliku DNA Star, http://www.dnastar.com). Sesazene sekvence byly zkontrolovany pro odstraneni pi'ipadneho vyskytu chyb a nasledne porovnany pomoci tzv. aligmnentu za pouiiti algoritrnu ClustalW v programu BioEdit (Biological sequence alignment editor v 5.0.9, http://mbio.ncsu.edulBioEditibioedit.html). Pomoci pocitacoveho programu Arlequin 2.000 (Schneider et al., 2000) byla spoctena tzv. nukleotidovi divers ita n (Nei, 1987), coije pmmemy pocet nukleotidu na pozici v sekvenci. Fylogeneticke vztahy mezi jedinci byly rekonstruovimy metodou "neighbour-joining" (NJ) za pouziti programu MEGA 2.1 (Kumar et aI. , 2001) a PAUP* ver. 4.0blO (Swofford, 2000). Program PAUP* by\ pouiit take pro konstrukci fylogenetickeho stromu pomoci metody maximaIni pravdepodobnosti (Maximum Likelihood, ML), stejne tak jako pro odhad parametru substitucniho modelu nejlepe odpovidajicimu danemu souboru dat. Jako nejvhodnejsi byl vybran GTR model (gt{neral time reversible) s gamma rozdelenim rychlosti mutaci (y=0.3), frekvencemi jednotlivYch basi A=0.29, C=;0.29, G==0.14, T==0.29 a nasledujici substitucni maticl: A-C == 4.30, ~-G == 37.80, A-T == 3.66, C-G == 1.80, C-T = 36.39, G-T = 1.00. ML fylogeneticky strom byl zkonstmovan pomoci metody "Quartet puzzling". Jako outgroup pro byla pouiita sekvence kapra obecneho (Cyprinus carpio) z GenBank (pristupove cislo AY347295.1). Tab. 1 Lokality v·-
Lokalita Dyje Vodiiany Hluboka nad Vltavou Strkov nad LuZilici Milevsko Dolni Bellesov Striz nad Nisou Bojanov, Chrudimka Dugo Selo Siva (Zagreb) Jezero Abashiri Szru'avas Shanghai, t1'h :Reka Guadiana ---l'fekaTrandio Reka Tajo Ricka Malleta Reka Jucar Nadrz Kirkareli
r---
[
Stat
_.
Cesko Cesko Cesko Ccsko Cesko Cesko Cesko Cesko Chorvatsko Chorvatsko Japonsko, Hokaido Mad'arsko Cina, Shanghai Portugalsko Portugalsko Portugalsko Italie, Piemont Spanelsko, Valencia Turecko, Thracia
-
Forma/drub
Pocet
Carassius 'gibelio ' Carassius auratus Carassius 'gibelio' Carassius 'gibelio' Carassius carassius Carassius 'gibelio' Carassius sp. Carassius 'gibelio' Carassius 'gibelio' Carassius 'gibe/io' Carassius langsdorfi Carassius 'gibelio ' Carassius sp. Carassius auaratus Carassius auaratus Carassius auaratus Carassius gibelio Carassius auratus Carassius 'gibelio'
2 2 3
2 1 2 t
--1
I --3 -2 2 3 2
I
3 2 2 1 1
--
2
VYSLEDKY A DISKUSE Delka konecneho aligrunentu sekvenci cytochromu b vsech 37 analyzovanychjedincu cinila 1078 basi. Variabilita byla prokazeina u 12.5% nukleotidovYch pozic, pi'icemi 9% pozic z ce1kove delky alignmentu bylo informativnich (tzv. parsimony infonnation). Nukleotidova diversita n byla 0.0275 (S.E. 0.0023). Fylogeneticke stromy sestrojcne pomoci metod NJ a ML byly navzajem kongruentni, viz. obr. 1., na kterem je zobrazen fyiogeneticky strom. Tradicne jsou v Evrope dosud rozlisovany pouze dva druhy ryb rodu Carassius: karas obecny a karas stiibhtY. Karas sti'ibi'itY je dale rozdelen do dvou poddruhll a to je karas zlatY (Carassius auratus auratus) a gibelio (Carassius auratus gibelio) (Berg 1949, Barns a Oliva 1992, Paepke 1999, Scze1'bowski 2002). Kottelat (1997), rozlisuje v Evrope th druhy: karas obecny (Carassius carassius), karas zlaty (Carassius auratus) a karas sti'ibi'itY ( Carassius gibelio). 70
Obcl
c! ~it'*iJ~: ,t~/!H} ?£ C! ~:if)~i:iq : ($Z~J~)
H.~
C~ Blj)~(!~ : {$..~ ~}{;!
CZ
C~ ~l~'~~i~'; {$'~ l;\1 h:~
C,
?].
cz
sor, C~ ~'~~'~?k~: ($$h) 11 C\ ~f~~i;!:;: (as~1~) c~ ~:i[;-~(:~:
8,~
{$7f..c.f\! if-;
·c. ijb~U(;: {$$L~~~ CZ
FylogenetickY strom zkonstmovany pomoci metod "neighbour joining" a "maximum likelihood" zmizoriiuJlcl vztahy mezi analyzovanymi jedinci. Jako outgroup byla pouzita sekvence kapra obecneho (Cyprinus carpio). Hodnoty u jednotlivYch vetvi znazoriiuji bootstrapovou podporu pro NJ a ML jako % z 1000 pseudoreplikaci. Zmizomeny jsou vsechny hodnoty, kde pro NJ analYzu byla podpora 50% a vice. V piipadech, kde pro znazomene hodnoty byla bootstrapova podpora ruzS! nez 50%, je dana hodnota nahrazena pomlckou. Zkratky: CZ - Ceska republika, H - Mad'arsko, HR - Chorvatsko, TR - Turecko, CN - Cina, I - Italie, P - Portugalsko, E Spanelsko, JP - Japonsko.
71
Karas zlatY zvany tez "zlata rybka" se do Evropy dostal v sedmnactem stoleti, do Portugalska bud' roku 1611 nebo ]691 (Yarrell, 1836). Po te co se stal karas zlatY diky zvladnuti jeho rozmnozovani dostupnejsim, zacal se objevovat , diky jehounikum z rybnicku Ci zamememu vysazovam, i ve volne prirode. Jeho vYskyt je vsak bodoy)' a vetSinou netvofi pfilis pocetne populace. TakovY typ yYskytu je pozorovan napfiklad u populaci karase zlateho na Pyrenejsk6m po!oostrove (Doadrio, 2001). Gynogeneticky, tj. asexmilne, se mnoZici populace karase stfibnteho (Carassius 'gibelio') ve stredni Evrope maji svllj puvod nejspiSe v importech z dalneho vYchodu (Lusk et aI., 1998). Na rozdil od zmineneho karase zlateho byla expanze tohoto komplexu v Evrope velmi uspesna. Pocatky teto expanze lze hledat pravdepodobne v povodi Dunaje, odkud se vlna kolonizace sifila po cele oblasti Ceske republiky a do dalSich casti Evropy. (HolCik & .litlian, 1978). Sireni karase stfibnt6ho napomohl predevsim clovek jeho rozsirovanim jako primesi rybich n{lsad. Unikatni schopnost tohoto druhu rozmnozovat se gynogeneticky, tj. pouzivat pro reprodukci samce jinych druhll kaprovitych ryb (tzv."sexmUni parazitizmus), stejne tak jako vysoki ekologicka plasticita a adaptabilita vedly k jeho rychIemu namnozeni na vhodnych lokalitach. Oproti dosavadnimu tradicnimu rozdeleni, kter6 bylo zmineno na zacatku diskuse ve shode s nasimi daty, se pfiklanime k nasledujicimu taxonomickemu feseni. Evropu obYvaji dva diploidni, bisexmllne se mnozici druhy: puvodni karas obecny (Carassius carassius) a introdukovany karas zlatY (Carassius aurafus), ktery se na kontinent dostal v 17. stoleti jiz jako domestikovana forma. Dale je v Evrope pfitomen hybridni polyploidni komplex krras stfibntY (Carassius 'gibelio' ) jehoz taxonomicke oznaceni "gibelio" je vzhledem k puvodu tohoto jmena jen docasne a proto je uvadeno v uvozovkach (Kalous & Bohlen, 2002). Z nasich dat vsakjednoznacne vyplYva, ze Carassius 'gibelio ' v zadnem pfipade nespada do taxonu Carassius auratus a mel by byt tedy form.aIne oddelen. Puvod expanzni formy: Vzhledem k vyssi pl"ibuznosti komplexu karase stfibfiteho s karasem zlatYm (ktery rna prokazate1ne puvod v Asii) a nizsi pnbuznosti s karasem obecnym, se domnivame, ze karas stfibrity pochazi skutecne z Asie a jeho vYskyt v Evrope tedy neni puvodni. Tato hypoteza je vyznamne podporena v predkladane studii zjistenym faktem, ze arIalyzovani jedinci karase stfibfiteho z Ciny tvorili (s vysokou statistickou podporou, viz. obr.l) monofyletickou linii s jedinci karase stfibfit6ho nejen z naseho uzemi, ale i z dalSich evropskych zemi. Tato prace tedy prokazala pfimou pfibuznost evropsk6ho karase stribl"it6ho s asijskYmi formami. Analvzy popuIaci karase z Pyrenejsk6ilo poloostrova jednoznacne prokazaly jejich blizkou pribuznost s jedinci okra;nych karasu (Carassius auratus) jedinci pocMzejicich z CR. Identifikace karase z Pyrenejskeho poloostrova tedy zal"adila tanmi populace do skupiny karase zlateho (Carassius auratus) a prokazala, ze se jedna o zdivoce16 populace domestifikovanych forem. ZajimayY je haplotyp ryby urcene morfologicky jako karas stfibntY z ficky Chrudimky. Tato ryba se vyskytuje ve stejne skupine s Carassius langsdorfi z Hokaida z Japonska. Tento fakt nas vede k uvaze zda na nase uzemi nebyl introdukovan i tento "druh", napfiklad s dovozy okrasnych koi kaprii. SOUHRN V Evrope se vyskytuji dva druhy a jeden hybridni polyploidlll komplex rodu karas (Carassius), ale jejich taxonomicka identita nem dostatecne jasmi. V nasi studii pi'edkladame rozdelelli Evropskych populaci rodu karas (Carassius) ve shode s nasimi daty ziskanymi ze sekvenace mtDNA genu pro cyt. b. Tl"i identifikovane linie'jasne oddeluji skupiny gibelio, carassius a auratus na Urovni druhu. Vets! pfibuznost karase stfibfiteho a vYskyt Cinskych haplotypu v teto skupine, doklada jeho asijskY puvod. Vsechny analyzovane divoke populace karase zlateho (Carassius auratus) z Pyrenejskeho poloostrova nalezi do stejne skupiny jako domestikovane formy karase zlateho z CR. Jediny exemplar z ficky Chmdimka mel haplotyp nejvice pfibuzny japonskemu Carassius langsdorfi. Tento nalez by moh! by! vysvetlen jako nasledek dalsich introdukci napI'. s dovozy koi kapn!.
PODEKovANI Tato studie vznikla za podpory grantu: BiodIberia Project number: A 110, GA CR 206/00/0668 a cileneho grantu Reg. cislo S 5045011 , AV CR. Radi bychom podekovali vsem kteri nim poskytli material pro analyzy.
LITERATURA Avise, lC., Giblin-Davidson, c., Laerm, J., Patton, lC., Lansman, R.A. , 1979. Mitochondrial DNA clones and matriarchal phylogeny withinand among geographic populations of the pocket hopher, Geomys pinetis. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 76, 6694-6698. Barns, V. & Oliva, 0., 1995. Petromyzontes and Osteichthyes II. Academi~ Prague, p. 215-234 Berg, L. S. , 1949. Fresh-water fishes of Soviet Union and adjacent countties II. Freshw. Fish. U£SR, Guide Fauna USSR No. 29: 467-925. [In Russian] Boron, A., 1994. Karyotypes of diploid and triploid silver crucian carp Carassius auratus gibelio (Bloch). Cytobios 80: 117-124 Collares-Pereira, M.l , Moreira da Costa, L. , 1999. Intraspecific and interspecific genome size variation in Iberian Cyprinidae and the problem of diploidy and polyploidy, with review of genome sizes within the family, Folia zoologica, vol.48 , s. 61-77. 72
Doadrio, I., 2001. Atlas y libro rojo de los peces continentales de Espana, Consejo Superior de Investigaciones Cientificas.CSIC. Ministerio de Medio Ambiente, Madrid s. 165-166 Hensel, K. , 1971. Some notes on Systematic Status of Carassius auratus gibelio (Bloch, 1782) wi~ Further Record ·of this Fish from the Danube River in Czechoslovakia, Vestnik Ceskosloveske Spolecnosti Zoologicke Svazek XXXV-Cislo 3- p.186-198 Holcik, J. & Zitiian, R., 1978. On tlle Expansion and Origin of Carassius auratus in Czechoslovakia, Folia Zoologica 27(3): 279-288 Kalous L. , Bohlen 1., 2002. Problem s taxonomickou identifikaci karase stfibfiteho (Carassius 'gibelio'), Sbornik referatu V. Ceska ichtyologicka konference, Bmo, 25-26.9.2002, 75-80. Kottelat, M., 1997. Biologia Bratislava, Section Zoology, volume 52/supp1.5, p. 52-53 Kumar, S., Tamura, K. , Jakobsen, I.B., Nei, M., 2001. MEGA2: Molecular Evolutionary Genetics Analysis software. Arizona State University, Tempe, Arizona, USA. Lusk, S., Luskovi, v., Halacka, K. , 1998. Karas stiibi'itJ - 25 let od jeho pfirozene introdukce. Sbornik referatu z III. Ceske ichtyologicke konference, Vodiiany Moritz, C., Dowling, T., Brown, W., 1987. Evolution of animal mitochondrial DNA: relevance for population biology and systematics. Ann. Rev . Ecol. Sys., 18,269-292. Nei, M., 1987. Molecular Evolutionary Genetics. Columbia University Press, New York. Olmo, S., 1970. Evolution by gene duplication. Springer-Verlag, NY. Paepke, H.-J., 1999. Bloch's fish collection in the Museum fUr Naturkunde der HlUllboldt Universitat zu Berlin: an illustrated catalog and historical account. Theses Zool. v. 32: 1-216, PIs. 1-32 (unpaginated). PaIumbi, S.R., 1996. Nucleic acids II: the polymerase chain reaction. In: Hillis, D.M., Moritz, C., Mable, B.K (Eds.), Molecular Systematics, second ed. Sinauer, Sunderland, MA. Penaz, M. , Rab, P. , Prokes, M., 1979. Cytological analysis, gynogenesis and early development of Carassius auratus gibelio. Acta Sci. Nat. Bmo, 13(7): 1-33. Popisil, 0. , Hisek, K., Ryby, Edice Voda a Zivot, Ryb:ii', HO. (rok neuveden) Sambrook, J., Fritsch, E .F., Manitais, T., 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, second ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor. Schneider, S., Roessli, D. , Excoffier, L., 2000. Arlequin ver. 2.000: A software for population genetics data analysis. Genetics and Biometry Laboratory, University of Geneva, Switzerland. Szerbowski : in Banarescu, P . M. & H.I Paepke, 2002. The freshwater fishes of Europe. Cyprinidae 2, Part III: Carassius to Cyprinus. Gasterosteidae. The freshwater fishes of Europe. v. 5:3: I-XI, 1-305. Swofford, D.L., 2000. PAUP. Phylogenetic Analysis using Parsimony (and other methods). Version 4. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts. Vasileva, B.D., 1990. Notes about morphologic differences between gynogenetic and bisexual fom1 of Carassius auratus (Cyprinidae, Pisces). Zoologiceskij zurnal, 11,97-110 [In Russian]. Yarrell, W , 1835··36. A history of British fishes, 2 vols. London. vol. l:i-xxxvi + 1-408; vol. 2:1-472 + supplements 1-45 and 1-72. Hist. Brit. Fish. ed. Zhou, L., Wang, Y., Gui, J. F., 2000. Genetic evidence for gonochoristic reproduction in gynogenetic silver cmcian carp (Carassius auratus gibelio Bloch) as revealed by RAPD assays. I Mol. Eve!. , 51: (5) 498506.
ADRESY AUTORU Ing. Lukas Kalous (1;2) e-mail:
[email protected] Mgr. Ventiula Slechtovd (2) e-mail:
[email protected] Dr. Jorg Bohlen (2) e-mail:
[email protected] Dr. Ignacio Doadrio (3) e-mail:
[email protected] (1) katedra zoologie a rybarstvi, Agronomicka fakulta, Ceska zemedelska univerzita v Praze, 16521 Praha () - Suchdol
(2) laborato1' genetiky ryb, Ustav zivoCisne ryziologie a genetiky zivoCichU, Akademie ved CR, 277 21 Libechov (3) Departemento de biodoversidad y biologia evolutiva, Museo nacionaI de ciencias naturales, C/Jose Gutierrez Abascal 2, 280 06 Madrid, Spanelsko
73
