KONV. Konzorciumvezető: Eszterházy Károly Főiskola

Kutatási terv

Egészségvédő és sportélelmiszerek eredetvédelmének és biztonságának erősítése újonnan kidolgozott analitikai és molekuláris biológiai módszerekkel nyert egyedi paraméterkomplexeket tartalmazó, és új algoritmusokra, illetve információs technológiai megoldásokra épülő adatbázis létrehozásával

TÁMOP-4.2.2.A-11/1/KONV

Konzorciumvezető: Eszterházy Károly Főiskola

2012

1

Tartalom Vezetői összefoglaló ................................................................................................................................ 3 1. kutatási alprojekt A termékazonosítás és az eredetvédelem hatékonyságának növelése, illetve az élelmiszerbiztonsági veszélyek csökkentése neurális hálózatokat, továbbfejlesztett RFID- és Datamátrix technikát alkalmazó on-line informatikai rendszer kidolgozásával...................................... 6 2. Kutatási alprojekt Magas hozzáadott értékű termékek élelmiszerbiztonsági és eredetvédelmi rendszerének bővítése egyedi kémiai paraméterekkel és újonnan kifejlesztett analitikai módszerekkel ............................................................................................................................................................... 18 3. Kutatási alprojekt Eredetvédelmi és élelmiszerbiztonsági paraméterek on-line monitorozásra alkalmas újszerű analitikai eszközök (bioszenzorok) kifejlesztése ........................................................ 34 4. Kutatási alprojekt In vitro élettani modellvizsgálati rendszerek kifejlesztése az élelmiszer komponensek biológiai hasznosulának és esetleges toxikus hatásának jellemzésére, illetve a biztonsági és eredetvédelmi adatbázis bővítésére ............................................................................... 42 5. Kutatási alprojekt Csökkentett allergénhatású, tej alapú új funkcionális élelmiszerek kifejlesztésének megalapozása, illetve az élelmiszerbiztonsági adatbázis bővítése új módszerekkel végrehajtott genomvizsgálatokkal, és fehérjeanalízissel ...................................................................... 52 6. Kutatási alprojekt Vad kecskebúza (Aegilops) génforrásai azonosítására és új vonalak létrehozására irányuló fejlesztések magas hozzáadott értékű termékek eredetvédelmének és biztonságának fokozására ............................................................................................................................................. 63 7. Kutatási alprojekt A kecskebúza (Aegilops) fajok felhasználásával létrejövő élelmiszer-alapanyagok eredetvédelmét biztosító új genetikai módszerek kidolgozása, illetve a beltartalmi tulajdonságok jelzésére is alkalmas genomok, mint adatbázis-paraméterek analízise................................................ 72

2

Vezetői összefoglaló Az élelmiszerek biztonságossága iránti fokozódó elvárás teljesítésének egyik legfontosabb eszköze az adott termékeket érintő valamennyi veszélytényező megbízható azonosítása, illetve a kontaminások precíz analízise által a kockázatok minimalizálása és lehetséges kiiktatása. Ezen cél nyilván a technológiai és logisztikai folyamatok átfogó jellemzése és szoros nyomonkövetése által valósítható meg, ami lehetővé teszi a hibás, kockázatos termékek fogyasztókhoz való eljutásának megakadályozását visszahívás formájában. Napjainkban számos élelmiszerbiztonsági, nyomonkövetési, minőségirányítási rendszer létezik, azonban ezek korántsem egységes, komplex és koherens megközelítésben kezelik a termékazonosítás és az eredetvédelem kérdését. A leglényegesebb kifogás ezen működő rendszerekkel szemben az, hogy az élelmiszerbiztonsági problémák csak egy csekély szegmensének azonosítására, és így elkerülésének elősegítésére alkalmasak, mivel a költséghatékonyság növelése, illetve konkrét előírások hiánya okán kevés célzott kémiai analitikai, mikrobiológiai vagy molekuláris biológiai vizsgálatra épülnek. Ebből adódóan számos veszélytényezőt egyáltalán nem, vagy csak későn, illetve szporadikusan jeleznek. A projektünkben érintett, magas hozzáadott értéket képviselő egészségvédő hatású, illetve sportélelmiszerekre vonatkozóan nem létezik minden igényt kielégítő, korszerű, költséghatékony nyomonkövetési rendszer. A hagyományos termékváltozatokra kidolgozott megoldások ugyanis éppen az értéktöbbletet és biológia előnyöket jelentő egyedi hatóanyagok (pl. megnövelt antioxidáns kapacitás, hozzáadott esszenciális aminosav, zsírsav, vitamin, vagy probiotikus baktérium) mennyiségi és minőségi követését nem tudják kielégíteni. Nincsen működő megoldás ezen összetevőkkel kapcsolatos eseti kockázatok, veszélytényezők feltárására, folyamatos, lehetőleg online követésére sem. A hazai élelmiszeripar számára kitörési pontot jelentenek az egészségvédő hatású, ill. magas hozzáadott értékű funkcionális élelmiszerek. A projektünkben foglalt kutatások jelentőségét fokozza, hogy a termékazonosítás és az eredetvédelem új módszerekkel történő hiteles érvényesítése a fogyasztói bizalom növekedését és ezen keresztül a termékek piaci pozíciójának a javulását eredményezi. A fentiekből következően nagy igény mutatkozik egy olyan komplex, transzparens és megbízható élelmiszerbiztonsági-eredetvédelmi adatbázis rendszerre, melyben a funkcionális és sportélelmiszerekre specifikusan jellemző biztonsági problémákra és a biológiai előnyök tudományos bizonyítására különös hangsúlyt fektetnek. Az általunk kifejlesztett rendszer újonnan kidolgozott paraméterkomplexek, termékazonosítási protokollok és algoritmusok alkalmazására épül. Új informatikai megoldások és eszközök integrálása révén alkalmassá tesszük a rendszert a legfrekventáltabb veszélytényezők korai detektálhatóságára, azok súlyának feltárása, így az élelmiszerbiztonsági problémák megelőzésére, illetve esetleges veszélyhelyzet esetén a gyors termékvisszahívásra a legkorszerűbb közeltéri kommunikáción alapuló lekérdezési lehetőségek kidolgozásával. Új rendszerünk a legkorszerűbb RFID-technikai, Datamátrix, illetve neurális hálózatos megoldásokat alkalmaz a termékazonosításra, valamint a biztonság és az eredet igazolására. Egyedi informatikai megoldásaink, illetve az új biztonsági paramétereket szolgáltató kémiai analitikai és molekuláris biológiai módszerfejlesztéseink számos más termékre, vagy szektorra adaptálhatóak, így alkalmazásuk nagyban kibővíthetőek. Rendszerünk alkalmas lesz a gabona- és tejalapú funkcionális és sportélelmiszerek gyártástechnológiai eljárásainak az aktív komponensekre gyakorolt hatása felmérésére és adatbázisban való megjelenítésére, amire hasonló protokollok egyáltalán nem terjednek ki, pedig a tényleges biológiai hatás jellemzése nélkülözhetetlen e nélkül. A biológiailag aktív anyagok, illetve az élelmiszerszennyezők hatásának, átalakulásainak és mennyiségének jellemzése mellett munkánk során megalapozzuk új, funkcionális és 3

sportélelmiszerek kidolgozását új, egyedi hatóanyag-kombinációk kialakításával és a mátrixhatások, a szinergizmus és a felszívódás mértéke figyelembevételével. Az egyedi hatóanyag-kombinációk, illetve kontaminánsok jellemzéséhez új eljárások kifejlesztése válik szükségessé. Új, specifikus analitikai eszközök, bioszenzorok létrehozásával támogatjuk az eredetvédelmi, illetve élelmiszerbiztonsági adatbázis fejlesztését. Az on-line mérési technikán keresztül gyors, pontos, azonnali és hiteles mérési eredményeket kapunk az adott bioaktív komponensre, az eredetiség megállapítására alkalmas összetevőkre, illetve a legjelentősebb szennyeződésekre. Ebből adódóan nagyban fokozható a tételazonosítás és a biztonsági veszélyek észlelésének a hatékonysága. Funkcionális komponensek (antioxidánsok), kontaminánsok (mikotoxinok) és baktériumok (bifido-, tejsav-, és patogén baktériumok) analízisére fejlesztünk ki bioszenzorokat. Mivel a hatóanyagok a gyártástechnológiai és logisztikai folyamatok során jelentős átalakuláson mehetnek keresztül, illetve a felszívódásuk mértékét sok tényező befolyásolja, modellvizsgálati rendszer kifejlesztésével nyerünk hiteles és tényszerű információkat a funkcionális és a sportélelmiszerek hatóanyagainak tényleges hasznosulása mértékéről, illetőleg a kontaminánsok negatív hatásairól. Ily módon új paraméterekkel gazdagíthatjuk az eredetvédelmi-élelmiszerbiztonsági adatbázist, és ellenőrizhetővé válik az élelmiszerekkel kapcsolatosan tett állítások megbízhatósága. Ezen újszerű paraméterekhez mesterséges emésztési, szövettenyésztési és antioxidáns felvételi modellvizsgálati rendszerek kidolgozása és alkalmazása által jutunk. A tejtermékek biztonságát alapvetően meghatározza az allergén hatású fehérjék jelenléte, mivel nagyszámú tejfehérje-érzékeny fogyasztó azonosítható társadalmunkban. Kiemelkedő jelentőségűek azon kutatásaink, melyek a hazai juh-, és kecskeállomány szelektált egyedei által termelt tejféleségek kazeinjei és savófehérjéi polimorfizmusának feltárását célozzák, mivel így azonosítani tudjuk azon specifikus genotípusú egyedeket, melyek tejei nem allergén tejfehérje-változatokat tartalmaznak. Vizsgálataink eredményeképpen rendelkezésre fognak állni klinikai tesztekkel is igazoltan csökkentett allergénhatású, tej alapú funkcionális élelmiszercsalád alapanyagai, illetve új, eredetvédelmi és biztonsági célokra alkalmazható analitikai és molekuláris biológiai módszerek. A búza eredetvédelme és biztonságának garantálása kiemelkedő jelentőségű, hiszen alapvető élelmiszer alapanyagról van szó. A magas hozzáadott értékű funkcionális gabonaalapú élelmiszerek kifejlesztését új, azonosított eredetű kecskebúza génforrások felderítésével, és speciális előállított vonalak vizsgálatával támogatjuk. A szelektált búzafajták esetében végrehajtjuk a beltartalmi és táplálkozás élettani paramétereinek javítását, illetve stressztűrő képességének fokozását. A munka során feltárjuk és az eredetvédelmi adatbázisban rögzítjük az egyedi gén vonalakat, illetve a fajták azon egyedi beltartalmi és élettani tulajdonságait, melyek lehetővé teszik nagy megbízhatóságú azonosíthatóságukat a későbbi nemesítési folyamat, illetve élelmiszeralapanyag-előállítás során. A kutatási program megvalósításának köszönhetően rendelkezésre fognak állni az Aegilops fajok felhasználásával létrejövő új búzafajtákból készülő termékek eredetazonosítására, és biztonságuk igazolására alkalmas új módszerek és paraméterek. Az eredmények hasznosításával hosszú távon olyan, jelenleg egy fajtában sem létező tulajdonság együttessel bíró új búzafajták születhetnek, melyekkel stratégiai előnyökhöz juthat a hazai funkcionális, ill. sportélelmiszer-gyártás, mivel kiemelkedő funkcionális és beltartalmi paraméterekkel, nagy stabilitással, alacsony allergéntartalommal és jó stessztűréssel jellemezhetőek. Az alábbiakban összefoglaljuk a program során létrehozott eredmények innovatív értékét.

4

A munka újszerűsége és innovatív tartalma Új szerkezetű és új paraméter-komplexeket tartalmazó élelmiszerbiztonságieredetvédelmi adatbázis létrehozása, a legkorszerűbb, közeltéri kommunikáción alapuló lekérdezési lehetőséggel. Új algoritmusok, információs technológiai megoldások, termékazonosítási protokollok kifejlesztése.

RFID-

és Datamátrix

Új kémiai analitikai és molekuláris biológiai eljárások kidolgozása, mely révén új paramétereket kapunk az eredet és az élelmiszerbiztonság igazolására. Az egyedi és új komponensek közötti speciális összefüggések, illetve a bioaktív komponensek gyártás-technológiák során bekövetkező átalakulásai feltárása. Az egyedi élelmiszerek eredetvizsgálatára kidolgozandó ujjlenyomat-rögzítéses módszer kidolgozása. Új hatóanyag kombinációk kialakítása, valamint a mátrixhatás, a szinergizmus, és a hatóanyagok biológiai hasznosulása közötti összefüggése feltárása. Új vagy továbbfejlesztett vizsgálati eljárások, biotechnológiai megoldások jönnek létre az enzimek kinyerése változatos területein. A korábban leírt rendszerekhez nem hasonlatos, új, egyedi műszerkonstrukciójú bioszenzorok kifejlesztése 6 meghatározó fontosságú élelmiszer komponensre. A továbbfejlesztett in vitro biológiai-emésztési és szövettenyésztési kísérleti modellrendszerek létrehozása a komponensek tényleges élettani hatása felmérésére. Életkorspecifikus funkcionális élelmiszer modellvizsgálati rendszereket fejlesztünk ki.

fejlesztéseket

megalapozó,

egyedi

Az antioxidánsok sportélettani hatása és felszívódása felméréséhez új módszereket fejlesztünk ki. Gyors, megbízható, nagy pontosságú módszerek alkalmazására épülő vizsgálati protokoll jön létre, juh- és kecskeállományok tejei fehérjeösszetételének, illetve az egyes egyedek genotípusainak a felmérésére. Új és egyedi adatbázist hozunk létre az alacsony allergenicitású tejet termelő fajtákból és egyedekből. Új, garantált biztonságú kecskebúza génforrások felderítése és azonosítása, melyek jól hasznosíthatóak a búza termésbiztonságának és táplálkozás-élettani tulajdonságainak javítására Az egyedi génforrások beltartalmi jellemzőinek összefüggése stressztényezőktől való függésének növényélettani hátterének feltárása.

abiotikus

Olyan új molekuláris citogenetikai módszerek, illetve kromoszóma specifikus molekuláris markerek jönnek létre, melyek alkalmasak az Aegilops fajok alkalmazásával előállított élelmiszerek azonosítására, eredetvédelmére. Új búza allergének, genomok és vad allélek azonosítása, melyek mind az eredetiség meghatározásában, mind a későbbi nemesítési munka során alkalmazhatóak. Új búza x Aegilops hibridek létrehozása, mely magas beltartalmi értékű, a szokványosnál előnyösebb biológiai hatású élelmiszerek alapanyagaként szolgál.

5

1. kutatási alprojekt A termékazonosítás és az eredetvédelem hatékonyságának növelése, illetve az élelmiszerbiztonsági veszélyek csökkentése neurális hálózatokat, továbbfejlesztett RFID- és Datamátrix technikát alkalmazó on-line informatikai rendszer kidolgozásával Az alprojekt lényege Az élelmiszerek biztonságossága iránti fokozódó elvárás teljesítésének egyik legfontosabb eszköze az adott termékeket érintő valamennyi veszélytényező megbízható azonosítása, illetve a kontaminások precíz analízise által a kockázatok minimalizálása és lehetséges kiiktatása. Ezen cél nyilván az élelmiszerkomponensek, illetve a technológiai és logisztikai folyamatok átfogó jellemzése, valamint a hiteles adatok hatékony lekérdezhetősége által valósítható meg. Így lehetővé téve a hibás, kockázatos termék fogyasztóhoz való eljutásának megakadályozását visszahívás formájában. A hazai élelmiszeripar számára kitörési pontot jelentő egészségvédő hatású élelmiszerekre vonatkozóan vonatkozóan nem létezik minden igényt kielégítő, korszerű, költséghatékony élelmiszerbiztonsági-eredetvédelmi-nyomonkövetési rendszer, így a jelen alprogramban ennek az informatikai alapjait, illetve konkrét megoldásait dolgozzuk ki. Új információs technológiai megoldások, RFID- és Datamátrix termékazonosítási protokollok kifejlesztése által fokozzuk az ellenőrzés hatékonyságát. Újonnan kidolgozott neurális hálózati algoritmusok (intelligens adatfelismerési eljárások) alkalmazásával a rendszer további bővíthetősége lehetőségeit is biztosítjuk.

Az alprojekt során elérendő célok 1. Élelmiszertermékek – célzottan a funkcionális és sportélelmiszerek – eredetazonosítására és az esetleges élelmiszerbiztonsági veszélyek kijelölésére alkalmas, bővíthető adatbázis kidolgozása információs technológiai újításokra támaszkodva. 2. Az új élelmiszerbiztonsági-eredetvédelmi rendszer vállalatirányítási szoftverekkel való kompatibilitásának biztosítása. 3. Kiterjesztett és továbbfejlesztett RFID és Datamátrix -alapú megoldások és új termékazonosítási protokollok létrehozása. 4. A termékekre specifikus, célzott biztonsági és minőségi paraméterek adatbeviteli eszközeinek prototípusa és a működtetéshez használt szoftverek kifejlesztése. 5. Az újonnan kidolgozott neurális hálózati algoritmusok (intelligens adatfelismerési eljárások) alkalmazásával a termékazonosítások és az eredetiség megállapítása hatékonyságának növelése. 6. A funkcionális összetevőként használt bioaktív hatóanyagok átalakulásának, így a biológiai hatás változásának a megjelenítése az eredetvédelmi-termékazonosítási infromatikai rendszerben. 7. Közeltéri kommunikáció nyomonkövetésben való alkalmazhatóságával kapcsolatos innovatív megoldások kidolgozása.

Fő kutatási irányok

6

1. A legfrekventáltabb veszélytényezők és azok súlyának feltárása a korai detektálhatóság, megelőzés és kiiktathatóság biztosítása érdekében. 2. Új paraméterkomplexekre és új algoritmusokra épülő eredetvédelmi adatbázis informatikai eszközeinek létrehozása.

élelmiszerbiztonsági-

3. A legkorszerűbb információs technológiára támaszkodó termékazonosítási protokollok kifejlesztése és az eredetvédelmi adatbázisba való adaptációja. 4. Az RFID-technika termékazonosításra, előállítási folyamatokra, illetve rögzített információk tárolására és feldolgozására való alkalmazhatóságának vizsgálata. 5. A funkcionális összetevőként használt anyagok egyedi jelölési lehetőségeinek vizsgálata, különös tekintettel az RFID technika (smart tagek - okos címkék, passzív/aktív RFID tagek, és szenzor RFID) és Datamátrix alkalmazhatóságának körülményeire. 6. A gabona- és tejalapú funkcionális és sportélelmiszerek gyártásával kapcsolatos technológiai eljárások (elsősorban őrlés, szárítás, pasztőrözés, sütés) aktív komponensekre gyakorolt hatásának megjelenítése az eredetvédelmi adatbázisban. 7. A gyártási körülmények adatbiztonságra gyakorolt hatásának tanulmányozása. 8. Az analitikai és molekuláris biológiai vizsgálatok során kapott egyedi, termékazonosításra alkalmas adatsorok neurális hálózatban való automatikus feldolgozását megalapozó vizsgálatok végzése, a megfelelő hardver és azt működtető szoftvermegoldások kidolgozása. 9. A neurális hálók, illetve RFID-technika és Datamátrix alkalmazásával létrehozott célzott termékazonosítási, élelmiszerbiztonsági rendszerünk bővítése komplex nyomonkövetési modellrendszerré. 10. A funkcionális és sportélelmiszerek élelmiszerbiztonsági nyomonkövetésére és eredetazonosítására alkalmas modellrendszer más termékek körére való kiterjeszthetőségének vizsgálata.

A munka újszerűsége és innovatív tartalma Új algoritmusokra és információs technológiai megoldásokra építve hozunk létre egy innovatív struktúrájú, célzott élelmiszerbiztonsági és eredetvédelmi adatbázist. Új termékazonosítási protokollok kifejlesztése RFID- és Datamátrix technika alkalmazásával, és az eredetvédelmi adatbázisba való adaptációja. A mesterséges neurális hálózatok által nyújtott intelligens felismerési lehetőségeket az élelmiszerek azonosításában és a nyomkövetésben még nem alkalmazták korábban. A funkcionális összetevőként használt bioaktív hatóanyagok egyedi jelölési lehetőségeinek kialakítása jelentős újításnak számít, és hozzájárul ahhoz, hogy a biológiai hatás változásának alakulását nyomon tudjuk követni a teljes élelmis láncon keresztül. Letesszük az alapjait egy komplex élelmiszerbiztonsági-termékazonosítási modellrendszernek, mely kiterjeszthető, illetve bővíthető teljes nyomonkövetési rendszerekké. Az eredményeink széles körű hasznosítása érdekében az élelmiszerbiztonsági paraméterek legkorszerűbb, közeltéri kommunikáción alapuló lekérdezési lehetőségeit értékeljük és dolgozzuk ki.

7

Indokoltság A szokványos termékeknél magasabb hozzáadott értéket képviselő egészségvédő hatású, illetve sportélelmiszerekre vonatkozóan nem létezik minden igényt kielégítő, korszerű, költséghatékony nyomonkövetési rendszer. A hagyományos termékváltozatokra kidolgozott megoldások ugyanis éppen az értéktöbbletet és biológia előnyöket jelentő összetevők, illetve a szennyezők mennyiségi és minőségi követését nem tudják kielégíteni. Ily módon nincsen működő megoldás a funkcionális hatóanyagokkal (pl. antioxidánsok, prebiotikumok, esszenciális aminosavak, zsírsavak, vitaminok, nyomelemek, probiotikus baktériumok) kapcsolatos eseti kockázatok feltárására, folyamatos, lehetőleg on-line követésére sem. Ezen funkcionális összetevőknél pedig különös figyelmet érdemelnek az eredetükkel kapcsolatos veszélytényezők, ill. az egyedi, pozitív biológiai hatás kifejtésében bekövetkező esetleges változások felismerése. A projekt által megcélzott funkcionális és sportélelmiszerek alapvetően gabona- vagy tejalapú termékek, melyeknél további nyomonkövetési problémaként jelentkezik az alapanyag ömlesztett jellege. E tulajdonságuk több nehézséget is jelent a minőség ellenőrzésében és a nyomonkövethetőség biztosításában: -

az egyes tételek csak jelentős költségek árán különíthetőek el egymástól, így jelentős a – legalább részleges – keveredés veszélye,

-

és a különböző eredetű, összetételű gyártási egységek csak költséges laboratóriumi vizsgálattal különböztethetőek meg egymástól.

A jelenlegi eredetvédelmi-nyomonkövetési rendszerek hiányosságai: Az alapanyagokkal kapcsolatos információk kezelésére használt jelenlegi megoldások is többféle gyengeségekkel bírnak, melyek jelentősen csökkentik a funkcionális élelmiszerek biztonságosságának, eredetiségének és magas minőségének garantálhatóságát. -

A legelterjedtebben használt papír alapú bizonylatolási rendszerben jelentősek a hamisítás lehetőségei, és gyakran kétséges a termék alapanyagai földrajzi származása.

-

Az egyedi, pozitív biológiai hatású komponensek analitikai vizsgálatára nem terjednek ki.

-

A kontaminánsoknak csak szűk csoportjait, és azokat is csak eseti alapon vizsgálják.

-

A funkcionális termékek egészségvédő hatásainak a technológiai tényezők hatása következtében előálló módosulásának követésére nem fektettek hangsúlyt, pedig a gyártás, a tárolás és a mátrixhatás következtésben jelentős változások következhetnek be.

-

A fenti okok miatt értelemszerűen hiányoznak a már létező vállalatirányítási rendszerekkel való összekapcsolódás lehetőségei, melyeknek nyilvánvaló szerepe lenne az élelmiszer előállításával kapcsolatos információk egy platformon való kezelésében.

Az élelmiszerbiztonsági-eredetvédelmi-nyomonkövetési rendszerekkel szembeni alapvető elvárások Nyomonkövetési rendszerek működtetését 178./2002. számú EK rendelet 2005. január 1-jétől kötelezően írja elő minden élelmiszergyártás és –forgalmazás területén működő vállalkozás számára. A nyomonkövetés, és így az eredetiség igazolásának technikájára viszont nincs egységes szabályozás, azt minden vállalkozásnak a saját termékének és alkalmazott technológiájának megfelelően kell kidolgoznia. Az ISO 22005:2007 számú, a nyomonkövethetőségre vonatkozó szabványban rögzített területeken kihasználható előnyök az alábbiak:

8

1. 2. 3. 4. 5. 6.

az élelmiszerbiztonsági és –minőségi célok támogatása, az eredetiség hiteles megállapításának leghatékonyabb eszköze, a termék költséghatékony visszavonásának és visszahívásának támogatása, a termékre vonatkozó specifikus információk ellenőrzésének elősegítése, információk eljuttatása az érintett felelősök és a fogyasztók számára, a szervezet hatékonyságának, termelékenységének és gazdaságosságának növelése. A jelen hazai (és EU-s) gyakorlatban alkalmazott rendszerek azonban ezek közül csak a hatósági előírásnak, a visszahívhatóság biztosításának igyekeznek megfelelni. A minőségi célok támogatása, a specifikus információ ellenőrzésének elősegítése, a releváns információk célba juttatása, a gazdasági hatékonyság növelése kimarad a működtetés céljai közül. Az oltalom alatt álló földrajzi árujelzőket automatikusan tovább védi az uniós jog, de 2011 utolsó napjáig termékleírást kell átadni a jogosultak számára. A nemzeti szabályozásban az eredetvédelmet a termékleírás veszi át. Magyarországon is három kategóriába sorolják a termékeket: Földrajzi jelzés nélküli termék. Oltalom alatt álló, földrajzi jelzésű termék. Oltalom alatt álló, eredet megjelölésű termék, mely kizárólag a földrajzi területen, az ott

termett anyagból készül. A kapcsolatnak a földrajzi hellyel alapvetőnek kell lennie, aminek konkrét összetevőit a termékleírás tartalmazza.

Az eredetiségvizsgálat szakmai alapjai és növekvő jelentősége A termékleírásnak való megfelelés ellenőrzése kiemelkedő fontosságú feladat, melynek megoldása során a következő kihívások jelentkeznek: bizonytalan eredetű termékek volumenének növekedése a piacon, a hatósági vizsgálatok körének beszűkülése, a vállalkozások forráshiány miatt igyekeznek a vizsgálatokat minimalizálni, a dokumentációs rendszer sokféleségéből adódó gyenge áttekinthetősége, korszerű nyomonkövetési rendszerek teljes hiánya, a technológiai folyamatok és az adalékolás nem kellően kontrollált volta. a komplex vizsgálatok és egzakt paraméterrendszer hiánya. Élelmiszerbiztonsági tendenciák és elvárások A funkcionális, ill. a sportélelmiszereknek, speciális jellegükből adódóan meg kell felelniük a szokványostól eltérő biztonsági paramétereknek is. Ezen többlet igényeknek az ellenőrzésére, monitorozására azonban nem léteznek megfelelő modellek. Ennek egyik legfontosabb oka az, hogy messze nem kielégítő módon ismerjük az adott élelmiszerféleség gyártása, felhasználása, emésztése során végbemenő, a hatóanyagokat érintő, így az adott termék által ígért biológiai hatásokat befolyásoló folyamatokat. Az általános és a specifikus információk nyomonkövetési célú gyűjtése és kezelése terén az elektronikus rendszerek – és jellemzően a központosított adatkezelést alkalmazó megoldások – felé mutatnak a tendenciák. Az Aberdeen Group 2007-ben az élelmiszerbiztonság alkalmazásában legfejlettebb USA vállalatok körében végzett felmérést, melyből kiderül, hogy az ún. Best-In-Class vállalatoknál kiugróan csekély (36 perc) egy hibás terméktétel azonosításához és visszahívásához szükséges idő, míg az e tekintetben lemaradóknál több, mint 45 óra. A különbségen emberéletek, ill. vállalkozások arculatvesztés miatti tönkremenetele múlhat. A felmérés rámutat arra is, hogy mely, az alábbi táblázatban felsorolt szempontokból tartják fontosnak az elektronikus élelmiszerbizonsági nyomonkövetést a gyártási és a logisztikai láncban. 9

650 vezető USA vállalat válaszadóinak %ában

Motiváció A rossz minőségű élelmiszer és nem megfelelőségből eredő extra költségek csökkentése

49

A termékvisszahívás kockázatának csökkentése

38

Megfelelés a szabályozási előírásoknak (US: nFDA, DOT, DoD, EPA, EU)

38

Minőségrendszerek előírásainak megfelelés ISO

33

Vásárlói-fogyasztói biztoság és elégedettség növelése több eladás

21

A visszahívási idő azon vállalkozásoknál a legrövidebb, melyeknél a lehető legtöbb adat on-line módon, optimális esetben emberi beavatkozás (és manipulációs lehetőség) nélküli adatrögzítésre épül. Eredetvédelmi-nyomonkövetési rendszerek az EU-ban A jelenleg az EU-ban, közösségi támogatásból folytatott kutatási projektek is azt mutatják, hogy nagy űr tátong a gyakorlatban működtetett rendszerek megalapozottságában. EU-s projektek csoportosítása témakör szerint Alapanyag-előállítás (mezőgazdasági termelés), és szállításának nyomonkövetése

A mikrobiális, ill. a GMOszennyezés megakadályozása és követése Élelmiszercsomagoláson elhelyezett tételazonosítók alkalmazása

Tájékoztatási tevékenységek

Tevékenységek Húsok és halak (hűtve vagy fagyasztott állapotában szállítását követik nyomon, két esetben tejelő, vagy húshasznú tehenek takarmányát követik nyomon, valamint egy esetben paradicsomot Az élelmiszer-feldolgozó iparban a szennyezések terjedésének megakadályozására, a veszélyes anyagokra útmutató kidolgozása, előre látható mikróbafertőzés előrejelzése (prediktív) számítással génmódosított anyagot tartalmazó élelmiszert követése Az élelmiszer csomagolásába helyezett chip (tag), üvegbe zárt érzékelők és DNSA alapú jelzőanyagok felhasználása. Munkaértekezletek és konferenciák szervezése az EU-jelölt országok számára, a nyomon követés etikai megközelítése, farmok részvétele, fogyasztókra összpontosító együttműködések országok között, eredetvizsgálatok, marketing eszközök és kutatási partner-kereső rendszer kiépítése

Projektek száma

9

4

3

7

Összességében megállapítható, hogy a 2008 évtől napjainkig pályázatot indított szervezetek nagyon heterogén kutatási témákat vonultattak fel. A primer mezőgazdasági termékek (hal, hús, tej, takarmány) nyomonkövetésének kutatása elsőbbséget élvezett, feldolgozott termékre 10

vonatkozó fejlesztések nem valósultak meg. Az élelmiszer-biztonság területéről a mikrobiológiai, dioxin és GM szennyezők nyomon követése kapott figyelmet az élelmiszerláncban. Összesen három projekt foglalkozott a nyomon követés eszköz-fejlesztésével, gyakorlati alkalmazásokkal. Viszonylag sok (7) projekt célja a módszertan, tapasztalatcsere, felkészítés, marketing. Mesterséges neurális hálózatok kialakítása és alkalmazása A projekt során élelmiszer alapanyagok és termékek azonosításához, osztályozásához fogjuk használni a neurális hálózatot, mely egy viszonylag új, dinamikusan fejlődő terület. A mesterséges neurális hálók az emberi agy modellje szerint működnek és valamelyest az emberi intelligencia ismérveit is mutatják, mégis jól kombinálhatóak hagyományos algoritmusokkal. Működésük lényege, hogy minta feladatokkal (adatsorokkal) képesek tanulni, ahol ismert a bemenetekhez az elvárt eredmény, és a tanulást addig folytatjuk, amíg az elvárt eredményt elég jól megközelítő megoldást nem kapunk. Kiválóan lehet az ilyen típusú neurális hálózatokat alkalmazni olyan esetekben, amikor valahonnan, pl. szenzorokról, mérő berendezésekről folyamatosan vagy gyakran érkeznek adatsorok, amelyekre reagálni szükséges, az adatsorok alapján osztályokba sorolni, esetleg figyelmeztetést adni. A tapasztalat szerint a további hasonló jellegű adatsorokra jó válaszokat tud adni a neurális hálózat. Nagy előnyük a hibatűrés és az általánosító képesség. A fentiek alapján tehát a mesterséges neurális hálózatok rendkívül előnyösen alkalmazhatóak mintafelismerésre, tételosztályozásra és termékazonosításra, így nagyban hozzájárulhatnak az eredetvédelmi-élelmiszerbiztonsági nyomonkövetési rendszerünk hatékony működtetéséhez, és az esetleges kockázatok minimalizálásához. Az RFID- és Datamatrix technika alkalmazhatósága A termékazonosítás rendkívüli jelentőségét, és a legfejlettebb és legmegbízhatóbb technológiai elemek alkalmazásának szükségességét az adja, hogy e nélkül a gyártás során összekeveredhet a kiváló minőségű és az átlagos alapanyag, lehetetlenné válik az egyedi azonosítás, és így a magas hozzáadott értékű termék piaci előnye nem realizálható. Az adatkezelés egyik leggyorsabban fejlődő területe az árura közvetlen rárakható, rádiófrekvenciás adattovábbításra épülő, ún. RFID-tag (címke) használata. Ma már nem csak adattárolásra, hanem akár aktív adatgyűjtésre (pl. hőmérséklet mérésére) is alkalmas címkék is léteznek. Ezeknek a szenzoros címkéknek az alkalmazása azonban számos, ma még tisztázatlan műszaki, természettudományos, ill. adatbiztonsági kérdést felvet, melyek részletes tanulmányozása alapján célszerű az ipari gyakorlat alkalmazható megoldásokat kifejleszteni. Az adatokat célszerű magához az alapanyaghoz, illetve a félkész termékhez kötni, hiszen a gyártás során esetleges korrekciókat ezen adatok alapján tudunk megtenni. Az adatkötés legegyszerűbb és legkorszerűbb módja egy passzív RFID tag elhelyezése a terméken, amely tartalmaz egy egyedi azonosítót (ID) és a vállalat irányítási rendszerben ehhez az azonosítóhoz társítjuk a termék adatait. A másik lehetőség egy olyan aktív RFID tag használata, amely az azonosításon kívül tartalmazza a termék adatait is. Ez utóbbi megoldás előnye, hogy az aktív RFID tag a keletkezéstől a végfelhasználásig vagy még azon túl az újrahasznosításig képes segíteni a döntéseket akár több vállalat esetén is. Ez passzív RFID tag használata esetén csak akkor lenne elképzelhető, ha az egyes vállalatirányítási rendszerek össze lennének kötve. A datamátrix (Data Matrix Code) 2D kódforma, 2 dimenziós adatrögzítési forma, mivel az információ tárolására két egymásra merőleges irány van kihasználva, szemben a vonalkóddal, ahol csak egy irányban tudunk kódolni. A datamátrix elemi cellákból épül fel, hasonlóan a sakktábla fekete és fehér mezőihez. A datamátrixban a cellák mérete megegyezik, az 11

információt a sötét és világos cellák összessége hordozza. A datamátrixokban akár több ezer karakter is eltárolható, ezek lehetnek számjegyek, betűkarakterek és írásjelek is. A kódolt adatmennyiség növekedésével a datamátrixokban lévő cellák mennyisége is változik. A Datamátrix kód lehetővé teszi több mint 2000 karakterből álló tetszőleges információ tárolását néhány négyzetcentiméteres (vagy kisebb) felületen. A Datamátrix jelölés, vagy papír alapú cimkével , vagy megjelölni kívánt tárgyra lézergarvirozással kerül fel. Ennek megfelelően, a kód tartalmazhatja például az RFID-nál alkalmazott (EPCGlobal ID) egyedi azonosítókat, vagy ezek mellet bármilyen más adatot(mérési eredmény) is. A Datamátrix kódok olvasására speciális optikai olvasók, illetve jelenleg szinte az összes okostelefonon elérhető alkalmazások szolgálnak. Üzleti-informatikai fejlesztési tendenciák Ma még sokak számára nem ismert, és ez által nem elfogadott tény, hogy a nyomonkövetési rendszerek bár elsősorban élelmiszerbiztonságot szolgáló eszközök, további minőségi, cégvezetési, üzletpolitikai szempontok is fontos szerepet kell, hogy játszanak a rendszer kialakítása során. Ma már a középvállalkozások sem bízhatnak hosszú távú fennmaradásukban, ha nem kezelik legalább stratégiai célként valamely integrált vállalatirányítási rendszer (ERP) bevezetését és alkalmazását. A jövő innovatív vállalkozásainak ERP iránti elvárása az igen magas fokú rugalmasság, az akár heteken belül való jelentős változás támogatása. A közel jövő okos rendszerei kell, hogy képesek legyen helyet adni a gyártók, viszonteladók és vevők közötti kapcsolatok erősödésének, az ún. tudásmenedzsmentnek, így akár közösen részt véve az innovációban. Az ügyfelek ma már megkövetelik, hogy ne több, egymással esetleg nem is kompatibilis szoftvert kelljen akár külön gépeken is üzemeltetni. Vagyis minden külön alkalmazás elérhető legyen az integrált rendszeren keresztül. Ennek megfelelően a projektben létrejövő informatikai megoldások kapcsán szem előtt tartjuk a nagy vállalatirányítási rendszerekhez való illeszthetőséget.

Hazai előzmények A hazai felsőoktatási intézmények közül több is (Budapesti Corvinus Egyetem, Szent István Egyetem, Nyugat-Magyarországi Egyetem, Debreceni Egyetem) foglalkozott az élelmiszerbiztonsági célú nyomonkövetés, ill. eredetazonosítás valamely aspektusával. A kutatások fő iránya a számosállat-tenyésztéssel és az abból történő állatitermék-előállítással volt kapcsolatos, illetve az élelmiszerbiztonsági paraméterek vizsgálhatóságával és nyomonkövetési rendszerekbe történő integrálhatóságával. Az ipari áruk nyomonkövetésének biztosítására több hazai informatikai cég nyújt konkrét, az adott vállalat igényeinek megfelelően egyedileg kidolgozott szolgáltatást, általában több más, vállalatirányítással kapcsolatos informatikai támogatással csomagban. Azonban ezeknek alapvető hátránya, hogy a különböző cégek által kifejlesztett és működtetett rendszerek egymással nem kompatibilisek, így a teljes láncon keresztül való követhetőség biztosítása az optimálisan sokkal hosszabb időt igényel. Az egységes informatikai megoldás nemzetközileg is leginkább elfogadott megoldását az EPC globális szabványok jelentik, melynek hazai jogtulajdonosa és alkalmazója a GS1 Magyarország Kft.. A vonalkód formájában a termékkel együttmozgó nyomonkövetési adatmennyiséget nagymértékben növeli a Datamatrix kód alkalmazása, melynek fejlesztésében vezető szerepet visz a Konzorcia Kft. Elektronikus adatkezelési megoldásokat is dolgozott ki ez a vállalat: rádiófrekvenciás azonosításra épülő (RFID alapú) követési rendszereknél hatékonyan biztosítható, hogy a termék mozgása során keletkező információk automatikusan rögzítésre kerüljenek a rajta elhelyezett, postabélyeg méretű chipen. 12

Konzorciumi előzmények Az egri Eszterházy Károly Főiskolán 2006-2009 között folyó Pázmány Péter Program keretébe létrehozott Regionális Egyetemi Tudásközpont munkatársai kidolgoztak egy univerzális adatbázisra épülő élelmiszerbiztonsági nyomonkövetési rendszer prototípusát. Az adatbázisrendszer lehetővé teszi, hogy számos felhasználó élelmiszergyártó cég egymástól lényeges eltérő jellegű, nagyszámú termékei ugyanazon rendszerben, költségtakarékosan nyomonkövethetőek legyenek. Központi adattárházban, az intézmény területén lévő szerveren történik az élelmiszergyártóknak az adott termékkel kapcsolatos, nyomonkövetési szempontból releváns adatainak gyűjtése és kezelése. Tizenegy jegyű számból álló egyedi termékazonosító biztosítja azt, hogy a termékek tételei nagy biztonsággal azonosíthatóak, paraméterei lekérdezhetőek legyenek.

Részlépések és alkalmazott módszerek 1.1. Gabona- és a tejalapú funkcionális és a sportélelmiszerek gyártási folyamatainak azonosítását és célzott élelmiszerbiztonsági nyomonkövetését támogató informatikai rendszer alapjainak kidolgozása A részfeladat célja Olyan új struktúrájú adatbázis, illetve annak alkalmazásához kapcsolódó adatfeldolgozási és lekérdezési protokollok kialakítása, melyek révén az egyedi termékek azonosítása és a biztonsági veszélyek kimutatása nagy megbízhatósággal végrehajtható. Részlépések

1.1.1. A funkcionalitás célzott követésére alkalmas adatbázisrendszer kialakítása o A megcélzott funkcionális és sportélelmiszerekre vonatkozó FMEA eljárás módszertanának kidolgozása o A vizsgált termékeknél kritikus specifikus veszélytényezők azonosítása és értékelése a célzott FMEA elvégzésével o Az adott paraméterek szenzoros és műszeres adatgyűjtésére és –továbbítására alkalmas (érintőképernyős, vonalkódolvasó, RFID, közeltéri kommunikációs) eszközök elvi lehetőségeinek összevetése, fejlesztési irányok megállapítása, az egyes élelmiszerláncok követelményeinek megfelelő eszközök prototípusainak kifejlesztése

1.1.2. Univerzális adatbeviteli protokoll elméleti alapjainak és alkalmazásainak kidolgozása o Adatbeviteli protokollok összehasonlító értékelése az élelmiszergyártás és – forgalmazás teljes vertikumában univerzálisan való alkalmazhatóság szempontjából o A követelményeknek megfelelő, új(szerű) adatbeviteli eljárás kidolgozása o Adatkommunikációs átjárók (gateway) funkcionális fejlesztése o Élelmiszerbiztonsági adatok gyűjtésére, feldolgozására, megjelenítésére alkalmas alkalmazási réteg funkcionális fejlesztése o Autentikációs és biztonsági elemek beépítése

13

1.1.3. A termék azonosításához, eredetvédelméhez és biztonságának garantálásához szükséges paraméter komplexek mérésében résztvevő analizátorok adatainak feldolgozása és integrálása az adatbázisban. o Bioszenzorok on-line adatgyűjtésre való alkalmazhatóságának informatikai vizsgálata o A kifejlesztett rendszermodell adatátviteli követelményeinek és a 3. kutatási programban kidolgozott bioszenzorok adatrögzítési megoldásainak összehangolása. o A szenzorprototípusok adatátviteli rendszerének tesztelése nyomonkövetési modell környezetben; a hatékonyságot befolyásoló tényezők értékelése. o mérőegységek kommunikációs követelményeinek elemzése, o optimális kommunikáció kialakítása.

1.1.4. Romlékony (tej alapú) élelmiszerek tartósságának vizsgálata a tárolás során mért hőmérsékletek alapján o Hőmérséklet mérésre alkalmas RFID tag-ek kiválasztása o Rizikót jelentő hőmérsékleti adatok bemérése o Riasztás, ha a tárolás során adott ideig túllép a hőmérséklet egy adott (előző pontban kimért) értéket

1.1.5. Egyedi azonosítók rögzítése ún. esemény-adatbázisban o Adatstruktúra kialkaítása: fix pontok azonosítása, bővítési pontok kijelölése. o adat beviteli felület (data-capturing interface) és adatlekérdezési felület (queryinterface) kialakítása. o Esemény-adatbázis kialakítása, mely rugalmas esemény ábrázolást/modellezést tesz lehetővé , illetve támogatja az eseményekhez kapcsolódó mérések kezelését. o Az esemény-adatbázis bővítése grafikai felülettel és szabály felülettel, melyek lehetővé teszik az esemény adatok térképen történő megjelenítését, illetve validálását. A részfeladat várható újdonságtartalma A létrehozott élelmiszerbiztonsági adatbázis számos technikai újítás alkalmazására épül, egyedi szerkezetű, illetve nagyon speciális megközelítések találhatók benne tartalmi, élelmiszerbiztonsági, valamint lekérdezhetőségi szempontokból is. 1.2. Mesterséges neurális hálózatok kifejlesztése termékazonosítás és az élelmiszerbiztonság növelése céljából A részfeladat célja Mesterséges neurális hálózatok alkalmazása mintafelismerésre, eredetvizsgálatra termékazonosításra, így az élelmiszerbiztonsági veszélyek és hamisítások korai felismerése.

és

Részlépések

1.2.1. Az élelmiszeriparban, mezőgazdaságban alkalmazható szenzorok által szolgáltatott adatokra használható neurális hálózatok megismerése, osztályozása, jellemzése. 14

1.2.2. A Kohonen Self Organized Map neurális hálózat alkalmazhatóságának vizsgálata. 1.2.3. Entitások klaszterezése, az egymáshoz közeli tulajdonságú termékek azonosítása. 1.2.4. A háló által elkészített két vagy háromdimenziós ábrázolásból adódó összefüggések nyerése. 1.2.5. Hardver eszközök alkalmazási lehetőségeinek felmérése a neurális hálózatok teljesítményének javítására. 1.2.6.

A neurális hálózati algoritmusok termékazonosítások validálása.

alkalmazásával

végrehajtott

A részfeladat újdonságtartalma Az élelmiszerparaméterekre a mienkhez hasonló, intelligens adatfelismerésre alkalmas rendszert még nem hoztak létre, mely hozzájárulhat az eredetvédelmi-élelmiszerbiztonsági nyomonkövetés hatékony működtetéséhez, és az esetleges kockázatok minimalizálásához. 1.3. RFID és Datamátrix alapú adatrögzítés eszközeinek fejlesztése egyedi élelmiszeripari felhasználásokra, adatbázis fejlesztéshez, termékazonosításhoz, veszély azonosításra és eredetvédelmi célokra. A részfeladat célja Új termékazonosítási protokollok kifejlesztése a komplex élelmiszerbiztonsági-eredetvédelmi rendszerünkben történő alkalmazásra Részlépések

1.3.1. Szenzor RFID technológia lehetséges nyomonkövetési alkalmazásának feltárása. o Az elérhető szenzor tag-ek alkalmazási lehetőségeinek és korlátainak felmérése o RFID és szenzor RFID alapú AIDC technológiák feltérképezése. o Az Auto-ID Labs által kidolgozott nyílt forrású Fosstrak programcsomagjának használata.(pl. Konzorcia által fejlesztett KEP is ezen alapul). o Alkalmazandó adatkommunikációs protokollok és integrációs, valamint üzenet szabványok elemzése. o Termékpálya specifikus megoldások kidolgozása.

1.3.2. Anyag eredetének és mozgatásának követése o GPS-kordináták autentikált, RFID technikájú rögzítési lehetőségeinek feltárása. o Az adatrögzítés (tag írása) és a rendszerben való tárolás szoftveres hátterének kidolgozása. o Az RFID alkalmazás hardveres feltételeinek nyomonkövetési célú optimalizálása.

1.3.3. Datamátrix alapú követési rendszerek o RFID és Datamátrix technika összehasonlítása élelmiszer nyomonkövetési szempontból : előnyök, hátrányok, semleges területek azonosítása. o Olyan rendszer alapjainak kidolgozása, mely egyaránt képes RFID és Datamátrix kódoláson alapuló egyedi azonosítók követésére. 15

A részfeladat újdonságtartalma Új, speciális adatok tárolására, gyűjtésére és továbbítására képes aktív RFID tag-ek, illetve egyedi Datamátrix kódok kifejlesztése, melyek alkalmasak az adatbázisban való célzott alkalmazásra. 1.4. A vizsgált termékek specifikus biztonsági és minőségi paramétereinek kezelésére kifejlesztett informatikai rendszer más termékpályákra való kiterjeszthetőségének előkészítése A részfeladat célja Komplex élelmiszerbiztonsági-termékazonosítási modellrendszer alapjainak a létrehozása Részlépések

1.4.1. A rendszer egy vagy több különböző szintű integrált vállalatirányítási rendszerhez való illesztéséhez szükséges lépések kidolgozása. 1.4.2. A kiválasztott ERP-hez szolgáltatásalapú architektúra elemévé való fejlesztés lehetőségeinek tanulmányozása. 1.4.3. A rendszer adatbázisában megvalósítható speciális, pl. üzleti intelligencia célú lekérdezési megoldások kidolgozása, egyszerűsített kezelő felületen való megjelenítése. 1.4.4. Bővítési protokoll kidolgozása. A részfeladat újdonságtartalma Az egyedi rendszerünk további bővítése, illetőleg más termékekre való alkalmazása csakis számos információtechnológiai elem továbbfejlesztése révén érhető el. 1.6. Az élelmiszerbiztonsági paraméterek legkorszerűbb lekérdezési lehetőségei elvi alapjainak kidolgozása A részfeladat célja: Az új adatbázis, illetve biztonsági-eredetvédelmi rendszer hatékonyságának és megbízhatóságának növelése az adatlekérdezésre alkalmazható legmegfelelőbb műszaki megoldások kifejlesztése révén. Részlépések:

1.6.1. Mobiltelefonok közeltéri kommunikációs lekérdezésben való alkalmazási lehetőségeinek megalapozása. 1.6.2. Off-line adatátvitel lehetőségeinek felmérése mérőműszerek és az adattárház között. 1.6.3. Kereskedelmi szintű alkalmazás fejlesztési tervének kidolgozása. A részfeladat újdonságtartalma a legkorszerűbb, közeltéri kommunikáción alapuló lekérdezési lehetőségek élelmiszerbiztonsági és eredetvédelmi paraméterekre való célzott alkalmazási módjait még nem dolgozták ki korábban.

16

Az alprojekt várható eredményeinek hasznosítása Hosszú távú hasznosítás Széles körben elterjeszthető, a nagyvállalatok igényeit is kielégítő eredetvédelmitermékazonosítási-nyomonkövetési rendszer fejleszthető ki a programban kidolgozott elvi megoldásokra építve. Az új informatikai eszközök és protokollok számos vállalati szegmensben alkalmazást nyerhetnek a minőségirányítási rendszer részeként a biztonsági veszélyek kizárására. Az élelmiszergyártási gyakorlatban széles körben alkalmazható, sorozatgyártásra kész eszközök fejleszthetők ki a létrehozott prototípusok alapján. Tudományos alkalmazhatóság A létrehozott élelmiszerbiztonsági adatbázis sokrétűen alkalmazható akár az orvosbiológiai vagy a hatósági gyakorlatban is. Korszerű, költséghatékony nyomonkövetési megoldások és közeltéri kommunikáció feltárt lehetőségei nemcsak a projekt tárgyát képező élelmiszerek körében, hanem számos más szektorban is alkalmazhatóak az élelmiszerbiztonság garantált igazolására. Összefüggés a projekt más kutatási programjaival A rendszer a 2. kutatási alprogram során kifejlesztett eredetvédelmi és nyomonkövetési laboratóriumi módszerfejlesztésekre épül, az ott felállított paraméterkomplexet alkalmazza, kiterjed azok on-line módon való rögzítésére. A 3. kutatási program alkalmazza a jelen kutatási program által megfogalmazott adatátviteli követelményeket. A 3. kutatási program során kifejlesztett hordozható bioszenzor megoldásokkal való integrálás adatátviteli és –rögzítési követelményeinek figyelembe vételével történnek az RFID fejlesztések. A 4. kutatási program során megállapított, a funkcionális és sportélelmiszerekre specifikus technológiai körülmények figyelembe vételével történik a hardver eszközök architektúrájának kialakítása. Az egyedi eredetvédelmi-nyomonkövetési elvárások integrálásra kerülnek e kutatási programban.

17

2. Kutatási alprojekt Magas hozzáadott értékű termékek élelmiszerbiztonsági és eredetvédelmi rendszerének bővítése egyedi kémiai paraméterekkel és újonnan kifejlesztett analitikai módszerekkel Az alprojekt lényege Az élelmiszergyártók alapvető érdeke, hogy kielégítsék a nagy hozzáadott értéket képviselő termékek fogyasztóinak az élelmiszer biztonsága és kiemelt minősége iránti elvárását. A rendelkezésre álló jelen módszerek azonban csak korlátozottan képesek megfelelni annak az elvárásnak, hogy a tételazonosítással egy időben az adott termék funkcionalitását jelentő összetevő(k)re, valamint az előforduló szennyeződésekre vonatkozóan is megbízható tájékoztatást adjanak a gyártók, a forgalmazók és a fogyasztók számára. Ennek megalapozására újszerű paraméter komplexet, illetve az egyedi és új komponensek közötti speciális összefüggésekre épülő új adatbázist alakítunk ki a hazai élelmiszeripar számára kitörési pontot jelentő egészségvédő hatású, ill. a sportélelmiszerek körében. A termékazonosítás és az eredetvédelem új módszerekkel történő hiteles érvényesítése a fogyasztói bizalom növekedését és ezen keresztül a termékek piaci pozíciójának a javulását eredményezi. Az új, egyedi hatóanyag-kombinációk, melyeket a mátrixhatások, a szinergizmus és a felszívódás mértéke figyelembevételével alakítottunk ki, új, egészségvédő hatású, és garantált biztonságú élelmiszer prototípusok kidolgozását alapozza meg.

Az alprojekt során elérendő célok 1. Olyan specifikus, és egyedi paraméterekkel (analitikai adatokkal) kibővített eredetvédelmi adatbázis álljon rendelkezésre, mely alkalmas a magas hozzáadott értékű (egyedi hatóanyag-összetételű) termékek azonosítására, illetve a főbb élelmiszerbiztonsági veszélytényezők kimutatására. 2. A legfrekventáltabb élelmiszerbiztonsági veszélytényezők azonosítását követően (1. alprojekt) új kémiai módszereket fejlesztünk ki azok egymás melletti érzékeny analízisére, figyelembe véve az egyidejűleg jelen levő kontaminánsok és komponensek szerepét. 3. Nagyobb biztonságú, új élelmiszerek előállítása váljon lehetővé annak révén, hogy feltárjuk a legjelentősebb kontaminánsok közti lehetséges kölcsönhatásokat és az azokat befolyásoló technológiai tényezők szerepét. 4. Rendelkezésre álljon az egyedi tejféleségek zsírsav-összetételének átfogó elemzésére és értékelésére alkalmas újszerű módszertani megközelítés. 5. Az alacsony allergenicitású tejfehérje-változatok sorozatvizsgálatára célirányosan kifejlesztett specifikus analitikai módszerek kerüljenek kifejlesztésre. 6. A funkcionális, ill. a sportélelmiszerekben jellemzően előforduló, ill. specifikusan alkalmazott bioaktív anyagok mennyiségét nagyban meghatározó mátrix-hatások és gyártási-technológia hatások értékelése a tényleges biológiai hatás értékelése céljából. 7. A pozitív élettani hatású anyagok között feltárt kölcsönhatások révén megalapozzuk a funkcionalitást legmegbízhatóbban nyújtani képes termékek kifejlesztését, illetve hitelesen jellemezzük a ténylegesen gyakorolt pozitív fiziológiai hatásokat. 8. Nagy pontosságú műszeres mérésekkel történjen meg az újonnan kifejlesztett bioszenzorok mérési paramétereinek validálása (lsd. III. alprojekt).

18

Fő kutatási irányok 1. Az eredetiség megállapítását és a tételazonosítást elősegítő egyedi paraméterkomplex kialakítása 2. Egyedi tejféleségek speciális zsírsavösszetételének átfogó analízise termékazonosítás céljából. 3. Újszerű peptidelválasztási és azonosítási módszerek kifejlesztése, különös tekintettel a eltérő fajok tejeinek azonosítására a fehérje összetétel alapján. 4. Pozitív élettani hatású, egyedi hatóanyag-kombinációk kifejlesztése az alkotók egyedi alapsajátosságainak és a technológiai folyamatok hatására bekövetkező átalakulásaik figyelembevételével. Egyedi antioxidánsok, antocianinok, esszenciális zsírsavak, aminosavak, prebiotikumok, terpenoidok vizsgálata és kombinálása. 5. Bioszenzorok validálása az alábbi vegyületcsoportokra: mikotoxinok, polifenolok, specifikus antioxidáns csoportok. 6. A legfontosabb élelmiszerkontaminánsok és funkcionális komponensek potenciális szinergista hatásának tanulmányozása: egymással és az élelmiszermátrixszal való kölcsönhatások feltárása, egymás reakciókészségének és stabilitásának befolyásolása, a kölcsönhatások felszívódásra gyakorolt hatása, a legjelentősebb mikotoxinokból, fémionokból és hatóanyagokból álló modellrendszerek vizsgálata.

A munka újszerűsége és innovatív tartalma Olyan adatbázis, vizsgálati protokoll és összehasonlító algoritmus együttesének kialakítása képezi az alprojekt alapját, melyek az eddigiektől eltérő módon adnak lehetőséget ismert tételek azonosítására, valamint ismeretlen tételek származási helyének felderítésére. A fenti eredetvédelmi adatbázis számos analitikai módszertani újításra és új paraméter-kombinációk alkalmazására épül. Az egyedi élelmiszerek eredetvizsgálatára kidolgozandó ujjlenyomat-rögzítéses módszer az eddigieknél olcsóbb, gyorsabb, és autentikus következtetések levonására alkalmas eljárás, mivel optimált számú paraméter vizsgálatára épül. Az eddigiektől eltérő struktúrájú és tartalmú és komplexitású adatmátrixot alakítunk ki, mely a folyamatos bővíthetősége által lehetővé teszi az egyre pontosabb tételazonosítást. A modell továbbfejlesztése és elterjesztése új és jelentős hozzájárulást jelent az élelmiszeripari szektor transzparenciájának növeléséhez, a hitelesség és a fogyasztói bizalom fokozásához, és így a magyar élelmiszerek versenyképessége növeléséhez. A vizsgálataink eredményei alapján képesek leszünk élelmiszerbiztonsági kockázatok és technológiai hibák kijavítására.

a

gyanítható

Indokoltság A kutatási program a funkcionális és a sportélelmiszerekkel kapcsolatos, ill. az élelmiszerbiztonság növelése irányában megfigyelhető korszerű tendenciáknak megfelelően azt célozza meg, hogy az egészséges élelmiszerek hazai gyártói olyan élelmiszereket tudjanak 19

kifejleszteni (később kereskedelmi forgalomba hozni), melyek garantált biztonságúak, illetve az egyedi és magas hozzáadott értékük egyértelműen bizonyítható, így későbbi piacképességük jelentős. Ezt egy célirányosan fejlesztett, kibővített adatbázis és új termékazonosítási módszerek létrehozásával lehet megvalósítani. Az alábbiakban azokat a szempontokat mutatjuk be röviden, melyek alátámasztják a téma aktualitását, a hazai akadémiai és gazdasági környezet számára való kiemelt jelentőségét. A téma aktualitása Az egészségmegőrzés, ill. a sportteljesítmény fokozása iránt növekvő igény egyre több hozzáadott bioaktív összetevőből álló termék kifejlesztését indítja el. A funkcionális és a sportélelmiszerek iránti, a szokványos változatokénál nagyobb minőségi elvárások kielégítésére nincsenek felkészülve a gyártók, a kereskedők, de a mérési-szolgáltatást végző laboratóriumok sem. Az élelmiszer komponensek kémiai szerkezet és élettani hatás szempontjából való változatossága a belőlük előállítható termékek sokféleségével együtt gyakorlatilag kezelhetetlen helyzetet teremtenek a jelenlegi élelmiszerbiztonsági megközelítés számára. A magas hozzáadott értékű, a szokványost meghaladó minőségű termékekkel kapcsolatos alapvető fogyasztói elvárásnak része az élettani hatás garantált érvényesülése mellett a magasabb biztonságosságra vonatkozó igény is. Azonban korábban szinte kizárólag csak a tiszta bioaktív komponensek vonatkozásában végeztek hatásvizsgálatokat, arra kevésé terjedtek ki a tanulmányok, hogy ezen anyagok együttesen előfordulva hogyan befolyásolhatják egymás stabilitását, kiválthatnak-e egyes reakciókat és ennek alapján várható-e változás az élettani hatásukban. Ezek a vizsgálatok várhatóan nagyban befolyásolják számos pozitív, ill. negatív hatású anyag tényleges biológiai aktivitásáról jelenleg kialakul képet, így az ezekre épülő termékek biztonságát és fiziológiai hatását felül kell vizsgálni. A gabona és a tej, mint alapanyag, ill. hatóanyagforrás számos fizikai, kémiai és biológiai veszélytényezőnek van kitéve, melyek kiiktatására tett erőfeszítések ellenére sem ritkulnak a velük kapcsolatos élelmiszerbiztonsági kifogások. Jól bizonyítja ezt, hogy egyre növekvő számban jelennek meg e termékeket közvetlenül vagy közvetve érintő élelmiszerbiztonsági veszélyhelyzetek az EU gyorsriasztási rendszerében (RASFF). A 2010. évre vonatkozóan az alábbi lényegi elemek emelhetők ki a RASFF-összefoglalóból. 2010-ben 3358 eredeti jelentést fogadott a brüsszeli RASFF iroda, mely az előző évhez képest 2,3%-os növekedést mutatott: ebből 592 bizonyult több tagországra kiterjedő riasztásnak. A legnagyobb hatást kiváltó esemény a Németországban nagy nyilvánosságot kapott dioxin-szennyezés volt, mely több ezer állattenyésztő telepet, vágóhidat és húsfeldolgozó üzemet érintett. A korábbi évekhez hasonlóan a legtöbb bejelentés a penészgombák által befertőzött gabonafélék és olajos magvakban talált mikotoxinra érkezett, mely 679 eseménnyel volt kapcsolatos, többségüket az EU határállomásain jelentkező szállítmányokban regisztrálták. Funkcionális és sportélelmiszerekben használt adalékok között Kínából származó, dioxinnal szennyezett A-vitamin palmitát, Ukrajnából származó kalcium-jodát, Izraelből származó réz-karbonát és Egyiptomból szállított szárított bazsalikom akadt fenn az ellenőrzés hálóján. A problémák fenti körét tükrözi a projektünk szakmai felépítése, hiszen az élelmiszeranalitikai vizsgálatok körében jelentős szerephez jutnak a mikotoxin-vizsgálatok is.

20

Nemzetközi előzmények Az eredetvédelem jogszabályi háttere Az utóbbi évek tapasztalatai alapján elmondható, hogy az Európai Unióban és ennek részeként Magyarországon működő eredetvédelmi rendszer a rendszeres analitikai vizsgálatok új megközelítése és új termékazonosítási paraméterek bevezetése nélkül nem alkalmas a csalások kiküszöbölésére. Az EU 2000-ben megjelent Fehér Könyvében (COM/1999/719) megfogalmazott elvnek megfelelően, a „termőhelytől a tányérig” („from farm to fork”) koncepció megvalósítása adna átfogó és megbízható információt az élelmiszerek biztonságáról, azonban ennek gyakorlati kivitelezése még várat magára. A nemzetgazdaságnak komoly veszteséget okoz az olcsó, kétes eredetű külföldi termékek beözönlése. Ezen túlmenően a fogyasztók is károsokat szenvednek el. Az EU átfogó élelmiszertörvénye, a 178/2002. számú, 2005. január 1-én hatályba lépő rendelet írta elő a nyomonkövethetőség biztosítását az egész élelmiszer ágazatban. A termékfelelősség bevezetésével együtt ez azt jelenti, hogy a termelő, a feldolgozó és a kereskedő köteles a fogyasztók kérésére bemutatni a termék biztonsági igazolásokat. Az Európai Bizottság által 2003-ban előterjesztett tervezet (COM/2003/52) az élelmiszerek hivatalos ellenőrzésének egységesítésére és modernizálására még mindig vita tárgyát képezi. A szakirodalomban jó néhány utalást találunk egy-egy vizsgálati módszer, vagy vegyületcsoport eredetazonosításban aló alkalmazhatóságáról, olyan rendszer azonban még nem született, ami kellő biztonsággal, elég gyorsan, ugyanakkor elfogadható áron képes az eredetvédelmi feladatok megoldására. Ezt részben magyarázza a feladat sokrétűsége. A megközelítés összetettségének megfelelően összetett paraméterrendszer felállítása a célunk, mely paraméterek együttese mintegy ujjlenyomatként jellemzi a terméket, komplexitásával biztosítva a tételek minél biztonságosabb azonosítását. Fontos továbbá, hogy a fentebb vázolt kérdések külön-külön is megválaszolhatók legyenek, erre az ujjlenyomat leginkább jellemző jegyének, jegyeinek alapján adható a legjobb megoldás. A pozitív élettani hatású anyagokkal kapcsolatos kutatási irányok Projektben kiemelt fontosságú alapanyagforrásként kezelt tejben kimutatott, igazolt élettani hatással rendelkező, a funkcionális és a sportélelmiszerekben ma is hasznosított, ill. potenciálisan alkalmazható hatóanyagok és élelmiszerek rövid áttekintő listája jól érzékelteti, hogy ennyiféle anyagnak különböző termékekben való biztonságos, az elvárt minőséget is garantáló felhasználása milyen hatalmas feladatot jelent az eredetvédelem, illetve a biológiai hatás igazolása szempontjából.

Ismert és szakirodalomban igazolt bioaktivitással rendelkező tej eredetű anyagok Hatóanyag (csoport) laktoferrin, transzferrin konjugált linolsavak, szfingomielin

Élettani hatás

Létező, ill. várható alkalmazás

vasfelszívódás elősegítése, vírusokkal szembeni ellenálló képességet fokozza

időskori tápszer

triglicerid-háztartás szabályozása, agyszövet kialakulása

koagulált tejkészítmények

éterlipidek

Apoptózis szabályozása

koagulált tejkészítmények

omega-6, omega-3 zsírsavak

Erősíti a szív, ér- és idegrendszert

koagulált tejkészítmények

21

propionsav, tejsav, ecetsav, vajsav tejfehérjék tejhidrolizátumok: laktotripeptid:, izoleucin-prolinprolin (IPP)

aminosavak

foszfatidilszerin laktitol, laktulóz

telítettség érzés fokozása, a propionsav gátolja egyes baktériumok, gombák szaporodását, a vajsav segíti a zsírsav anyagcserét, sejtszaporodás gátló gyulladásokat csökkentik, porcvédő hatásuk van az optimális vérnyomás biztosításával fokozza az erek rugalmasságát glutaminsav csökkenti a szellemi fáradtságot, javítja az agy teljesítményét, gyorsítja a szervezet terhelés utáni regenerálódását a prolin a kollagén alapú szövetek épségét segít megőrizni a hisztidin részt vesz a vörösvértestek képezésében, a cink és vas felvételében a metionin segíti az anyagcsere végtermékek eltávolítását a májból, a zsírszövet lebontását a treonin részt vesz a kollagén képzésben, megakadályozza a zsírsavak felhalmozódását a májban segít az időskori memória frissen tartásában, immunerősítő, csökkenti a kortizol szintet prebiotikumként elősegíti a probiotikumok szaporodását

funkcionális joghurtok időskori tápszer, koagulált készítmények időskori tápszer

sporttápszer, felnőttkori és időskori tápszer funkcionális joghurt

felnőttkori és időskori tápszer funkcionális joghurt

Ismert és szakirodalomban igazolt bioaktivitással rendelkező lisztkomponensek Hatóanyag (csoport) Nem keményítő poliszacharidok (arabinogalaktán, arabinoxilán, béta-glükán) Fitoszterolok

Élettani hatás Vízoldható rost, prebiotikum Koleszterin csökkentő

Tokolok (pl. tokoferol)

Antioxidáns, kollagénképző

Folát

CV védelem, Fe felszívódás segítése Antioxidáns, antimutagén

Alkilrezorcinok Ferulasav Nyomelemek (pl. felvehető vasforrás!)

antioxidáns vas-felvétel

Létező, ill. várható alkalmazás teljes kiőrlésű liszt, gabonapehely Olaj, lágy kapszula, kenyérhez adalékolva Pl. E-vitaminnal dúsított élelmiszerek Táplálékkiegészítők, vastabletták teljes kiőrlésű liszt , funkcionális joghurt funkcionális joghurt teljes kiőrlésű liszt

A funkcionális és a sportélelmiszerek biztonságos voltánál még nehezebben kezelhető kérdés a magas hozzáadott érték és az egyedi, kiváló minőség igazolása. A termékek összetételének és főként az ígért hatásnak az ellenőrzése, garantálása még magasabb szintű felkészültséget és célirányos fejlesztéseket igényel. A gyártó számára csak az analitikai eszköztár áll rendelkezésre, mely csak korlátozottan használható információkat szolgáltat az adott összetevő biológiai hatásával kapcsolatosan. A projektben is megcélzott termékek forgalma az ingatag bizalmon alapszik, melyet akár egy véletlen hiba, de akár egy szándékos manipuláció is könnyen lerombolhat. A fogyasztói bizalom csakis megbízható, hiteles, egyértelmű és jól hozzáférhető információkkal fokozható, amelynek integráns része a mi esetünkben a pozitív biológiai hatás igazolása. Nyilvánvaló tehát, hogy nélkülözhetetlen egy olyan új 22

megközelítésre épülő analitikai módszertan és eszköztár, melynek eredményei egy célzott nyomonkövetési rendszerben a terméklánc bármely tagja számára elérhetővé, lekérdezhetővé válnak. A komplex rendszer specifikus előnyei: a bioaktív összetevők mennyisége és minősége a termék előállításának bármely fázisában ellenőrizhetővé válik, az esetleges hibák még az adott anyagtétel felhasználása előtt kiszűrhetőek, a termékek magas hozzáadott értéke állandóan biztosítható a gyártás során, a gyártás vagy a forgalmazás során fellépő, az elvárt biológiai hatást maradéktalanul teljesíteni nem képes terméktételeknek a fogyasztóhoz való elérését meg lehet akadályozni. Élelmiszer kontaminánsokkal és egyedi komponensekkel kapcsolatos kutatási irányok A korábbi évek élelmiszeripari fejlesztései során több olyan adalékanyagot használnak, melyekkel ugyan meghosszabbítható az élelmiszerek eltarthatósága, és fokozott aroma-, illetve illathatás érhető el, azonban a legtöbb esetben ezek az adalékanyagok nem természetes forrásból származnak, ez által kérdéses a biztonságosságuk, és egyre csökken irántuk a fogyasztók érdeklődése is („E-szám fóbia”). A fogyasztók egyre inkább preferálják a természetes forrásból származó élelmiszer-összetevőket alkalmazó termékeket, így ez meghatározza a funkcionális élelmiszerek fejlesztési irányait is. A természetes forrásokból kinyert, élelmiszeripari adalékanyagként alkalmazott bioaktív komponensekre építhető a pozitív élettani hatású funkcionális és sportélelmiszerek célirányosan tervezett, új generációja. A hatóanyagok alkalmazásának kurrens problémakörét az alábbiakban foglaljuk össze: Az alkalmazást korlátozó technológiai tényezők és azok elhárításának lehetőségei Élelmiszeripari elvárás

Ismert, állandó szintű hatóanyagtartalom

Eltérő élettani igényű célcsoportok számára speicifikusan fejlesztett élelmiszerek összeállítása.

Kihívás/bizonytalansági tényező

Tételről-tételre változó, évjáratok között is jelentősen ingadozó hatóanyag-tartalom mikroklimatikus tényezők változásai genotípusok változatossága Tételenkénti sorozatvizsgálatokhoz megfelelő, költséghatékony analitikai eljárások hiánya, a meglévő módszerek alacsony hatékonysága és nagy költsége. Hatóanyagok előállításának bizonytalansága, valamint az élelmiszermátrixok és hatóanyagok kombinációi eltérően hatnak a különböző élettani igényű célcsoportokra, ezekről a hatásokról egyenlőre nincs elegendő megbízható ismeret.

23

Megoldási lehetőségek, megoldandó projektfeladatok

Végeredmény

Tételenkénti hatóanyag-tartalom mérést követő egalizálás. Speciális kivonatok készítése során történő standardizálás. Újszerű, módosított, költséghatéknyság szempontjából is fejlesztett analitikai módszerek kidolgozása. A hatóanyagés mátrix kombinációk kölcsönhatásainak feltárása biológiai modellrendszerek alkalmazásával.

Igazolt, stabil hatóanyagtartalmú funkcionális élelmiszer

Kibővített, az új módszerek eredményeit is tartalmazó eredetvédelmi a datbázis Bevizsgált és igazolt biológiai hatású, egyedi hatóanyagokra épülő funkcionális élelmiszer prototípusok

Az eredetvédelemre irányuló kutatások A termékek biztonságossága és minősége szempontjából is kulcsfontosságú az összetevők eredetének azonosítása, melyre ugyan számos módszert kidolgoztak már, azonban ezek abban megegyeznek, hogy egyetlen paraméter és annak mérésére kifejlesztett eljárás nem elégséges erre: jól megválasztott paraméterek komplex rendszerével lehet megbízhatóan azonosítani egy-egy természetes anyag eredetét. A természetes, ill. a feldolgozott természetes eredetű anyagok ugyanis gyakran számos vegyület keverékei, ami az eredetük azonosításában előny és hátrány is egyben. Sokféle anyag mennyiségének a meghatározása lehetséges belőlük, azonban csak alapos vizsgálatok során dönthető el, hogy ezek közül melyek hordoznak lényeges információt az eredetre vonatkozóan. A hazai kutatások jelentősége nemzetstratégiai szempontból Jelen pályázat több tekintetben is érint kiemelt nemzetstratégiai jelentőséggel bíró területeket. Az alábbiakban röviden összefoglaljuk ezeket. Magyarország mezőgazdasága számára a saját fejlesztésű, magas minőségű alapanyagokból előállított egyedi, egészségvédő hatású termékek gyártásának és forgalmának bővítése fontos kitörési pontot jelent. Az ebben rejlő lehetőségeket csak a fokozott biztonsági kritériumoknak is megfelelő, igazoltan magas hozzáadott értékű, a fogyasztói bizalmat elnyerni és megtartani képes termékekkel lehet kihasználni. Az értékes termékek hamisítása azonban gyorsan rontja az eredeti termékek hitelességét, keresettségét, ezért alapvető fontosságú, hogy a fejlesztés kezdetétől fogva nagy megbízhatósággal azonosítani tudjuk a minőségi alapanyagot, ill. az ebből készülő terméket. A magyar termékek biztonságos volta és kiemelkedő minősége nemzetközileg is elismert, melyet tovább erősíthet a nemzetközileg is figyelemfelkeltő, várhatóan EUs projektekben való együttműködést eredményező pályázatunk. A projekt révén kifejleszthető egy olyan nyomonkövetési modellrendszer és specifikus élelmiszerbiztonsági adatbázis, mely alkalmas az egyedi, funkcionális élelmiszerek megbízható termékazonosítására, és a biológiailag előnyös tulajdonságok igazolására. A termékazonosítási modell változatos termékpályákra alkalmazható, így hozzájárul a magyar termékek iránti általános fogyasztói bizalom erősítéséhez, ezáltal a fogyasztói bizalom erősödéséhez. Intézményi előzmények Az egri Eszterházy Károly Főiskola az Észak-Magyarországi régió legnagyobb hagyománnyal rendelkező, négy karral rendelkező felsőoktatási intézménye, mely infrastrukturálisan és kvalifikált kutatókkal egyaránt igen jól ellátott és szerteágazó kutatási profilt lefedő Természettudományi Karral rendelkezik. Az Eszterházy Károly Főiskolán kialakított Egri Regionális Tudásközpont regionális, és országos szinten is meghatározó élelmiszeripari kutatóközponttá fejlődött. A laboratórium komplexum jól felszerelt eszközháttérrel rendelkezik, ahol élelmiszer analitikai, molekuláris biológiai, élelmiszer- és táplálkozás-mikrobiológiai, élelmiszertechnológiai, műszerfejlesztési valamint bioszenzorfejlesztő kutatócsoportok folytatnak élelmiszeripari kutatásokat. A jelenlegi kutatási területek a következők: Klasszikus finomanalitikai mérések egyedi hatóanyag vizsgálatokhoz; 24

Új módszerek és eljárások kidolgozása élelmiszermátrixok komponensei elválasztására Új termékek és egyedi technológiák kidolgozása, Analitikai és molekuláris biológiai módszerfejlesztések eredetvédelmi célokra, Biológiai hasznosulás, felszívódás modellezése, Élelmiszerminőségi és higiéniai vizsgálatok; Élelmiszeripari folyamatok kockázatelemzése; Nyomonkövetési és minőségirányítási rendszerek kialakítása, működtetése, felülvizsgálata, informatikai hátterének kialakítása. Korábbi releváns fejlesztések lényegének bemutatása: Új bioanalitikai műszerek és új paraméterrendszer kifejlesztése az élelmiszerbiztonság növelése érdekében: étkezési búza mikotoxin kontaminációjának vizsgálata, új PCRmódszerek kidolgozása, nyomonkövetési rendszerbe való integrációja (OMFB01352/2006). Élelmiszerbiztonsági modell kifejlesztése a magyar bortermékpályára: a termőhely és a technológia hatása a bor biztonságára, boranalitikai fejlesztések, bioszenzor-kutatások (GVOP-3.1.1-2004-05-0283/3.0). Komplex nyomonkövetési rendszerek, új élelmiszerbiztonsági paraméterek és eszközök újszerű infokommunikációs rendszerrel: elektronikus, mobil telefonos nyomonkövetési rendszer hátterének kidolgozása, eredetazonosítási vizsgálatok; analitikai és molekuláris biológiai módszer fejlesztések, bioszenzorok és fubkcionális élelmiszerek kidolgozása (RET 09/2005, Pázmány Péter Program). Egyedi hatóanyagok izolálása, vizsgálata, technológiai alkalmazásuk körülményeinek vizsgálata, funkcionális élelmiszerek kifejlesztése, biológiai modellkísérletek kivitelezése (JÁP-FUNKFOOD-OMFB/00182-2008).

Részlépések és alkalmazott módszerek 2.1. Az eredetiség megállapítását és a tételazonosítást elősegítő egyedi paraméterkomplex kialakítása A részfeladat célja Egyedi paraméterkomplex kidolgozása, mely az egyedi paraméterek figyelembevételével képes átfogó eredetvédelmi feladatok megoldására.

súlyozott

Részlépések 2.1.1. Modellvizsgálatok az aktuális minőségi viszonyok mennyiségi arányok feltárására: aminosavak, peptidek, zsírsavak, fenolos vegyületek, nyomelemek 2.1.2. Az optimális paraméterek körének meghatározása (bioaktív komponensek és kontaminánsok) 2.1.3. A legmegfelelőbb indikátor jellegű komponensek statisztikai módszerekkel történő kiválasztása és súlyfaktorokkal való ellátása, prioritási soruk felállítása 2.1.4. A technológiai körülmények jellemzésére alkalmas eredetiség-indikátorok kiválasztása 2.1.5. Az előzőek integrálásával adatbázis létrehozása, statisztikai módszer kiválasztása 2.1.6. A vizsgálati módszerek továbbfejlesztése és optimalizálása, a javasolt módszer ellenőrzése különböző mintákkal 2.1.7. Módszertani kalauz (best practice guide) elkészítése 25

A részfeladat várható újdonságtartalma Olyan komplex rendszer, illetve paraméteregyüttes eddig még nem született, amely önmagában kellő biztonsággal és hatékonysággal alkalmazható lenne az eredetvédelem hiteles igazolására. Az egyes komponensek új vizsgálati módszerekkel végrehajtott elemzése új eredményeket szolgáltat a tételazonosításra alkalmas adatbázisban. 2.2. Egyedi tejféleségek speciális zsírsavösszetételének átfogó analízise termékazonosítás céljából A részfeladat célja: Olyan összefüggésekre kívánunk rávilágítani az eltérő tejféleségek zsírsavösszetétel vonatkozásában, mely révén képesek leszünk a tejváltozatok állatfajonkénti azonosítására. A kutatás lépései 2.2.1 Egyedi tej- és termékféleségek zsírsavösszetételének felmérése, egyedi arányok megállapítása o vizsgálati módszer: származékképzett formában gázkromatográfiás mérés tömegspektrometriai detektálással és azonosítással, o telített és telítetlen zsírsavak aránya, kettős kötések száma és láncon elfoglalt 3 6). o zsírsavkomponens tartományok meghatározása különböző fajokból származó tejek és tejtermékek esetén. o zsírsavak (olajsav, palmitinsav, linolsav, linolénsav, palmitolajsav, miriszticinsav, mirisztolajsav) egyedi arányainak meghatározása állatfajtákra, földrajzi eredetre vetítve, o az eredetazonosítás szempontjából jellemző paraméterek meghatározása, egyedi mintázatok rögzítése. 2.2.2 Különböző zsírsavak, ill. vegyületeik technológiai tényezők hatására bekövetkező változásainak felmérése o hőkezelés hatására bekövetkező izomerizáció követése, termékek analízise: a – különböző technológiákra jellellemző – hőmérsékleteken (80; 100; 130 °C), különböző időtartamban (30; 60; 300; 600 sec.) és különféle hőközléssel (direkt; indirekt/ hagyományos; mikrohullámú) kezelt tejminták esetében vizsgáljuk a különböző zsírsavak mennyiségének alakulását, a telítetlen zsírsavak izomerizációjának (cisz/transz) mértékét. o savanyított termékek (joghurt, kefir) előállítása során a zsírsavak mennyiségében bekövetkező változás nyomonkövetése, a különböző kultúrák zsírsavösszetételre gyakorolt hatásának vizsgálata o az egyes zsírsavak megoszlásának vizsgálata a különböző technológiai folyamatok fő és melléktermékei között o a különféle technológiák melléktermékeinek vizsgálata: az élettani szempontból előnyös zsírsavak mennyiségének vizsgálata, szelektív kinyerésük, adalékként való alkalmazásuk lehetőségének vizsgálata 2.2.3 A mátrix hatásának vizsgálata a zsírsav eredetének függvényében

26

o fehérje-összetétel-, pH, szénhidráttartalom-, mikroelem összetételbeli különbségek hatása az egyes zsírsavak mennyiségére, ill. azok arányára, o Fermentáció során bekövetkező változások hatása a zsírsav összetételre (zsírok hidrolízise, izomerizáció). A részfeladat újdonságtartalma Az egyes tejféleségek összetétele nagyfokú variabilitást mutat, azonban direkt összefüggésrendszert az egyedi zsírsavak aránya és a tejváltozat eredete között eddig hitelt érdemlően nem írtak le. Ennek fő oka az, hogy a fajta,a laktációs periódus, valamint a takarmányozás jelentős befolyással van a zsírsav-összetételre. 2.3. Újszerű peptidelválasztási és azonosítási módszerek kifejlesztése A részfeladat célja Bioaktív peptidek jelenlétének igazolása, az egyedi komponensek azonosítása, illetve a stabilitásuk tanulmányozása kulcsfontosságú az allergenicitás feltárásában, valamint termékgyártás és a későbbi alkalmazás tudatos megtervezésében. A kutatás lépései 2.3.1. Allergén (glutén és tejfehérje), illetve pozitív élettani hatású peptidek elemzése o tejfehérjék elválasztása gélelektroforetikus módszerek alkalmazásával o az allergén fehérjéket, illetve kisebb moltömegű, előnyös tulajdonságú peptideket tartalmazó frakciók azonosítása, kinyerése. o az egyes fehérje módszerekkel.

frakció

komponensek

azonosítása

gélekroforetikus

o az egyes izolált fehérjék stabilitásának vizsgálata az alábbi körülmények között: hőkezelés hatásának vizsgálata: a – különböző technológiákra jellemző – hőmérsékleteken (80; 100; 130 °C), különböző időtartamban (30; 60; 300; 600 sec.) és különféle hőközléssel (direkt; indirekt/ hagyományos; mikrohullámú) kezelt tejminták a pH változás (savanyított tejtermékek) hatásának vizsgálata – az előállítás folyamatában bekövetkező pH változás modellezésével a liofilizálás (tejpor készítése fagyasztva szárítással) hatása – liofilizált minták vizsgálata az emésztés körülményeinek hatása – a szokásos emésztési modell alkalmazásával a fehérjestabilitás követésére a gélelektroforetikus elválasztási eljáráson túl DSC, NMR FTIR vizsgálati módszerek alkalmazását is tervezzük. 2.3.2.

Az egyes tejfehérje izolátumok potenciális biológiai modellkísérletekkel (részletesen lásd a 4. alprojektben)

hatásának

felmérése

o allergének azonosítása, illetve átalakulásainak vizsgálata emésztési modellekben. 2.3.3. Eredetazonosításra alkalmas egyedi jellemzők azonosítása, ingadozásukat befolyásoló tényezők hatásának tanulmányozása o a legfontosabb komponensek (fehérje, lipid és szénhidrát) vizsgálatával, ezek statisztikai elemzésével kiválasztjuk az egyes vegyületcsoportok legjellemzőbb képviselőit melyek mennyiségének, illetve mennyiségi arányainak

27

megállapításával, készítjük el az adott tej „standard” profilját, esetleg ujjlenyomatát. o a lehetséges befolyásoló tényezők (tartás/takarmányozás; laktációs periódus, fajta) hatásának felderítését ezek valamelyikében eltérő minták standard profillal való összehasonlításával jellemezzük. o fehérje, lipid és szénhidrát összetétel, arány meghatározása, továbbá csoportokon belüli és csoportok közötti arányok meghatározása és az aránypárok, valamint egy újonnan kidolgozandó ujjlenyomat tartomány alkalmazása eredetvizsgálatokra. o specifikus indikátorfehérje kiválasztása, analitikájának kidolgozása. A részfeladat várható újdonságtartalma Az allergén hatás kiváltásáért felelős fehérjéket sokrétűen vizsgálták eddig, azonban a szakirodalmi adatokban lényeges ellentmondások mutatkoznak a célvegyületek azonosítását illetően. Komplex módon – azonos módszertannal vizsgálva a fő fehérjekomponensek mellett a savó, ill. minor fehérjéket is – eddig nem vetették össze eltérő állatfajok, ill. azon belüli, különböző fajták és genotípusok tejének allergenicitását.

2.4. Pozitív élettani hatású, egyedi hatóanyag-kombinációk kifejlesztése az alkotók egyedi alapsajátosságainak és a technológiai folyamatok hatására bekövetkező átalakulásaik figyelembevételével. A részfeladat célja Antioxidánsok, prebiotikus hatású szénhidrátok és egyedi bioaktív ágensek izolálása, azonosítása új eljárásokkal, illetve az új vizsgálati módszerekkel nyert eredmények alkalmazása tételazonosításra. Ezen túlmenően a gyártási technológia különböző fizikai-kémiai tényezői hatására bekövetkező átalakulás analitikai követése, ez alapján egyedi hatóanyag kombinációk kialakítása. A kutatás lépései 2.4.1. Új műszeres analitikai módszerek kidolgozása az egyedi bioaktív komponensek izolálására, azonosítására, valamint stabilitásuk és átalakulási folyamataik megállapítására o A bioaktív hatóanyagokat hatékony és precíz műszeres analitikai eszközök igénybevételével fogjuk azonosítani és mennyiségüket meghatározni. Az általunk alkalmazott analitikai módszerek HPLC-MS/MS (nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia iontömeg detektorral), és a NIR. A következő feladatokat végezzük el az analitikai módszerfejlesztések során. Optimális, gyors és nagy precizitású minta előkészítési folyamatok kidolgozása, a hatékonyság növelése érdekében homogenizátorok (TURRAX, sejt roncsolásos feltárás) és kaszkád rendszerű extraktor sorok alkalmazása. Specifikus elválasztási kromatográfiás oszlop kiválasztása több kísérletsor alkalmazásával. A mobil fázis oldószerkomponensei (eluensek) helyes megválasztásának és azok arányának megállapítása. A tömegdetektorok kiválasztása és optimálása.

28

A komplex élelmiszer-mátrixból a bioaktív komponenseket detektálni képes analitikai módszerek kidolgozása minden egyes vegyületcsoport esetén, ahol az egymás melletti keresztreakciók kiiktatása a fő szempont. o A fő átalakulási termékek azonosítása, azok stabilitásának vizsgálata: Kettős kötést tartalmazó esszenciális zsírsavakból savkatalizált vízaddícióval kialakuló hidroxi származékok meghatározása, Oxigén hatására bekövetkező lánctöredezés nyomonkövetése A cisz zsírsavak hő hatására végbemenő izomerizációjának nyomonkövetése Antocianinok pH változás hatására történő átalakulásainak vizsgálata Természetes aminosavak mikrobiológiai dekarboxilezése esetén képződő biogén aminok keletkezésének nyomonkövetése Aminosavak racemizációjának vizsgálata Prebiotikus szénhidrátok hő hatására bekövetkező, esetleg savkatalizált lánctöredezésének vizsgálata Terpenoidok esetén a gyűrűrendszeren bekövetkező oxidációs, hidrolitikus, esetleg pH indukált átalakulások, gyűrűfelnyílás okozta aktivitás csökkenés tanulmányozása. 2.4.2. Egyedi hatóanyagok perzisztenciájának vizsgálata különböző körülmények között és eltérő élelmiszermátrixokban. o Az egyes komponensek hőstabilitás tanulmányozása az élelmiszer tárolására jellemző hőmérsékleti skálán (-18°C, +4°C és +30°C), továbbá a technológiára jellemző magasabb hőmérsékleteken (pasztőrizálás esetén 80-130 °C, sütés esetén 140-180 °C), mátrixhatás (fehérje, keményítő alapú élelmiszer modellek), pH stabilitás (pH=4.0, pH=7.0, pH=10.0), fény hatására bekövetkező bomlások (gyökös átalakulások), oxigén hatására bekövetkező lánctöredezés és antioxidáns aktivitás csökkenés. 2.4.3. Az egyes funkcionális komponens csoportok aktivitásának összehasonlító elemzése o Antioxidáns aktivitás vizsgálata négy módszerrel (DPPH, FRAP, ABTS, ORAC) a fent részletezett körülmények között. 2.4.4. Technológiai tényezők hatására bekövetkező változások felmérése a tiszta hatóanyagokra vonatkozóan o Az eltérő kezelési-gyártási körülmények az adott komponensek érzékenységével szoros összefüggésben igen jelentős különbözőségeket eredményeznek a hatóanyagok mennyiségében és szerkezetében, valamint az ebből adódó biológiai hatásában. Ezáltal pontosan rámutathatunk a kifejlesztendő bioaktív komponensekben gazdag termék biológiai hatásossága érvényesülése mértékére, valamint az elvárható előnyös tulajdonságokat befolyásoló tényezők szerepére, illetve a maximális élettani hatás kifejtéséhez szükséges feltételekre. o Vizsgáljuk a hőmérséklet, a pH, és az oxidatív környezet és a fémek jelenléte hatásait a reakciókészségre, stabilitásra a leglényegesebb funkcionális komponensek esetében: antioxidánsok, antocianinok, esszenciális zsírsavak, aminosavak, prebiotikumok, terpenoidok. o A felszívódás, biológiai hasznosulás becslése in vitro modellvizsgálatokkal. o Egyedi bioaktív komponensek együttes jelenlétében bekövetkező változások modellvizsgálata. 29

2.4.5. Új, funkcionális élelmiszer termékek prototípusaiban alkalmazható egyedi hatóanyagkombinációk analízise és kialakítása o Az alábbi kombinációkban tervezzük vizsgálni a hatóanyagok kölcsönhatását: vitaminok – antioxidánsok, mikroelemek, prebiotikumok zsírsavak – antioxidánsok, mikroelemek nyomelemek Prebiotikumok - antioxidánsok A részfeladat várható újdonságtartalma A technológiai folyamatok során bekövetkező átalakulások, illetve a szinergista hatások és a felszívódás mértékének figyelembevételével létrehozott egyedi hatóanyag kombinációk alkalmazása módot adhat új termék prototípusok kifejlesztésére. Az egyes bioaktív komponensek új vizsgálati módszerekkel végrehajtott elemzése új eredményeket szolgáltat a tételazonosításra alkalmas adatbázisban. 2.5. Bioszenzorok validálása A részfeladat célja A bioszenzor fejlesztéssel foglalkozó alprojekt munkája során létrejövő megoldások mérési paramétereinek (pontosság, megbízhatóság, reprodukálhatóság) meghatározása nagyműszeres analitikai mérésekkel mikotoxin- (aflatoxin, fumonizin, dezoxi-nivalenol, nivalenol), polifenol-, antioxidánstartalom mérési irányban. A kutatás lépései 2.5.1. A kutatásba bevont műszerek validálása (pumpa, biokémiai érzékelő, elektrokémiai érzékelő) o A bioszenzor alapú módszerek kidolgozása során a szelektív detektálás szempontjainak figyelembe vételével a megfelelő detektor kiválasztása és fejlesztése, az optimális körülmények (pH, áramlási sebesség, hőmérséklet) meghatározása. 2.5.2. A validációs paraméterek meghatározása adott bioszenzor kísérleti összeállítás esetén o Precizitás és pontosság (Véletlen és rendszeres hibák), eltérés és szórás, ismételhetőség és reprodukálhatóság (Intra day, inter day, inter laboratory), érzékenység, szelektivitás és specificitás, kimutatási és meghatározási határ, linearitás, intervallum, megbízhatóság, visszanyerhetőség (spike, CRM=certified reference material) független módszer, robosztusság. 2.5.3. A validáláshoz szükséges független módszer fejlesztése o HPLC módszer kidolgozása mikotoxin származékok kimutatására és kvantitatív meghatározására fluoreszcens detektálás mellett. Idelális eluens minőség és arány, kromatográfiás oszlop, áramlási sebesség megállapítása, az ideális mérési körülményekre jellemző jelszeparáció, érzékenység és kimutatási határ meghatározása. o valós minták esetén a HPLC vizsgálatokhoz szükséges mikotoxin extrakciós eljárások optimalizálása.

A részfeladat várható újdonságtartalma 30

A validálás révén a gyakorlati életben, illetve biológiai és környezeti minták analízisére is alkalmazható, nagy megbízhatóságú bioszenzorok létrehozása válik lehetővé, melyeknek az általunk kidolgozott prototípusait korábban még nem dolgozták ki és írták le.

2.6. A legfontosabb élelmiszerkontaminánsok és funkcionális komponensek potenciális szinergista hatásának tanulmányozása és beépítése a komplex élelmiszerbiztonsági rendszerünkbe A részfeladat célja A főbb hatóanyagok és kontaminánsok egymással és az élelmiszermátrixszal való kölcsönhatások feltárása, egymás reakciókészségének, felszívódásának és stabilitásának befolyásolásának vizsgálata az egyedi funkcionális élelmiszerhez rendelhető, ténylegesen érvényesülő biológiai hatások megállapítása céljából. A funkcionális és a sportélelmiszerek minőségbiztosítási rendszerének bővítése a kritikusnak bizonyuló kölcsönhatásokkal. A kutatás lépései 2.6.1. A fémszennyezettség formáinak feltárása, szerepének elemzése speciális élelmiszermátrixokban, keresztreakciók és komplexképződési folyamatok követése. o az alap és adalékanyagok szennyezettségének megállapítása, a szennyező források azonosítása, javaslat a szennyezés csökkentésére, o adott nyomelem élő szervezet számára hozzáférhető továbbá az ebből felvehető formában lévő mennyiségének becslésére alkalmas modellrendszer kidolgozása, o a felvehetőséget befolyásoló tényezők vizsgálata, o a fémek és élelmiszer-mátrix kölcsönhatásának vizsgálata, o a fémek és bioaktív anyagok kölcsönhatásának vizsgálata élelmiszer-mátrixban, o a fémek szerves kontaminánsok degradációjára gyakorolt hatásának vizsgálata élelmiszer-mátrixban. 2.6.2. A kiválasztott kontaminánsok egymással való kölcsönhatásának tanulmányozása o Egymás reakciókészségének és stabilitásának befolyásolása, a felszívódásra gyakorolt hatás felmérése az alábbi vegyületekre: mikotoxinok (aflatoxin, fumonizin, dezoxi-nivalenol, nivalenol) egymásra gyakorolt hatásának tanulmányozása páronként és együttes jelenlét esetén. 2.6.3. Az élelmiszermátrixszal való kölcsönhatás vizsgálata egyedi kontaminánsoknál és speciális szennyező kombinációknál o A mátrixnak (fehérje, illetve szénhidrát alapú) az egyedi kontaminánsok és speciális toxin-kombinációk stabilitására, perzisztenciájára és a felszívódásuk mértékére gyakorolt hatásának vizsgálata. o nyomelemek hatása az élelmiszer mátrixban jelenlevő kontaminánsok stabilitására és átalakulására, a bomlástermékek beazonosítása és vizsgálata. 2.6.4. Az élelmiszermátrixszal való kölcsönhatás vizsgálata egyedi kontaminánsok kombinációi és aktív hatóanyagok együttes jelenléte esetén. o A mátrixnak, illetve az egyedi vegyületeknek a kontaminánsok és aktív hatóanyagok reakciókészségére, stabilitására és a felszívódására gyakorolt hatásának vizsgálata.

31

o A 4 legjelentősebb mikotoxinból, fémionokból és hatóanyagokból álló modellrendszerek vizsgálata eltérő kombinációkban, toxin párok és együttes vizsgálat elvégzése, majd egy-egy fém jelenlétében, végül teljes modell rendszerben. A vizsgált modell rendszer aflatoxin, fumonizin, dezoxi-nivalenol, nivalenol (ppb koncentráció tartomány) mikotoxinokat és különböző fémionokat (Fe(II), Fe(III), Cu(II), Zn(II), Ca(II), Mg(II), Na(I) (ppm koncentráció tartomány) alkalmaz a hatóanyagtartalom vizsgálata során. a toxinok különböző kombinációi hatásának vizsgálata különböző bioaktív komponensekre (vitaminok, színanyagok, zsírsavak, antioxidánsok, aminosavak, fehérjék) ezen hatások változása különféle mikroelemek jelenlétében. o A hatóanyag és mikotoxin tartalom nyomonkövetése HPLC módszerekkel történik UV/VIS (diódasoros), fluoreszcens és tömegspektrometrás detektálás mellett, a mikroelem tartalom vizsgálatokat atomabszorbciós mérésekkel végezzük el. 2.6.5. A jelentős élelmiszerkockázatot hordozó kölcsönhatások jellemzése eredményeinek beépítése a funkcionális és sportélelmiszerek komplex biztonsági rendszerébe o A komponensek közötti kölcsönhatások fellépését és a biztonsági veszélyek növekedését kiváltó tényezők értékelése és részletes kockázatbecslésére. o A lényeges kockázatnövekedéssel járó interakciók megelőzési lehetőségeinek, ill. a beavatkozás technikájának kidolgozása. o Javaslat kidolgozása az egyes kritikus kölcsönhatásoknak a minőségbiztosítási rendszerben való kezelésére. A részfeladat újdonságtartalma A egyedi kontamináns-, illetve hatóanyag-kombinációk speciális viszonyait eddig nem tanulmányozták részletekbe menően, így modellvizsgálataink új eredményt szolgáltatnak az élelmiszerekben ténylegesen végbemenő folyamatokról és azok funkcionalitásra és az élelmiszerbiztonságra gyakorolt hatásairól.

Az alprojekt várható eredményeinek hasznosítása Hosszú távú hasznosítás Az új eljárások felhasználásával nyert adatsorok révén a termékazonosítási célú adatbázis hatékonyan bővíthető, így az adott termékek eredetvédelme fokozható. Nagy biztonsággal ellenőrizhetővé válik a magas hozzáadott értékű termékek és azok alapanyagainak a biztonságossága, így a fogyasztói bizalom növekedése által a jövőben fokozható a termékek kereskedelmi forgalma. A sokrétű hatóanyag stabilitási és hasznosulási vizsgálatok olyan új, egészségvédő termékek és sportélelmiszerek prototípusait alapozzák meg, melyek magas hozzáadott értéke és biológiai előnyei egyértelműen bizonyítást nyertek. Tudományos alkalmazhatóság Új módszerek, új vizsgálati technikák kerülnek kifejlesztésre. Az egyedi hatóanyag-kombinációk tényleges biológiai hatásának eredményekkel gazdagítja a tudományos eredmények jelenlegi körét. Új, magas hozzáadott értékű termék prototípusok megalapozása.

32

feltárása

új

Összefüggés a projekt más kutatási programjaival Az 5.6. alprojekt során létrejövő molekuláris markerek beépülnek a jelen alprojekt keretében létrejövő, a funkcionális és sportélelmiszerek élelmiszerbiztonságának fokozását célzó célzott nyomonkövetési rendszerbe. A 3. alprojekt keretében kifejlesztett bioszenzor-megoldások mérési paramétereinek nagyműszeres eredményekkel történő összehasonlítása a jelen projekt egyik kiemelt feladata.

33

3. Kutatási alprojekt Eredetvédelmi és élelmiszerbiztonsági paraméterek on-line monitorozásra alkalmas újszerű analitikai eszközök (bioszenzorok) kifejlesztése Az alprojekt lényege Az alprojekt keretében új mérési eljárások, illetve az ezekre épülőspecifikus analitikai eszközök, bioszenzorok létrehozásával támogatjuk az eredetvédelmi, illetve élelmiszerbiztonsági adatbázis fejlesztését. Azáltal, hogy az új bioanalitikai műszerekkel gyors, pontos, azonnali és hiteles mérési eredményeket kapunk a bioaktív összetevőkre, az eredetiség megállapítására alkalmas komponensekre, illetve a legjelentősebb szennyeződésekre, nagyban fokozható a tételazonosítás és a biztonsági veszélyek észlelésének a hatékonysága. A funkcionális és a sportélelmiszerek gyártása és forgalmazása során felmerülő minőség-, ill. eredetellenőrzési tevékenységekhez kapcsolódóan az alábbi komponensek analízisére fejlesztünk ki bioszenzorokat: antioxidánsok, polifenolok, mikotoxinok (DON, aflatoxin, fumonizin), telomeráz enzim, probiotikus (bifido-, és tejsav-) baktériumok, patogén baktériumok. A bioszenzorok alkalmazásának előnyének tekinthető az on-line mérési technikán és ezáltal nyomonkövetése/eredetvédelmi rendszerekhez való adaptáció lehetőségén túlmenően az, hogy igen gyors, helyszíni elemzések végzésére is alkalmas, valamint költséghatékony vizsgálati eljárásról van szó.

Az alprojekt során elérendő célok 1. Legalább 6 új, ill. adaptált bioszenzor álljon rendelkezésre az eredetvédelmi célú vizsgálatokhoz, ill. élelmiszerbiztonsági paraméterkomplex meghatározásához. 2. Bioszenzorok alkalmazására épülő specifikus analitikai adatokkal kibővített eredetvédelmi adatbázis álljon rendelkezésre egyes paraméterek on-line monitorozásával. 3. Antioxidáns kapacitás és polifenolok mérésére alkalmas bioszenzorok új nemzedékének kifejlesztése. 4. Rendelkezésre álljanak egyes mikotoxinok, ill. probiotikus és szennyező baktériumok elemzésére képes bioszenzorikus mérőműszerek. 5. Hordozható bioszenzor prototípusok műszaki megoldásainak kifejlesztése azon komponensek, illetve eljárások esetében, ahol a műszer alegységei miniatürizálhatóak. 6. Rendelkezésre álljon a telomeráz enzim működésének modellezésére alkalmazható, bioszenzor alapú megoldás.

Fő kutatási irányok 1. Új biotechnológiai módszerek kidolgozása (enzimforrások feltárása, expresszálás, antitestek előállítása, immunológiai reakciók vizsgálata, enzimaktivitás optimalizálása): Antioxidánsok, polifenolok, és biogén aminok mérésére alkalmas amperometriás bioszenzor fejlesztéshez szükséges enzimpreparátumok előállítása, kinyerése. 34

Mikotoxinok, ill. probiotikus és szennyező baktériumok QCM és OWLS bioszenzorokkal való elemzésére alkalmazható antitest előállítási folyamatának kifejlesztése. 2. Enzim- és immunreakciók alkalmazása bioszenzorokban, vizsgálati rendszer összeállítása Antioxidánsok, polifenolok, és biogén aminok vizsgálatára amperometriás bioszenzorhoz szükséges elektródok készítése.

alkalmazható

Az amperometriás bioszenzor reakciócellájának kidolgozása. A bioszenzorikus mérőrendszer technológiai, műszaki paraméterek optimalizálása, ideális vizsgálati körülmények kialakítása. 3. Hordozható bioszenzor prototípusok összeállítása, megfelelő műszaki konstrukció kialakítása, miniatürizált analitikai részegységek készítése, validálása in-situ vizsgálatokhoz. 4. Enzimaktivitás, életmód és testmozgás összefüggésének vizsgálata, különös tekintettel a telomeráz enzim működésére.

A munka újszerűsége és innovatív tartalma A korábban leírt vagy megalkotott rendszerekhez nem hasonlatos, új bioszenzorok kifejlesztése 6 meghatározó fontosságú élelmiszer komponensre. Ilyen szenzorok jelenleg nem érhetőek el a kereskedelemben. Élelmiszerbiztonsági szempontból releváns anyagok on-line monitorozására, illetve termékazonosítási célokra korábban nem alkalmaztak szenzorokat. Új vagy továbbfejlesztett vizsgálati eljárások, biotechnológiai megoldások jönnek létre az alábbi területeken: enzimek expresszálása mikrobiológiai kísérletekkel, enzimek kinyerése növényi forrásokból, enzim immobilizálási technikák, specifikus enzimcellák létrehozása, immunreakciók optimálása. A bioszenzorikus mérőrendszerek műszerkonstrukciókat jelentenek.

optimalizált

változatai

egyedi

A bioszenzorokhoz szükséges specifikus, egyedi enzimek és antitestek előállítása, illetve ezek beható biokémiai jellemzése.

Indokoltság A téma aktualitása Új bioszenzorok megtervezése és kifejlesztése különösképpen szükségszerű az általunk felölelt alkalmazási területeken, mivel, jelenleg a releváns élelmiszerbiztonsági és minőségi paramétereknek csak igen korlátozott körének megállapítására áll rendelkezésre on-line követésre is alkalmas szenzor. Az élelmiszerek piacán az egészségvédő hatású, a szokványos termékekhez képest tényleges biológiai előnyökkel felruházott funkcionális élelmiszerek, köztük is az ún. sportélelmiszerek mutatják a leglátványosabb fejlődést. A nagy kereslet magával hozza azt is, hogy egyre növekvő számba és volumenben jelennek meg a magas hozzáadott értékű termékek hamisított változatai, amelyeket csak költséges, nagyműszeres vizsgálatokkal lehet kiszűrni. Az ellenőrzés egy igen költséghatékony, gyors és megbízható módjának tekinthetjük a bioszenzoroknak a mainál jóval kiterjedtebb alkalmazását, melyekkel lehetőség nyílik a költséges rutintechnikák kiváltására. Ezen analitikai eszközök az eredetiség szempontjából lényeges paraméterek meghatározása mellett alkalmasak lehetnek az élelmiszer biztonságosságának igazolására is, akár helyszínen elvégzett vizsgálatok által. 35

A bioszenzorikus mérési eljárások előnyei: Érzékeny és megbízható analízisekre ad módot. Kiemelkedő szelektivitás, ami a biokémia reakciók jellegéből adódik. Költséghatékony analitikai módszer, alkalmas a költséges nagyműszeres vizsgálatok kiváltására. Gyors, in situ mérések kivitelezhetősége, így kiemelkedő hatékonysággal alkalmazható technológiai paraméterek monitoringjára és környezeti minták elemzésére. Multifunkciós műszeregyüttes létrehozásának a lehetősége. Egyszerű mintaelőkészítés, ami idő-, és anyagmegtakarítást eredményez. Nemzetközi előzmények A szenzorkutatások az utóbbi évtizedekben világszerte az érdeklődés középpontjába kerültek, elsősorban a szenzorok nagy szelektivitása, illetve a mérések egyszerűsége és költségkímélő jellege következtében. Sok esetben a mérések gyorsasága, megbízhatósága és precizitása lehetővé teszi a hosszadalmas (pl. kromatográfiás) módszerek kiváltását, és így a bioszenzoros technika alkalmassá válik rutinmódszerként történő alkalmazásra. A mai napig a bioszenzorok kifejlesztése igen lassú ütemben folyik, az általános kémiai paraméterek vonatkozásában csak néhány olyan szenzor áll rendelkezésre (glükóz, etil-alkohol, C-vitamin, acetát-ion) áll rendelkezésre, melyet élelmiszervizsgálatokra is adaptálni lehet. Az élelmiszer kontaminánsok vagy káros adalékok csoportjából nitrit-, szulfit- és hormonszenzorok ismeretesek. Ily módon igen nagy igény mutatkozik új bioszenzorok kidolgozására számos releváns élelmiszerbiztonsági paraméterre. A kereskedelemben kapható kevés számú bioszenzor elsősorban klinikai alkalmazásra, biológiai minták elemzésére használható. A nagyszámú nemzetközi kutatócsoport által kidolgozott rendszereket nem validálták, így azok megbízhatósága és gyakorlati alkalmazhatósága kétséges A projekt során többféle vizsgálati technika kerül alkalmazásra. Az ezekre vonatkozó naprakész ismereteket mutatjuk be röviden az alábbiakban. 1. Amperometriás bioszenzorok A műszer felépítése és működésének elvi lényege: Az Egerfood Regionális Tudásközpont bioszenzor-fejlesztő laboratóriumában kiépítettünk egy új, a korábbiakhoz képest sokkal jobban használható bioszenzor rendszert, mely átfolyó rendszerű, így folyamatos elemzésre alkalmas, valamint az enzimcella és az elektródtér elkülönül, a komponensek detektálása amperometriásan történik. A mérés kétféleképpen történhet, egyrészt az enzimcellában lejátszódó enzimkatalizált kémiai reakció során keletkezett elektroaktív anyag (pl. hidrogén-peroxid) okozta áramerősség-változás detektálásával, másrészt, ha a szubsztrát maga is elektroaktív az enzimreakció okozta koncentráció-változás miatti jelcsökkenés detektálásával.

36

Mérhető szubsztrátok köre A rendszer minden olyan vegyület elemzésére alkalmas, melyhez rendelhető oxidációsredukciós enzim. Munkánk elsősorban a funkcionális és a sportélelmiszerekben fokozott jelentőségű antioxidánsok és polifenolok vizsgálatára fog irányulni, mivel ezek kifejezetten érzékenyek a gyártás körülményeire és a fogyasztó nem érzékelheti azt, hogy ha a funkcionális hatóanyag átalakul, degradálódik. Ezen túlmenően a biogén aminok analízisének szentelünk nagy teret, hiszen fontos élelmiszerbiztonsági indikátorokról van szó. 2. Quartz Crystal Microbalance (QCM) műszer A műszer működésének elvi lényege A kvarckristály mikromérleg a kvarc piezoelektromos tulajdonságai alapján méri a felszínen végbemenő tömegváltozást. A QCM működése a tömeglerakódás okozta frekvencia-változáson alapul. Számos tanulmány kiemeli a műszer egyszerűségét és költséghatékonyságát a többi technikához képest. Alkalmazását tekintve az egyik legfontosabb szempont, hogy gyors, egy lépésben elvégezhető, jelölésmentes detektálást tesz lehetővé. A QCM technika érzékeny és szelektív kimutatási módszer, mely az időigényes, napokig tartó hagyományos mikrobiológiai eljárásokkal szemben lehetővé teszi nagyszámú élelmiszerminta egyszerűen kivitelezhető, pár órán belüli ellenőrzését. A műszer felépítése, részegységei a: puffer ; b: perisztaltikus pumpa e

b

a

c

c: injektor ; d: átfolyó cella ;

f

d

g

i

h

e: hulladék ; f: oszcillátor ; g: analizátor ; h: potenciosztát

A

Mérhető szubsztrátok köre

i: PC

aa ee aa

A szenzortípust elsősorban immunszenzorként alkalmazzák, antigén-antitest kötődés vizsgálatára. Élelmiszerminőségi vizsgálatokban elsősorban GMO-k, patogén baktériumok, valamint toxinok azonosításánál alkalmazható. Projektünk során optimalizált immunizálási eljárással fogjuk termeltetni azokat, mivel a vizsgálandó probiotikus baktériumok tekintetében nem érhetőek el kereskedelmi forgalomban levő készítmények. A probiotikus bifido-, és tejsavbaktériumok túl patogén csíraszám meghatározására fejlesztünk ki mérőrendszereket. 3. Electrochemical Optical waveguide light-mode spectroscopy (EC-OWLS) műszer fejlesztése A műszer működésének elvi lényege Az optikai hullámvezető fénymódus spektroszkópia (OWLS) egy olyan szenzortechnika, amely lehetővé teszi a határfelületen lejátszódó folyamatok valós idejű, jelölésmentes vizsgálatát. Az integrált optikai hullámvezető szenzor alapját a chip adja, amely egy kb. 200 nm vastagságú üveglemezre felvitt nagy törésmutatójú SiO2-TiO2 rétegből áll, amelyben finom optikai rácsot alakítanak ki. Ez az optikai rács csatolja be a méréshez használt lineárisan polarizált He-Ne lézer fényt a hullámvezető rétegbe egy pontosan meghatározott szögnél. A becsatolás szöge jellemző a felületen lezajló folyamatokra (adszorpció, deszorpció). A becsatolás szöge a felületen található 37

anyag és a szenzor komplex törésmutatójának függvénye. A becsatolt fény teljes visszaverődések sorozatával terjed a hullámvezetőben, intenzitását pedig fotodiódákkal detektáljuk. A becsatolás szöge pontosan meghatározható, belőle pedig a felületen megkötött anyag rétegvastagsága, törésmutatója, egységnyi felületre eső mennyisége számolható. A chip felépítése, részegységei, az OWLS sematikus működése v izsgált minta antigén antitest

100 - 150 nm

hullámv ezetô

lézerfény EM mezô megoszlása

üv eg hordozó

Mérhető szubsztrátok köre Az OWLS szenzor-technika alkalmas fehérjék felületi adszorpciójának vizsgálatára, kémiai szenzorként különböző gázok mérésére, antitest/antigén, illetve ligandum/receptor kötődés vizsgálatára, immunszenzorként antigének, illetve antitestek mérésére, fehérje - DNS kölcsönhatás tanulmányozására. A mérési technika alkalmas mikotoxinok (Aflatoxin, DON, NIV, fumonizinek) elemzésére, amire mi is alkalmazni kívánjuk ezt a szenzortípust. A hazai kutatások jelentősége nemzetstratégiai szempontból A világviszonylatban egyre frekventáltabb bioszenzor-kutatás Magyarországon csak igen kevésé nyert teret, habár neves magyar kutatók, mint pl. Pungor Ernő, Inzelt György, Tóth Klára aktív és elismert tagjai ennek a nemzetközileg elismert kutatóterületnek. Jelenleg az Egerfood Regionális Tudásközpont mellett kizárólag a KÉKI kétfős kutatócsoportja foglalkozik új szenzorok kifejlesztésével. A szegedi, illetve pécsi egyetemeken főként a 90-es években folytak bioszenzorok részegységeivel kapcsolatos tudományos vizsgálatok, azonban ezen munkák a folyamatok precíz leírásán túlmenően nem vezettek új, saját fejlesztésű műszerek kialakításához, illetve termékszabadalmak létrehozásához. Ily módon a fejlesztések gyakorlati alkalmazásának a lehetősége korábban fel sem vetődött. Ezen a helyzeten lényegesen fog javítani az Eszterházy Károly Főiskolán folyó bioszenzor fejlesztési tevékenység megerősítése. A létrejövő kísérleti bioszenzorok ipari, kereskedelmi gyakorlatban alkalmazható prototípusok kifejlesztésének lesznek alapjai, melyek már az élelmiszerbiztonsági rendszerbe állításuk tényével is fokozni fogják a hamisításokkal szembeni visszatartó erőt. Konzorcium saját korábbi eredményei Az Eszterházy Károly Főiskolán 6 éve folyik nemzetközi publikációkban és szabadalmakban testet öltő, több külföldi egyetemmel együttműködésben megvalósuló kutatási tevékenység bioszenzorok élelmiszerbiztonsági célú alkalmazásának megalapozására. A jelenleg hatfős csoport összesen 15 szakcikkben és 36 nemzetközi konferencia előadásban, ill. poszteren tette közzé eredményeit, valamint 2 szabadalom is született munkájuk eredményeként.

38

Részlépések és alkalmazott módszerek 3.1. Új biotechnológiai módszerek kifejlesztése enzimek és antitestek előállítására 3.1.1. Antioxidánsok és polifenolok mérésére alkalmas amperometriás bioszenzor fejlesztéshez szükséges enzimpreparátumok előállítása o Megfelelő enzim termelésére alkalmas organizmusok feltárása (növények és mikrobák) és az enzimexpresszió összehasonlító vizsgálata. o Az enzim kinyerésének és tartósításának megoldása: extrakciós modellkísérletek, enzimtisztítási eljárások, stabilizálás eltérő komponensekkel. o Az enzimaktivitás optimalizálása a körülmények kísérleti úton történő beállításával. 3.1.2. Probiotikus és patogén baktériumok QCM és OWLS bioszenzorokkal való kimutatására alkalmazható antitest előállítási folyamatának fejlesztése o Antigén-előállítási eljárások összehasonlító értékelése a bioszenzorokban való alkalmazás feltételeit alapul véve. o Poliklonális antitestek előállítási módszerei hatékonyságának vizsgálata a bioszenzor fejlesztés tekintetében. o Az antitestek antigén-reakciónak bioszenzoros reakcióban való specifikusságát meghatározó körülmények tanulmányozása. o Az immunkreakciók kinetikájának vizsgálata o Poliklonális vizsgálata.

antitest-preparátumok

specifikusság

növelése

lehetőségeinek

3.2. Enzim- és immunreakciók alkalmazása bioszenzorokban (elektródok készítése, reakciócella kidolgozása, technológiai, műszaki paraméterek optimalizálása) 3.2.1. Antioxidáns méréshez alkalmas amperometriás bioszenzorhoz szükséges elektród fejlesztése o Megfelelő enzim termelésére alkalmas organizmusok (növények és mikrobák) vizsgálata o Enzimpreparátumok stabilitási, szelektivitási és reprodukálhatósági jellemzőinek meghatározása a reakciókörülmények széles tartományában, kinetikai jellemzők meghatározása. o Az enzimek különböző való rögzítési módjai (kovalens kötés, keresztkötés, redox hidroxigélbe ágyazás, elektropolimerizáció) vizsgálata. o A fehérjéknek a hordozó felületen való, a termékre jellemző reakciókörülmények között optimális rögzítési módjának (kovalens kötés, keresztkötés, redox hidroxigélbe ágyazás, elektropolimerizáció) meghatározása. o

A szenzorkiegészítők (mediátorok, stabilizálók, aktivátorok) optimalizálása.

o A szenzorkiegészítők (mediátorok, stabilizálók, aktivátorok) optimalizálása. o Egy és két munkaelektródos amperometriás szenzor összeállítása átfolyó cellával. o A szenzorok általános jellemzőinek meghatározása a komponensenként eltérő reakciókörülmények között. (Enzimaktivitás megőrzése, a szenzor élettartama,

39

érzékenység, az érzékelési határok, általános elektrokémiai paraméterek és az impedancia karakterisztika értékelése). o A kémiai-biológiai reakció során kontrollálni kell az áramlás sebességét, a folyadék koncentrációját, a hőmérsékletet, a pH-t stb., illetve be kell állítani az elektrokémiai cella paramétereit és mérni a cella elektromos jeleit a termék tulajdonságainak megfelelően. o Új elektród kondícionálási technikák kidolgozása, az elektród felszínének módosítása, a felszín-jel viszonyának meghatározása. Hatékony felszínregeneráló eljárás kifejlesztése. o Az átfolyó cella speciális kialakításával kialakításának lehetőségének vizsgálata.

turbulencia-mentes

áramlás

o Az elektromos jelfeldolgozás kidolgozása, az oszcillátor és analizátor zavaró hatásainak kiküszöbölése. o Kidolgozzuk a korlátozott erőforrásokkal (processzorteljesítmény, memória, tápellátás) rendelkező eszközben alkalmazható jelfeldolgozási algoritmusokat a bioszenzorok jeleinek fogadására és feldolgozására. o A bioszenzorok műszerbe integrálásához feltétlenül szükséges a szenzorok jelátvitele technikai vonatkozásainak kidolgozása. 3.3.QCM és OWLS bioszenzorokban alkalmazható antitestek előállítása 3.3.1. Antitestek különböző felületeken való rögzítési módjai specifikussággal és stabilitással való összefüggéseinek vizsgálata. 3.3.2. A szilanizálási folyamat paraméterei antigén-antitest reakció specifikusságára gyakorolt hatásának felmérése. 3.3.4. A szenzorspecifikuság mérési körülményektől való függésének meghatározása (pH, hőmérséklet, ionerősség). 3.3.5. A szenzorspecifikuság mintaelőkészítéstől való függésének meghatározása. 3.3.6. A kifejlesztett rendszer igényeinek megfelelő mintavételezési eljárás kidolgozása. 3.3.7. A működési paraméterek meghatározása, optimálása. 3.3.8. Kimutatási határ, lineáris mérési tartomány meghatározása. 3.3.9. Reális minták elemzésében való alkalmasság vizsgálata. 3.4. Hordozható bioszenzor prototípusok összeállítása, validálása in-situ vizsgálatokhoz 3.4.1. A kialakított bioszenzor modulok összekapcsolása történik meg a vizsgálandó folyadékfázisú anyag áramlását biztosító precíziós pumpával, a műszer vezérlését végző alaplapon. 3.4.2. A perisztaltikus pumpa, injektor, átfolyó cella, oszcillátor, QCM analizátor, potenciosztát, PC illesztés valorizációja. 3.4.3.

Folyadékáramoltatási, működtetésére.

mintakezelési

rendszer

kidolgozása

a

bioszenzorok

3.4.4. A vezérlő szoftver feltöltését követően elvégezzük a műszer validálását először laboratóriumi mintákon és körülmények között, majd a kezelő személyzet betanítását követően üzemekben, valós feltételek mellett.

40

3.4.5. A különböző típusú szenzorok integrálási lehetőségeinek tanulmányozása, műszaki alternatívák kidolgozása az egymást korlátozó mérési körülmények összehangolására. 3.4.6. A műszer prototípusának véglegesítése, a műszer részletes műszaki és kezelési dokumentációjának előállítása.

Az alprojekt várható eredményeinek hasznosítása Hosszú távú hasznosítás Orvosi, élelmiszeripari, kereskedelmi, ill. laboratóriumi szolgáltatási gyakorlatban is alkalmazható bioszenzorok kifejlesztése. A létrehozott új eljárásokkal és szenzorokkal nyert adatok integrálhatóak az eredetvédelmi adatbázisba, így nagyban fokozható a vizsgált élelmiszerek biztonsága és származásának helyes megállapítása. Az újszerű biotechnológiai eljárások széles körben alkalmazást nyerhetnek.. A kidolgozott műszaki, műszertechnikai újítások elvezethetnek egy miniatürizált bioszenzor műszercsalád kifejlesztéséhez, mely kiválóan adaptálható helyszíni vizsgálatokra. Tudományos alkalmazhatóság 12 új mérési eljárás, illetve 6 új bioszenzorikus műszer egyaránt alkalmas biokémiai, molekuláris biológiai és analitikai folyamatok követésére. A megcélzott szubsztrátokra szelektív bioszenzorok kifejlesztéséhez szükséges feltárni specifikus biokémiai és biofizikai összefüggéseket (enzimaktivitás befolyásolási módjai, immunreakciók kinetikája, mikróbák és enzimek adszorpciója), melyek sokrétűem alkalmazhatóak a tudomány számos területén. Az egyes specifikus enzimek és antitestek új vagy továbbfejlesztett előállítási módozatai nem kizárólag bioszenzorfejlesztési célú kutatásokhoz alkalmazhatóak. A bioszenzorokban alkalmazott, egyedi úton előállított antitestek és enzimek nem csak bioszenzorfejlesztésre, hanem pl. orvostudományi vagy gyógyszerészeti kutatásokra is igénybe vehetőek. A műszertechnikai újítások analitikai eszközök szélesebb köre esetén is alkalmazhatóak. Összefüggés a projekt más kutatási programjaival Az 1. kutatási program során felállított paraméterkomplexben megadott kritikus alkotókra specifikus fehérjék előállítására vonatkozó vizsgálatok ebben az alprojektben kerülnek elvégzésre. A 4. kutatási program során megállapított, a funkcionális és sportélelmiszerekre specifikus technológiai körülmények figyelembe vételével kerülnek kijelölésre a vizsgálandó tényezők és azok tartományai. A 4. kutatási programban kidolgozandó hatékony mérőeszközök kifejlesztése az e programban szerzett ismeretek alapján történik meg.

41

4. Kutatási alprojekt In vitro élettani modellvizsgálati rendszerek kifejlesztése az élelmiszer komponensek biológiai hasznosulának és esetleges toxikus hatásának jellemzésére, illetve a biztonsági és eredetvédelmi adatbázis bővítésére Az alprojekt lényege Az alprojekt elsődleges célja, hogy humánélettani, ill. azt modellező vizsgálatokkal nyerjünk hiteles és tényszerű információkat a funkcionális és a sportélelmiszerek hatóanyagainak tényleges hasznosulása mértékéről, illetőleg a kontaminánsok negatív hatásairól. Ily módon új paraméterekkel gazdagíthatjuk az eredetvédelmének és biztonságossági adatbázist, hiszen az adott termék élettani előnyeiről, vagy éppen biztonságáról többet mond a tényleges biológiai hasznosulás vagy károsodás mértékének a megállapítása, mint a kémiai koncentráció. Ezen tulajdonképpeni új paraméterek kiegészülve a klasszikus módszerekkel nyert hatóanyag és kontamináns koncentrációkkal egy komplex rendszert képezve hitelesen jellemzik egy adott élelmiszer biztonságos voltát és a vele kapcsolatosan tett állítások megbízhatóságát. Ezen újszerű paraméterekhez mesterséges emésztési, szövettenyésztési és antioxidáns felvételi modellvizsgálati rendszerek kidolgozása és alkalmazása által jutunk.

Az alprojekt során elérendő célok 1. Új, sokoldalúan alkalmazható mesterséges emésztési modellrendszer felhasználásával történjen a bioaktív anyagok hasznosulásának, ill. a kontaminánsok, valamint allergének emésztési folyamatokra gyakorolt hatásának elemzése. Ezen új rendszer az eddigieknél nagyobb pontossággal szimulálja a valós folyamatokat, valamint képes az életkorfüggő eltérések érvényesítésére, így egyedi és új paraméterekkel bővítjük az élelmiszerbiztonsági adatbázist. 2. Emésztés során keletkező citotoxikus, ill. allergén anyagok jelentette veszélyek felmérésére alkalmas szövettenyésztéses eljárás álljon rendelkezésre, így új vizsgálatokkal és információkkal tudjuk jellemezni az adott termék biztonságát. 3. Átfogó képet kapjunk a rekreációs testmozgás antioxidánsok felszívódására és hasznosulására gyakorolt hatásáról, mely az élelmiszerbiztonsági-termékazonosítási rendszerünkben megjelenik, mint a magas hozzáadott értékű termék biológiai előnyét tényszerűen alátámasztó lényeges, egyedi információ. 4. A pulzáló mágnesterápia mint gyorsan terjedő új rekreációs eszköz antioxidánsok felszívódására, valamint az emésztési folyamatra gyakorolt hatásának feltárása széles körben segítse elő ezen eszközben és a funkcionális, ill. sportélelmiszerekben rejlő lehetőségek hasznosulását. Ily módon a fenti módszert egyess funkcionális élelmiszer csoportok biológiai hatásának fokozását elősegítő faktorként szerepeltetjük a termékazonosítási adatbázisban.

Fő kutatási irányok 1. Mesterséges emésztési modell továbbfejlesztése funkcionális és sportélelmiszerek átfogó vizsgálatára: a. emésztőenzimek és aktivátoraik optimális arányának megállapítása, b. három eltérő életkornak megfelelő emésztőnedv-termelés szimulálása, 42

eltérő

összetételű

és

mennyiségű

c. 6 fajból álló genotobiotikus bélmikrobiota modell felállítása és az optimális induló csíraszámarányok meghatározása, d. komplex emésztési modell típusok kidolgozása a különböző fejlesztési irányok integrálásával 2. Az allergének, valamint élelmiszerkontaminánsok és toxikus anyagok élettani hatásának modellezésére szolgáló szövettenyésztési modellvizsgálati rendszer kidolgozása. 3. Antioxidáns anyagok és azokat tartalmazó élelmiszerek sportélettani hatásának felméréséhez szükséges módszerek kifejlesztése, melyek révén meg lehet határozni, hogy milyen mértékben hasznosulnak a sportélelmiszerekben lévő antioxidánsok különböző intenzitású terhelés esetén. 4. A rekreációs folyamat felerősítési lehetőségeinek tanulmányozása a mágnesterápia által javított antioxidáns felvétel és emésztési folyamat révén.

pulzáló

A munka újszerűsége és innovatív tartalma 1. A továbbfejlesztett in vitro modellel egyedülállóan fogjuk tudni felmérni, hogy az egyedi, magas hozzáadott értékű termékek bioaktív összetevői milyen változáson mennek át az emésztés során, ily módon a tényleges élettani hatásuk hogyan alakul az elvárthoz viszonyítva. Ennek köszönhetően tudatosan lehet kiválasztani a legkedvezőbb termékfejlesztési irányokat, technológiákat, illetve hatóanyag alkalmazási formákat. 2. Új élelmiszerbiztonsági, illetve termékazonosítási paraméterek kidolgozása az egyes bioaktív hatóanyagok vagy kontaminánsok tényleges biológiai hasznosulása mértékének becslése révén. 3. Specifikusan kifejlesztett szövettenyésztési kísérletekkel a valóságos viszonyokat hitelesen tudjuk modellezni a felszívódás és a biológiai hasznosulás mértékét, illetve az esetleges toxikus hatást. 4. Életkorspecifikus funkcionális élelmiszer fejlesztéseket megalapozó, egyedi modellvizsgálati rendszereket fejlesztünk ki, melyeknél az egyes életkorokban megváltozott emésztőrendszer specifikumainak figyelembevételével lehet optimalizálni a termék hatóanyag összetételét. 5. Új módszereket fejlesztünk ki az antioxidánsok sportélettani hatásának felméréséhez. 6. Jelenleg nem ismert, hogy az egyes antioxidánsok, valamint az ezeket tartalmazó élelmiszerek hatását milyen irányban és milyen mértékben befolyásolja a szervezet aktuális terhelésének intenzitása. 7. A pulzáló mágnesterápia tekintetében még nem került feltárásra, hogy az miként befolyásolja az antioxidánsok felszívódását, hasznosulását, valamint az emésztési folyamatot.

Indokoltság Az utóbbi néhány évben megnövekedett az igény in vitro emésztési modellrendszerek kidolgozására, hogy szimulált gasztrointesztinális körülmények között kövessék nyomon az elfogyasztott élelmiszerek strukturális változásait, emészthetőségét, valamint a bioaktív komponensek biológiai hasznosulását. Az emésztés nagyon összetett biokémiai folyamatrendszer, melynek fiziológiai körülményeit igen nehéz pontosan reprodukálni, a legpontosabb eredményeket az emberi és az állati etetési kísérletek adják, azonban ezek időigényesek és rendkívül költségesek. Ennél fogva kompromisszumot kell kötni a pontosság és a könnyen felhasználhatóság között, ehhez jelentenek egy használható alternatívát az in vitro emésztési modellek az élelmiszerek gyors vizsgálatára. 43

A szabadgyökök természetes velejárói életünknek, amelyek belső és külső körülmények hatására is keletkezhetnek. Belső tényező lehet például az abiotikus stressz, külső faktorok közül jelentősek a különböző stressz hatások, környezet szennyezés, dohányzás. Érdekes módon nem csak káros hatások által keletkezhetnek, hanem a testedzés is egy magasabb szabad-gyök termelés beindítását eredményezi. Ekkor azonban beindul a megfelelő antioxidáns termelés, ezzel mintegy ellenállóbbá téve a szervezetet. Az utóbbi időben egyre több módszer terjedt el az élelmiszerek és különböző biológiai rendszerek antioxidáns kapacitásának mérésével kapcsolatban, napjainkra már több száz variánsuk ismeretes. Az antioxidánsok túlzott bevitele felboríthatja az emberi szervezet természetes védekezőképességét, a túl kevéssel pedig elmulaszthatjuk bizonyos betegségek kivédését. A szabadgyökök ellen megfelelő védelmet az antioxidánsok nyújtanak, melyek egy részét a szervezet termeli meg, de előfordulnak olyanok is, melyeket csak a táplálkozással tudunk bejuttatni. Elsősorban ezeket hivatottak pótolni a magas antioxidánstartalmú funkcionális és sportélelmiszerek. A rekreáció egyik legújabb, intenzíven terjedő eszközei az alacsony erősségű pulzáló mágneses teret előállító berendezések. A mágneses tér pulzálása elsősorban a mikrokeringés serkentése révén fejti ki jótékony hatását, melynek köszönhetően a stressznek, károsodásnak kitett szövetek jobb tápanyag-(elsősorban oxigén-) ellátáshoz jutnak. Így közvetetten, de nyilvánvalóan befolyásolhatja a vér és a szövetek antioxidáns státuszát. Azonban ennek iránya, egyensúlya eddig nem vizsgált területe ennek a sok tekintetben már tudományos igénnyel is igazolt hatású eszköz hatásának.

Nemzetközi előzmények A mesterséges emésztési modellekkel kapcsolatos kutatási irányok A leggyakrabban használt biológiai molekulák az emésztési rendszerekben az emésztő enzimek (pankreatin, pepszin, tripszin, kimotripszin, peptidáz, α-amiláz, lipáz), epe sók és mucin. A különböző enzimek egymást követően vannak hozzáadva a rendszerhez, nem egyszerre, így szimulálva az emésztési folyamat különböző lépéseit. Az egyes módszerek szofisztikáltsága, hogy hány lépcsős az emésztési folyamat illetve milyen enzimeket használnak mindig az adott tanulmány céljától függ: Vizsgált paraméter keményítő emészthetőség szorgum protein emészthetősége pektin gél képződés vas felvehetőség rozskenyérből oxalát meghatározása tarógyökérből heterociklikus aminok meghatározása főtt húsból szója izoflavonoidok fementációja

Enzimek, hozzáadott anyagok α-amiláz

Lépések száma 1 - vékonybél

Emésztési idő 0-180 perc

pepszin

1 - gyomor

0-120 perc

pepszin, sósav, pankreatin pepszin, pankreatin, epesó α-amiláz, mucin, BSA, pepszin, pankreatin, lipáz, epesók amiláz, pepszin, pankreatin

2 – vékonybél 2 – vékonybél 3 – száj, vékonybél

sósav, epe

pankreatin,

Referencia

gyomor,

5 perc, 2 h, 2 h

gyomor,

10 perc, 30 perc, 3,5 h

Bravo et al. (1998) Nunes et al. (2004) Polovic et al. (2008) Bering et al. (2006) Savage and Catherwood (2007) Kulp et al. (2007)

5 – gyomor, vékonybél, vastagbél: felszálló-, haránt-, leszálló ág

2 h, 6 h, 18 h, 36 h, 22 h

De Boever et al. (2000)

3 – száj, vékonybél

44

gyomor, gyomor,

15 perc, 1-25 h 1 h, 1 h

Szövettenyészetek allergének, ill. citotoxikus anyagok vizsgálatára való alkalmazása A legkorszerűbb technikáknál humán sejtvonal modellekben: Caco-2, a HT29, ennek nyálkát termelő változata a HT-29-MTX sejvonalakkal ún inszerciós technológiát alkalmaznak. Az e célra kifejlesztett többrétegű berendezés felső karmájába pipetázzák az emésztett élelmiszer mintát durva szűrést követően. E kamra alján, dialízis membránon egy sejtréteg vastagságban bélhámsejtek ülnek, ezeken keresztül a fiziológiás körülmények során is átszűrődő anyagok az alsó kamrába abszorbeálódnak (Sabboh-Jourdan, H. et al., 2011, Mahler et al., 2009). A vizsgált anyagok transzportját folyamatos mintavétellel HPLC analízissel követik nyomon, valamint ellenőrzik az immunmoduláns hatású anyagok, pl. az allergének által indukált interleukintermelést, továbbá mikroszkópos vizsgálattal citotoxikus károsodások bekövetkezte is felismerhető (Gardinali, A., et al., 2011). Az antioxidánsok élettani hatásával kapcsolatos kutatási irányok Szoros a kapcsolat a sejtek metabolizmusa és a képződő szabadgyökök között, hiszen a sejtekben az egyik legnagyobb gyöktermelő a mitokondrium, melyben az aerob energia nyerés során szabadgyökök is képződnek. Az első testedzéssel kapcsolatos vizsgálat, jelentős mennyiségű szabadgyököt mutatott ki a vázizom mitokondriumában a kimerülésig végzett futás hatására, melyet elektron spin rezonanciával vizsgáltak (Davies et al., 1988). A mozgás következtében hatékonyabban lebontott fehérjék csoportjához tartozik a béta-amyloid, melynek a felszaporodása az Alzheimer betegség oka és ennek a betegségnek nagyon súlyos funkcionális következményei vannak (Lazarov et al., 2005). Hasonlóan fontos szerepe van a testedzésnek a Parkinson kór esetén is. Mindkét betegség jelentős oxidatív stresszt jelent az idegsejtek számára és a testedzés által indukált magasabb aktivitású antioxidáns rendszerek védelmet jelentenek (Radák, 2008).

Hazai és intézményi előzmények Fritz Péter és munkatársai a Semmelweis Egyetemen folytattak részletes vizsgálatokat különböző nagy antioxidáns tartalmú étrendkiegészítőknek az eltérő egészségügyi állapotú egyének antioxidáns státuszára gyakorolt hatásáról. Intézményi előzmények Az Eszterházy Károly Főiskola Egerfood Regionális Tudásközpontjában országosan is kiemelkedő eredményességű és intenzitású munka folyik mesterséges emésztési modellek fejlesztése. Jelenleg 6 enzim, 3 aktivátor és 9 ásványi só speciális kísérletekben megállapított protokoll szerinti alkalmazásával működő rendszerben, ill. 4 különböző fajhoz tartozó bélbaktériummal modellezik a vastagbélben végbemenő folyamatokat. A főiskola Sporttudományi Intézetében több éve folynak intenzív sportélettani vizsgálatok az egyes fiziológiai paraméterek és sportolás intenzitása, illetve milyensége közötti összefüggés feltárása vonatkozásában.

45

Részfeladatok és alkalmazott módszerek 4.1. A ténylegesen hasznosuló hatóanyag arány megállapítását célzó mesterséges emésztési modell kifejlesztése az enzimek optimalizálásával: új paraméter az eredetvédelmi-élelmiszerbiztonsági adatbázisban A részfeladat célja Az emberi emésztést az eddig alkalmazott módszerekénél nagyobb pontossággal modellező renndszer álljon rendelkezésre élelmiszerek bioaktív anyagai és kontaminánsai élettani hatásának in vitro vizsgálatához, a tényleges biológiai hasznosíthatóság becslésére. A kutatás lépései 4.1.1. Különböző eredetű enzimek aktivitását befolyásoló tényezők felmérése o Különböző eredetű (emberi, állati, növényi) enzimek (α-amiláz, mucin, pepszin, kimotripszin, pankreász amiláz, tripszin, lipáz) működését befolyásoló fizikaikémiai tényezők (koncentráció, hőmérséklet, pH, rH, inhibitorok, inkubációs idő) hatásának vizsgálata. 4.1.2. A kiválasztott enzimekre specifikus aktivátorok optimális koncentrációjának meghatározása o Az aktivitást módosító komponensek (koenzimek, epesavak, sók, BSA) mennyiségének optimalizálása. 4.1.3. Különböző összetételű élelmiszereknek megfelelő enzim-aktivátor komplex arányainak kidolgozása o A valamely fő alkotót az átlagosnál nagyobb arányban tartalmazó emésztendő anyag (szénhidrátban, fehérjében vagy zsírban gazdag) összetételének megfelelő specifikus összeállítású rendszer kidolgozása. A hasznosulást jellemző paraméter kidolgozása. A részfeladat várható újdonságtartalma Az általunk kifejleszteni kívánt emésztési modellel az eddig létezőeknél nagyobb pontossággal tudjuk az élelmiszerek és kontaminánsok való élettani hatását jellemezni. Az új rendszer a korábbiaknál összetettebb: legalább hat enzim, és 5 különböző kofaktor együttes hatásának vizsgálatára épül. Az új in vitro biokémiai modellrendszerben alkalmazott komponensek a korábbitól eltérő arányban vannak jelen. 4.2. Életkorspecifikus gasztrointesztinális modellek kidolgozása a hatóanyagok hasznosulása átfogó jellemzése és specifikus éllemiszerbiztonsági paraméterek nyerése érdekében A részfeladat célja A fő életszakaszok (gyermekkor, felnőttkor, időskor) jellemzően eltérő összetételű és hatékonyságú emésztőnedv-termelését alapul vevő, azt modellező rendszerben történjen meg az élelmiszerek bioaktív anyagai és kontaminánsai élettani hatásának in vitro vizsgálata. Ily módon specifikus új paraméterekkel tudjuk az élelmiszerbiztonsági adatbázist bővíteni. A kutatás lépései 4.2.1. Az egyes életkorokra jellemző enzimösszetétel aktivitását befolyásoló tényezők felmérése

46

o Fizikai-kémiai tényezők hatásának vizsgálata az egyes enzimeket eltérő arányban, ill. az emésztőnedveket különböző mértékben csökkentett mennyiségben tartalmazó rendszerben. 4.2.2. A specifikus aktivátorok egyes életkorokra jellemző eltérő mennyisége emésztési hatékonyságra gyakorolt hatásának felmérése o Az emésztés hatékonyságának, időigényének felmérése az aktivitást módosító komponensek (koenzimek, epesavak, sók) életkoronként eltérő mennyisége mellett. 4.2.3. Különböző főkomponensek túlsúlyával jellemezhető élelmiszereknek emészthetőségének hatékonyságának vizsgálata gyermek- és időskorban o Az adott fő összetevőben az átlagosnál gazdagabb emésztendő anyag összetétele és a lebontás hatékonysága közti összefüggésének feltárása gyermek- és időskorra jellemző emésztőnedv-összetétel mellett. A hasznosulást jellemző paraméter kidolgozása. A részfeladat várható újdonságtartalma Az egyes életkorokat specifikusan jellemző, eltérő emésztőnedv-összetételű gasztrointesztinális rendszerek jelenleg nem léteznek, így új megközelítéssel és paraméterrel jellemezhetjük a komponensek felvehetőségét.

4.3. Új összetételű in vitro emésztési rendszer kidolgozása a vastagbél mikrobiológiai folyamatainak modellezésével a biológiai hasznosulást jellemző új paraméterek nyerése céljából A részfeladat célja A legfontosabb és nagy számban jelen lévő mikroorganizmus tömeg a gasztrointesztinális traktuson belül a vastagbélben kolonizálódó bélmikrobiota, melynek optimális összetétele és működésének hatékonysága nagymértékben meghatározza az elfogyasztott táplálék élettani hatását. Így ennek a reálist minél nagyobb mértékben közelítő szimulációja nélkülözhetetlen az emésztési folyamat teljes körű modellezéséhez. A komponensek valós biológiai hasznosulásának mértéke fontos paraméter az eredetvédelmi-élelmiszerbiztonsági adatbázisban. A kutatás lépései 4.3.1. Hat fajból álló bélmikrobiota kompetíciós viszonyainak tanulmányozása különböző induló csíraszámarányok mellett o A jelenleg 4 fajból álló rendszer egy probiotikus és egy patogén faj bevonásával 6 tagúra bővítése mellett megvizsgáljuk, hogy milyen irányban módosul a 48 órás fermentáció során kialakuló záró csíraszámok értéke eltérő induló csíraszámok mellett. 4.3.2. Különböző főkomponensek túlsúlyával jellemezhető élelmiszerek emésztése során keletkező anyagok mikrobiota összetételre gyakorolt hatásának felmérése o A csíraszám-változás tendenciában bekövetkező különböző összetételű, emésztett tápanyagok esetén.

módosulások

felmérés

4.3.3. A tápanyag-összetétel és a hattagú mikrobiota anyagcsere-aktivitása közti összefüggések feltárása

47

o A gáz-, a rövidláncú zsírsav- és a vitamintermelés felmérése eltérő összetételű tápanyagok optimális emésztőnedv-kompozíció melletti emésztése során. A hasznosulást jellemző paraméter kidolgozása. A részfeladat várható újdonságtartalma Jelenleg nem létezik hat fajt alkalmazó genotobiotikus modell a vastagbélben történő folyamatok, így a biológiai felvehetőség modellezésére. Ebből fakadóan új élelmiszerbiztonsági paramétert is nyerünk. 4.4. Komplex in vitro emésztési rendszer összeállítása a korábbi fejlesztési lépések eredménye alapján átfogó élelmiszerbiztonsági paraméter kifejlesztésére A részfeladat célja A korábbi részfeladatokban nyert eredmények integrálása és komplex in vitro biokémiai rendszer kidolgozása az optimalizált emzin-kombinációk és mikroba-összetételek alkalmazásával. A komponensek valós biológiai hasznosulásának mértékét komplexen és átfogóan jellemző paraméter kidolgozása. A kutatás lépései 4.4.1.

A különböző életkorokra jellemző emésztőnedv-összetétel csíraszámarányaira gyakorolt hatásának felmérése

bélmikrobiota

o A hattagú vastagbél-mikrobiota modell záró csíraszám és anyagcsere-aktivitás változásainak vizsgálata az egyes életkorokra jellemző emésztőnedv-összetétellel emésztett tápanyagoknál. 4.4.2. Különböző főkomponensekben gazdag élelmiszerek eltérő hatásának vizsgálata az emésztési folyamatra és a komponensek hasznosulására o Az eltérő élelmiszer-összetétel különböző életkorok során a csíraszám és az anyagcsere-aktivitás változásaiban megnyilvánuló hatásának vizsgálata. 4.4.3. Különböző életkorokra és eltérő táplálék-összetételre specifikus modellek optimális protokolljának meghatározása o A 3 életkorra és 4-féle jellegzetesen eltérő összetételű táplálék vizsgálatához optimális modellek kiválasztása és validálása. A részfeladat várható újdonságtartalma Élelmiszerek emésztési folyamatainak in vitro tanulmányozására minden korábbinál sokrétűbben alkalmazható modellrendszer jön létre. Új megközelítéssel és egyedi paraméterrel jellemezhetjük a komponensek felvehetőségét, tényleges biológiai hasznosulását, mely döntően meghatározza az élelmiszerbiztonságot. 4.5. Szövettenyészeti modell felállítása élelmiszerek emésztése során keletkező bomlástermékek, bioaktív anyagok citotoxikus és immunmodulációs hatásának, illetve biológiai felvehetőségének értékelésére A részfeladat célja Olyan szövettenyészeten alapuló módszer álljon rendelkezésre, melynek alkalmazásával megbízhatóan értékelhető azon anyagok élettani hatása, illetve hasznosulása, melyek funkcionális és sportélelmiszerek eltérő feltételek mellett történő emésztése során keletkeznek. 48

A kutatás lépései 4.5.1. A citotoxikus, ill. immunmodulációs reakció mértékét befolyásoló tenyésztési feltételek meghatározása o Citotoxikus tüneteket és az interleukinok közé tartozó immunstimuláns anyagok termelését befolyásoló fizikai-kémiai tényezők vizsgálata. 4.5.2. A reakció mértékének felmérése tiszta állapotban alkalmazott, a funkcionális és a sportélelmiszerek során keletkező, feltételezhetően bioaktív anyagok esetén o Felmérjük, hogy az emésztés során nagy valószínűséggel keletkező, feltételezhetően bioaktív anyagok tiszta állapotában milyen mértékű reakciót váltanak ki a különböző szövettenyészettípusokban. 4.5.3. Az élelmiszermátrix bioaktív anyagok toxikus, ill. immunmoduláns hatására gyakorolt befolyásának felmérése o Különböző jellegű élelmiszerek emésztett változataiban különböző koncentrációban alkalmazott bioaktív anyagok hatására végbemenő változások követése műszeres mérésekkel. 4.5.4. Gabona- és tejfehérjék emésztése során keletkező anyagok immunmoduláns hatásának értékelése különböző eredetű, eltérő allergenicitású alapanyag-források esetében o Az 5., a 6. és a 7. alprojekt során létrejövő, alacsony allergén hatásúként azonosított alapanyagok (liszt, tej, tejtermékek) fehérjepreparátumainak, ill. a teljes élelmiszermátrixnak az emésztése során keletkező anyagok allergén hatásának értékelése szövettenyésztéses rendszerben. A kapcsolódó alprojektek eredményeinek validálása a létrejövő adatok alapján. 4.5.5. Antioxidáns hatású összetevőket tartalmazó funkcionális és sportélelmiszerek összehasonlító értékelése citotoxikus, ill. immunmoduláns hatásuk alapján o Az 5., a 6. és a 7. alprojekt során létrejövő, nagy antioxidáns tartalmúként azonosított alapanyagok, ill. termékprototípusok emésztése során keletkező anyagok citotoxikus hatásának értékelése szövettenyésztéses rendszerben. A kapcsolódó alprojektek eredményeinek validálása a létrejövő adatok alapján. A részfeladat várható újdonságtartalma Az emésztési során keletkező allergén, ill. toxikus anyagok hatásának értékelésére egyedi, eddig nem alkalmazott rendszer jön létre, melynek révén új módon validálhatjuk a kapcsolódó alprojektek során kifejlesztett módszereket. Új megközelítéssel és egyedi paraméterrel bővíthetjük az élelmiszerbiztonsági adatbázist, hiszen az új eredmények a ténylegesen fellépő toxikus hatást jellemzik. 4.6. Rekreációs testmozgás hatásának tanulmányozása különböző antioxidáns – kísérő anyag kombinációk felszívódására a szervezetben a biológiai hatás komplex jellemzésére A részfeladat célja Átfogó képpel rendelkezzünk a különböző intenzitású testmozgásnak az antioxidánsok felszívódásának és hasznosulási mértékére gyakorolt hatásáról. A kutatás lépései 4.6.1. Nagy antioxidáns kapacitású funkcionális és a sportélelmiszerek felszívódásának és hasznosulási mértékének mérésére szolgáló módszer kidolgozása 49

o A bevitel formája és a felszívódás, valamint a hasznosulás mértéke közti összefüggés időbeli lefutásának feltárására alkalmas módszertan kifejlesztése érdekében különböző időközönként vérből mért, antioxidáns kapacitással összefüggő paraméterek, valamint a vizelet antioxidáns tartalma kerül meghatározásra, valamint nem-invazív antioxidáns mérési eljárásokkal összehasonlításra. 4.6.2. A felszívódás és hasznosulás mértéke kémiai vegyületcsoportokkal való összefüggésének feltárása antioxidánsok könnyen felvehető formáinál o Izotóniás sportital formájában bevitt, különböző vegyületcsoportokba tartozó antioxidánsok felszívódásának és hasznosulásának mérése az előző lépés során kidolgozott módszerrel. 4.6.3. A kísérő anyagok antioxidáns felszívódásra gyakorolt hatásának vizsgálata o A sportélelmiszerekben leggyakrabban felszívódásának tanulmányozása különböző jelenlétében.

alkalmazott antioxidánsok kísérő anyag kombinációk

4.6.4. Az antioxidánsok felszívódási ütemének és hatékonyságának meghatározása különböző terhelési övezetekben végzett testmozgás mellett o Az antioxidánstartalmú sportélelmiszerből felvett antioxidáns mennyiség meghatározása három különböző terhelési övezetet (<65 %, 65-85 %, 85 %<) jelentő testmozgás során és azt követő különböző időtartamok elteltével. A részfeladat várható újdonságtartalma Új vizsgálati módszerekkel egyedi paramétereket nyerünk az antioxidánsok biológiai hasznosulására, ami felhasználható az élelmiszerbiztonsági adatbázisban.

4.6. Rekreációs célú pulzáló mágnesterápia különböző antioxidáns – kísérő anyag kombinációk felszívódására, valamint a prebiotikus anyagok hasznosulására a szervezetben a biológiai hatás komplex jellemzésére A részfeladat célja A pulzáló mágnesterápia mint fokozatosan terjedő, új rekreációs eszköz antioxidánsok felszívódásának serkentésében való potenciális szerepéről átfogó képet kapjunk a funkcionális és sportélelmiszerek szélesebb körű hasznosítása és biológiai hatása fokozása céljából. A kutatás lépései 4.6.1. A pulzáló mágnesterápia könnyen felvehető antioxidánsok hasznosulására gyakorolt hatásának felmérése o Izotóniás sportital formájában bevitt, különböző vegyületcsoportokba tartozó antioxidánsok felszívódásának és hasznosulásának mérése az előző részfeladat során kidolgozott módszerrel. 4.6.2 Különböző intenzitású pulzáló mágnesterápiás kezelés befolyásának vizsgálata a kísérő anyagok antioxidáns felszívódásra gyakorolt hatására o A sportélelmiszerekben leggyakrabban alkalmazott antioxidánsok felszívódásának vizsgálata különböző kísérő anyag kombinációk jelenlétében végzett eltérő intenzitású pulzáló mágneskezelés hatására.

50

4.6.3. Rekreációs testmozgást követő pulzáló mágnesterápiás kezelések antioxidáns felszívódási ütemre gyakorolt hatásának meghatározása o A 65-85 % közötti intenzitású, rekreációs tartományba tartozó testmozgást követően vizsgáljuk a szervezet antioxidáns státuszát különböző összetételű, a testmozgás előtt bevitt funkcionális és sportélelmiszer hatására különböző időzítésű és intenzitású mágnesterápiás kezelések mellett. A részfeladat várható újdonságtartalma Új módszerek kidolgozásával új információkat nyerünk az antioxidánsok hatásának fokozására, így elősegítjük a funkcionális és sportélelmiszerek szélesebb körű hasznosítását és biológiai hatásának erősítését. Komplex, új paraméterekkel tudjuk jellemezni a hatóanyagok biológiai hasznosíthatóságát.

Az alprojekt várható eredményeinek hasznosítása Hosszú távú hasznosítás Az adott termékek (újonnan kifejlesztettek vagy már bevezetettek) élelmiszerbiztonsága nagymértékben fokozható az alprojekt során kidolgozott eljárások felhasználásával. A vizsgálatok során nyert adatsorok termékazonosítási célú adatbázisban tárolva eredetvédelmi célra is felhasználhatóak. A testmozgás antioxidánsok felszívódását befolyásoló élettani hatásának megismerése révén olyan, célzottan a rekreációs terhelésnek megfelelő összetételű termékek lesznek kifejleszthetőek, melyek nagy biztonsággal nyújtják az elvárt hatást a fogyasztók számára, magas hozzáadott értékük és biológiai előnyeik egyértelműen bizonyítottak. A vizsgált és tudományosan bizonyított élettani hatások körének bővülése jelentősen elősegítheti a pulzáló mágnesterápiában mint rekreációs eszközben rejlő lehetőségek kiaknázását. Tudományos alkalmazhatóság Új módszerek, új vizsgálati technikák kerülnek kifejlesztésre az egyes élelmiszerek, illetve hatóanyagok tényleges biológiai hatásának és hasznosulásának felmérésére. Új megközelítéssel és egyedi paraméterekkel jellemezhetjük nem csak a biológiai felvehetőséget, hanem az esetleges toxicitást, melyek kiterjeszthetők bármely élelmiszerre. Az egyedi antioxidáns-kombinációk tényleges biológiai hatásának feltárása új eredményekkel gazdagítja a tudományos eredmények jelenlegi körét. Új, magas hozzáadott értékű termék prototípusok megalapozása, különös tekintettel az életkor-specifikus élelmiszerek egyedi elvárásáaira.. Összefüggés a projekt más kutatási programjaival A 2. projekt során kifejlesztett mérési eljárások révén megállapított antioxidáns értékek ezen alprojekt eredményeinek tükrében kerülnek validálásra. Az 5., 6. és 7. alprojekt során létrejövő új, alacsony allergénhatásúnak feltételezett élelmiszer-alapanyagok immunrendszerre gyakorolt hatása a jelen alprojekt keretében kerül elsődleges értékelésre a klinikai vizsgálatok előtt. Az egyes hatóanyag-kombinációkra, élelmiszertípusokra jellemző emésztési információk bekerülnek az 1. alprojekt keretében kifejlesztett eredetvédelmi adatbázisba.

51

5. Kutatási alprojekt Csökkentett allergénhatású, tej alapú új funkcionális élelmiszerek kifejlesztésének megalapozása, illetve az élelmiszerbiztonsági adatbázis bővítése új módszerekkel végrehajtott genomvizsgálatokkal, és fehérjeanalízissel Az alprojekt lényege A magas hozzáadott értékű tejtermékek biztonságát alapvetően meghatározza az allergén hatású fehérjék jelenléte. Kiemelkedő jelentőségűek azon kutatásaink, melyek a hazai juh-, és kecskeállomány szelektált egyedei által termelt tejféleségek kazeinjei és savófehérjéi polimorfizmusának feltárását célozzák, mivel így azonosítani tudjuk azon specifikus genotípusú egyedeket, melyek tejei nem allergén tejfehérje-változatokat tartalmaznak. Ebből következően rendelkezésre fognak állni klinikai tesztekkel is igazoltan csökkentett allergénhatású, tej alapú funkcionális élelmiszercsalád alapanyagai. A különleges alapanyagforrást biztosító ideális genotípusú egyedek tejfehérje komponensei és az egyéb fő komponensek közötti összefüggések, illetve lehetséges kölcsönhatások feltárása eredményeként eljuthatunk a fenntartható és állandóan magas minőségű termék-előállítás megalapozásához. A kutatás eredményeként olyan új, analitikai és molekuláris biológiai módszereket fejlesztünk ki, melyek jól alkalmazhatóak az értékes alapanyagok és az azokból előállított termékek eredetvédelmében, azonosításban is, valamint a kijelölt genotípusokkal kapcsolatos információk, és az egyedi fehérjemintázatok az eredetvédelmi adatbázisban is hasznosulnak.

Az alprojekt során elérendő célok 1. Megtörténjen azon hazai és Kárpát-medencei tejtermelésre hasznosított juh és kecske genotípus variánsoknak az azonosítása, melyek csökkentett allergénhatású tejet termelnek. Ezen specifikus genotípusú egyedek teje az élettani összefüggések vizsgálatán túl később termékfejlesztési tevékenységekre is felhasználható. 2. Specifikus genomvizsgálati adatokkal, illetve a termékazonosításhoz szükséges egyedi hatóanyag-összetételt leíró eredményekkel kibővített eredetvédelmi adatbázis álljon rendelkezésre. 3. Az alacsony allergenicitású tejfehérje-változatok és génjeik sorozatvizsgálatára célirányosan kifejlesztett, illetve továbbfejlesztett specifikus analitikai és molekuláris biológiai módszerek álljanak rendelkezésre. 4. Feltárjuk az alacsony allergenicitású tej termelési képessége és más élettani, ill. termelési tulajdonságok közti korrelációkat. 5. Részletes ismeretekkel rendelkezzünk a különleges minőségű tej komponenseinek a hagyományos termékgyártási technológiai folyamatokra (koaguláció, fermentáció, mikrobás utóérlelés, romlási jelenségek) gyakorolt hatásáról, mely lényeges a különleges tejkészítmények feldolgozhatósága és eltarthatósága szempontjából. 6. A emésztési, ill. in vitro allergológiai modellek kifejlesztése, mely alkalmazásával összevethető legyen egymással az egyes tejvariánsok és tejtermékek allergén hatása. 7. Klinikai körülmények között végzett rövid idejű allergiapróbák is alátámasszák az analitikai és in vitro tesztek eredményét a vizsgált tejek és tejtermékek alacsony allergenicitásáról.

52

Fő kutatási irányok 1. Molekuláris biológiai módszerek kifejlesztése az alacsony allergenicitású tejfehérjeváltozatok és génjeik sorozatvizsgálatára. 2. A hazai és Kárpát-medencei, tejtermelésre hasznosított juh és kecske állományok részletes vizsgálata olyan tejfehérje variánsokat termelni képes egyedek azonosítására, melyek csökkentett allergénhatásúak. Ezen egyedekből nyert tejeket alkalmazzuk további termékfejlesztésekre. 3. Az alacsony allergén hatású tej összetétele (kiemelten vizsgálva az aminosav és zsírsavtartalmat) és a tejtermelő állatok más élettani, ill. termelési tulajdonságai közti korrelációk vizsgálata. 4. A különleges minőségű tej összetétele és a hagyományos termékgyártási technológiák, valamint a tárolás során végbemenő fizikai, kémiai, biológiai folyamatok (koaguláció, fermentáció, mikrobás utóérlelés, romlási jelenségek) összefüggésének feltárása. 5. Előzetes allergológiai vizsgálatok végzése mesterséges emésztési modellel, illetve in vitro allergia tesztekkel. 6. Rövid idejű, klinikai körülmények között végzett dermatológiai allergiapróbák végzése a legkedvezőbb tejalapanyagok, ill. különböző frakcióik (beleértve a savó összetevőit is) és a belőlük készített kísérleti anyagok felhasználásával.

A munka újszerűsége és innovatív tartalma 1. Olyan alacsony allergén hatású tejet termelő juh- és kecskeállományok azonosítása, melyek révén lehetővé válik a nagyszámú tejfehérje-érzékeny fogyasztó számára alkalmas, különleges minőségű tej előállítása, illetve egyéb készítmények kifejlesztése. 2. Gyors, megbízható, nagy pontosságú módszerek alkalmazására épülő vizsgálati protokoll jön létre, mely jól alkalmazható juh- és kecskeállományok tejei fehérjeösszetételének, illetve az egyes egyedek genotípusainak a felmérésére. 3. Az élelmiszerbiztonsági adatbázis bővítése allergénfehérjékkel és egyedi genomokkal.

új

paraméterekkel:

specifikus

4. Mivel nem létezik részletes felmérés a Kárpát-medencére vonatkozóan a különböző fajtákhoz tartozó juh- és kecske állományok tejfehérje-összetételére, és genotípusaira vonatkozóan, új és egyedi adatbázist hozunk létre az alacsony allergenicitású tejet termelő fajtákból és egyedekből. 5. A különleges minőségű tejekből előállított alvadékféleségek összetételének a technológiai-fermentációs-koagulációs folyamatokkal való összefüggéseinek feltárása új eredményekkel támasztja alá a termékfejlesztési utak realitását. 6. A specifikus tejek és tejtermékek tényleges allergén hatásának feltárására, az egyes anyagok immunmoduláló hatásának megismerésére, illetve a csökkentett allergén hatás klinikai igazolására új in vitro emésztési, valamint továbbfejlesztett dermatológiai módszert dolgozunk ki.

Indokoltság A kutatási programot a funkcionális és a sportélelmiszerekkel kapcsolatos, ill. az élelmiszerbiztonság növelésére irányuló legkorszerűbb tendenciáknak megfelelően alakítottuk ki. Az alábbiakban azokat a szempontokat mutatjuk be röviden, melyek alátámasztják a téma aktualitását, valamint Magyarország számára való kiemelt jelentőségét.

53

A téma aktualitása Míg az emberiség egy része alultáplált, a másik része, melynek számára megfelelő mennyiségű és biztonságos élelmiszer áll rendelkezésre, egyre nagyobb mértékben élelmiszereredetű „civilizációs betegségekben” szenved. A humán táplálkozásban nagyon fontos szerepet tölt be a tej, ennek ellenére egyre többen hagyják el e termék fogyasztását, melynek oka a népesség körében jelentős hányadban jelen lévő tejallergia Ugyanakkor az egészséges táplálkozáshoz, különösen az élet első évtizedében, alapvetően szükség van arra a tápanyagra, ami a tejben megtalálható. Azonban ahhoz, hogy a tejben lévő tápanyaghoz az egyes tejfehérje frakciók jelenlétére érzékenyen reagáló emberek (tejallergiában szenvedők) is hozzá jussanak, olyan módszert kell kidolgozni, amelyik mesterséges beavatkozás nélkül kiiktatja e betegség kiváltóját a tejből. Az egyes allergiás reakciót kiváltó tejfehérje frakciók (αs1 kazein, αs2 kazein, β kazein, β laktoglobulin, és esetenként az αlaktalbumin) szerencsére sok variánsból állnak össze, és nem mindegyik variánshoz rendelhetők kedvezőtlen reakciók. A probléma társadalmi jelentősége Világviszonylatban a 3 év alatti gyerekek átlagosan 2,5 %-a szenved tehéntej allergiától, ez az érték azonban Skandináviában 7-8 % Host és mtsai szerint, míg Nestle írásában ez az arány a Föld egyes területein a 20 %-ot is meghaladja. Haenlein szerint a kecsketejjel történő kezelés a probléma 30-40 %-át is megoldhatja. A kazeinek és savófehérjék genetikai polimorfizmusainak változatai adják a tehéntej allergia komplexitását, ezért is nehéz egyértelműen kijelenteni, melyik fehérjefrakció felelős az allergiás reakciókért. Hazai, ill. nemzetközi szakirodalom által is igazolt módon az egyes variánsok DNSvizsgálattal elkülöníthetők. Ez lehetővé teszi, hogy természetes módon, mesterséges beavatkozás nélkül, olyan termékek előállítását célozzuk meg, amelyek ezen allergiás reakciót kiváltó frakciókat nem tartalmazzák. Ehhez ki tudjuk választani azon juhokat és kecskéket, amelyek a kívánt összetételű tejet termelik, s ezek tejéből olyan termékeket állíthatunk elő, amelyeket a tejallergiában szenvedők minden negatív következmény nélkül fogyaszthatnak. Nemzetközi előzmények A tejfehérje allergia háttere és ezzel kapcsolatos kutatási irányok A tehéntej allergia háttere nem teljesen tisztázott Az allergia okozója alapvetően a tejben található fehérje, egyes embereknél viszont a laktóz okoz emésztési gondokat (laktóz intolerancia), ami nem tekinthető allergiának. A tehéntej αs1kazeinjének, α-laktalbuminjának és β-laktoglobulinjának allergiát okozó hatását már évek óta ismerik Sieber szerint. A tehéntej 18 fehérjefrakciója közül, a β-laktoglobulin nem található meg a humántejben, ezért feltételezik róla, hogy ez a legártalmasabb fehérje az allergia szempontjából, holott Buergin-Wolff és mtsai, valamint Taylor összehasonlító vizsgálatai azonban nem mutattak ki szignifikáns különbséget a tehéntej β-laktoglobulinjának és a kazeinjeinek allergizáló hatásában. Kaiser eredményei szerint 21 felnőtt és 13 gyermek, tehéntejre allergiás páciens esetében az α-laktalbumin okozta a legpozitívabb reakciót a bőrpróba alkalmával. A vizsgálatok eredményeiből arra a következtetésre jutottak a különböző szerzők, hogy a különböző allélek által meghatározott fehérje frakciók szerint a tejféleségek elkülöníthetők, s az allergiát kiváltó okok természetes módon kiküszöbölhetők. A szokványos juh- és a kecsketej csak részlegesen alkalmas a tehéntej helyettesítésére Egyes kutatók a gyerekek élelmezésében a kecske- és juhtejet csak 2 éves kor után javasolják, míg mások már a csecsemőkorban ajánlják a fogyasztását. A tehéntej-fogyasztás visszaszorulásával, a juh- és kecsketej mellett egyéb alternatívák merültek fel. Egy brit kutatás 54

eredménye szerint a kecsketej alkalmas az allergia kezelésére, különösen gyermekkorban, és egyéb esetekben is, mint pl. a malabszorpciós szindróma. A legnagyobb problémát (a tejallergia vonatkozásában) az jelenti, hogy az élelmiszeripar egyre növekvő arányban használ fel kecske-, és juhtejet, illetve ilyen eredetű terméket a különböző félkész-élelmiszerekben, melyek, az arra allergiásokra nézve veszélyesek lehetnek. A tehéntejjel összehasonlítva, a kecsketej kevesebb αs1-kazeint, de több αs2- és β-kazeint tartalmaz, míg a juhtej a tehéntejhez képest többet tartalmaz mind a három említett fehérjéből Spuergin és mtsai szerint. Bernard és mtsai által végzett aminosav-szekvencia vizsgálatok a tehén- és juhtej αs1- és αs2-kazein aminosav összetétele között 87, míg a kecske- és juhtejé között 97,4%-os hasonlóságot találtak. A hazai kutatások jelentősége nemzetstratégiai szempontból Jelen pályázat több tekintetben is nemzetstratégiai jelentőséggel bír. Az alábbiakban röviden összefoglaljuk ezeket. Hazánkban korlátozott számban végeztek kecsketej allergiára vonatkozó vizsgálatokat, de a juhtejet tekintve még semmilyen vizsgálatra nem került sor. Országunkban mintegy 300.000-400.000 fő érintett a tejallergiában, de az EU-ban ez a létszám mintegy 50 millió főre rúg, akiket el lehetne látni a megcélzott tejtermékféleséggel. Magyarország mezőgazdasága számára a saját fejlesztésű, magas minőségű alapanyagokból előállított funkcionális termékek fontos hazai és nemzetközi kitörési pontot jelentenek. Az értékes termékek hamisítása gyorsan rontja az eredeti termékek hitelességét, keresettségét, ezért alapvető fontosságú, hogy a fejlesztés kezdetétől fogva nagy megbízhatósággal azonosítani tudjuk a minőségi, biztonságos és igazolt eredetű talapanyagot, ill. terméket. Ez nagyban hozzájárul a fogyasztói elvárások kielégítéséhez, és a hazai termékek megbízhatóságába vetett bizalom erősödéséhez. Hazai és intézményi előzmények Az alacsony allergénhatású tejfehérje változatok azonosításának analitikai és molekuláris biológiai módszerei Magyarországon eddig a hazai kecskefajták tejfehérje polimorfizmusának más kecskefajták hasonló tulajdonságaihoz való hasonlítására került sor, az is korlátozott létszámú minta alapján (Kusza et al, 2009 és 2010). A juhfaj esetében néhány cigája változat tejfehérje variánsainak, valamint az awassi és a gyimesi racka juhfajta új β-laktoglobulin variánsának meghatározására került sor (Bösze – Baranyi, 2009). Az alacsony allergénhatású tejet termelő egyedek azonosításának eddigi tapasztalatai Az eddigi vizsgálatok eredményei azt mutatják, hogy az αs1 és αs2 kazein variánsokat tekintve jelentős eltérések tapasztalhatóak a hazai kecskefajták és az intenzív külföldi fajták (alpesi, szánentáli, núbiai) jellemzői között. A juhfajt tekintve a fentebb említett vizsgálatok eredményei csak variánsok meglétét igazolják, de ezek célirányos felmérése még nem történt meg. Az eddigi tapasztalatok azt mutatják, hogy az egyedi eltérések az e célra kifejlesztett molekuláris biológiai módszerek alapján nagy biztonsággal feltérképezhetők, meghatározhatók. A kedvező tulajdonsággal rendelkező egyedek tejtermelési képességét befolyásoló tényezők hatásával kapcsolatos eddigi megfigyelések A különböző tejfehérje variánsokat hordozó hazai juh és kecske egyedek tejfehérje variánsai és tejtermelési tulajdonságai közötti összefüggések vizsgálatára eddig nem került sor. Bár a 55

különféle tejfehérje variánsok tejtermelésre gyakorolt hatását külföldi szerzők már vizsgálták, de ezekben csak egy-egy tejfehérje-féleség variánsai hatásának tanulmányozását tekintették a munkájuk céljának. Intézményi előzmények Az Eszterházy Károly Főiskolán működő Regionális Tudásközpontban számos eredetvédelmi célú, PCR-alapú DNS-vizsgálati eljárást (TaqMan-próbát) dolgoztunk ki hústermékek összetételének ellenőrzésére. Egymástól pontmutációkban eltérő egyedek, ill. fajon belüli csoportok megkülönböztetésére kiválóan alkalmas HRM-technikát (High Resolution Melting – a DNS olvadási hőmérsékletének nagy pontosságú meghatározását alkalmazó módszert) fejlesztettünk ki sorozatvizsgálatok céljából. Mikroba izolátumok rendszertani helyének azonosítására PCR-eljárás tervezési, fejlesztési és validálási protokollt fejlesztettünk ki. Szarvasmarha, juh, kecske és lótejek laktoferrin-tartalmának részletes vizsgálatát végeztük el kapilláris gélelektroforetikus technikával. A különböző hazai fejt juh genotípusok vizsgálata alapján megállapítottuk, hogy a βlaktoglobulin variánsok jelentős mértékben befolyásolták a tejhozamot és a sajtkihozatalt, de további mélyebb vizsgálatokra nem került sor. Az egyes cigája változatok közötti eltérések feltárását célozták a DNS mikrosatellit vizsgálatok, de ezek nem terjedtek ki a részletes fehérje összetétel vizsgálatára. Az awassi és a gyimesi racka esetében a β-laktoglobulin új variánsát taláták meg (Baranyi és Bösze, 2009). Kusza és mtsai (2009) magyar tejelő kecskék vizsgálata alapján megállapították, hogy az αs1- és αs2- kazein variánsok (allélek és genotípusok) jelentős mértékben eltérnek az úgynevezett intenzív kecskefajták jellemzőitől.

Részlépések és alkalmazott módszerek 5.1. Alacsony allergén hatású tejeket termelő egyedek azonosítása összehasonlító fehérjeanalízissel (kapcsolatban a 2.3. részfeladattal) A részfeladat célja Eltérő fajtából kiválasztott 1000-1000 mintából álló juh és kecske egyedpopuláció esetében azon példányok kiválasztása analitikai vizsgálatokkal, melyek által termelt tejek allergénfehérje koncentrációja az átlagosnál 45-60 %-kal alacsonyabb. Ezen kísérletekkel le tudjuk szűkíteni azon egyedek számát, melyeket a jóval költségesebb genomanalízissel vizsgálunk tovább. A kutatás lépései 5.1.1. Átfogó, összehasonlító tejfehérje analízisek o Kapilláris gélelektroforézis (részleteket lásd: 2.3. részfeladat) és immunanalitikai vizsgálatok ELISA és immunoblot módszerekkel az állatállomány gondos és átfogó felmérését követően kiválasztott egyedeken. 5.1.2. A legcsekélyebb allergénfehérje koncentrációjú tejvariánsok és azok alapján a megfelelő fajták (egyedek) kiválasztása o Az fehérjeösszetételre vonatkozó adatsorok összehasonlító értékelése alapján választjuk ki a azon egyedeket és tenyészeteiket, melyek fejlesztéseinkhez és további vizsgálatainkhoz szükségesek. A nagy változatosság biztosítását tartjuk szem előtt ezen tevékenységnél, hogy minél több fajta és minél különbözőbb adottságú egyedek legyenek reprezentálva a későbbi részletes kutatások során. 56

A részfeladat várható újdonságtartalma Nem létezik részletes felmérés a Kárpát-medencére vonatkozóan a különböző fajtához tartozó juh- és kecske állományok tejfehérje-összetételére vonatkozóan. Az elvégzett eddigi felmérések a vizsgált fajták rokonságára vonatkoztak (dns mikrosatellit alapon), de a fehérje összetevőik vizsgálatára nem. A fentebb jelzett β-laktoglobulin vizsgálatok is csak a variánsok közötti eltérésekre koncentráltak, ezért az eredményeink újnak fognak számítani. Egyedi és részletes adatbázis jön létre az alacsony allergenicitású tejet termelő fajtákból és egyedekből. 5.2. Molekuláris biológiai módszerek kifejlesztése az alacsony allergenicitású tejfehérjeváltozatokat kódoló gének sorozatvizsgálatára a legígéretesebb fajták estében (lsd. 5.1.) és integrálásuk az eredetvédelmi rendszerbe A részfeladat célja Rendelkezésre álljanak az alacsony allergén hatású variánsok megbízható detektálására alkalmas, továbbfejlesztett, validált molekuláris biológiai sorozatvizsgálati módszerek a tejfehérje vizsgálatokkal leszűkített egyedek pontmutációi esetében. A kutatás lépései 5.2.1 Az irodalmi adatok alapján a különböző vizsgálati módszerek összehasonlítása o Az αs1- és αs2-, β-, és κ-kazein változatok, valamint a β-laktoglobulin, és αlaktalbumin változatokat kódoló gének azonosítására alkalmas vizsgálati módszerek alkalmazhatóságának összehasonlító értékelése: PCR-AS, PCR-RFLP, HRM-technikák. 5.2.2 A legkedvezőbb módszer kiválasztása o A fejlesztésre kijelölt, előbbi módszerek hatékonyságának referenciaminták felhasználásával történő továbbfejlesztése. 5.2.3 A kidolgozott módszerek validálása és tesztelése o A továbbfejlesztett módszerek validálása referenciaminták felhasználásával, majd tesztelésük a terv szerint begyűjtött vérminták 10 %-án. A részfeladat várható újdonságtartalma Az alacsony allergén hatású fehérjét kódoló génvariánsok meghatározása terén jelenleg jelentős hiányosságok állnak fenn a juh és a kecsketej esetében. Gyors, olcsó, megbízható sorozatvizsgálatra alkalmas módszer az eddigi irodalmi ismereteink szerint nem áll rendelkezésre. 5.3. A validált módszerrel a hazai (Kárpát-medencei) tejtermelésre hasznosított juh és kecske állományok átfogó vizsgálata a megfelelő genotípusú egyedek azonosítására A részfeladat célja A kifejlesztett új molekuláris biológiai vizsgálati módszerrel az 5.1. részfeladatban kiválasztott fajták, ill. állományok legalább 200-200 egyede vonatkozásában a genotípus meghatározása, és a megfelelő, csökkentett allergénfehérje tartalmú tejest adó egyedek kiválasztása.

57

A kutatás lépései 5.3.1 A vizsgálandó állományok meghatározása o Az 5.1. részfeladatban kiválasztott fajták, ill. állományok legalább 200 egyedének kijelölése: nem rokon juh-, és ugyanennyi kecske kiválasztása szükséges a céljaink eléréséhez. Mintavétel. 5.3.2. A minták DNS vizsgálata a tejfehérje variánsok meghatározása céljából o A megfelelő genotípusú egyedek azonosítása a kidolgozott és validált molekuláris biológiai módszert alkalmazva. A részfeladat várható újdonságtartalma A kapott eredmények egyetemlegesen újdonságnak számítanak mivel korlátozott információk állnak rendelkezésünkre olyan genotípusú egyedekről, melyek csekély allergén hatású tejet termelnek. 5.4. Az alacsony allergenicitású tej összetétele tekintetében megfigyelhető korrelációk vizsgálata a későbbi termékfejlesztés megalapozására A részfeladat célja A DNS vizsgálatok alapján csoportosított állományok által termelt tejek tejfehérjéi és a tejösszetétel közötti összefüggések feltárása. A kutatás lépései 5.4.1 A laktáció során az összetételben bekövetkező változások követése o A DNS vizsgálatok eredményei alapján az egyes fajták egyedeiből csoportokat képezünk, és ezektől tömegtej mintát veszünk, amely mintavételre a hivatalos befejések alkalmával (négyhetente), egymást követő legalább 4 alkalommal kerül sor a laktációs periódus fejt részének időszakában. o A csoportos tejminták vizsgálata: tejfehérjék, zsírsav, aminosav, szénhidrát, Ca, Mg, nyomelemek; 5.4.2. Korreláció a tejfehérje eloszlás és egyéb komponens összetétel összefüggéseinek feltárása o Soktényezős feltáró módszerek alkalmazása. A részfeladat várható újdonságtartalma A juh és kecske fajták eltérő tejfehérje variánsainak egyéb tejösszetevőkkel való korrelációját eddig nem tárták fel. Nem áll rendelkezésre adat a laktáció során bekövetkező tejfehérje összetétel változásokra. 5.5. A különleges minőségű tejféleségek összetétele és a hagyományos termékgyártási technológiák során végbemenő fizikai, kémiai, biológiai folyamatok (koaguláció, fermentáció, mikrobás utóérlelés, romlási jelenségek) összefüggéseinek feltárása a prototípusok kifejlesztése előkészítéséhez A részfeladat célja A DNS vizsgálatok alapján képzett csoportoktól vett tömegtej minták főbb jellemzői, illetve hatóanyagai viselkedésének feltárása a tejfeldolgozás eltérő fázisaiban.

58

A kutatás lépései 5.5.1 Kísérleti alvadék gyártás során a fizikai-kémiai-mikrobiológiai paraméterek változásának követése, és azok fehérjeösszetételre gyakorolt hatásának vizsgálata o Az előző feladat keretében begyűjtött tömegtej mintákból különböző alvadékok (gomolya, kefir, joghurt) előállítása, és a végbemenő folyamatok során bekövetkező fizikai-kémiai-mikrobiológiai változások vizsgálata. Hőmérséklet tűrés és pH hatásának kiemelt vizsgálata. A tejösszetétel folyamatos monitorozása az előbbi paraméterek változása hatására. 5.5.2 Az előállított alvadékok fermentáció és utóérlelés során bekövetkező változásai monitorozása o Az genotípuscsoportok és a mintavételi időpontok szerint kiválasztott tejféleségekből előállított alvadékféleségek fermentációs és mikrobás utóérlelési folyamatainak vizsgálata. A hatóanyagok, az allargének, illetve a fő komponensek változásának a követése a fenti folyamatok során. 5.5.3 Az előállított alvadékok eltarthatósági és stabilitási vizsgálata o A DNS vizsgálatok eredményei alapján képzett csoportok tömegtej mintáiból gyártott alvadékféleségek minőségi és romlási jelenségeinek vizsgálata a mintavételek időpontjai alapján, valamint a szükséges érlelési időszakok folyamán. 5.5.4 Az alvadékok kivétele után megmaradó savó vizsgálata o Tekintettel arra, hogy az allergiát okozó fehérje féleségek variánsainak jelentős része a savóban marad a feldolgozás során, a savó összetételének vizsgálata nagy jelentőséggel bír. A részfeladat várható újdonságtartalma Az eltérő tejfehérje variánsok alapján képzett csoportok tejéből készült különböző alvadékféleségek feldolgozása során a fehérje összetételben bekövetkező változások és a technológiai paraméterek összefüggéseit eddig nem tárták fel. A fenti csoportok tejéből készült alvadékféleségek érési, tárolási és minőség változási tulajdonságainak jellemzése az érés folyamán, valamint a laktáció eltérő időszakaiban új eredménynek számít. Az alvadékok mellett képződő savó jellemzőinek feltárása is alapvetően új megfigyelésnek számít, illetve lehetővé teszi a melléktermékként kezelt savó önálló hasznosítását funkcionális termékek (savóital, savósör, savópor) alapanyagaként.

5.6. Előzetes biológiai modellvizsgálatok végzése továbbfejlesztett mesterséges emésztési modellel a csökkentett allergén hatás igazolására (kapcsolódás a 4. alprogrammal) A részfeladat célja A eltérő tejfehérje variánsok szerint csoportosított állományok által termelt tej és az abból előállított alvadék típusok allergén hatásának becslése egy általunk továbbfejlesztett komplex in vitro emésztési modellrendszerrel. A kutatás lépései 5.6.1 Az alacsony allergénhatású tejek és kísérleti alvadékaik emészthetőségi vizsgálata o Különböző genotípuscsoportok tejeinek és alvadékaiknak mesterséges emésztési modellben történő lebomlási folyamatai elemzése. A keletkező termékek (peptidek, aminosavak) azonosítása HPLC-vel. 59

5.6.2 A vizsgált tejek és kísérleti alvadékaik bélmikrobiota összetételére gyakorolt hatásának vizsgálata o A mesterséges emésztés során keletkező termékeknek a vastagbél baktériumai egyensúlyára gyakorolt hatásának feltárása 4-6 fajból álló gnotobiotikus rendszerben. 5.5.3 Probiotikus bélbaktériumok szaporodására és anyagcseréjére gyakorolt hatás vizsgálata o A szaporodási képesség és a probiotikus jelleggel összefüggő anyagcseretevékenységek (elsősorban rövidláncú zsírsavak termelése) változásának felmérése az alacsony allergenicitású tejek és termékeik emésztése során. 5.5.4. Az emésztés során keletkező allergia mediátorok reakciókeltő hatásának vizsgálata szövettenyészetben o Az emésztés során keletkező anyagok által kiváltott, az interleukinok termelése formájában megnyilvánuló reakció felmérése a különböző genotípuscsoportok tejénél és alvadékaiknál. 5.5.5. A savó emészthetőségének vizsgálata o Tekintettel arra, hogy a sportolók többlet fehérje bevitelének alapja a tejsavó, így ezen melléktermék biológiai hasznosulásának értékelése az in vitro modellrendszerünk alkalmazásával lényeges eredményt szolgáltat.

A részfeladat várható újdonságtartalma A csekély allergén hatású tejek és alvadékaik emésztése során keletkező anyagokra vonatkozóan nem rendelkezünk adatokkal. Nem ismert ezen különleges tejeknek a bélmikrobák egyensúlyára gyakorolt hatása, mint ahogy ismeretlen a probiotikus baktériumokra gyakorolt élettanihatásuk is. Eddig nem alkalmazták a szövettenyésztési eljárásokra épülő allergenicitási tesztet mesterséges emésztési rendszerrel együtt alkalmazva tejek és tejtermékek értékelésére.

5.7. Rövid távú, klinikai körülmények között végzett allergiapróbák végzése a legkedvezőbb tejek és a belőlük készített kísérleti prototípusok felhasználásával a csökkentett allergén hatás igazolására A részfeladat célja Klinikai allergia próbák végrehajtása az előzetes (5.5. részfeladat) biológiai modellvizsgálatok eredményeinek figyelembe vételével. Az allergénmentesség igazolása humán dermatológiai vizsgálatokkal, eltérő tejfehérje variánsokat hordozó tejtételekből készült alvadéktípusokon, illetőleg kísérleti prototípusokon. A kutatás lépései 5.7.1 A humán vizsgálatok protokolljának kidolgozása o Az előállítani szándékozott alvadékféleségek dermatológiai allergológiai vizsgálatához szükséges protokoll elkészítése és etikai engedélyeztetése. 5.7.2 A klinikai allergiai vizsgálatok elvégzése o Az előállított alvadékféleségek és kísérleti prototípusok allergén hatásának a fenti protokoll szerinti vizsgálata. 60

5.7.3 A humán allergológiai vizsgálatok eredményeinek értékelése o A különböző alvadékféleségek allergén hatásának összehasonlító értékelése és az allergén hatás erősségének rangsorolása. Ennek alapján ajánlás kidolgozása a termékfejlesztésre. A részfeladat várható újdonságtartalma Jelenleg nincs elérhető allergológiai vizsgálati eredmény, amely a hazai, eltérő juh és kecsketej fehérjevariánsok alapján készített alvadék féleségek allergén hatását bemutatná, és a termékfejlesztések alapját képezhetné.

Az alprojekt várható eredményeinek hasznosítása Hosszú távú hasznosítás A létrejövő új eljárások és a felhasználásukkal nyert eredmények révén nagy biztonsággal ellenőrizhetővé válik az alacsony allergénhatású, egyedi élelmiszerek magas hozzáadott értéke és eredetazonossága. A vizsgálatok útján kijelölt, egyedi génállományú juh-és kecskefajok további kutatások, akár tenyésztési kísérletek alapjául szolgálhatnak. Az alapkutatás során kifejlesztett új paramétereket és módszereket alkalmazó adatbázis hatékonyan kiaknázható a tejtermékek eredetazonosítására. Az allergén hatású fehérjékkel kapcsolatos vizsgálatok eredményei nem csak a tejszektorban, hanem az élelmiszertudományi kutatások más területein is alkalmazást nyerhetnek Nemzetgazdasági szinten is jelentős, egyedi, bizonyítottan allergénmentes feldolgozott tejtermékek kerülnek kifejlesztésre. Az allergológiai modellvizsgálatok újonnan kialakított protokolljára és a tesztek eredményére alapozva átfogóbb, többrétű klinikai kísérletek indulhatnak. Tudományos alkalmazhatóság A genetikai polimorfizmus célzott feltárásával megismert változatosság, a létrejövő adatbázis jó kiindulási alapot ad további géntartalékok feltárásával, hasznosításával foglalkozó kutatások tervezésénél és kivitelezésénél. Az egyedi megközelítésekkel és specifikus paraméterekkel végzett klinikai és biokémiai modellvizsgálatok egyéb modellek összevetve továbbfejleszthetők, illetve eredményei más termékek hatásvizsgálatainál is kedvezően kamatoztathatók. A tejfehérje-összetételben determináns genomok analízisére, illetve a fehérjevizsgálatokra kifejlesztett sorozatvizsgálati módszerek mind a biológiai, mind az élelmiszertudományi vizsgálatokban alkalmazhatóak a későbbiekben. Egyedi tejféleségek összetevőinek egymásra gyakorolt hatásának, illetve technológiai paraméterektől való függésének vizsgálata új összefüggésrendszer feltárást jelenti, mely számos más termékre és szektorra kiterjeszthető. Összefüggés a projekt más kutatási programjaival A létrehozott molekuláris markerek az eredetellenőrzési módszerek fejlesztésével foglalkozó 1. kutatási program keretében beépülnek a funkcionális és sportélelmiszerek élelmiszerbiztonságának fokozását célzó célzott nyomonkövetési rendszerbe. 61

Az új, alacsony allergénhatású alapanyagok végső soron új, az eddigieknél kedvezőbb termékek kifejlesztését teszik lehetővé, mely elősegíti a 4. alprojekt megvalósítását is. A 4. alprogramban kidolgozott mesterséges emésztési alprojektben sorozatvizsgálatokra alkalmazzuk.

modellrendszert

ezen

Analitikai platform (2. alprojekt) végzi az allergén hatású fehérjék analízisét, illetve a tejösszetétel és a tejfehérje komponensek korrelációja feltárását.

62

6. Kutatási alprojekt Vad kecskebúza (Aegilops) génforrásai azonosítására és új vonalak létrehozására irányuló fejlesztések magas hozzáadott értékű termékek eredetvédelmének és biztonságának fokozására Az alprojekt lényege A búza eredetvédelme és biztonságának garantálása kiemelkedő jelentőségű, hiszen alapvető élelmiszer alapanyagról van szó. A magas hozzáadott értékű funkcionális gabonaalapú élelmiszerek kifejlesztését új, azonosított eredetű kecskebúza génforrások felderítésével, és speciális előállított vonalak vizsgálatával támogatjuk. A szelektált búzafajták esetében végrehajtjuk a beltartalmi és táplálkozás élettani paramétereinek javítását, illetve stressztűrő képességének fokozását. Ezen specifikus vonalak élettanilag előnyös sajátosságaikat, és egyedi beltartalmi paramétereiket várhatóan kedvezőtlen termesztési körülmények közt is megtartják. A munka során feltárásra és az eredetvédelmi adatbázisban rögzítésre kerülnek az értékes vonalak azon egyedi beltartalmi és élettani tulajdonságai, melyek lehetővé teszik nagy megbízhatóságú azonosíthatóságukat a későbbi nemesítési folyamat, az azt követő fajtahasználat, illetve élelmiszeralapanyag-előállítás során. A feltárt egyedi gén vonalak új termékazonosítási paraméterként hasznosíthatók, így az eredetiség igazolásán túlmenően a biztonsági garanciát is jelentenek, hiszen már bevizsgált, ismert összetételű és biztonságú vadbúzafaj(ta) sajátságai érvényesülnek a felhasználást követően is.

Az alprojekt során elérendő célok 1. A legkedvezőbb tulajdonságú Aegilops vonalak szelekciója azonos szemlélettel felállított génforrás-adatbázisra épülve történjen a meglévő gyűjteményi és kárpát-medencei élőhelyről begyűjtött tételekre vonatkozóan. 2. A funkcionális élelmiszer-alapanyag előállítása szempontjából fontos beltartalmi jellemzők kedvező volta, illetve azoknak a környezeti tényezőktől való minél kisebb függése alapján jelöljük ki a megfelelő vonalakat és az azonosításukra alkalmas eredetvédelmi paramétereket. 3. Rendelkezésre álljanak azon szelektált vonalak, amelyek az elvárt, előnyös beltartalmi paramétereket kedvezőtlen termesztési (vízhiány, magas sókoncentráció és hőmérséklet) körülmények közt is megtartják, így távlatilag alkalmasak a búza nemesítésében génforrásként való hasznosításra.

Fő kutatási irányok 1. Az eredetvédelemhez és a biztonság garantálásához szükséges információkat tartalmazó adatbázisrendszer kialakítása új, stressztűrő és kimagasló beltartami összetételű Aegilops génforrások azonosítására. Ezáltal kiaknázhatóvá válik a búza rokonsági körébe tartozó vad fajok különleges genetikai potenciálja, illetve az ezekből készült termékek eredetvédelme és biztonságának garantálása is megoldható lesz. 2. Garantált biztonságú, kedvező beltartalmi tulajdonságokkal és táplálkozás élettani paraméterekkel rendelkező genotípusok szelekciója az MTA ATK MGI génbank által rendelkezésre bocsátott, illetve a Kárpát-medencében és környékén begyűjtött tételekből. 3. A begyűjtött, sikeresen felszaporított és a génbanki vonalak stresszélettani vizsgálata különös tekintettel a vízhiányra, magas sótartalomra és hőmérsékletre, az akklimációs mechanizmusok feltárása.

63

4. A vonalak szelekciója révén, ami az abiotikus stressztényezők és a beltartalmi mutatók feltárt összefüggései alapján történik, lehetővé válik a legkedvezőbb genotípusok távlati hasznosításának megalapozása.

A munka újszerűsége és innovatív tartalma 1. A búzafajták átfogó és megbízható eredetvédelmére, illetve a belőlük készült termékek biztonsága igazolására alkalmas adatbázisnak az egyedi génforrások beltartalmi jellemzőivel való kibővítése, mely még nem áll rendelkezésre. Ez alapján hatékonyan azonosíthatóvá válnak az egyes kecskebúzavonalak. 2. Magas hozzáadott értékű, egyértelmű biológiai előnyökkel és kiemelkedő beltartalmi paraméterekkel jellemezhető élelmiszerek alapanyagául szolgáló, egyedi fajokat szelektálunk. 3. Új, garantált biztonságú génforrások felderítése és azonosítása. 4. A Martonvásáron kezelt, nyilvános hozzáférésű, a citogenetikusok és növénynemesítő kutatók által használható génbank olyan vonalakkal való bővítése, melyek magas környezeti stressztűrésük alapján kerültek begyűjtésre, és funkcionális élelmiszerfejlesztési célra is használhatóak. 5. A funkcionális élelmiszerként való hasznosítás szempontjából kiemelkedő fontosságú összetevők abiotikus stressztényezőktől való függésének növényélettani hátterét eddig nem tárták fel. 6. Fajés nemzetségkeresztezés során génforrásként használható egyedi kecskebúzavonalak azonosítása és szelektálása, amelyek különböző stressz tényezőkkel szembeni toleranciájuknak köszönhetően hátrányos körülmények között is megőrzik funkcionális élelmiszerfejlesztés szempontjából előnyös összetételüket. 7. Új, változatos génforrások hasznosítása a búza termésbiztonságának és táplálkozásélettani tulajdonságainak javítása érdekében.

Indokoltság A téma aktualitása A búza központi szerepet tölt be az emberi táplálkozásban, ezért tápanyag összetétele, beltartalmi mutatói jelentős hatást gyakorolnak az emberi szervezet működésére. Ebből adódóan kiemelkedő jelentőséggel bírnak a búzafajták genetikus vonalainak feltárására, illetve szelektálására irányuló vizsgálatok, melyek révén kedvező élettani hatású és a szokványosnál előnyösebb beltartalmi sajátosságokkal rendelkező élelmiszer alapanyagok állíthatók elő. Ezen egyedi fajokra alapozott specifikus élelmiszerek egyszerűen és hatékonyan építhetők be a mindennapi táplálkozásba, tehát pozitív élettani hatásai igen egyértelműen és gyorsan jelentkeznek. Ugyanakkor a globális klímaváltozásból következően hazánkban is számolnunk kell a termesztési körülmények kedvezőtlen alakulásával, ami nem csak jelentősen csökkenti a búza évenkénti termésátlagát, hanem tápanyag-összetételét is ronthatja. Magyarország éghajlatából adóan a vegetációs időszakok tíz éves periódusokra számítva 3-5 évben aszályosak. A búza termésbiztonságának és tápanyag-összetételének javítása - a fent említett kedvezőtlen körülmények között is - nemzetgazdasági érdek. A termesztett búza ellenálló képességének, beltartalmi mutatóinak és genetikai diverzitásának javítására egyaránt jó módszer a búzával rokon, azonosított eredetű vad fajok hasznos agronómiai tulajdonságainak átvitele faj- és nemzetségkeresztezés révén. Ebben az összefüggésben kitüntetett jelentőségre tehet szert a búza rokonsági körében olyan új, garantált biztonságú génforrások felderítése és azonosítása, melyek az abiotikus környezeti tényezőkkel szembeni ellenállóság mellett kedvező összetételüket is megtartják. Az ezek felhasználásával létrehozott vonalak későbbi alkalmazása 64

során úgy javítható a búza genetikai variabilitása és tápanyag-összetétele, hogy az nem vet fel olyan etikai és egészségbiztonsági kérdéseket amelyek a géntranszformáció során felmerülnek. Nemzetközi előzmények Mivel a búza központi élelmezési szerepénél fogva fontos mikroelem, vitamin és étkezési rostforrás, ezért e paraméterek növelését, biofortifikációját világ és az Európai Unió is, elsőrendű prioritásként kezeli (http://www.copenhagenconsensus.com) és az ezzel kapcsolatos kutatásokat több FP7-es kutatási pályázat keretében finanszírozta (Cooperation Work Programmes: KBBE-2007-2-2-03, KBBE-2009-1-2-04, KBBE.2010.2.2-03, 2.3-03). A CGIAR (Consultative Group on International Agricultural Research) keretében alakult Harvest Plus Program (http://www.harvestplus.org) szintén a gabonafélék biofortifikációját célzó nemzetközi kutatásokat koordinálja. A mikroelemek, vitaminok és rostanyagok alapvető fontosságúak az emberi táplálkozás számára. Számos vizsgálat szerint a mikroelem és vitamin alultápláltság, valamint a rostszegény táplálkozás negatív hatásaiban szenvedők részaránya világszerte folyamatosan emelkedik az utolsó négy évtizedben (Graham et al. 2007). Ennek legalább két okot tulajdonítanak. 1. A magas hozamú búza fajták termesztése nőtt az egyéb, a fenti beltartalmi összetevőkben gazdagabb, pl. hüvelyes növények rovására. 2. A modern növénynemesítés tradícionálisan a termőképesség fokozására helyezi a hangsúlyt, míg a beltartalmi paraméterek kisebb figyelmet kapnak (Morris és Sands 2006). A megnövekedet termőképesség a beltartalmi paraméterek csökkenését eredményezte a szemtermésben (Oury et al. 2006). Ugyanakkor az elégtelen vagy csökkent napi mikroelem- és vitaminbevitel (B csoport, E vitaminok) súlyos egészségügyi problémákat okoz nemcsak a fejletlen, de a fejlett nyugati társadalmakban is (Combs 2001), különösen a gyermekek és terhes nők körében. Hiányuk daganatos megbetegedésekhez, szív- és érrendszeri problémákhoz vezethet, valamint jelenlétük különböző okok miatt neuroprotektív, és koleszterinszintet csökkentő, stb. hatással is bír (Sen et al. 2006). A búza szintén jelentős étkezési rostforrás. Az étkezési rostok jótékony élettani hatásai közt említhető a bélrendszeri bántalmak megelőzése, de csökkentik a vér koleszterin szintjét, a 2-es típusú diabétesz és egyes daganatos betegségek kockázatát. Az étkezési rostok fő összetevői az arabinoxilán, (1,3;1,4)- -D-glükán, és az amilóz ami előanyaga az emészthetetlen ún. rezisztens keményítőnek. A nemesítési programok előfeltétele a potenciális génforrások és genetikai alapanyagok felderítése, melyben az EKF Növényélettani Tanszékének és az MTA Agrártudományi Központ Mezőgazdasági Intézetének kutatói is jelentős eredményeket értek el (Molnár et al. 2002, Molnár et al. 2004, Dulai et al. 2005, Molnár et al. 2005, Dulai et al. 2005, 2006, 2009). A termesztett búza elsődleges és másodlagos génforrásai közé sorolható kecskebúza (Aegilops) fajok az agronómiai tulajdonságokért (abiotikus és biotikus stressztűrés, termés elemek) felelős gének alléljeinek gazdag tárházát képviselik (Friebe et al. 1996; Schneider et al. 2008). Ugyanakkor több Aegilops fajról kimutatták, hogy szemtermésük Fe- és Zn-tartalma 2-3 szorosan meghaladja a búzáét (Cakmak et al., 2000; Calderini and Ortiz-Monasterio, 2003; Chhuneja et al., 2006). Búza-Aegilops amfiploidok vizsgálata azt mutatta, hogy az amfiploidok az Aegilops szülőhöz hasonló beltartalmi paraméterekkel rendelkeztek (Tiwari et al. 2008; Rawat et al. 2009), ami bizonyítja, hogy a keresztezésekkel átvitt vad allélek képesek kifejeződni a búza genetikai háttérben is. Mindez arra utal, hogy az Aegilops fajokban jelentős genetikai potenciál rejlik mind a mikroelem, vitamin és étkezési rost tartalom növelését, mind a kedvezőtlen környezeti tényezőkkel szembeni ellenállóságot illetően, így alkalmasak lehetnek a búza beltartalmi mutatóinak és ellenállóságának javítására fajkeresztezések segítségével. Hasonló okok miatt az utóbbi néhány évben a vad fajokban rejlő géntartalékok felderítése és a nemesítésben történő alkalmazása a nemzetközi tudományos érdeklődés homlokterébe került. 65

A hazai kutatások jelentősége nemzetstratégiai szempontból Az előző fejezetben részletezett okok következtében az Európai Unió kutatási prioritásként jelölte meg a vad fajok genetikai potenciáljának nemesítésben való kiaknázását (FP7 Cooperation Work Programm: KBBE.2010.1.1-03: Characterisation of biodiversity resources for wild crop relatives to improve crops by breeding). Annak ellenére, hogy termesztett búza termésbiztonságának fenntartása, valamint beltartalmi összetételének és táplálkozás élettani paramétereinek javítása nemzetgazdasági érdek, a vad fajok ez irányú hasznosítása, a hazai előfordulású, azonosítható génforrások esetében jelentősen elmarad kívánatos mértéktől. Ebben a tekintetben az MTA Agrártudományi Központ Mezőgazdasági Intézetének és az EKF Növényélettani Tanszékének kutatóinak eddigi eredményei reményt keltőek, de a fejlesztési lehetőségeket, természetes flóránk gazdagságát tekintve jelentős hátrányban vagyunk. Ezen a helyzeten lényegesen javítani fog a Kárpát-medence és környéke különböző nagytájairól, eltérő éghajlati területeiről származó Aegilops vonalak azonosítása, valamint az előnytelen környezeti tényezőknek ellenálló, kiváló beltartalmi értékekkel rendelkező, vonalak szelektálása és a nemesítéshez szükséges mennyiségben történő előállítása. Ezek a későbbiekben hazai és külföldi nemesítők számára hosszú távon változatos génforrásként szolgálhatnak a búza említett paramétereinek javítására. A pontos lelőhelyi, genetikai és fiziológiai adatokkal dokumentált adatbázis, a felhasznált génforrásokat az eredettől azonosíthatóvá és nyomon követhetővé teszi. Konzorcium saját korábbi eredményei Az EKF Növénytani Tanszéke, a hazai flóratérképezés regionális központjaként vezető szerepet vállalt a magyarországi növényfajok elterjedés vizsgálatában, növényföldrajzában. A térségben kiterjedt fitocönológiai munkákban jellemezték a száraz gyepeket (Vojtkó 1996-97, 1998, Schmotzer és Vojtkó 1996, Vojtkó és Farkas 1999), a Pannonikum jellemző élőhely együttesét. Ezen kutatások módszertanát és eredményeit súlypontosan kerülnek beépítésre a tervezett termőhelyfeltárási munkálatokba. Az eddigi botanikai munkákban, flóraművekben és növényföldrajzi jellemzésekben az Aegilops cylindrica elterjedésével is foglalkoztak, részben jellemezték előfordulásának körülményeit (Vojtkó 2001, Pintér et al. 2010, Vojtkó et al. 2010). Az MTA Agrártudományi Kutatóközpont Mezőgazdasági Intézetének (MTA ATK MGI) génbankjában jelenleg 21 Aegilops faj 313 genotípusát tartják fenn. A Lángné Molnár Márta irányításával működő Génmegőrzési és Organikus Nemesítési Osztályon évek óta folynak idegen fajú keresztezések a búzával a vad fajok genetikai potenciáljának kiaknázása céljából. Az elmúlt években több Ae.biuncialis vonallal búza × Ae. biuncialis hibrideket, amfiploidokat és egy vonallal addíciós sorozatot állítottak elő. Az MTA ATK MGI és az EKF Növényélettani Tanszéke közt 2001-óta intenzív együttműködés van a különböző genotípusok stresszélettani vizsgálata területén. Az egri kutatók kimutatták, hogy az alacsony csapadékellátottságú élőhelyről származó MvGB382 genotípus és az MvGB470 és MvGB1112 vonallal előállított búza × Ae. biuncialis amfiploidok szárazságtűrése jelentősen meghaladta a kontroll búza genotípusokét. Az EKF Növényélettani Tanszék stressz- és ökofiziológiai műhelyében OTKA támogatással (T43120) 22 a mediterrán és nyugat-ázsiai elterjedésű, különböző mértékben száraz termőhelyekről származó Aegilops vonal részletes stresszélettani vizsgálata történ meg (Molnár et al. 2002, Molnár et al, 2004, Dulai et al. 2005, Molnár et al. 2005, Dulai et al. 2005, 2006, 2009). Más hazai és nemzetközi pályázati együttműködés keretében szintén az MTA ATK MGI kutatóival együttműködésben egyéb gabonafélék (OTKA K75466, Generation 66

Challenge Programme-CGIAR GCP SP3) genotípusain is folynak kutatások (Molnár et al. 2007, Dulai et al. 2010, 2011, Molnár-Láng et al. 2011). Ezen kívül a stresszélettani kutatások széles spektrumát lefedő témákban dolgoztak együtt (Dulai et al. 1998, 1999, Marschall et al. 1998 1999, 2004, Erdei et al. 2001, Stiller et al. 2008, Zsófi et al. 2009, Darkó et al. 2011). A tanulmányok mellett a jelzett stressz és ökofiziológiai témákban több diploma és OTDK dolgozat született, valamint habilitációs fokozatszerzések is történtek. Mindez lehetővé tette, hogy az egri stressz- és ökofiziológiai kutatócsoport részben ezeken a kutatásokon keresztül az ország elismert műhelyévé váljon.

Részlépések és alkalmazott módszerek Az alprogram során a génbanki és közvetlen gyűjtésből származó, a rendelkezésre álló idő alatt megfelelő mennyiségben felszaporítható kecskebúza (Aegilops) tételekből olyan genotípusok kiválogatása valósul meg, melyeknek a legkedvezőbbek a beltartalmi paraméterei, és azok kevéssé változnak az abiotikus stresszek során. 6.1. Az eredetvédelemhez és az élelmiszerbiztonság garantálásához szükséges információkat tartalmazó adatbázisrendszer kialakítása új, stressztűrő és kiemelkedő beltartalmi sajtáságú Aegilops génforrások egyedi paramétereivel A részfeladat célja Olyan adatbázisrendszer kidolgozása és feltöltése, amely alapvető információforrás lesz az alprojekt minden fázisában a génbanki bővítéstől a szelekciós stratégia kidolgozásán át a kiválogatott vonalak értékelési eljárásáig. A kutatás lépései 6.1.1. Élelmiszerbiztonsági és eredetvédelmi adatbázis felállítása a gabonatermesztés és nemesítés szempontjából jelentős, Kárpát-medencében élő őshonos búza vad rokonfajok, az Aegilops nemzetség tagjainak a projekt céljaira való alkalmasság értékelésére o Az összegyűjtött információk révén áttekinthetővé válik a vad rokonfajok előfordulása, populációinak állapota, megőrzési és fenntartási lehetőségei a Pannon Biogeográfiai Régióban, amely az Európai Unió NATURA 2000-es kiemelt jelentőségű természeti területe. o Alapvető a begyűjtött, betárolt mag (szemtermés) tételek és gyűjtési helyeik adatainak pontos dokumentálása és adatbázissá fejlesztése. A mag adatbázis a későbbiek során számos elméleti és gyakorlati kutatást, projektet segíthet adatokkal. A növények fenológiai és morfológiai paramétereinek rögzítése (kalászhossz, szálka mérete, növénymagasság, stb.) és értékelése. 6.1.2. Átfogó maggyűjtés végzése a Kárpát-medence nagytájain o A gyűjtött populációk termőhelyein az adott élőhely minősítése, a lehető legtöbb elérhető paraméter alapján. o A gyepek jellemzése során figyelembe kell venni a termőhelyi adatokat (csapadékmennyiség, hőmérséklet, tengerszint feletti magasság, lejtésszög, mikrodomborzati formációk, talajtípus, talajparaméterek, talajvízszint magasság) és az esetleges gazdasági jellemzőket (trágyázás, öntözés, legeltetési mód). o A gyepek növényzetének cönológiai kvadrát módszer való vizsgálata, az adott élőhely mezőgazdasági csoportba sorolása. 67

6.1.3. A begyűjtött és felszaporított minták, illetve előállított vonalak előkészítése és a beltartalmi értékeik meghatározása o A minták előkészítése és mikrohullámú roncsolása és az elemtartalom meghatározása atomabszorpciós spektrométerrel határozzuk meg. o Az arabinoxilán-tartalom meghatározása Douglas, a búzaliszt pentozánjainak a meghatározására kifejlesztett módszerével (Martonvásár, Kalászos Gabona Nemesítési Osztály) o A vegyes kötésű β-gükán tartalom mérése szabványos enzimalapú módszerrel (Martonvásár, Kalászos Gabona Nemesítési Osztály) o A keményítő amilóz és amilopektin tartalmának meghatározása a Megazyme szabványos protokolljának módosított változata szerint (Martonvásár, Kalászos Gabona Nemesítési Osztály) o A vitamintartalom (A: βtokotrienol) meghatározása HPLC-vel.

-tokoferol, β

-

6.2. Egyedi paraméterek nyerése az eredetvédelmi-élelmiszerbiztonsági adatbázis bővítésére: a begyűjtött és a génbanki vonalak stresszélettani vizsgálata és az akklimációs mechanizmusok feltárása A részfeladat célja Az Aegilops különböző genotípusai szemtermés összetételének stabilitását és ezzel az eredetvédelmi célra használható paraméterek megbízhatóságát befolyásoló abiotikus stressztényezők és azok kombinációi hatásának felmérése. Üvegházi és szántóföldi környezetben a kísérleti növényeket vízkultúrában és talajban felnevelve vizsgáljuk a szárazság stressz hatását a terméselemekre és a szemtermés beltartalmi paramétereire. A talajban történő vizsgálatok Martonvásárban történnek. A kutatás lépései 6.2.1. Vízkultúrás növekedési teszt o Összefüggésben az 1. ponttal, vízkultúrás kísérleti rendszerben, kisnövény fejlődési stádiumban vizsgáljuk a só-, hőmérséklet- és a PEG-indukált szárazság stressz hatásait. o A mérés vízkultúrás körülmények között különböző ozmotikus potenciálok és sókoncentráció mellett tartott csíra növények növekedését hasonlítja össze, a kapott eredmények száraz anyag stressz index (DMSI) v. növény magasság stressz index (PHSI) formájában kerülnek feldolgozásra. 6.2.2. A kritikus hőmérsékleti érték (Tc) meghatározása a kezdeti (F0) és steady-state (Fs) fluoreszcencia szint hőmérsékletfüggése alapján. o A kezdeti (F0) és a steady-state (Fs) és hőmérséklet függésének meghatározása Schreiber és Berry módszerével. o A minta hőmérsékletének a nevelési hőmérséklettől 1 oC/min-os fűtési sebességgel való folyamatosan emelése 60 oC-ig. Az F0(Fs)-T görbék regisztrálása után meghatározhatók azok kitüntetett pontjait: Tc (critical temperature), Tp (peak temperature). 6.2.3. Klorofill fluoreszcencia quenching analízis és a P700 aktivitás mérése

68

o A klorofill fluoreszcenciájának időbeli változását figyeljük meg abban a szakaszban, amikor a végleges, egyensúlyi fotoszintézis intenzitás kialakul, és a megfigyelt változásokból következtetünk a növényi minta “potenciális” fotoszintetizáló képességére különböző kezelések mellett. A fluoreszcencia hatásfok és a P700 aktivitás változását egy amplitúdó és frekvencia-modulált klorofill fluorométerrel (DUAL-PAM 100, Walz Effeltrich, Németország) követjük nyomon. 6.2.4. CO2 gázcsere mérések infravörös gázanalízissel o A CO2-fixálás fényintenzitás és hőmérsékletfüggését egy speciális fűthető/hűthető levélkamra alkalmazásával határozzuk meg: a gázcsereparamétereket – transpirációs ráta (E); asszimilációs ráta (A); sztómakonduktancia (gs); intercelliláris CO2 koncentráció (Ci) – a von Caemmerer és Farquhar által megadottak szerint számítjuk. 6.2.5 Az ozmotikus adaptáció o A nem kompatibilis ozmolitok közül a K+-ion koncentrációjának meghatározását végezzük a vizsgált búza növények friss gyökerében és levelében atomabszorpciós fotometriával határozzuk meg. o A kompatibilis ozmolitok szerepének feltárása szempontjából prolin- és összoldható szénhidráttartalom meghatározást végzünk a Dubois- féle fenolkénsavas módszerrel. 6.2.6. Ionkiáramlás mérése o A membrán permeabilitás változásának növekedésévnek konduktometriás mérésével.

követése

az

ionkiáramlás

6.2.7. Enzimaktivitás vizsgálatok o A nitrogén-asszimiláció során működő nitrát-reduktáz aktivitásának felmérése az anyagcsere folyamatok általános jellemzésére. 6.2.8. A szárazság stressz hatásnak vizsgálata talajos kísérleti rendszerben o Agronómiai tulajdonságok vizsgálata (virágzási idő, bokrosodás, termés mennyiség, betegség ellenállóság) stresszmentes és szárazságnak kitett növényeken. o Termést meghatározó fiziológiai paraméterek vizsgálata (CO2 gázcsere, klorofill fluoreszcencia, RWC, szénhidrát anyagcserével kapcsolatos paraméterek) 6.3. A vonalak szelekciója az abiotikus stressztényezők és a beltartalmi mutatók feltárt összefüggései alapján: az eredetvédelmi-élelmiszerbiztonsági adatbázis feltöltése az új, egyedi paraméterekkel A részfeladat célja A szemtermés összetételének stabilitását befolyásoló tényezők komplex értékelése a legmegfelelőbb, búzanemesítési célra alkalmas vonalak kiválasztása, az eredetazonosságuk meghatározására alkalmas növényélettani paraméterek meghatározása A kutatás lépései 6.3.1. A stressztényezők közötti korrelációk ellenőrzése statisztikai módszerekkel o Paraméteres és nem-paraméteres korrelációanalízis o Soktényezős feltáró módszerek 69

6.3.2. A stressztényezők súlyozásának kidolgozása o A súlyok meghatározása a funkcionális élelmiszerek fejlesztéséhez elvárt beltartalom stabilitására gyakorolt hatás alapján történik. 6.3.3. A termőhelyi információkat is figyelembe vevő szelekció elvégzése, adatbázis feltöltése egyedi paraméterekkel o A kedvező stressztűrési tulajdonságokat minél nagyobb termőhelyi (és ezzel feltehetően genetikai) változatossággal biztosító vonalgarnitúra kiválogatása. o Az eredetvédelmi célokra alkalmas paraméterek azonosítása és bevitele az élelmiszerbiztonsági-eredetvédelmi adatbázisba.

Az alprojekt várható eredményeinek hasznosítása Hosszú távú hasznosítás Eredetvédelmi, élelmiszerbiztonsági és nemesítési célokat egyaránt szolgáló, a pontos lelőhelyi, genetikai és fiziológiai adatokkal dokumentált adatbázis - amely a termőhelyiés társulásbeli különbségekre is rámutat - a felhasznált génforrásokat azonosíthatóvá és nyomonkövethetővé teszi. Új, változatos génforrások hasznosítása a búza termésbiztonságának és táplálkozásélettani tulajdonságainak javítása érdekében. A nyilvánosan hozzáférhető génbanki tételek száma jelentős mértékben növekszik. Mivel az azonosított és szelektált genotípusok a termesztett búzával szoros genetikai/filogenetikai rokonságban állnak, a stressztűrő képességért és beltartalmi értékekért felelős génkomplexumok búzába könnyen átvihetők. Az EU prioritásoknak megfelelően a hazai és külföldi nemesítők számára hosszú távon változatos génforrásként szolgálhatnak az egyedi fajok a búza termésbiztonságának és táplálkozás-élettani tulajdonságainak javítása érdekében. A funkcionális élelmiszerként való hasznosítás szempontjából kiemelkedő fontosságú a magas biológiai értékű, előnyös beltartalmi paraméterekkel bíró és stressztűrő fajok szelektálása, jellemzése. Tudományos alkalmazhatóság Vizsgálataink részletes információkkal szolgálhatnak a különböző genommal rendelkező Aegilops fajok abiotikus stresszekkel (szárazság, só, magas hőmérséklet) szembeni toleranciájáról, a védekező/szabályozó mechanizmusokról és a különböző beltartalmi paraméterek stresszkörülmények alatti állandóságáról. A Kárpát-medence és környéke különböző nagytájairól, eltérő éghajlati területeiről származó Aegilops szemtermések (magbank: Martonvásár, Eger) beltartalmi paraméterei átfogó vizsgálatának összevetése nemzetközi tapasztalatokkal, gyűjteményekkel. A különböző stressztényezőkre szelektált, kiváló beltartalmi értékekkel rendelkező vonalak génforrásként használhatók hasznos agronómiai tulajdonságok átvitelére faj- és nemzetségkeresztezés révén. A létrehozott F1 hibridek későbbi alkalmazása során úgy növelhető a búza genetikai variabilitása, hogy az nem vet fel olyan etikai kérdéseket, amelyek a géntranszformáció során felmerülnek. Összefüggés a projekt más kutatási programjaival

70

A génforrások azonosíthatóságán és eredetének vizsgálatán keresztül a program az 1. alprojekthez kapcsolódik. A beltartalmi és stresszélettani vizsgálatok részben a 7. alprojekt keretében előállított vonalakon történnek. A Kárpát-medence különböző nagytájairól, eltérő éghajlati területeiről származó Aegilops vonalak genetikai analízise a 7. alprogramban valósul meg. A szemtermések táplálkozás élettani paraméterin keresztül a program a 4. alprojekthez is kapcsolható.

71

7. Kutatási alprojekt A kecskebúza (Aegilops) fajok felhasználásával létrejövő élelmiszeralapanyagok eredetvédelmét biztosító új genetikai módszerek kidolgozása, illetve a beltartalmi tulajdonságok jelzésére is alkalmas genomok, mint adatbázis-paraméterek analízise Az alprogram lényege A jelen kutatási program elsődleges célja, hogy rendelkezésre álljanak az Aegilops fajok felhasználásával létrejövő új búzafajtákból készülő termékek eredetazonosítására, és biztonságuk igazolására alkalmas új módszerek és paraméterek, valamint megalapozásra kerüljön az ezek használatához szükséges eredetvédelmi adatbázis modell. Az eredmények hasznosításával hosszú távon olyan, jelenleg egy fajtában sem létező tulajdonság együttessel bíró új búzafajták születhetnek, melyekkel stratégiai előnyökhöz juthat a hazai funkcionális, ill. sportélelmiszer-gyártás az alábbi jellemzőknek köszönhetően: fokozott funkcionális összetevő tartalom, nagy beltartalmi stabilitás, alacsony allergéntartalom, szélsőséges időjárás (elsősorban szárazság) tűrés.

Az alprojekt során elérendő célok 1. Célirányosan kifejlesztett, új molekuláris citogenetikai módszerekkel álljanak rendelkezésre az Aegilops fajok felhasználásával végzett keresztezések élelmiszeralapanyagokban való kimutatatására. 2. Olyan genomok analízise és azonosítása, melyek az eredetiség meghatározására, illetve a biztonság igazolására alkalmas paraméternek is tekinthetők, így integrálhatóak a célzott eredetvédelmi adatbázisba. 3. Az azonosított genomok alkalmazást nyerjenek a neurális hálózat elvén működő termékazonosítási rendszerben. 4. Az eredetvédelmi adatbázis szerkezete, működési alapelvének kialakítása az Aegilops fajok egészségmegőrzés, ill. sporttáplálkozás szempontjából funkcionális összetevők terén feltáratlan genetikai variabilitásának figyelembe vételével történjen. 5. A funkcionális termékfejlesztéshez szükséges beltartalmi tulajdonságokkal összefüggésben lévő DNS-szakaszok térképezése, az Aegilops fajok és a felhasználásukkal végzett klasszikus keresztezések követése új kromoszóma specifikus molekuláris markerek felhasználásával történjen. 6. A nemesítési munkához rendelkezésre álljanak az Aegilops fajokban eddig nem vizsgált, kedvező beltartalmi tulajdonságokért felelős gének vad alléljeinek, valamint az IgE mediált búza allergéneknek eddig nem vizsgált variabilitására vonatkozó új ismeretek, melynek révén majd jelentősebb kisebb allergéntartalmú lisztes termékek lesznek előállíthatóak.

Fő kutatási irányok 1. Az eredetvédelmi-élelmiszerbiztonsági adatbázisba illeszthető, és funkcionális termékfejlesztésben előnyös búzahibridekben felhasználandó, búzanemesítés szempontjából leginkább értékes, U és M jelű Aegilops kromoszómákra specifikus molekuláris markerek (SNP, DArT) széles körének előállítása. E markerek közül 72

kerülnek kiválasztásra az Aegilops kromoszómadarabok kimutatására alkalmasak, amelyek felhasználhatóak a kitűzött eredetvédelmi, termékazonosítási célokra. 2. Génbanki és begyűjtött Aegilops tételek alapvető agronómiai jellemzőinek és funkcionális, ill. sportélelmiszerekhez való felhasználásnál fontos beltartalmi tulajdonságainak meghatározása a nemesítési alapanyagok elsődleges kiválogatásának megalapozására. 3. A funkcionális élelmiszerfejlesztés, valamint a termésminőség stabilitása szempontjából legfontosabb beltartalmi tulajdonságokért felelős gének, valamint a búzaallergiát kiváltó gének eddig nem ismert vad alléljeinek azonosítása Aegilops fajokban. 4. A kedvező beltartalmi tulajdonságok azonosítását biztosító allélspecifikus markerek fejlesztése, melyek az eredetellenőrzés céljára is nagy biztonsággal alkalmazhatóak az Aegilops-keresztezésű, megnövelt értékű élelmiszer-alapanyagoknál. Az eredet azonosítására alkalmas tulajdonságok és a vizsgálatukra kifejlesztett módszerek a kialakítandó célzott nyomonkövetési adatbázis részét fogják képezni. 5. A hosszú távú nemesítési folyamat kiindulását jelentő búza x Aegilops hibridek létrehozása a távlati céloknak megfelelő, kiválogatott vonalakkal történő keresztezés révén.

A munka újszerűsége és innovatív tartalma Olyan új molekuláris citogenetikai módszerek jönnek létre, melyek alkalmasak az Aegilops fajok alkalmazásával előállított élelmiszerek azonosítására. Új búza allergének, genomok és vad allélek azonosítása, melyek mind az eredetiség meghatározásában, mind a későbbi nemesítési munka során alkalmazhatóak. A kifejlesztett molekuláris biológiai paraméterek alkalmazást nyernek a neurális hálózat elvén működő termékazonosítási rendszerben. Az eredetvédelmi-élelmiszerbiztonsági adatbázis egyedi, újonnan kifejlesztett elemekkel bővül. Új kromoszóma specifikus molekuláris markerek kidolgozása révén követhetővé és ellenőrizhetővé válik a magas hozzáadott értékű, kiemelkedő beltartalmi tulajdonságokkal bíró Aegilops fajok felhasználása. Új búza x Aegilops hibridek létrehozása, mely magas beltartalmi értékű, a szokványosnál előnyösebb biológiai hatású élelmiszerek alapanyagaként szolgál.

Indokoltság A téma aktualitása A kutatási program a funkcionális és a sportélelmiszerekkel kapcsolatos, ill. az élelmiszerbiztonság növelése irányában ható legkorszerűbb tendenciáknak megfelelően került kialakításra. Az alábbiakban azokat a szempontokat mutatjuk be röviden, melyek alátámasztják a téma aktualitását, Magyarország számára való kiemelt jelentőségét. A funkcionális és a sportélelmiszerek fejlesztésének követelményei Az egészségmegőrzés, ill. a sportteljesítmény fokozása iránt növekvő igény egyre több hozzáadott bioaktív összetevőből álló termék kifejlesztését indítja el. Azonban egyre fokozódik az ún. „clean-label” elvárás is, amely az előbbi tendenciával ellentétes irányban hat: az ilyen attitűddel rendelkező fogyasztók kerülik a sok hozzáadott komponensből álló termékeket, még ha azok természetes eredetűek is. A kétféle elvárás összehangolt kielégítésének legjobb módja, ha az alapanyag maga tartalmazza a természetes úton termelődött, a termék különleges tulajdonságáért felelős bioaktív összetevőket a kívánatos arányban. Miután élelmiszereink 73

többsége (köztük a funkcionális és a sportélelmiszerek) gabona alapú, ezért a legésszerűbb fejlesztési irány olyan búzafajták kifejlesztése, melyek révén már az alapanyag maga tartalmazza a funkcionalitáshoz szükséges összetevőket, ill. azok optimalizált arányát. Kutatásaink ezen célhoz, illetve kutatási irányhoz illeszkednek A búzanemesítés aktuális kihívásai A búzaalapú táplálkozásunk miatt számos, gyakran egymás ellen ható késztetések mentén történik az igények kielégítésére alkalmas új fajták nemesítése. Projektünk tekintetében az alábbi tendenciákat vettük figyelembe. Az egyik legkorszerűbb búzanemesítési irány az egészségmegőrzés támogatása olyan fajták létrehozásával, melyek az e célt szolgáló összetevőkben kedvezőbb összetétellel rendelkeznek. A szokványos fajták szemtermésének összetétele azonban nagyban függ az adott évjárat időjárási viszonyaitól, ezért a funkcionális termékek gyártása szempontjából komoly versenyelőnyt jelent, ha a termés összetétele lényegesen nem ingadozik, így az élelmiszerek előállítása során nem vagy csak kis mennyiségben szükséges alkalmazni hozzáadott anyagokat. A különböző táplálkozási allergiákban, intoleranciákban szenvedő betegek mintegy húsz százaléka szenved búzaallergiában, melyet a búza és néhány rokon gabonaféle (rozs, árpa, zab, tritikálé) egyes magfehérjéi okoznak. A jelenség fehérjeoldali háttere, kimutatása elsődlegesen néhány nagyobb fehérjecsaládra korlátozódik. A mag endospermiumában található prolaminok (pl. gluteninek, gliadinok, alfa-amiláz inhibítorok, lipidkötő fehérjék) azonban csak részben felelősek az okozott tünetekért. Ugyanakkor allelikus jelenlétükben a különböző búza fajok között nagy variabilitás mutatkozik. A kecskebúza (Aegilops) fajok kiválóan alkalmazhatóak búzanemesítési tevékenységekben. E nemzetség Kárpát-medencében őshonos vad fajai szoros filogenetikai rokonságban állnak a termesztett búzával, azzal könnyen keresztezhetők, így a búza legfontosabb génforrásai közé sorolhatók. Az elmúlt évtizedekben számos betegség rezisztenciáért és abiotikus stressz tűrésért felelős gént sikerült beépíteni a búzába. Az Aegilops nemzetség búzával való szoros rokonságának köszönhetően klasszikus nemesítési eljárásokkal, génmanipuláció nélkül, ún. idegenfajú hibridizációval is megoldható a célzott tulajdonságok átvitele. Az így létrejövő hibridek nem ütköznek Magyarországnak az Alaptörvényben rögzített, génmódosított élőlényektől mentes mezőgazdasági termelésre vonatkozó passzusába, tehát korlátozás nélkül termeszthetőek lesznek majd élelmiszergyártási célra. A búza allergén jellegének csökkentésére tett erőfeszítések közül azok a legígéretesebbek, melyek közeli rokon növények nem allergén változatainak megtalálására és nemesítésben való alkalmazására irányulnak. A különböző Aegilops fajok allergia szempontból történő tanulmányozása lehetővé teszi olyan új genotípusok előállítását, melyekben az allergiát kiváltó fehérjék a vad fajokból származó, potenciálisan-allergiát nem okozó fehérjékre cserélhetők. Nemzetközi előzmények Az Aegilops fajok nemesítésben való alkalmazásának problémái és megoldása Az Aegilops fajok felhasználását célzó fajkeresztezések folyamán első lépésként F1 hibrideket, a genom megkettőzésével amfiploidokat, majd több éven keresztül történő visszakeresztezésekkel addíciós és szubsztitúciós vonalakat állítanak elő. A cél olyan transzlokációk előállítása, amelyben a beépített szegmentum lehetőség szerint csak a kívánt gént 74

tartalmazza. A transzlokáció akkor lehet sikeres, ha a kiesett búza kromoszóma szegmentum hatását az idegen kromoszóma szegmentum képes kompenzálni, ami a homeológ kromoszómákból képződött transzlokációk esetén valósul meg. Ebben az esetben az adott funkciókért felelős gének sorrendje a különböző eredetű kromoszómákon közel azonos. A génátviteli folyamat során szükséges a beépített idegen kromoszóma azonosítása és nyomon követése. A molekuláris citogenetikai módszerek fejlődésével, genomi és repetitív és DNS próbák alkalmazásával (GISH, FISH) a beépített idegen kromoszómák kimutathatók és a hibridizációs mintázat alapján azonosíthatók. Ez a megközelítés azonban egyre kevésbé hatékony: A molekuláris citogenetikai módszerek hátránya, hogy csak meghatározott, relatíve kisszámú egyed vizsgálatát teszi lehetővé. A visszakeresztezett és öntermékenyített nemzedékek számával párhuzamosan exponenciálisan nő az egyedek száma, így a kívánt genotípusok (addíciós-, szubsztitúciós-, transzlokációs vonalak) citológiai módszereken alapuló szelekció hatékonysága csak jelentősen növekvő mértékű ráfordításokkal tartható fenn. A probléma megoldását az egyes Aegilops fajok kromoszómáira specifikus, PCR-alapú molekuláris markerek használata jelenthetné, mely lehetőséget adna évente több ezer egyed genotipizálására és nagyszámú introgressziós vonal szelekciójára. E fejlesztésre azért van égető szükség, mert a vad fajokban rejlő genetikai potenciál még távolról sem kiaknázott, ami legalább két okra vezethető vissza: A kecskebúza fajok begyűjtött tételeit kezelő génbankoknak nincs kapacitásuk az egyes tételek agronómiai tulajdonágainak jellemzésére. A kecskebúzákról igen kevés genomi (molekuláris) információ (markerek, genetikai térképek, génsorrend) áll rendelkezésre. A vad fajok géntartalékként való hasznosítása A vad fajokban rejlő géntartalékok felderítése és a nemesítésben történő alkalmazása egyre inkább a nemzetközi tudományos érdeklődés homlokterébe kerül, amint azt több jelentős nemzetközi szervezet (CIMMYT, CGIAR, BBSRC, INRA) kutatási programja is bizonyítja. Az Európai Unió szintén kutatási prioritásként jelölte meg a vad fajok genetikai potenciáljának nemesítésben való kiaknázását (FP7 Cooperation Work Programmes, KBBE.2010.1.1-03: Characterisation of biodiversity resources for wild crop relatives to improve crops by breeding). Mindezek alapján a pályázat megvalósulása esetén megteremti a feltételeit egy jövendőbeli nemzetközi együttműködésben megvalósuló FP7-FP8-as Európai Uniós pályázatnak is. Korlátozott sikerekkel eddig csak néhány, jórészt a búza diploid őseinek tekintett S illetve D genommal rendelkező Aegilops fajok (Ae. speltoides, Ae. searsii, Ae. longissima, Ae. sharonensis,és Ae. tauschii) esetében számoltak be (Peil és mtsai., ill. Pestsova és mtsai) főleg búza SSR markerek alkalmazásáról. A kromoszóma specifikus szekvencia adatbázisok segítségével a beltartalmi paraméterek (mikroelemek, vitaminok, étkezési rost összetevők) meghatározásában szerepet játszó gének vad alléljeinek izolálása és a tulajdonságok nyomon követését lehetővé tevő markerek fejlesztése is megvalósulhat. Az áramlásos citometria mint korszerű kromoszómavizsgálati módszer Áramlásos (flow-) citometria segítségével a növényi genom méret alapján kromoszóma populációkra bontható és az átlagostól eltérő méretű egyedi kromoszómák izolálhatóak. Ennek alapja az, hogy a DAPI-festett kromoszómák fluoreszcencia intenzitása arányos a mérettel, így az adott faj flow-kariotípusának (a fluoreszencia intenzitás függvényében megfigyelt kromoszóma számok) csúcsai egyedi kromoszómákat, vagy hasonló méretű kromoszómák csoportjait reprezentálják, melyek izolálhatóak. A flow-sorted kromoszómák azonosítását molekuláris citogenetikai módszerekkel (repetitív DNS próbákkal végzett fluoreszcens in situ hybridizáció, 75

FISH) végzik Kubaláková és mtsai. Eddig 17 növényfaj esetében számoltak be Dolezel és mtsai mitotikus kromoszómák flow-citometriai analíziséről. A gabonafélék közül mostanáig csak a gazdasági jelentőséggel bíró termesztett fajokból (T. aestivum, T. turgidum ssp. durum, H. vulgare, S. cereale, A. sativa, O sativa, Z. mays) sikerült egyedi kromoszómákat izolálni. A flow-sorted kromoszómákra alapozva a kromoszóma alapú genomika lehetővé tette az elmúlt években, kromoszóma (-kar) specifikus BAC könyvtárak létrehozását, a kromoszómák shot-gun szekvenálását és virtuális génsorrendjének megállapítását és kromoszóma specifikus markerfejlesztést. A kromoszóma alapú megközelítés alapvető szerepet játszik a nemzetközi búza és árpa genomszekvenálási konzorciumok (http://www.wheatgenome.org; http://barleygenome.org/) munkájában is. A nagy és komplex genomokkal rendelkező növényfajok esetében az új markerek előállítását jelentősen nehezíti a diszperz repetitív szekvenciák nagy (~80%) aránya és sok esetben a két vagy három különböző genom jelenléte. A minta komplexitásának csökkentésének egyik elegáns módja az, hogy nem teljes genomi DNS mintából, hanem kromoszóma specifikus szubgenomi DNS mintából indulnak ki a markerfejlesztés során. Áramlásos citometria módszer fejlesztési lehetőségei A Dr. Jaroslav Doležel által irányított csehországi kutatócsoport jelenleg az egyetlen, amely képes a növényi kromoszómák rutinszerű flow-citometriai analízisére és izolálására. Az olomouci Kísérleti Botanikai Intézet és az MTA ATK MGI Génmegőrzési és Organikus Nemesítési Osztálya között évek óta szoros munkakapcsolat áll fent, mely számos tudományos publikációt eredményezett. Az olomouci csoport egyedülálló flow-citometriai tapasztalata és a pályázónak az Aegilops fajok molekuláris citogenetikai genomanalízise terén szerzett ismeretei lehetővé teszik egyedi Aegilops kromoszómák izolálását, szekvenálását és kromoszóma specifikus markerek (SNP, COS, DArT) fejlesztését. A hazai kutatások jelentősége nemzetstratégiai szempontból Jelen pályázat több tekintetben is nemzetstratégiai jelentőséggel bír. Az alábbiakban röviden összefoglaljuk ezeket. Magyarország mezőgazdasága számára a nagy hozzáadott értékű, feldolgozott, a nemzetközi piacokon keresett, kvótákkal nem korlátozottan forgalmazható élelmiszertermékek jelentik a kitörés fő lehetőségét. A saját fejlesztésű, magas minőségű alapanyagokból előállított funkcionális, ill. sportélelmiszerek kiváló példát jelentenek ezen elvárásoknak megfelelő termékekre. Az értékes termékek hamisítása azonban gyorsan rontja az eredeti termékek hitelességét, keresettségét, ezért alapvető fontosságú, hogy a fejlesztés kezdetétől fogva nagy megbízhatósággal azonosítani tudjuk a minőségi alapanyagot, ill. az ebből készülő terméket, melyre a fejlesztés tartalmát – az Aegilops fajok felhasznált kedvező tulajdonságait kódoló géneket – azonosító módszereket fejlesztünk ki a projekt során. A projekt révén kifejleszthető egyedi termékek célzott nyomonkövetési modellje, az ebben alkalmazott adatbázis-megoldások más termékek, termékpályákra is kiterjesztve hozzájárulnak a magyar termékek minőségére vonatkozó fogyasztói elvárások kielégítéséhez, a hazai termékek megbízhatóságába vetett bizalom erősödéséhez. Az éghajlati szélsőségek várható fokozódása növekvő mértékben befolyásolja a termés mennyisége mellett annak összetételét is, ami különösen sújthatja az egyedi összetételre épülő termékek gyártását. Így a projekt során a termésösszetétel stabilitásának megőrzése érdekében végzett nemesítési munka e tekintetben is példamutató lesz.

76

Intézményi előzmények A projekt kutatási programja hosszútávra visszatekintő előzményekkel rendelkezik úgy Martonvásáron, az MTA ATK MGI Génmegőrzési és Organikus Nemesítési Osztályán, mint az Eszterházy Károly Főiskolán. A jó agronómiai tulajdonságokkal és keresztezhetőséggel rendelkező Mv9kr1 búza genotípus (Mv9kr1) alkalmazásával évek óta sikeresen állítanak elő búza-rozs, búzaárpa, búza-Aegilops és búza-Agropyron hibrideket. A martonvásári génbankban fenntartott Ae. biuncialis vonalak közül több vonallal hibrideket, amfidiploidokat és egy vonallal addíciós sorozatot (2M, 3M, 7M, 1U, 3U) állítottak elő. Az idegen kromoszómák nyomon követéséhez, Magyarországon egyedüliként a növénybiológiai kutatások terén, kialakítottak egy az in situ hibridizációs módszerek (GISH, FISH) rutinszerű alkalmazását lehetővé tevő molekuláris citogenetika labort. Az itt dolgozó kutatók jelentős eredményeket értek el a búza, árpa, rozs, és Agropyron fajok genomanalízise terén. Amerikai, spanyol, bolgár, cseh együttműködések keretében vizsgálták különböző Aegilops fajok genomszerveződését. Az eltérően jelölt Ae. umbellulata (U genom) és Ae. comosa (M genom) próba DNS segítségével Martonvásáron, Molnár és mtsai. sikerrel különböztették meg az allotetraploid Ae. biuncialis Ub és Mb kromoszómáit, valamint a FISH és GISH módszer kombinálásával intergenomikus transzlokációkat azonosítottak különböző Ae. biuncialis és Ae. geniculata genotípusokban. Az intézményben tehát rendelkezésre állnak az Aegilops kromoszómák azonosítására szolgáló molekuláris citogenetikai módszerek, és a rutinszerű alkalmazás laboratóriumi és személyi feltételei adottak Martonvásáron. Az MTA ATK MGI Alkalmazott Genomikai Osztálya hosszú távú tapasztalatokkal rendelkezik a növényi genomikai vizsgálatokban, többek között kromoszóma-, lókusz- és allélspecifikus markerek fejlesztésében különböző növényi magfehérjék génjeinek jellemzésére, azonosítása. Juhász és munkatársai több intézménnyel együttműködésben (CSIRO PI és NSW Wagga Wagga, Ausztrália) részt vettek különböző beltartalmi tulajdonságokért, első sorban sikér minőségért felelős markerek kifejlesztésében, tesztelésében, validálásában. Ezeket a markereket ma nem csak Magyarországon, de különböző ausztrál nemesítési programokban is használják. Az MTA ATK MGI Kalászos Gabonanemesítési osztályán 2005-ben kezdtek el foglalkozni a Healthgrain EU FP6 pályázat keretein belül a bioaktív komponensekkel (antioxidánsok, rostanyagok). Vizsgálták a különböző bioaktív komponensek diverzitását különböző gabonafélékben, valamint ezen tulajdonságok genetikai öröklődését és a környezeti tényezők szerepét. A pályázat eredményeként nemesítési programok indultak, azzal a céllal, hogy egyes bioaktív komponensek mennyiségét megnöveljék búzában, zabban vagy durumban. Ezt a programot egy nemzeti pályázat (HTcereal) keretében indították el a Gyermely Zrt. vezetésével, melynek végső célja funkcionális céllisztek és olyan végtermékek (tészta, pékáru) fejlesztése volt, melyek fogyasztása egészségesebb táplálkozást eredményez. Az MTA ATK MGKI Alkalmazott Genomikai Osztálya és a Kalászos Gabonanemesítési Osztály közös programon belül foglalkozik a búza intoleranciát okozó magfehérjék azonosításában, kenyérbúzában, illetve különböző rokon fajokban, mint pl. T. spelta, T. dicoccoides, Aegilops tauschii.

77

Részlépések és alkalmazott módszerek 7.1 Az U és M kromoszómákra specifikus molekuláris markerek, mint új eredetvizsgálati paraméterek (DArT, SNP) előállítása A feladat célja A búza x Aegilops fajkeresztezésekkel történő génátviteli folyamat költséghatékonyabbá és gyorsabbá tétele azáltal, hogy az Aegilops kromoszóma régiók nyomon követésére alkalmas molekuláris markereket állítunk elő. Ennek érdekében búza-Aegilops introgressziós vonalak és áramlásos citometria segítségével izolált egyedi Aegilops kromoszóma karokat reprezentáló szubgenomi DNS minták segítségével DArT és SNP markereket azonosítunk U és M Aegilops kromoszómákon. A kutatás lépései 7.1.1 Búza-Aegilops introgressziós vonalak citológiai ellenőrzése o A diszómás és diteloszómás addíciós vonalak bizonyos fokú instabilitással rendelkeznek ami az idegen kromoszómák (karok) elvesztését eredményezheti. Ezért a kísérletek elkezdése előtt molekuláris citogenetikai módszerekkel (GISH, FISH) ellenőrizzük az Aegilops kromatin jelenlétét a búza genetikai háttérben. U és M genomi próbákkal végzett genomi in situ hibridizáció (GISH) segítségével ellenőrizzük az idegen kromoszómák jelenlétét a búza genetikai háttérben. A GISH eredmények rögzítése után repetitív DNS próbákkal végzett in situ hibridizáció (FISH) segítségével azonosítjuk az egyes kromoszómákat/ kromoszóma karokat. 7.1.2 DArT markerek azonosítása Aegilops kromoszómákon o A búza-Aegilops introgressziós vonalak és szülői genotípusok genomi DNS-ét elküldjük a Diversity Arrays Technology Pty Ltd (Yarralumla, ACT 2600, Australia) céghez (a technológia alkalmazásának kizárólagos joga a cég kezében van, ezért szükséges a szolgáltatást itt igénybevenni), ahol 8000 DArT marker jelenlétét ellenőrzik minden egyes elküldött DNS mintán. A búza/Aegilops polimorfizmust mutató markereket kiválogatjuk, genomi pozíciójukat az addíciós vonalak segítségével meghatározzuk. A polimorf DArT markerek szekvenciái alapján specifikus PCR primereket tervezünk, melyeket visszaellenőrzünk az addíciós vonalakon. 7.1.3 Aegilops kromoszómák izolálása, szekvenálása, SNP-k azonosítása o Nemzetközi együttműködésben a Dr. Jaroslaw Doležel által irányított csehországi kutatócsoporttal (Kísérleti Botanikai Intézet, Olomouc) az U és M genom kromoszómáit tartalmazó búza-Aegilops diteloszómás addíciós vonalakból az Aegilops kromoszóma karokat áramlásos citometria segítségével izoláljuk és FISH segítségével azonosítjuk. Az izolált egyedi Aegilops kromoszómákat szekvenáljuk, majd megfelelő bioinformatikai módszerekkel (Genome Zipper Analysis) a szekvencia readeket nagyobb kontigokká illesztjük. A búza és az Aegilops kromoszómák szekvencia adatainak összehasonlításával az egyes gének intron régióira specifikus SNP-ket azonosítunk. Várható újdonságtartalom Az Aegilops fajok U és M kromoszómáira specifikus DArT markerek. U és M kromoszóma specifikus subgenomi DNS minták Az Aegilops fajok U és M kromoszómáinak génsorrendje, Az Aegilops kromoszómák nyomonkövetését biztosító génspecifikus markerek (SNP-k, COS) 78

7.2 Génbanki és begyűjtött Aegilops tételek szaporítása A feladat célja A martonvásári génbankban található Aegilops fajok tételeit (Ae. comosa (MM): 4 db, Ae. umbellulata (UU): 4 db, Ae. biuncialis (UbUbMbMb): 19 db, Ae. geniculata (UgUgMgMg): 11 db ) és a 6. Alprogram keretében gyűjtött Aegilops tételeket üvegházi és szántóföldi körülmények közt szaporítjuk. Vizsgáljuk a vad fajok genotípusainak agronómiai tulajdonságait. A kutatás lépései 7.2.1 Az Aegilops genotípusok felszaporítása és agronómiai tulajdonságainak vizsgálata o A génbanki és gyűjtött Aegilops fajok genotípusait szabadföldi körülmények között és üvegházban szaporítjuk annak érdekében, hogy megfelelő szemszámot biztosítsunk a szárazságtűrési és beltartalmi tulajdonságok meghatározásához, valamint a búzával való keresztezésekhez. Szántóföldi körülmények között vizsgáljuk a vad fajok genotípusait a fontosabb agronómiai tulajdonságokra (koraiság, bokrosodás, harvest index, termés elemek, betegség ellenállóság) nézve. Várható újdonságtartalom Agronómiai szempontok szerint jellemzett és felszaporított Aegilops genotípusok, melyek további élettani, analitikai és genomikai vizsgálatokhoz, továbbá keresztezési partnerként előnemesítési programokban alkalmazhatóak. 7.3 Az élelmiszerbiztonsági-eredetvédelmi adatbázisban alkalmazandó, a beltartalmi tulajdonságokért felelős gének és búza allergiát kiváltó gének vad alléljeinek azonosítása Aegilops fajokban A feladat célja A béta glukán, amilóz és arabinoxilán génekhez kapcsolt publikus markerek feltérképezése, tesztelése U és M genommal rendelkező diploid Aegilops genotípusokon. A publikált markerekkel nem rendelkező géneknél a tulajdonságokat elsődlegesen meghatározó szekvenciáinak in-silico elemzése, allélek keresése. Inszerciók/deléciók és pontmutációk alapján allélspecifikus PCR primerek tervezése, tesztelése, validálása. Az IgE mediált búza allergiához kapcsolható fehérjék génjeinek markeres elemzése: A publikált irodalmi adatok alapján 10-15 féle T. aestivum allergén fehérje génjére marker tervezése és tesztelése Aegilops fajokban, majd a vad allél változatok azonosítása. A kutatás lépései 7.3.1 Bioinformatikai vizsgálatok o Az Aegilops fajokból és a T. aestivum-ból elérhető publikus szekvenciák összegyűjtése, beltartalmi tulajdonságokkal, ill. allergiával kapcsolatos gének és allélek azonosítása. Szekvenciák elemzése, gén homológok azonosítása. Alléleken belül inszerciók/deléciók azonosítása, specifikus primerek tervezése. 7.3.2 Molekuláris biológiai vizsgálatok o A vizsgálandó Aegilops genotípusokból és deléciós vonalakból genomi DNS izolálása. Génspecifikus markerek tervezése kb. tízféle beltartalmi tulajdonsággal és kb. húszféle búza allergiával kapcsolatba hozható génre. Polimeráz láncreakciók optimalizálása, polimorfizmus detektálása. PCR markerek tesztelése és validálása a különböző Aegilops genotípusokon. Szükség esetén a kapott PCR fragmentek ellenőrző szekvenálása, újabb primerek tervezése. 79

7.3.3 Proteomikai vizsgálatok o Az IgE mediált búza allergének azonosítása két-dimenziós gélelektroforézissel és in-gél immunodetektálással. A vadfajokból szekvenciális extrakcióval víz/só, alkohol illetve híg sav/lúg oldható frakciók izolálása és összehasonlítása fluoreszcens detektálás (DIGE) mellett a T. aestivumból izolált megfelelő frakciókkal. Az eltérést mutató fehérjék azonosítása LC-MS-MS analízissel. Várható újdonságtartalom Azonosított, beltartalmi és allergia szempontból jelentős gének, allélek. Gén illetve allélspecifikus markerek: Aegilops fajok búza allergomja, és az immunodetektálás során eltérően reagáló fehérjék alapján allergiát nem okozó allélvariánsok. 7.4 Magas beltartalmi tulajdonságok nyomonkövetését és az eredetvédelmet, ill. garantált biztonságot szolgáló allélspecifikus markerek fejlesztése

A feladat célja A beltartalmi vizsgálatok eredményei alapján az allél adatok és a mért paraméterek közötti összefüggések statisztikai elemzése, összefüggések feltárása. A magas beltartalmi tulajdonságokkal rendelkező genotípusok alléljeinek szekvenálása, elemzése. Marker alapú szelekcióhoz specifikus markerek fejlesztése, tesztelése. A kutatás lépései 7.4.1 Statisztikai elemzések : o A különböző beltartalmi vizsgálatokat követően statisztikai elemzések végzése, összefüggések feltárása, értékelése. 7.4.2 Molekuláris biológiai vizsgálatok: o A magas beltartalmi tulajdonságokkal rendelkező fajták megfelelő alléljeinek izolálása, klónozása, szekvenálása. Marker alapú szelekcióhoz specifikus markerek fejlesztése, tesztelése és validálása a génbankban található genotípusokon. Várható újdonságtartalom Magas beltartalmi tulajdonságokhoz kapcsolható, tesztelt és validált molekuláris markerek. 7.5 Aegilops kromoszóma szegmentumok átvitele a búzába fajkeresztezésekkel A feladat célja A 6. Alprogram keretében kiválogatott, jó beltartalmi és stressztűrési paraméterekkel rendelkező Aegilops genotípusok kromoszómáinak hagyományos keresztezési eljárásokkal történő átvitele a tetraploid (T. turgidum ssp. durum) és hexaploid (T. aestivum) búzába. Az Aegilops kromoszómák és hasznos beltartalmi tulajdonságokat meghatározó allélek jelenlétének igazolása az F1 hibridekben a 7.1 és 7.4 alfeladatokban létrehozott markerek segítségével.

80

A kutatás lépései 7.5.1 Búza-Aegilops F1 hibridek előállítása o A 6. Alprogram keretében kiválogatott Aegilops genotípusokat összekeresztezve a jó termékenyülési tulajdonságokkal rendelkező tetraploid (’Mv Makaróni’) és hexaploid (Mv9kr1) búza genotípusokkal F1 hibrideket állítunk elő. 7.5.2 Búza-Aegilops F1 hibridek vizsgálata molekuláris markerekkel o A létrehozott F1 hibrideket a 7.1 és 7.4 alfeladatokban létrehozott molekuláris markerekkel vizsgálva igazoljuk az Aegilops kromoszómák és hasznos allélek jelenlétét. A részfeladat újdonságtartalma T. turgidum ssp durum × Aegilops F1 hibridek : o ’Mv Makaróni’× Ae. umbellulata, ’Mv Makaróni’× Ae. comosa, ’Mv Makaróni’× Ae. biuncialis, ’Mv Makaróni’× Ae. geniculata, T. aestivum × Aegilops F1 hibridek : o Mv9kr1× Ae. umbellulata, Mv9kr1× Ae. comosa, Mv9kr1× Ae. biuncialis, Mv9kr1× Ae. geniculata A fenti F1 hibridek, melyek a projekt keretében előállított markerek alkalmazásával bizonyítottan rendelkeznek a megadott Aegilops kromoszómákkal és hasznos allélekkel, közvetlenül alkalmazhatóak a funkcionális élelmiszer alapanyagként szolgáló búzafajták létrehozásához szükséges előnemesítési programokban.

Az alprojekt várható eredményeinek hasznosítása Hosszú távú hasznosítás A létrejövő új eljárások és a felhasználásukkal nyert adatok révén nagy biztonsággal ellenőrizhetővé válik az Aegilopsszal történt keresztezésre épülő, magas hozzáadott értékű élelmiszerek eredetazonossága. A kifejlesztett új markerek, és feltárt egyedi genomok kiindulópontját jelenthetik egy jóval kiterjedtebb, eredetvédelmi-élelmiszerbiztonsági adatbázisnak. A kutatási program eredményeként olyan búza-Aegilops hibridek jönnek létre, melyek kiváló nemesítési alapanyagot jelentenek funkcionális és sportélelmiszerek előállítására. Tudományos alkalmazhatóság Az egyes Aegilops kromoszómák izolálása és szekvenálása lehetővé teszi az Aegilops kromoszómák génsorrendjének feltérképezését, a búzával való kolinearitás megállapítását és ezen keresztül az agronómiai jellegek kialakulásának mélyebb elemzését. A különböző beltartalmi tulajdonságokért felelős génekre (arabinoxilán, béta-glukán, amilóz) kifejlesztett Aegilops specifikus markerek által lehetőség nyílik az idegen fajú keresztezést követően az U és M genom donorokból származó kedvező tulajdonságok követésére, szelekciójára. A különböző génbanki Aegilops állományokból az előnemesítési feladatokra a markerek felhasználásával kiválogatott tételekből új, egyedi, magas biológiai értékű fajok előállítására nyílhat lehetőség.

81

Összefüggés a projekt más kutatási programjaival A létrehozott Aegilops kromoszóma specifikus (SNP, COS, DArT) markerek lehetővé teszik a 6. alprogramban kiválogatott Aegilops genotípusok kedvező beltartalmi paramétereit meghatározó kromoszómarégiók célzott átvitelét a búzába, valamint további agronómiai tulajdonságok (Szárazság-, só-, alumínium-tűrés, koraiság, rozsdabetegségekkel, lisztharmattal szembeni rezisztencia) genetikai térképezését. A létrehozott molekuláris markerek az eredetellenőrzési módszerek fejlesztésével foglalkozó 1. kutatási program keretében beépülnek a funkcionális és sportélelmiszerek élelmiszerbiztonságának fokozását célzó célzott nyomonkövetési rendszerbe. A létrehozott búza-Aegilops hibridek hozzájárulnak új nemesítési alapanyagok végső soron új, az eddigieknél kedvezőbb bioaktív komponensekkel rendelkező búza fajták előállításához, mely szervesen illeszkedik az MTA ATK MGI kutatási profiljába, de elősegítik a 4. alprogram megvalósítását is. A martonvásári génbanki tételek jellemzése és a jó agronómiai tulajdonságokat (bioaktív komponensek, rostanyagok) hordozó genotípusok, mint potenciális keresztezési partnerek 6. kutatási programmal szorosan együttműködve végzett kiválogatása jelentős előrelépést biztosít az intézet hosszú távú kutatási tevékenységében is.

82