KULIAH 6, Ljt Metoda penelitian 1 KULIAH 5 6, BIOTAN

KULIAH 6, Ljt Metoda penelitian

1

KULIAH 5‐6, BIOTAN

PERANAN UTAMA DARI BIOTA TANAH KACANG‐ KACANGAN

JAGUNG

MIKROSIMBION Jamur mikoriza

Makrofauna – Cacingg – Rayap

Dekomposer e.g. perombak cellulose PENGHASIL zat pemacu tumbuh Nematoda Hama dan penyakit e.g. fungi, invertebrata f i i t b t

Source Swift (2002)


Bakteria pemfiksasi N p

Pentransformasi C&N C&N e.g.methanogens & nitrifiers

2

KESUBURAN TANAH VS KUALITAS TANAH KUALITAS TANAH


3

PENGELOLAAN YANG BAIK

Biodiversity

memberikan keuntungan

Penekanan k Hama dan penyakit

Tambahkan bahan organik Rotasi tanaman Kurangii pengolahan K l h untuk t k menjaga bahan organik tanah

T h sehat Tanah h t

Kurangi pemakaian P ti id & pupuk Pestisida k buatan b t

Biodiversity bawah tanah KULIAH 5‐6, BIOTAN

4

FAKTOR YANG MEMPENGARUHI PERTUMBUHAN DAN PERKEMBANGAN BIOTA TANAH

• • • • • • •

Ciri kimia tanah (pH, unsur hara NPKS…) Temperatur Kadar air A Aerase dan drainase (CO d d i (CO2 dan O d O2) Ketersediaan sumber karbon Cahaya Faktor lainnya diluar faktor tanah Faktor lainnya diluar faktor tanah KULIAH 5‐6, BIOTAN

5

• PREDIKSI PREDIKSI PERANAN DAN AKTIVITAS MIKROBIA PERANAN DAN AKTIVITAS MIKROBIA TANAH SERING MENGGUNAKAN PARAMETER KIMIA TANAH DAN PENAMPAKAN PERTUMBUHAN TANAMAN SEHINGGA TIDAK BISA SECARA MENDALAM MENJELASKAN FENOMENA YANG SESUNGGUHNYA TERJADI DI DALAM TANAH SESUNGGUHNYA TERJADI DI DALAM TANAH • SEHINGGA SERING MENIMBULKAN KERAGUAN DAN KETIDAKYAKINAN


6

• PENJELASAN PENJELASAN MELALUI PENDEKATAN BIOLOGIS MELALUI PENDEKATAN BIOLOGIS MERUPAKAN CARA TERBAIK UNTUK DAPAT MENJELASKAN FENOMENA YANG TERJADI MENJELASKAN FENOMENA YANG TERJADI DALAM TANAH SECARA LEBIH KOMPREHENSIF


7

• Tanaman mensekresikan berbagai g senyawa y organik g yang menciptakan lingkungan yang kaya nutrisi bagi pertumbuhan mikroorganisme • Akibatnya perakaran tanaman dikolonisasi oleh berbagai mikroorganisme tanah • Mikrorganisme yang mengkolonisasi disebut epiphyte i h t (pada ( d permukaan) dan k ) d endophyte d h t (berada (b d dalam sel) • Komunitas mikroorganisme g mempengaruhi p g tanaman baik secara langsung maupun tidak langsung: Komensalisme, Amensalisme, Mutualisme, Patogenik KULIAH 5‐6, BIOTAN

8

Interaksi pada perakaran Interaksi pada perakaran – Rhizoplane – permukaan akar, bulu‐bulu akar memliliki permukaan yang luas ((> 6 m2 rata‐rata untuk tanaman permukaan yang luas ((> 6 m rata rata untuk tanaman gandum). Hanya Only 4 ‐ 10% dari rhizoplane yang berkontak langsung dengan mikroorganisme tanah – Rhizosfir – merupakan daerah dalam tanah yang langsung dipengaruhi oleh akar tanaman (sangat variable). Tanah yang tersisa setelah akar diguncang‐guncang yang tersisa setelah akar diguncang guncang. – Rhizosheath – beberapa tanaman mengekskresikan substansi menyerupai mucous yang merekat partikel‐ partikel tanah disekeliling akar. Sering terlihat pada tanah kering.


9

METODA DAN TEKNIK PENGAMATAN DALAM METODA DAN TEKNIK PENGAMATAN DALAM PENELITIAN BIOLOGI TANAH BIOLOGI TANAH


10

BAGAIMANA PENDEKATANNYA??? BAGAIMANA PENDEKATANNYA??? JIKA TANAH MERUPAKAN SUATU MEDIA YANG JIKA TANAH MERUPAKAN SUATU MEDIA YANG KOMPLEKS ??


11

METODA PENGHITUNGAN POPULASI DAN AKTIVITAS METODA PENGHITUNGAN POPULASI DAN AKTIVITAS MIKROORGANISME TANAH


12

a. Prosedur pengambilan contoh h tanah h • Dapat dilakukan secara komposit, sitematis (proporsional) dan random ( non proporsional) tergantung pada tujuan dan sasaran yang akan dicapai • Kedalaman pengambilan contoh tanah pada kedalam olah (20 Kedalaman pengambilan contoh tanah pada kedalam olah (20 cm) bisa 10 cm jika perakaran padat • Contoh tanah satelit dari profil tanah • Contoh tanah rhizosfir atau rhizoplane atau non rhizosfir C t h t h hi fi t hi l t hi fi • Data keadaan fisik lingkungan perlu dicatat (lereng, vegetasi, altitude, dan latitude, keadaan permukaan tanah) • Contoh tanah diberi label dan disimpan dalam termos pada temperatur 2‐40C atau ‐200C untuk waktu lama


13

RHIZOSFIR

Pseudomonas g corrugata

Pythium sporangium KULIAH 5‐6, BIOTAN

14

b. PENGHITUNGAN POPULASI DAN AKTIVITAS MIKROORGANISME TANAH MIKROORGANISME TANAH Penghitungan dapat dilakukan melalui beberapa cara : 1. Menggunakan kultur media : mikroorganisme tanah diekstrak dari tanah, dilakukan satu seri pengenceran dan kemudiaan dikulturkan pada media agar dalam petri dish. Teknik pengkulturan dapat mengikuti teknik cawan tuang (pour plate), atau (pour plate) atau sebar rata (spread plate). rata (spread plate) Teknik goresan (streak plate) digunakan untuk tujuan tertentu seperti untuk isolasi 2. Tidak menggunakan kultur media : Penghitungan langsung dibawah mikroskop dengan bantuan haemacytometer (dengan pewarnaan acridine atau tidak, penghitungan biomassa terhadap unsur C dan N dengan teknik ekstraksi Chloroform (CFI‐CFE), total protein dan Chloroform (CFI CFE) total protein dan DNA, DNA PCR terhadap gen khusus


15

Table 1. Beberapa metoda yang biasa digunakan dalam mengukur pertumbuhan bakteri Metoda Pengamatan langsung di bawah mikroskop Penghitungan sel hidup (colony counts)

Aplikasi Penghtungan bakteri dalam susu atau sel vaksin Penghitungan e g tu ga ju jumlah a ba bakteri te dalam susu, makanan, tanah, air, dan dalam media kultur di laboratorium, etc.

Keterangan Tidak bisa membedakan antara yang hidup dengan yang mati S Sangat sensitif i if jika jik kondisi k di i pengkulturan berjalan optimal

Pengukuran turbiditas

Perkiraan besaran jumlah bakteri dalam media cair atau transparan (broth)

Cepat dan tidak destruktif , tetapii tidak id k dapat d mendeteksi d ki kepadatan sel kurang dari 107 sel per ml

Pengukuran total N dan protein

Pengukuran total sel yang dihasilkan dari kultur yang sangat padat

Hanya dilakukan untuk penelitian laboratorium

Pengukuran aktivitas biokimia ex. Produksi O2 dan CO2 serta, serta ATP dll. dll

Percobaaan mikrobiologis

Membutuhkan standar pasti yang berhubungan dengan aktivitas kimia terhadap massa sel atau jumlah sel

Pengukuran berat kering dan berat basah dari sel atau volume sel setelah sentrifugasi

Pengukuran total sel dalam media kultur

Kemungkinan pengukuran terhadap total N dan total protein lebih sensitif


16

1. Penghitungan secara tidak langsung (menggunakan media kultur) a. PLATE COUNT (CAWAN TUANG) a. PLATE COUNT (CAWAN TUANG) • Siapkan satu seri pengenceran ( biasanya 104 – 108) • Tuangkan larutan dengan pengenceran tertentu pada petri dish yang terisi media agar yang sesuai yang tumbuh (30 (30‐300) 300) setelah setelah • Hitung jumlah koloni yang tumbuh 7‐14 hari inkubasi. Setiap koloni yang muncul pada petri dish mencerminkan jumlah propagul yang ada


17

METODA PENGHITUNGAN…… EKSTRAKSI DARI TANAH MENGGUNAKAN LARUTAN

PETRI DISH TERISI MEDIA YANG SESUAI


18


19

Seri pengenceran & plating

• Dilakukan agar jumlah bakteri dalam sampel tanah bisa dihitung


20

METODA PENGHITUNGAN

MOST PROBABLE NUMBER (MPN) ( ) • Siapkan serangkaian pengenceran 3 – 105 p g p g • Inokulasikan suspensi dengan pengenceran 10 ke dalam tube yang berisi media yang sesuai • Setelah diinkubasi beberapa hari tube yang memperlihatkan pertumbuhan dilakukan lih tk t b h dil k k penghitungan Gunakan tabel MPN dalam penghitungan populasi • Gunakan tabel MPN dalam penghitungan populasi


21

METODA PENGHITUNGAN

KEUNTUNGAN MPN KEUNTUNGAN MPN • Memungkinkan penghitungan mikrobia spesifik • Isolasi dapat dilakukan dengan tingkat pengenceran rendah d h


22

METODA PENGHITUNGAN

KELEMAHAN MPN KELEMAHAN MPN • Tidak akurat • Membutuhkan b hk media dan di d peralatan l yang cukup banyak


23

Sumber penyebab ketidak akuratan penghitungan populasi dengan kultur media Colony‐‐Forming Unit Colony

Ketika kita mengamat koloni yang tumbuh, kita mengasumsikan koloni itu berasal dari satu sel bakteri. Namun demikian sel yang berpasangan atau sel sewaktu dibiakkan di media saling berdekatan akan memberikan atau membentuk satu koloni. Oleh sebab itu satuan yang digunakan untuk koloni adalah CFU (colony-forming unit= satuan pembentuk koloni-SPK) jika dianggap asal satu koloni dari satu sel. KULIAH 5‐6, BIOTAN 24

Table . Generation times for some common bacteria under optimal conditions of growth. Medium

Generation Time (minutes)

Glucose-salts

17

Bacillus megaterium

Sucrose-salts

25

Streptococcus lactis

Milk

26


Lactose broth

48

Staphylococcus aureus

Heart infusion broth

27-30

Lactobacillus acidophilus

Milk

66-87

Rhizobium japonicum

Mannitol-salts-yeast extract

344 461 344-461

Mycobacterium tuberculosis

Synthetic

792-932

Treponema pallidum

Rabbit testes

1980

Bacterium Escherichia

coli


25

Perhitungan waktu regenerasi G (Waktu regenerasi) = t(waktu, dalam menit atau jam)/jumlah generasi)

Perhitungan: n = logB + nlog2

G = t/n t/ G = waktu regenerasi (waktu untuk membelah diri) t = interval waktu dalam menit atau jam B = jumlah bakteri pada awal suatu interval waktu b = jumlah bakteri di akhir suatu interval waktu n = jumlah generasi (jumlah kali suatu populasi menjadi 2 kali lipat selama interval waktu) b = B x 2n (Persamaan ini menggambarkan pertumbuhan populasi bakteri)

G = t/n


n = logb - logB log2 n = logb - logB .301 n = 33.3 3 logb/B G = t/n Nilai G G= t 3.3 log b/B

26

cells are dividing and doubling in number at regular intervals KULIAH 5‐6, BIOTAN

27

Contoh soal: Jika jumlah populasi bakteri meningkat dari 10.000 sel menjadi 10 000 000 sell dalam 10.000.000 d l waktu kt 4 jam. j Berapakah waktu regenerasi dari bakteri tersebut????? G = t/n


28

membatasi pertumbuhan Makanan dan mungkin saja oksigen sudah sangat b k berkurang

phase

phase

Fase adaptasi m.o

phase


29

Keuntungan jika menggunakan media kultur dalam penghitungan populasi adalah kita bisa berlanjut dengan isolasi dan karakterisasi serta identifikasi terhadap i l bakteri/ jamur isolat b k i/ j yang kita ki isolasi i l i

c. TEKNIK KULTUR DAN ISOLASI MIKROBIOTA TANAH MIKROBIOTA TANAH


30

TEKNIK ISOLASI • Mikrobiota target yang akan diisolasi diekstrak dari tanah dengan g menggunakan gg larutan buffer yang y g disesuaikan (aquadest, atau NaCl) kemudian dibiakkan dalam media spesifik yang sesuai dengan menggunakan kultur teknis seperti pada slide sebelumnya • Isolasi bertujuan untuk mendapatkan isolat yang murni tidak terkontaminasi dengan yang lain. Koloni yang memiliki ciri‐ciri yang memiliki ciri ciri yang jelas yang jelas dan berbeda dengan yang lain diisolasi dan dikultur ulang pada petri dish yang baru yang baru sampai tidak ditemukan kontaminasi dengan yang lain KULIAH 5‐6, BIOTAN

31

Isolation techniques


32

TEKNIK ISOLASI 1. Streak plates (metode gores) Semua koloni tumbuh pada permukaan media agar media agar 2. Dilution and pour plates (Pengenceran dan cawan tuang) tuang)‐ Koloni tumbuh pada bahagiaan dalam dan permukaan agar 3. Spread Plates (Pengenceran dan disebar rata) ‐ Koloni tumbuh di permukaan agar


33

1. Streak plates ( Teknik penggoresan)

Metoda I l i Isolasi terhadap campuran 2 kultur bakteri

Koloni tumbuh di permukaan agar

Koloni warna putih Koloni warna merah KULIAH 5‐6, BIOTAN

34

2. Dilution and pour plates ( Koloni tumbuh di dasar, dalam dan permukaan media agar)

Koloni tumbuh di dasar, dalam dan permukaan media agar KULIAH 5‐6, BIOTAN

35

3. Spread Plates (Sebar rata) Koloni tumbuh di permukaan agar

place 0.1 ‐1 ml of mixed KULIAH 5‐6, BIOTAN culture on surface of agar plate

36

spread over plate

METODA PENGHITUNGAN melalui TEKNIK media kultur

• PLATE COUNT (Cawan ( Tuang) g) Plate count dapat digunakan untuk menghitung populasi bakteria, jamur dan aktinomisetes dengan menggunakan media tumbuh selektif

Group

Media selektif

Bakteri

Media Thornton, Ekstrak tanah

Jamur

Media Martin, Agar masam, Antibiotik

Aktinomisetes

Agar chitin, media Jansens


37

KEUNTUNGAN TEKNIK MEDIA KULTUR • Isolasi Isolasi terhadap mikrobia dapat berlanjut kepada terhadap mikrobia dapat berlanjut kepada proses identifikasi • Karakter biokimia dari setiap koloni dapat langsung p p g g diketahui jika menggunakan media yang sesuai (Contoh : produksi CO2 pada media yang mengandung CaCO3, kelarutan fospat pada media yang ada Ca2HPO4, atau kemampuan hydrolisis pati pada media mengandung pati)


38

PENAMPAKAN KOLONI YANG TUMBUH PADA MEDIA DALAM PETRI DISH ( setiap koloni yang tumbuh dianggap berasal dari satu sel diistilahkan dengan cfu= colony forming unit atau satuan pembentuk koloni))


39


40

KEKURANGAN TEKNIK PLATE COUNT (CAWAN TUANG) KEKURANGAN TEKNIK PLATE COUNT (CAWAN TUANG) • Satu media tidak memungkinkan g tumbuhnya y keseluruhan mikrobia yang ada dalam tanah ( tidak bisa ditumbuhi oleh semua jenis bakteri) • Kondisi inkubasi yang aerobik yang aerobik menyebabkan kelompok anaerobik tidak dapat tumbuh • Ada kesulitan dalam melepaskan mikrobia dari partikel t h menyebabkan tanah b bk tidak tid k semuanya dapat d t terhitung t hit • Produk ekstraselular yang dihasilkan oleh suatu mikrobia pada p p petri dish mungkin g dapat p menghambat g atau memacu pertumbuhan koloni yang lain


41

METODA PENGHITUNGAN populasi l i

2. PENGHITUNGAN LANGSUNG DENGAN MIKROSKOP • • • •

Siapkan serangkaian pengenceran Teteskan suspensi hasil pengenceran pada objek gelas Sebarkan merata pada luasan 1cm2 dan lakukan fiksasi warna Lak kan pewarnaan Lakukan pe arnaan (staining) dengan (staining) dengan menggunakan mengg nakan pewarna pe arna bersifat masam (Acid Fuchsin, Rose bengal, Erythrosin) dan lakukan pengamtan dan penghitungan di bawah mikroskop Dapat juga menggunakan Haemacytometer


42

Ilmu tanah

Sampel dari lapangan, Profil, Lanskap, lingkungan perakaran tanaman Komposit, ulangan, transportasi, pengadukan, subsampling, fraksionasi

Mikroskopis

Mikroskop transmisi, p , elektron atau scanner, fluorescence, probes immunologik

Morfologi, jumlah, biovolume, identitas, fungsi, dan pengaturannya

Analisis Kimia struktur molekul

Asam Nukleat

Analisis fisiologis

Fungsional atau g CFI‐CFE, Lipid, CFI CFE Lipid Plate counts, MPN, Plate counts MPN phospholipid, ergosterol, phylogenetic probes, Biolog, Enzime, gen reporter, PCR, ATP, DNA, %G+C absorbsi ribosomal RNA Thymidine dan

Studi proses

Biotransformasi, penjejakan 2 , N , CH4, CO2, NO3‐, SO42‐ 2 Fraksi Bahan organik tanah

leucine Jumlah, identitas, struktur komunitas

Transfer gen, stabilitas populasi, struktur komunitas komunitas, phylogenetik

Nomenklatur Biokimia, kemampuan fisiologis, karakteristik pertumbuhan

Pertumbuhan dan pengembalian hara, ketersediaan, kualitas biogeokimia lingkungan g g

Aktivitas Biotik, Biomassa dan Keragaman dalam tanah, endapan, air ataupun sampel geologis KULIAH 5‐6, BIOTAN

43

SECARA MIKROSKOPIS SECARA MIKROSKOPIS • PADA PADA PENGHITUNGAN DENGAN MIKROSKOP PENGHITUNGAN DENGAN MIKROSKOP KITA DAPAT MENGHITUNG JUMLAH BAKTERI, SPORA DAN MISELIA SERTA MISELIA SPORA DAN MISELIA, SERTA MISELIA AKTINOMISETES • DENGAN ALAT BANTU HAEMACYTOMETER DENGAN ALAT BANTU HAEMACYTOMETER


44

HAEMACYTOMETER


45

PENGGUNAAN HAEMACYTOMETER


46

1 mm2

1/400 mm2

1/25 mm2


47

HAEMACYTOMETER ((memiliki ruangg antara cover glass dengan g g objek j gglass yang y g disebut volume hitung)

• mudah, murah, dan cepatk • Berguna untuk menghitung baik eukariot maupun eukariot maupun prokariot • Tidak dapat membedakan antara sel hid p antara sel hidup dengan yang mati


Figure 6.12

48

METODA PENGHITUNGAN

KEUNTUNGAN METODA MIKROSKOPIS KEUNTUNGAN METODA MIKROSKOPIS 1 Dapat melihat distribusi biovolume mikro 1. organisme dalam tanah dan hubungannya dengan partikel tanah p 2. Dapat melihat koloni dan morfologi mikrobia dalam tanah dan sebagaimana adanya


49

METODA PENGHITUNGAN

KELEMAHAN METODA MIKROSKOPIS 1. Sulit membedakan antara sel hidup dengan sel mati p bakteri dengan g 2. Sulit membedakan spora aktinomisetes 3. Tidak memungkinkan karakterisasi mikrobia lebih l j t lanjut 4. Sulit menghitung bakteri yang hidup berkoloni 5 Sulit membedakan mikrobia dengan partikel tanah 5.


50


51

METODA PENGHITUNGAN

ALTERNATIF LAIN ALTERNATIF LAIN • Menggunakan pewarna Fluorescent (Acridine orange) untuk membedakan sel hidup dengan orange) untuk membedakan sel hidup dengan yang mati • Pewarna Fluorescent dan antibodi P Fl d ib di (Fluorescent antiserum) untuk mikrobia tetentu dan dapat digunakan pada permukaan d d di k d k tanah KULIAH 5‐6, BIOTAN

52

METODA PENGHITUNGAN POPULASI

3 IDENTIFIKASI IMMUNOLOGI 3. IDENTIFIKASI IMMUNOLOGI • Menggunakan k Polyclonal antibody l l l ib d • Enzyme‐linked immunosorbent assay (ELISA)


53

METODA PENGHITUNGAN

4. Isolasi 4 Isolasi DNA (teknik DNA (teknik biomolekuler) • Sel bakteri diekstrak dari tanah • Kemudian di dilysis dil i dan d DNA yang lepas l diekstrak • Dilakukan Amplifikasi DNA dengan PCR (Polymerase Chain Reaction) • Dilakukan komparasi (pembandingan) dengan segment DNA dari g mikrobia target yang sudah g y g ada dalam DNA bank KULIAH 5‐6, BIOTAN

54

Shaking

Macerating

Vortex

Washing with sterile water or Washing with sterile water or phosphate buffer

centrifuge

Non‐adhering soil


Ultrasonic bath

grinding55

Lolium perenne

Trifolium repens

B lk il Bulk soil

Soil adhering to the root

Washed root (endorhizosphere/rhizoplane)

Purify DNA f Amplify 16S rDNA 16S rDNA cloning 16S rDNA characterized by PCR y restriction analysis OUT measurement Calculate the diversity KULIAH 5‐6, BIOTAN

56 Marilley et al., 1998

DNA PROBES

BIORHIZOSFIR II

57

CHUKA

cahier

de

labo

2/DGGE 2

en

page

81

sens

gauche

vers

droit e

10

11

12

13

Du 06/12/2010 Puits

Sol

1à5

6

7

1Kb+

1Kb+

L DGGE

L

8

9

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

1Kb+ 1648

1649

1652

1653

1654

1657

1660

1661

1664

L

1665

1668

1671

1672

1675

1676

1677

9

10

27

28

29

1Kb+

1Kb+

à 32

L

L DGGE

Bulk

58

59

Identifikasi dengan teknik DGGE (Different Gradient Gel Electrophoresis

100

80

agustian

60

40

20

agustian

sol 10 agustian sol 9 agustian ladder1 agustian ladder2 agustian

9 (1) Band No

9 (1) Position 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44

15 24 37 47 52 71 75 89 97 101 111 116 122 127 133 137 143 149 156 161 168 177 181 197 205 210 215 230 234 241 245 251 263 269 275 282 295 303 313 331 340 350 357 371

9 (1) Band % 1,38 4,61 3,42 1,03 0 87 0,87 3,00 1,70 0,81 4,17 2,37 1,66 1,42 3,13 0,93 1,39 3,65 2,28 0,79 5,02 7 51 7,51 3,58 3,30 2,87 1,72 2,11 1,51 5 94 5,94 1,27 1,82 2,78 0,83 1,91 2,99 2,28 0,42 3,37 1,21 1,13 1,51 1,64 1,35 1 26 1,26 1,11 0,95

9 (1) Rf 0,030 0,053 0,084 0,109 0 121 0,121 0,170 0,181 0,217 0,237 0,247 0,271 0,283 0,297 0,310 0,326 0,336 0,352 0,367 0,385 0 398 0,398 0,416 0,439 0,449 0,490 0,510 0,523 0 535 0,535 0,572 0,582 0,600 0,610 0,624 0,654 0,669 0,684 0,701 0,736 0,757 0,784 0,832 0,856 0 884 0,884 0,902 0,940

10 (2) Band No

10 (2) Position 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

9 13 23 35 44 50 54 70 74 87 96 100 111 115 121 126 132 136 142 148 155 160 167 174 181 196 204 210 213 234 240 244 250 261 268 275 281 294 303 312 331 340 349 358 372

10 (2) Band % 0,68 2,13 5,90 4,70 1 39 1,39 1,04 1,47 1,71 2,97 0,68 3,88 1,69 0,60 3,07 2,72 0,97 1,20 2,84 1,73 1 08 1,08 7,74 7,77 3,57 2,23 1,61 2,18 1 25 1,25 1,72 5,64 1,15 2,51 1,29 1,51 2,79 2,23 0,30 3,95 1,15 0,84 1,54 1,64 0 72 0,72 0,55 0,95 0,73


10 (2) Rf 0,021 0,030 0,054 0,083 0 105 0,105 0,119 0,129 0,169 0,179 0,212 0,235 0,245 0,272 0,282 0,297 0,310 0,326 0,336 0,352 0 367 0,367 0,385 0,398 0,416 0,434 0,453 0,491 0 512 0,512 0,527 0,535 0,587 0,601 0,611 0,626 0,653 0,670 0,687 0,701 0,735 0,759 0,782 0,832 0 857 0,857 0,882 0,906 0,945

62


63

EKSTRAKSI DNA SUDAH DIAJARKAN UNTUK ANAK‐ UNTUK ANAK‐ANAK SEKOLAH DASAR DAN SUDAH SEPERTI MENGAJARKAN RESEP MAKANAN KULIAH 5‐6, BIOTAN

64

METODA PENGHITUNGAN

KELEMAHAN IDENTIFIKASI rDNA KELEMAHAN IDENTIFIKASI rDNA • Ekstraksi DNA dan prosedur purifikasinya sangat melelahkan sangat melelahkan • Kebanyakan sel mikrobia sulit dilysis • Humus dan komponen tanah lainnya sering menjadi penghambat dalam proses ekstraksi


65

Bio 97-Genetics

Recombinant m DNA


©2001-2005 Lee Bardwell 66

Transfer gen dari bakteri tanah yang mengkode pembentukan suatu protein Protein yang terbentuk bersifat toksin dan bisa membunuh serangga tertentu


67

DNA PROBES


68

Identifikasi dengan DNA DNA‐ Sequence Sequence • Rantai pendek dari DNA produk DNA produk amplifikasi (PCR) menggunakan primer spesifik selanjutnya dilakukan sequencing (pembacaan sequencing (pembacaan urutan basa‐basa) dari potongan DNA tersebut Kemudian urutan basa tersebut. Kemudian basa‐basa basa tersebut dilakukan komparasi (pembandingan) dengan data base bakteri yang dimiliki data base bakteri yang dimiliki oleh DNA Bank DNA Bank Data menggunakan software Blastn KULIAH 5‐6, BIOTAN

69

TEKNOLOGI BARU TEST DNA TEKNOLOGI BARU TEST DNA • Affymetrix • “DNA Chip” • Ratusan test dalam Ratusan test dalam waktu yang sama. • Hasil yang diperoleh Hasil yang diperoleh di scan dengan laser dan file bisa dan file bisa disimpan di komputer KULIAH 5‐6, BIOTAN

70


71

Analisis data DNA yang diperoleh dapat Analisis data DNA yang diperoleh dapat dianalisis dengan menggunakan berbagai software gratis seperti Blast yang disediakan software gratis seperti Blast yang disediakan oleh berbagai Bank Data DNA seperti NCBI (USA) EBI (Eropa) dan DDBJ (japan) yang (USA), EBI (Eropa), dan DDBJ (japan) yang dapat diakses lewat internet ke website lembaga tersebut lembaga tersebut


72

USTPO

Commitment to International Collaboration

GenBank

EPO

EMBL

NCBI (USA) Since 1982

EBI (Europe) Since 1980

ーDNA Data Bank of Japanー（DDBJ）

DDBJ DDBJ (Japan) Since 1986 KULIAH 5‐6, BIOTAN

JPO 73


74


75

PENGUKURAN AKTIVITAS MIKROORGANISME PENGUKURAN AKTIVITAS MIKROORGANISME 1. Pengukuran Respirasi g p • Pemakaian O2 • Jumlah CO2 yyang dikeluarkan g 2. Penghitungan Biomassa mikrobia • Fumigasi dengan Chloroform (CHCl3) • Penghitungan ATP (reaksi Luciferase) 3. Pengukuran aktivitas enzimatik • Pengukuran terhadap produk yang dihasilkan atau kehilangan substrat KULIAH 5‐6, BIOTAN

76

1. PENGUKURAN RESPIRASI 1. PENGUKURAN RESPIRASI


77

2. Penghitungan biomassa 2. Penghitungan • •

• •

•

Fumigasi dengan Chloroform (CHCl3) Sampel tanah ditimbang seberat 5 g, kemudian ditambahkan 25 ml chlroform, diinkubasikan selama 24 jam diruang asam (fume hood) sampai seluruh chloroform menguap Choloroform berfungsi dalam melysis dinding sel sehingga sel menjadi hancur Hasil lysis dinding sel diekstrak dengan menggunakan larutan K2SO4, y g g gg , kemudian biomassa mikroorganisme dapat dihitung berdasarkan kandungan N atau C atau P dengan perlakuan tanpa inkubasi chloroform sebagai kontrol Selisih kandungan N, C atau P antara sampel yang diinkubasi khloroform dengan tanpa kholoroform yang dikalikan dengan nilai konstanta merupakan berat biomassa mikroorganisme tanah KULIAH 5‐6, BIOTAN

78

AKTIVITAS ENZIMATIK


79

3. PENGUKURAN AKTIVITAS MIKROORGANISME

PRODUKSI FITOHORMON (AUKSIN CYTOKININ GIBBERELIN ABA DLL PRODUKSI FITOHORMON (AUKSIN, CYTOKININ, GIBBERELIN, ABA DLL KULIAH 5‐6, BIOTAN

80

Activity assays


81

AKTIVITAS BAKTERI PELARUT FOSFAT DARI RHIZOSFIR TITHONIA


82

AKTIVITAS TERHADAP ANTIBIOTIK


83

AKTIVITAS ENZIMATIK

Aktivitas enzimatik dapat dilihat dengan menumbuhkan bakteri atau jamur pada media yang mengandung substrat tertentu KULIAH 5‐6, BIOTAN

84

JUMLAH DAN AKTIVITAS

•

JUMLAH DAN AKTIVITAS MIROBIA

Hal‐hal yang berlaku umum : 1. Menurun dengan kedalaman tanah (C d (Cenderung maksimum pada lapisan atas karena adanya O ki d l i k d O2 dan ketersediaan makanan) 2. Meningkat seiring dengan pertumbuhan tanaman 3. Meningkat bila aerasi, kadar air dan temperatur optimum 4. Meningkat segera setelah pengolahan tanah 5 M i k t b ik d t 5. Meningkat baik pada tanpa ataupun pengolahan terbatas t l h t b t


85

–TERIMAKASIH‐ TERIMAKASIH


86


87

ALAT ELEKTROPHORESIS ALAT ELEKTROPHORESIS

Digunakan untuk pemisahan protein dan visualisasi aktivitas enzimatik pada gel Digunakan untuk pemisahan protein dan visualisasi aktivitas enzimatik pada gel serta karakterisasi sifat fisikokimianya KULIAH 5‐6, BIOTAN

88

Two famous microbiologists pioneered the study of these processes: Sergius Wi Winogradsky d k (1856‐1953) and Martinus Willem Beijerinck (1856 1953) d M ti Will B ij i k (1851‐1931). (1851 1931)


89

KOMPONEN PENYUSUN TANAH


90

JUMLAH DAN AKTIVITAS


91

TANAH DAN LINGKUNGANNYA


92

TANAH DAN LINGKUNGANNYA


93

PROFIL DAN HORIZON TANAH


94

HORIZON TANAH


95

HORIZON TANAH


96

TUGAS • 1. Buatkan resume kuliah ke 1 Buatkan resume kuliah ke‐1 1 dan 2 dan 2 • 2. Tugas dikumpulkan pada kuliah ke‐3


97


98


99

Quantification of Microbes in the Environment Quantification of Microbes in the Environment • Quantification – Culture‐based (limited: 2000 species vs. 13,000 species of bacteria in soil by DNA‐based methods

• Counting colony forming units (CFUs) • Most probable number (MPN) assay M b bl b (MPN) • Activity assays: need cell or biomass count to normalize

– Culture‐independent • Direct Counts Di C – General fluorescent stain, like acridine orange or SYBR gold – Counting cells in FISH assay

• Biomass assays Biomass assays – Quantification of an element like C or N – Chloroform fumigation / incubation or direct extraction – Total protein or DNA


100

Detection of Microbes in the Environment Detection of Microbes in the Environment • Detection – Culture‐based • Enrichment culture, isolation Enrichment culture isolation

– Culture‐independent • Probing – Whole cells (e.g. Fluorescence In Situ Hybridization) – 16S RNA genes

• PCR of specific genes


101

Culture independent approaches p pp (article by Pace)

• Many options once DNA is extracted from the y p sample • Key to probing is that you need a sequence – From cultured or uncultured organism

• Fingerprinting will not necessarily give community composition it iti • Clone library development is time consuming (= $) (= $) • Use the right tool for the job! KULIAH 5‐6, BIOTAN

102

By definition, bacterial growth is cell replication – i.e., growth of the culture. Most species of bacteria replicate by binary fission, where one cell divides into 2 cells, the 2 cells into 4, the 4 into 8, etc. If this cell division occurs at a steady rate – such as when the cells have adequate nutrients and compatible growing conditions – we can plot numbers of cells ll vs. time i such h as on the h graph h at right. Before too long, we will need to extend the paper vertically as the population p p continues to double. For a culture where cells divide every 20 minutes, one cell can result in 16,777,216 (i.e., 224) cells after just 8 ho rs – barring n hours nutrient trient depletion or other growth-altering conditions. KULIAH 5‐6, BIOTAN

103

If we were we e too convert co ve our ou vertical ve c axis to a logarithmic scale – as on the graph at right – we will not need as many sheets of graph paper, and we will find that a steady rate of growth is reflected as a straight line. (On the vertical axis, the same distance on the paper is covered with each doubling.) This type of graph paper is called semilogarithmic graph paper on which we will be plotting our class results. The numbers we plot will fall on the graph at the same place the logarithms of these numbers would fall when plotted on conventional ggraph p p paper. p KULIAH 5‐6, BIOTAN

104

The example at right shows the type of graph we may obtain from our class data. We can plot both colony colony-forming forming units (CFUs) per ml and absorbance on the same graph, remembering that the absorbance units should also be on a logarithmic scale. Rather than "connecting the dots," we draw the best straight line among our CFU/ml plots to represent the phases h off growth th – lag, l exponential, and the start of the maximum stationary phase.


105

Table . Generation times for some common bacteria under optimal conditions of growth.

Medium

Generation Time (minutes)

Glucose salts Glucose-salts

17

Bacillus megaterium

Sucrose-salts

25


Milk

26


Lactose broth

48

Staphylococcus aureus

Heart infusion broth

27-30

Lactobacillus acidophilus

Milk

66-87

Rhizobium japonicum

Mannitol-salts-yeast extract

344-461 344 461

Mycobacterium tuberculosis

Synthetic

792-932

Treponema pallidum

Rabbit testes

1980

Bacterium E h i hi Escherichia

coli


106

Calculation of Generation Time G (generation time) = t(time, in minutes or hours)/n(number of generations) G = t/n G = generation time (time for the cells to divide) t = time interval in hours or minutes B = number of bacteria at the beginning of a time interval b = number b off b bacteria i at the h end d off the time interval n = number of generations (number of ti times th the cell ll population l ti doubles d bl during the time interval) b = B x 2n (This equation is an e pression of gro expression growth th b by binar binary fission)

G = t/n


Solve for n: n = logB + nlog2 n = logb - logB log2 n = logb - logB .301 n = 33.3 3 logb/B G = t/n Solve for G G=

t 3.3 log b/B

107

Example: What is the generation time of a bacterial population that increases from 10,000 cells to 10,000,000 cells in four hours of growth? G=

t 3.3 log b/B

G = 240 minutes 3.3 log 107/104 G = 240 minutes 33x3 3.3 G = 24 minutes KULIAH 5‐6, BIOTAN

108


109


110


111


112


Figure . Schematic diagram of a chemostat, a device for the continuous ti culture lt off bacteria. The chemostat relieves the environmental conditions that restrict growth by continuously supplying nutrients t i t to t cells ll and d removing waste substances and spent cells from the culture medium.113


114


115

By definition, bacterial growth is cell replication – i.e., growth of the culture. Most species of bacteria replicate by binary fission, where one cell divides into 2 cells, the 2 cells into 4, the 4 into 8, etc. If this cell division occurs at a steady rate – such as when the cells have adequate nutrients and compatible growing conditions – we can plot numbers of cells ll vs. time i such h as on the h graph h at right. Before too long, we will need to extend the paper vertically as the population p p continues to double. For a culture where cells divide every 20 minutes, one cell can result in 16,777,216 (i.e., 224) cells after just 8 ho rs – barring n hours nutrient trient depletion or other growth-altering conditions. KULIAH 5‐6, BIOTAN

116

If we were we e too convert co ve our ou vertical ve c axis to a logarithmic scale – as on the graph at right – we will not need as many sheets of graph paper, and we will find that a steady rate of growth is reflected as a straight line. (On the vertical axis, the same distance on the paper is covered with each doubling.) This type of graph paper is called semilogarithmic graph paper on which we will be plotting our class results. The numbers we plot will fall on the graph at the same place the logarithms of these numbers would fall when plotted on conventional ggraph p p paper. p KULIAH 5‐6, BIOTAN

117

The example at right shows the type of graph we may obtain from our class data. We can plot both colony colony-forming forming units (CFUs) per ml and absorbance on the same graph, remembering that the absorbance units should also be on a logarithmic scale. Rather than "connecting the dots," we draw the best straight line among our CFU/ml plots to represent the phases h off growth th – lag, l exponential, and the start of the maximum stationary phase.


118

KULIAH 6, Ljt Metoda penelitian 1 KULIAH 5 6, BIOTAN

Recommend Documents