[AZ IZOLÁLT ALGAFAJOK CÉLZOTT ALAPKUTATÁSA]
AZ „IZOLÁLT ALGAFAJOK CÉLZOTT ALAPKUTATÁSA” CÍMŰ TÁMOP PROJECT (TÁMOP-4.2.2.A-11/1/KONV-2012-0007) CÉLKITŰZÉSEI
Jakab Gusztáv1 – Turcsán Zsolt1 – Maróti Gergely1,2 1Gazdasági, 2Magyar
Agrár- és Egészségtudományi Kar, Szent István Egyetem, Szarvas Tudományos Akadémia, Szegedi Biológiai Kutatóközpont, Szeged
1. BEVEZETÉS Az állati és élelmiszeripari, valamint vágóhídi eredetű hulladék feldolgozó üzemekben nagymennyiségű technológiai szennyvíz keletkezik, amely mechanikai és biológiai tisztítása után is kedvező beltartalmi összetétele miatt, alkalmas másodlagos hasznosításra, nagy hozzáadott értékű termékek előállítására. E tisztított szennyvíz homogén minőségű, nagy szervetlen és szervesanyag tartalmú folyadék, ami nem tartalmaz a mikroorganizmusokra nézve toxikus komponenseket. Nagy anyagtartama miatt a befogadóba juttatása előtt, még kémiai tisztításon is keresztül kell mennie, hogy felszíni vízszennyezés elkerülhetővé váljon. Léteznek azonban technológiák az oldott szervetlen és a még benne lévő szervesanyag környezetkímélőbb kivonására. A legolcsóbb és a természetes környezetre nézve legkíméletesebb megoldás a mikroalgák alkalmazása. Jól kiválasztott mikroalga fajokkal a tisztított szennyvíz ammóniatartalmának 99%-a, a nitrátok
88%-a és a foszforvegyületek 99%-a eltávolítható. Az algák rendkívül jó víztisztító hatása jelentős légköri CO2 megkötéssel és biomassza-termeléssel párosul. Optimális körülmények között naponta képesek megduplázni friss tömegüket, aminek fontos klímavédelmi aspektusa, hogy 100 t alga biomassza előállítása 183 t légköri CO2 megkötését eredményezi. Egy 100 m3 –es fotobioreaktorban naponta képződő algatömeg: 200 kg, fajlagosan 2 kg/m3 a keletkező biomassza mennyiség. A mikroalgák a vízben oldott tápanyagokat és fényenergiát kiválóan hasznosító egysejtű élőlények, amelyekből esszenciális aminosavak, esszenciális zsírsavak, többek között összetettebb tápanyagok alapanyagaként is alkalmazható, magas fehérje és vitamintartalmú táplálék kiegészítőként kerülhetnek alkalmazásra. Funkcionális élelmiszerek és funkcionális állati takarmányok állíthatók elő belőlük, melyek jelentős importtermék behozását váltják ki. A mikroalgák - mint egyedüli szervezetek a természetben, amelyek képesek a 165
[AZ IZOLÁLT ALGAFAJOK CÉLZOTT ALAPKUTATÁSA] 18 szénatomszámú telített zsírsavakból képesek többszörösen telítetlen omega zsírsavak EPA és DHA zsírsavakat előállítani. E két zsírsavat az állati és emberi szervezet megfelelő deszaturáz enzimek hiánya miatt csak a 18 szénatom számú 2 és 3 telítetlen kötéssel rendelkező linolsavból és linolénsavból, mint prekurzorból képes szintetizálni. Kétszáz kilogramm kivont algamennyiségből 140 liter olaj nyerhető ki a kísérletek szerint. A zsírsavakat termelő mikroalgák tenyésztése bonyolult feladat, még nem áll rendelkezésre receptszerű technológia e célra. A mikroalga tenyésztés összetett folyamat is egyben, mert a fajok életközössége érzékenyen reagál a környezeti változásokra, így például a hőmérséklet, fényviszony, tápanyag-összetétel változására. Bonyolult és nehézkes továbbá az oldatból való kinyerésük, kezelésük, tárolásuk és az állati tápokhoz való adagolásuk is. Ezért elsődleges célunk az, hogy olyan mikroalga fajokat szelektáljunk és fenntartható termelési technológia alapjait dolgozzuk ki konkrét feltételrendszer mellett, ami az állati eredetű hulladék feldolgozó üzemekben keletkezett tisztított szennyvíz utótisztítását végzik. Az algák eközben a tisztított szennyvíz oldott szervetlen, valamint szervesanyag tartalmát csökkentéve– utótisztítás -, jól hasznosítható nagy esszenciális zsírsavakban és aminosavakban gazdag biomasszát állítanak elő. 2. KUTATÁSI FELADATOK 2.1. Algaizolálás természetes környezeti mintákból Az algák rendkívül változatosak mind morfológia, elterjedés és metabolikus kapacitás szempontjából is. Célunk hogy felmérjük néhány kiválasztott vízi és
szárazföldi ökoszisztéma természetes, illetve tisztított és tisztítatlan szennyvizek ökoszisztémájának összetételét. Vizsgálatunk tárgyát képezik szárazföldi talajminták, valamint a felszíni- és szennyvizekből származó vízminták. Célunk a különböző természetes vagy mesterséges környezetekből izolálható algatörzsek az összehasonlítása mellett az egyes vizsgált területek szerkezetileg elkülönülő részeinek a mikrobiális szintű összehasonlítása is. A pontos vizsgálatok elvégzése céljából előre sterilizált eszközöket használunk, ezáltal csökkentve a külső forrásból eredő fertőzések veszélyét. A más forrásból származó fertőzések és szennyeződések jelenléte hibás vizsgálati eredményeket generálhat, amely jelentősen nehezítheti az algák és a velük együtt élő mikrobiális közösség együttélésének a pontos megértését. A megbízható adatok és eredmények kinyerése céljából magas mintavételi számmal dolgozunk (legalább 50 mintavétel). Különös figyelmet fordítunk arra, hogy a begyűjtött mintákat a szállítás és a fenntartás során az eredeti lelőhelyük fizikai és kémiai paramétereihez hasonló környezetben tartsuk fenn, ezáltal is elkerülve a környezeti változásokból adódó mérési hibákat. A gyűjtött mintákon először mikroszkópiás ellenőrzéseket végzünk az alga jelenlétének igazolására. Meghatározzuk a bakteriális és alga kultúrák sejtszám arányait az egyes mintákon. Az eredeti természetes, közvetlenül a lelőhelyükről származó kultúrákat olyan általunk mesterségesen előállított tápoldatba, illetve lemezekre oltjuk le, amelyek megfelelően szimulálják az eredeti lelőhely tápanyag összetételét. Ezzel a módszerrel hosszútávon képesek leszünk megőrizni az eredeti mikrobiális konzorcium összetételét a további vizsgálatok céljából. A kultúrák egymástól 6
[AZ IZOLÁLT ALGAFAJOK CÉLZOTT ALAPKUTATÁSA] elválasztott és monokultúraként fenntartott mikrobiális és alga összetevőit szelektív tápoldatokban és lemezeken tartjuk fenn. A monokultúrák létrehozásához többszörös átoltást, antibiotikumokat és szelektív környezeti faktorokat (fény, sötétség, megfelelő hőmérséklet, stb.) alkalmazunk. Az izolált bakteriális és alga törzseket felszaporítjuk a megfelelő tápoldatokban, majd hosszú távú fenntartásuk céljából rendszeresen továbboltjuk őket, ügyelve a tiszta axénikus vonalak megőrzésére. Az izolált alga törzsek növekedését és életképességét különböző mesterséges tápoldatokban és szennyvizekben teszteljük. Figyelemmel kísérjük az egyes alga törzsek reakcióit az új tápoldatokra. Rendszeres analitikai mérésekkel követjük nyomon az egyes tápoldat komponensek fogyását és újabb szolubilis anyagcsere termékek megjelenését. Megvizsgáljuk az alga sejtek reakcióit a különböző antibiotikumokra és azok különböző koncentrációban történő adagolására. Az egyes algatörzsek szaporításához legalkalmasabb tápoldatok meghatározása után összehasonlítjuk az egyes algatörzsek biomassza hozamát 100 mL-es térfogatban. A húsz leggyorsabban osztódó algatörzsön léptéknövelést hajtunk végre 5-10 L-es fotobioreaktorokban. Meghatározzuk a hatékony biomassza növesztéshez szükséges környezeti faktorok ideális intervallumait (fényerősség, pH, hőmérséklet, oldott szénforrások, levegő széndioxid mennyisége). Végül megmérjük és összehasonlítjuk a legmegfelelőbb kondíciók mellett szaporított algatörzsek napi biomassza hozamát (száraz, nedves tömeg).
2.2. Törzsazonosítás molekuláris vonalkóddal Az ipari méretű alga termesztés során nem lehet garantálni a steril körülményeket, így gyakori esemény a tenyészetek befertőződése más törzsekkel, amelyek káros hatással lehetnek az alga biomassza képződésére és a kontamináló bakteriális vagy gomba törzsek toxinokat is termelhetnek, sőt az is előfordulhat, hogy az alga fog nemkívánatos metabolitokat termelni bizonyos baktériumok jelenlétében (pl. ismert tény, hogy számos alga képes antimikrobiális hatóanyagok, peptid és egyéb típusú vegyületek termelésére a fertőzések megfékezése, szinten tartása céljából. Tehát mindenképpen szükség van a beoltó algakultúra és az algatermesztés során az algakultúrák rendszeres ellenőrzésére, a kialakuló közösségek folyamatos nyomon követésére. Ipari méretekben minden esetben lesznek kontamináló ágensek jelen az algakultúrában, nem cél, hogy ezektől a partnerektől minden esetben megszabaduljunk, azonban fontos ezek kontrollálása, és annak megelőzése, hogy esetlegesen nem kívánatos, akár humán patogén együttélő mikroszervezetek jelenjenek meg és szaporodjnak el az algakultúrában. Erre a nyomon követésre, gyors diagnosztikára alkalmas a DNS vonalkód technika. A DNS vonalkód technika segítségével egyedileg azonosíthatóvá válnak a tenyészetben jelen lévő különböző alga és kontamináló baktérium illetve gomba fajok, vagy akár izolátumok is. Első lépésként a kultúrákból a sejteket kifugáljuk (az összes sejtes szervezetet), majd ebből a biomasszából teljes DNS-t izolálunk, mely tartalmazni fogja az alga DNS-en kívül a baktériumokból és minden egyéb kontamináló törzsből származó genetikai információt. Ezen az össz DNS-en univerzális primerekkel PCR reakció segítségével 7
[AZ IZOLÁLT ALGAFAJOK CÉLZOTT ALAPKUTATÁSA] felsokszorozzuk az összes jelenlévő 16S rDNS (prokarióta, illetve alga kloroplaszt eredetű) illetve 18S rDNS (alga genom illetve egyéb eukarióta eredetű) szakaszokat és meghatározzuk a felamplifikált szakaszok pontos nukleotid sorrendjét új generációs szekvenálással. Az így kapott nukelotidsorrendek egyedi mintázatúak, jellemzőek egy adott fajra, ami lehetővé teszi a törzsek, fajok azonosítását a keverék mintákban is. Ráadásul kvanitatív adatokat is kapunk, pontosan meg tudjuk mondani a mintában jelen lévő fajok egymáshoz viszonyított arányait. A jellemző kontamináló törzsekre, illetve a tenyésztendő kiválasztott 12 algatörzsre kidolgozzuk a DNS vonalkódon alapuló gyors törzsazonosítási eljárást, azaz nem lesz szükség a teljes közösség de novo azonosítására, hanem célzottan tudjuk a számunkra releváns fajokat vizsgálni, pontos számukat meghatározni egy adott mintában. A gyorsteszteket standardizáljuk, ehhez a rendszeres mintavételt és rutin ellenőrző méréseket fogunk végezni az azonosítási folyamat több fázisában. 2.3. Törzsoldatok biomassza tesztek
előállítása,
alga
Az alga biomassza növesztés egyik kiemelt fontosságú eleme a gazdaságosan és nagy mennyiségben előállítható, valamint megfelelő intenzitású biomassza növekedést lehetővé tevő tápoldatok alkalmazása. Az alga tápok alapját képzik a só és nyomelem oldatok megfelelő arányú keverékei. Ezek mennyiségeinek az optimalizálásával jelentősen növelhető a tenyésztés költséghatékonysága. A különböző környezetből izolált alga típusok eltérő minőségű tápoldatot igényelnek aszerint, hogy édesvízi, tengeri vagy szárazföldi környezetből
származnak-e. Például jelentősen különböznek az édesvízi és tengeri közegből származó algatörzsek só koncentráció toleranciái tekintetében, amelyet mindenképpen figyelembe kell venni a tápoldatok összetételének optimalizálása során. Emellett külön figyelmet igényelnek egyes speciális algatörzsek, amelyek optimális növesztéséhez egyéb kiegészítő tápanyagok, mint vitaminok és különféle nitrogénforrások szükségesek. Jövőbeli célunk különböző forrásvizek és kezelt szennyvizek tápoldatként történő alkalmazása. Ezek alkalmazási lehetőségeinek vizsgálatához olyan mesterségesen előállított szennyvizeken növesztünk alga kultúrákat, amelyek hűen modellezik a jövőben alkalmazni kívánt szennyvizek fizikai és kémiai tulajdonságait. A biomassza növesztés egyik legfontosabb eleme a fény mellett a szénforrás(ok) jelenléte. Az algák oldott formában képesek felvenni és felhasználni a szénforrások széles skáláját, kezdve a buborékoltatással adagolható széndioxidtól, a különböző hígításban hozzáadott alkoholokon át a szerves oldott savakig. A projekt során fontosnak tartjuk az egyes szénforrások felhasználhatóságának a monitorozását az egyes algatörzsekre nézve. Mindez lehetővé teszi számunkra az egyes algatörzsek vagy azok keverékeinek specializált növesztését az ismert oldott szerves anyag összetételű szennyvizeken. A különböző paraméterű tápoldatok alkalmazása lehetőséget ad számunkra, hogy széles spektrumon vizsgáljuk az egyes algatörzsek pH tűrésének intervallumát. Az optimális pH értékek alkalmazásával a biomassza hozam tovább optimalizálható. Emellett a pH értékek megfelelő beállításával elősegíthető a másodlagos metabolitok sejtszintű felhalmozódása, termelődésük maximalizálása. További másodlagos metabolit termelést érhetünk el az alga kultúrák hőmérsékletének 8
[AZ IZOLÁLT ALGAFAJOK CÉLZOTT ALAPKUTATÁSA] optimalizálásával és tápanyaghiány (kén, nitrogén és foszfor megvonás) alkalmazásával. A környezeti faktorok megfelelő időben, időtartamban és arányban történő alkalmazásával célunk a maximális biomassza mennyiség elérése mellett a másodlagos metabolit termelés maximalizálása. A növesztési paraméterek optimalizálását fokozatosan végezzük a kis léptékű laboratóriumi fotobioreaktoroktól egészen az ipari termelést modellező fotobioreaktorok szintjéig. Az egyes fotobioreaktorok lehetővé teszik a kevertetés mértékének a széles spektrumú tesztelését. A kevertetés sebességének a beállításával szabályozható egyrészt a kevertetéshez felhasznált energia mennyisége, másrészt az alga sejtek fényhez jutásának mértéke. A két tényező optimális arányának a megtalálása kiemelten fontos az alga augmentációja során, ezúton érhető el a legkisebb energiafelhasználás mellett a legnagyobb értékes másodlagos metabolitokat is tartalmazó hasznos biomassza hozam. Kiemelendő ugyanakkor annak vizsgálata is, hogy a különböző mesterségesen meghatározott növesztési körülmények között toxikus anyagok is termelődnek-e. Ezek vizsgálata és meghatározása elengedhetetlenül szükséges a jövőbeli ipari alkalmazás szempontjából. 2.4. Hidegtűrő alga törzsek izolálása és vizsgálata Az egyes algatörzsek jellemző tulajdonsága, hogy csak egy bizonyos hőmérsékleti tartományban képesek megfelelően növekedni. A különböző hőmérséklettartományú algatörzsek izolálásával lehetővé válik számunkra, hogy redukáljuk az állandó hőmérsékletű környezet fenntartásához használt energia mennyiséget és ezáltal a kezdeti
beruházások költségeit. Szükségtelenné válik az üvegházak és hűtő-fűtő berendezések alkalmazása. Ezek alapján célunk , hogy széles hőmérséklettartományt reprezentáló mintavételt végezzünk a különböző természetes és mesterséges ökoszisztémákból. A kora tavaszi időszak során vett mintákból olyan hidegtűrő algatörzseket izolálunk, amelyekkel kitolható a gazdaságos alga biomassza növesztés időszaka anélkül, hogy jelentős mennyiségű pénzt és energiát kellene befektetnünk az alga kultúrák fűtésébe és hűtésébe, állandó hőmérsékleten tartására és végső soron növesztésébe. A hideg környezetből izolált algatörzsek növekedési potenciálja különböző, ez képezi vizsgálatunk elsődleges célját. Az alga sejtosztódás sebességét számos környezeti faktor befolyásolja (hőmérséklet, fényerősség, nappalok és éjszakák arányának változása). Az évszakok előrehaladtával ezen változó környezeti hatásokra egyes törzsek felszaporodnak, míg mások sejtszáma jelentősen lecsökken. Fontos meghatároznunk az egyes törzsek hőmérsékleti optimumát. Ehhez speciális, hűtő-fűtő funkcióval rendelkező, moduláris, sok egységből álló és kis térfogatú (100 mL) fotobioreaktorokat használunk. A párhuzamosan indított, de eltérő hőmérsékleten növesztett minták folyamatos optikai denzitásának monitorozásával kiválóan nyomon követhetjük az algasejtek osztódásának intenzitását. A hőmérséklet meghatározása mellett fontos a fényerősségnek a beállítása, mivel a téli időszak során a fény erőssége jelentősen csökken. A csökkent fényerősség és nappali órák száma szintén jelentősen befolyásolja a biomassza hozamot. A gazdaságos termelés szempontjából kiemelt fontosságú ezen paraméterek alapos vizsgálata is. Mindez a 9
[AZ IZOLÁLT ALGAFAJOK CÉLZOTT ALAPKUTATÁSA] megvilágítási tulajdonságok dinamikus változtatásával kiválóan figyelemmel követhető az egyes algatörzsek esetében. Az izolált algatörzsek közül célunk 5 °Cos átlaghőmérsékletig azon alga típusok izolálása és szelektálása, amelyekkel lehetővé válik a legalább 0.2 g alga szárazanyag / L nap hozam elérése. A kiválasztott, megfelelő növekedési paraméterekkel rendelkező algatörzsek növesztésének tesztelését különböző fél ipari méretű szabadtéri nyitott, illetve zárt fotobioreaktorokban tervezzük. Ezen kísérletek során meghatározhatjuk az egyes algatörzsek költséghatékony ipari termelésének és a másodlagos alga metabolitok előállításának ideális körülményeit és anyagi vonzatát. Hosszú távú célunk a különböző természetes és mesterséges környezetből izolált algatörzsekből egy olyan alga portfólió kialakítása, amellyel képesek lennénk lefedni egy teljes év termelését, ezáltal lehetővé téve a különböző algatörzseken alapuló folytonos biomassza növesztést és másodlagos alga metabolitok előállítását. Az egyes évszakok által biztosított speciális körülmények lehetőséget adnak arra, hogy külső, mesterséges beavatkozás nélkül olyan stressz hatásoknak tegyük ki az egyes algatörzseket, amelyek elősegítik a másodlagos anyagcsere termékek termelődését, évszak specifikusan, az egész év során. 2.5. További meteorológiai és ökológiai tényezők hatásának vizsgálata az alga biomassza termelésre Az alga biomassza gazdaságos növesztéséhez kiemelendően fontos a fenntartási és növesztési költségek alacsony szinten tartása. Ehhez egy olyan szabadtéri (nyitott vagy zárt) rendszer kialakítása szükséges, amely előnyösen tudja kihasználni a külső ökológiai tényezők és az időjárás változásait egyaránt. A különböző kultivációs
eszközök külső környezeti tényezőkhöz való hangolásával maximalizálható az alga biomassza növesztés sebessége. A stabil növesztési környezet paramétereinek mesterséges fenntartása folytonos és jelentős energia befektetést igényel, amelynek anyagi vonzata a külső környezet adottságaitól függően eltérő mértékben változhat. Kutatási célunk a befektetett energia mennyiségének olyan mértékű redukálása, amely mellett a biomassza növesztés még hatékony marad. Ez egy olyan intelligens rendszerrel lehetséges, amely képes érzékelni az adott terület időjárási paramétereit és ez alapján a növesztési tulajdonságokat képes összehangolni és optimalizálni a környezeti tényezők változásával. Ezen rendszerek hatékony működésének a magalkotásához számos előzetes laboratóriumi vizsgálat szükséges. A széleskörű szabályozhatóságot lehetővé tevő, különböző térfogatú laboratóriumi alga augmentációs eszközök lehetőséget nyújtanak arra, hogy széles skálán valós környezeti hatásokat teszteljünk a különböző algatörzseken. Tág spektrumban vizsgálhatóak a rövid (napi) és hosszú távú (évszakos) hőmérsékletváltozások alga sejtekre gyakorolt hatásai. Lehetővé válik, hogy különböző éghajlatok jellemző hőmérséklet változásait vizsgáljuk különböző típusú laboratóriumi szintű alga kultivációs eszközökben. A kisebb méretű (100 – 500 mL térfogat) fotobiorekatorokkal gyorsan és hatékonyan vizsgálható az optimális növesztési hőmérséklet, míg a nagyobb térfogatú (>5L) alga kultivációs eszközökkel a kapott eredmények féli ipari – ipari léptékben ellenőrizhetőek, illetve tovább finomíthatóak. A hőmérséklet folytonos változása mellett a fény mennyisége és minősége is fokozatosan változik a szabadtéri alga kultiváció során. Változtatható hullámhosszú led panelek 10
[AZ IZOLÁLT ALGAFAJOK CÉLZOTT ALAPKUTATÁSA] alkalmazásával időben jól modellezhető a szabadtéri beeső fény spektrum összetételének a változása és nyomon követhető az alga fotoszintetikus apparátusának az alkalmazkodása. A fény hullámhossz összetétele mellett annak erősségének alakulása is jól szimulálható kisméretű laboratóriumi fotobioreaktor rendszerekben. A másodlagos metabolitok gazdaságos termeltetésének céljából fontos előzetesen megvizsgálni a különféle algatörzsek reakcióit a különböző intenzitású megvilágításokra. Az egyes algatörzsek legoptimálisabb hőmérsékleti és megvilágítási körülményeinek a meghatározásával megadható az adott törzs szabadtéri növesztéséhez legmegfelelőbb éghajlat és évszak. Az alga törzsek laboratóriumi vizsgálatával meghatározható, hogy a különböző típusú fotobioreaktorokban milyen paraméterekkel növeszthető a leghatékonyabban az adott törzs. Meghatározható a növesztésre fordított erősforrások és a kapott termék értékének aránya. Ez hosszú távon tervezhetővé teszi az anyagi befektetés és megtérülés mértékét. A megtérülési időt tovább rövidíthetik azon egyszerű felépítésű augmentációs rendszerek (nyílt, sekély tavas rendszer) használata, amelyek költséghatékony módon (árnyékolás, vízmélység szabályozás) teszik lehetővé a környezeti változásokhoz történő alkalmazkodást. A hatékony és hozzáadott értéket tartalmazó alga kultúrák gyors és olcsó növesztésének eléréséhez elengedhetetlen a nagy mennyiségben és olcsón alkalmazható szénforrások használata is.
2.6. Zsírsav és fehérjeösszetétel vizsgálatok a kiválasztott algatörzseken
A feladat során az algatenyészetek zsírsavösszetételét részletesen vizsgáljuk, a zsír- és olajösszetétel mennyiségi és minőségi meghatározására fókuszálunk. A zsír és olajösszetételt standard analitikai módszerekkel mérjük, trimetilszulfónium-hidroxidos (TMSH) extrakció után t-butil-éterben metil-észterezve és TMSH-ban átészterezve. A mérések gázkromatográfiával történnek. A zsírsavösszetétel esetében külön vizsgáljuk a többszörösen telítetlen zsírsavak mennyiségét és arányát a mintákban, EPA, DHA méréseket végzünk, vizsgáljuk az alkalmazott tápoldatok összetételének hatását az omega 3 és omega 6 zsírsavak arányának alakulására az összes zsírsavhoz képest. A zsírsavak mellett külön figyelmet fordítunk az élettani szempontból nagyon fontos szterolokra is. Ismert, hogy a legtöbb növény, így a zöldalgák is számos szterolvegyületet tartalmaznak kis mennyiségben. Klinikai vizsgálatok támasztják alá alapvető bizonyítékokkal, hogy a növényi szterolok csökkentik a teljes koleszterinszintet, azon belül is az alacsony sűrűségű lipoprotein (LDL) koleszterinszintet, a koleszterin felszívódásának részleges megakadályozásával. A feladat során specifikusan vizsgáljuk az alábbi szterolok jelenlétét az alga biomasszában: cholesterol, β-sitosterol, stigmasterol, ergosterol. Ezen szterolok esetében pontos mennyiségi meghatározást is végzünk gázkromatográfiás módszerrel. A zsírsavak és szterolok mellett az algák összes fehérjetartalmát is vizsgálni fogjuk, illetve elemzést készítünk az aminosavösszetételről is az egyes mintákban. Párhuzamos méréseket végzünk különböző összetételű tápoldatban előállított algák zsírsav és fehérje-tartalmának összehasonlítására. A tápoldatok esetén a következő főbb paramétereket változtatjuk: nitrogén 11
[AZ IZOLÁLT ALGAFAJOK CÉLZOTT ALAPKUTATÁSA] mennyisége (3 féle értékkel), nitrogén beviteli formája (3 formában), a kezdeti tápoldat pH értéke (pH 6, 7, 8), a pH beállításhoz használt pufferek minősége (KH2PO4, K2HPO4, TRIS-HCl), ecetsav mint szerves szénforrás jelenléte és szintje. Az algatenyésztés különböző fázisaiban (exponenciális növekedés, stacioner fázis, elöregedő kultúra) veszünk mintát és vizsgáljuk a zsírsavak, szterolok és fehérjék időbeli alakulását összevetve a tápoldatok analitikai adataival, az algakultúrák tápanyagfelhasználásával (folyamatos tápoldat analitikai elemzések, elemanalízis, összes szerves anyagtartalom, szárazanyagtartalom, C/N arány). Az abiotikus körülmények hatását is vizsgáljuk az azonos korú algakultúrák zsírsav és fehérjetartalmára. Elsősorban a hőmérséklet és a fényviszonyok hatását kívánjuk vizsgálni, a hőmérséklet esetében 3 értéket állítunk be a teljes tenyésztési folyamatra, míg a fény esetében a fényerősséget és a megvilágításra alkalmazott fény hullámhosszát tervezzük variálni (mindkét paraméter esetében 3 értéket alkalmazva). További fontos vizsgálandó elem az algakultúrák mikrobiális összetételének hatása az algák zsírsavtartalmára. Össze kívánjuk hasonlítani adott algafajok axénikus és definiált partner organizmusokkal (elsősorban baktériumok) alkotott konzorciumai esetében az algák zsírsavtartalmát. 2.7. Közösségek szelekciója (alga közösségek, alga-baktérium vegyes konzorciumok) A bioreaktorokkal végzett kísérletek és üzemi alkalmazások arra mutatnak rá, hogy egy adott organizmus (baktérium, gomba vagy alga törzs) sokkal nehezebben tud alkalmazkodni a változó külső körülményekhez, mint egy
különböző egyedekből, izolátumokból álló közösség. Tudományos és ipari szempontból is fontos megvizsgálni az ismert növekedési képességgel rendelkező algákból, illetve algabaktérium konzorciumokból összeállított közösségek stabilitását, növekedési rátáját, metabolikus potenciálját és esetleges szekunder metabolit termelését. Az alga törzsek izolálása történhet közösségi szelekcióval, amikor is egy vízmintából nem izoláljuk az algákat külön-külön, hanem a vízmintában növekedő különböző algatörzsek (illetve algabaktérium, alga-gomba illetve ezek kombinációs közösségeinek) együttes jellemzőit vizsgáljuk. A korábbi feladatban fejlesztett DNS alapú vonalkódozási technikával kvantitatív módon, pontosan nyomon tudjuk követni az egyes alga vagy egyéb törzsek előretörését vagy háttérbe szorulását a környezeti paraméterek változásának/változtatásának függvényében. A rendelkezésére álló algatörzsek (Chlorella spp, Scenedesmus spp, Chlamydomonas spp.) közül legalább három alga inokulum keverékét, mint starter vegyes kultúrát kell összeállítani és vizsgálni az így kapott algaközösségek együttes növekedését, illetve az egyes partnerek arányait változó körülmények mellett. Ezzel párhuzamosan legalább három környezeti, úgynevezett természetes minta tesztelése szükséges a bennük lévő alga közösségek növekedési tulajdonságaira (talaj és vízminták, 3-3 párhuzamos mintavétel megfelelően kiválasztott, egymáshoz képest eltérő fény, hőmérsékleti és tápanyagellátottsági adottságokkal rendelkező területekről). A kísérleteket standard laboratóriumi körülmények között tervezzük elvégezni. A vizsgálati eredmények alapján javaslatot teszünk az ipari alkalmazás során felhasználható algaközösségek összeállítására és 12
[AZ IZOLÁLT ALGAFAJOK CÉLZOTT ALAPKUTATÁSA] rendszeres ellenőrzésére (DNS vonalkód technika). A mesterséges és természetes alga közösségeket a kutatás befejezését követő két évig fenntartjuk. A természetes közösséget alkotó egyedi alga törzseket izoláljuk antibiotikum tartalmú táptalajokon, a törzseket DNS vonalkóddal látjuk el. Amennyiben különösen jó növekedési paraméterekkel bír egy-egy újonnan azonosított alga törzs (min. 0.6 g alga szárazanyag/l/nap), meghatározzuk a zsírsavtartalmát és összetételét is illetve részletesen karakterizáljuk ezen törzseket (pontos taxonómiai besorolás, szekunder metabolit termelési képességek). 2.8. Alga-alapú vizsgálatok
szennyvíztisztítási
A feladat során az algák szennyvíztisztítási képességét tervezzük tudományos igényességgel vizsgálni. A szennyvizekből történő algák általi tápanyaghasznosítási hatékonyságot többféle szennyvíz tesztelésével fogjuk felmérni, élelmiszeripari és kommunális szennyvizeket fogunk tesztelni a tisztítási folyamatok különböző fázisaiból véve párhuzamos mintákat, illetve definiált összetételű mesterséges szennyvizeket is vizsgálunk. Első lépésként pontosan felmérjük az ipari szennyvizek kezdeti állapotát, részletes analitikai elemzést végzünk, a vizsgálandó paraméterek: KOI, szerves anyagtartalom, karbonát, ammónium, nitrát, foszfát, szulfát, elemanalízisek (Na, Ca, K, Mg, Cl, Fe, N:K, K:Mg, K:Ca, C, N, C:N) A mesterséges szennyvízmodellek tesztelése révén pontos információkat nyerhetünk egy-egy kiválasztott szennyvíz-komponens algákra gyakorolt hatásáról, ezáltal a szennyvíztisztítási hatékonyság fő limitáló paraméterei vizsgálhatóak direkt módon. A definiált
összetételű szennyvizek vizsgálatával a fő cél a magas N-tartalom modellezése, ezért számos nitrogénvegyülettel teszteljük az algák nitrogén beépítő, metabolizáló képességét a mesterséges szennyvizekben. Különböző nitrát és ammóniumtartalmú szennyvizeket fogunk tesztelni, illetve magas fehérjetartalmú szennyvizeket is vizsgálni fogunk. A szennyvizeket alga és alga-baktérium keverék inokulumokkal oltjuk be, különböző inokulum típusokat (tiszta algatörzsek, keverék algatörzsek, keverék alga-baktérium közösségek ismert baktérium-alga arányokkal) és különböző beoltási arányokat használva (0,5%, 5%, 20%). A tisztulási, tápanyaghasznosítási folyamat különböző szakaszaiban (2 hetente) folyadék mintavételeket és teljeskörű analitikai elemzéseket végzünk (KOI, szerves anyagtartalom, karbonát, ammónium, nitrát, foszfát, szulfát, Na, Ca, K, Mg, Cl, Fe, N:K, K:Mg, K:Ca, C, N, C:N), illetve folyamatosan mérjük a képződő alga illetve mikrobiális biomasszát. A centrifugálással összegyűjtött sejtes frakciót mérjük, feltárjuk, az összes zsírsav és fehérjetartalmat meghatározzuk. Fontos feladat a tápanyag-tartalom optimalizálása a tisztítási folyamat közben, a 2 hetente történő analitikai mérések eredményei alapján be tudunk avatkozni és amennyiben szükséges a megfelelő, aktuálisan limitáló tápanyagokat utánpótoljuk (optimálisan szennyvíz adagolással, illetve a definiált szennyvizek esetében a limitáló komponens pótlásával. Emellett fontos lehet a mikroelemek utánpótlása, illetve speciális vitaminok adagolása az algák számára. Ez utóbbira alternatíva lehet az alga-baktérium konzorciumok alkalmazása, ismert, hogy a baktériumok fontos vitaminok megtermelésével tudják elősegíteni az algák szaporodását
13
[AZ IZOLÁLT ALGAFAJOK CÉLZOTT ALAPKUTATÁSA] (vizsgálni fogjuk ezen jelenség esetleges meglétét a rendszereinkben). A zárt rendszerű szennyvíztisztítási kísérleteink során a leírt analitikai elemzéseken túl az alga és algabaktérium vegyes kultúrák gázanyagcsere vizsgálatát is tervezzük, ennek révén speciális fermentációs folyamatokat, útvonalakat azonosíthatunk, gázkromatográfiával a CO2, H2, N2 és CH4 mérését tervezzük. 2.9. A legnagyobb produktivitású alga törzsek transzkriptomikai jellemzése A feladat során a tesztelt tápoldatokban a legmagasabb biomassza hozamot produkáló alga törzseket (2 törzset) kiválasztjuk, és megvizsgáljuk a globális génexpressziós mintázatukat különböző környezeti paraméterek alkalmazása mellett. Ezen paraméterek lesznek a fény (2 változóval, magas és alacsony fényintenzitás), a hőmérséklet (2 változóval, alacsony növekedési sebességet biztosító és magas biomassza hozamot lehetővé tévő optimális hőmérsékletek) és egy definiált szerves szénforrás jelenléte illetve hiánya (pl. ecetsav). Összesen 16 alga minta teljes transzkriptom analízisét fogjuk elvégezni. A főbb munkafolyamatok a következők lesznek: alga nevelések a meghatározott 16 kombinációban (törzsek és körülmények kombinációi), minden esetben 3 párhuzamos tenyészetet használva (összesen 48 tenyészet), alga sejtek összegyűjtése, a sejtes frakciók izolálása, az algasejtek feltárása, teljes RNS kivonása és előkészítése (in vitro fragment könvtárak készítése) transzkriptomikai analízisre, majd transzkriptom szekvenálások mintánként legalább 5 millió leolvasás generálásával, végül az eredmények, nyers szekvenciaadatok bioinformatikai analízise, létező alga genomokra történő illesztése, az egyes gének expressziós szintjének
meghatározása minden mintában (az algákban nagyságrendileg 8-12 ezer gén található), majd a minták kvantitatív összehasonlító analízise. A transzkriptom analízisek célja a komplex génszabályozási útvonalak megértése, a körülmények változtatására bekövetkező és törzsfüggő molekuláris reakciók (génexpresszió változások) azonosítása, speciális figyelmet szentelve a zsírsav és fehérje anyagcseréknek, illetve a kapcsolódó metabolikus folyamatoknak. Elsősorban azokat a metabolikus útvonalakat, illetve egyes enzimeket kívánjuk azonosítani a feladat révén, melyek a különböző paraméterek (fény, szubsztrát minősége, hőmérséklet) változtatásának hatására olyan módon változnak meg (csendesülnek, vagy aktiválódnak), mely a zsírsavtermelésre illetve számunkra fontos metabolitok termelésére befolyással vannak. Az így szerzett ismeretek elvezetnek a fényhasznosítás és szubsztrát felhasználás limitáló lépéseinek genetikai szintű feltárásához, és lehetővé teszik olyan molekulák, célpontok azonosítását, amelyek géntechnológiai módszerekkel történő módosítása elősegíti a zsírsav-felhalmozás optimalizálását. Hangsúlyozzuk, hogy jelen pályázati feladatok keretében semmiféle genetikai módosítást nem kívánunk létrehozni, csupán azonosítani kívánjuk azokat a géneket, amelyek fontos kapcsolóként, szabályozó elemként működnek számunkra fontos termékek bioszintézise során. Hosszabb távon sem feltétlenül szükséges genetikai szintű beavatkozás, a cél az, hogy a genetikai információtartalom megváltoztatása nélkül, csupán a szabályzó faktorok megismerése révén képesek legyünk ezen szabályozó elemek kívülről történő irányított működtetésére. A feladat végrehajtása során a legmodernebb és legmegbízhatóbb technológiát, az új generációs szekvenáló 14
[AZ IZOLÁLT ALGAFAJOK CÉLZOTT ALAPKUTATÁSA] rendszert fogjuk alkalmazni, mellyel a génexpresszió vizsgálata (a teljes transzkriptom egyidejű vizsgálata) digitálisan kivitelezhető minden korábbinál pontosabban, nagyobb felbontásban. 2.10. A természetes alga-baktérium szimbiotikus interakciók molekuláris jellemzése Az algák a természetben kizárólag közösségekben, gyakran nagy komplexitású ökoszisztémák tagjaiként találhatóak meg. Tiszta, axénikus alga tenyészetek a természetben nem léteznek, ezt fontos szem előtt tartani akkor, amikor algákkal akarunk számunkra hasznos terméket előállítani, legyen az bioüzemanyag alapanyagként szolgáló zsírsav vagy humán fogyasztási célra szánt telítetlen zsírsavakat tartalmazó alga extraktum. Szinte minden esetben alapvető elvárás a magas biomasszahozam, ez azonban kizárólag akkor lehetséges, ha az alga optimális feltételeket talál a növekedéséhez, akár tisztán fototróf, akár fotoheterotróf növekedéshez. Ismert, hogy az algák a természetben a közösségek egyéb tagjaitól szerzik be vitaminszükségletük, illetve nyomelemigényük jelentős részét. Az ember által kívánt termékek alga alapú előállításának tervezésekor megfontolandó paraméter az alga mellett egyéb mikrobiális partnerek kontrollált alkalmazása. Elsősorban alga szimbionta baktériumok lehetnek rendkívül hasznosak, melyek úgy segítik az alga növekedését, hogy semmiféle káros hatással nincsenek a kívánt alga termék minőségi paramétereire. A feladat során különböző bakteriális partnerek hatását kívánjuk tesztelni algazsírsav termelés során. Ehhez kontrolláltan hozunk létre definiált algabaktérium közösségeket, és minden esetben vizsgáljuk ugyanazon paraméterekre a tiszta algatörzseket
illetve a tiszta baktériumtenyészeteket is. 2 féle algatörzset tervezünk vizsgálni, egy Chlorella és egy Chlamydomonas törzset, és mindkettő algához kétféle baktériumot (Rhodococcus sp. és Escherichia sp.) kívánunk adagolni egyenként, illetve együtt is, azaz 6 féle vegyes tenyészetünk lesz összesen (illetve 2 tiszta alga és 2 tiszta baktérium tenyészet). Mind a 10 mintát 3 párhuzamosban neveljük minden esetben. A tenyészetekből hetente részletes zsírsav analíziseket végzünk, a sejtes frakciókat pedig 2 hét növesztés után összegyűjtjük, majd minden mintából teljes RNS kivonásokat végzünk (a vegyes kultúrák esetében minden faj RNS populációja jelen lesz a nukleinsav mintákban, ezek a minták metatranszkriptomoknak tekinthetőek). A mintákat a transzkriptom analízisnek megfelelően készítjük elő szekvenálással történő analízisre, a metatranszkriptom minták esetében a leolvasásszámot duplájára növeljük a tiszta kultúrák RNS mintáihoz képest, ezt azért tesszük, hogy a közösség minden tagjában kvantitatívan tudjuk követni a bekövetkező metabolikus változásokat. A kapott eredményeket összehasonlítjuk egymással (elsősorban a tiszta kultúrákat a vegyes kultúrákkal), és azonosítjuk a szimbiózis, interakcióspecifikus géneket, útvonalakat az alga genomokban. Ezen információk rendkívül hasznosak lehetnek a további biomassza fokozás szempontjából, tervezett, definiált közösségekkel várhatóan szignifikánsan növelhető az alga termékek előállításának hatékonysága a biztonságosság megtartása mellett. Az azonosított kölcsönhatás specifikus gének diagnosztikai markerként is szolgálhatnak, egy új alga izolátum esetén ezek meglétének vagy hiányának ellenőrzése egy gyors PCR alapú teszttel azonnali információt nyújthat a adott alga izolátum felhasználhatóságáról. 15
[AZ IZOLÁLT ALGAFAJOK CÉLZOTT ALAPKUTATÁSA]
2.11. Axénikus és természetes algakultúrák biohidrogéntermelési lehetőségeinek vizsgálata Az előállított alga biomasszának a felhasználási céloktól függően megfelelő tisztasággal kell rendelkeznie. Az élelmiszeripari célra, táplálékkiegészítőként vagy takarmányként történő alkalmazásra növesztett alga biomasszára szigorú előírások és tisztasági paraméterek vonatkoznak, amelyeket a forgalomba hozatal céljából feltétlenül be kell tartani. Ennek céljából az izolált algatörzseket mindenképpen axénikus formában tároljuk és tartjuk fenn, ezáltal már a növesztés első fázisában elkerülve a fertőző ágensek alga biomasszában történő megjelenését. A megtermelt fertőzésmentes alga biomassza hozzáadott értékét a megtermeltetett másodlagos metabolitok mellett tovább növelhetik egyéb hasznosítható másodlagos anyagcsere termékek. Kén limitáció mellett a már felnövesztett alga biomasszával lehetőség nyílik biohidrogén termelésre. Ennek ipari szintű alkalmazásához elengedhetetlenül szükségesek az előzetes laboratóriumi vizsgálatok. A kísérletek során a gazdaságosság szempontját a középpontban tartva tanulmányozzuk a környezeti paraméterek hatását a hidrogéntermelésre. Különös figyelmet érdemel a hidrogén előállítása során a napi átlaghőmérséklet, az elnyelt fénymennyiség, az alkalmazott tápoldat minősége és a hozzáadott szénforrás minősége és mennyisége. A hidrogéntermelés optimalizálásánál és a költségek előzetes tervezésénél figyelembe kell vennünk, hogy a hidrogéntermelést mindenképpen zárt fotobioreaktorban kell folytatni. A módszer optimalizálása során célunk a különböző zárt fotobioreaktor
rendszerek tesztelése a hidrogéntermelés szempontjából. Jelentős energia ráfordítás takarítható meg a hidrogéntermelés során, ha a természetes nappal és éjszaka periódusokat kihasználjuk. A nappal alkalmazható kénmegvonás módszere mellett, a fermentáció kiválóan alkalmazható az éjszakai sötét periódusok folyamán. Ezen célból érdemes olyan algatörzseket kiválasztani, amelyek egyrészt nagy mennyiségben képesek keményítőt felhalmozni és elraktározni, másrészt a kén-megvonás és sötét fermentáció során ezt lebontani és a lehető legnagyobb hatékonysággal a hidrogéntermelésre fordítani. A sötét fermentáció során a lebontott keményítőből anyagcsere végtermékként a hidrogén mellett széndioxid, laktát, acetát, formát és etanol keletkezhet. Ezek hosszútávon gátolhatják a fermentáció folyamatát, de rendszeres kinyerésükkel ez egyrészt megakadályozható, másrészt újabb értékes termékekhez juthatunk. Ezt a szempontot szem előtt tartva célunk olyan algatörzsek izolálása, tanulmányozása és alkalmazása amelyek hatékonyan képesek ezek közül legalább egy hatékony szekretálására. A legújabb kutatási eredmények azt mutatják, hogy az alga respirációját számos bakteriális partner hatékonyan képes kiegészíteni, ezáltal elősegítve a hidrogént termelő oxigén érzékeny hidrogenázok működéséhez szükséges alacsony oxigén szint elérését. Az algabaktérium kevert kultúrák hidrogéntermeléséhez fényen nem szükséges kénmegvonás, valamint a kénmegvonás módszerétől eltérően a hidrogéntermelés és a biomassza növesztés párhuzamosan végbemehet. Célunk olyan algatörzsek izolálása és jellemzése, amelyek ezen módszerrel a leghatékonyabban képesek az oldott szénforrásokat a hidrogéntermeléshez és 16
[AZ IZOLÁLT ALGAFAJOK CÉLZOTT ALAPKUTATÁSA] a sejtosztódáshoz felhasználni. Valamint olyan GRAS (általánosan biztonságosan nyilvánított) bakteriális partnerek tesztelése, amelyek a leghatékonyabban képesek hozzájárulni a biomassza növekedéshez és a hidrogéntermeléshez. 2.12. Kombinált alga-alapú szennyvíztisztítás és energiatermelés kutatása Az alga-baktérium kevert kultúrán alapuló hidrogéntermelés egyik legfontosabb eleme az oldott szénforrás folyamatos jelenléte a tápoldatban, amely egyszerre gyorsítja fel az alga sejtosztódás ütemét és teszi hosszútávon fenntarthatóvá a biohidrogéntermelést. Tápoldatként a mesterségesen előállított tápoldatok mellett használhatunk az algák számára toxikus összetevőket nem tartalmazó szennyvizeket is. Célunk különböző forrásból származó szennyvizek fizikai és kémiai paramétereinek meghatározása. A párhuzamos alga biomassza növesztés és hidrogéntermelés monitorozása mellett figyelemmel kísérjük szennyvízanalitikai mérésekkel a szennyvíz kémiai összetevőinek, a pH szintjének és az oldott széndioxid koncentrációjának a változásait. A gyors alga biomassza és biohidrogén termelés mellett a módszer további hozadéka a hatékony szennyvíztisztítás lehetősége, amelynek hatékonyságát minden egyes különböző összeállítású alga-baktérium kultúra esetében nyomon követjük majd. A hővel előkezelt és szűrt szennyvizek lehetőséget adnak arra, hogy előre meghatározott, gazdaságos termelést lehetővé tevő alga-baktérium konzorcium párost alkalmazhassunk. Emellett jövőbeli terveink között szerepel a kezeletlen szennyvizeken történő kísérletek végrehajtása. A kezeletlen szennyvizeknél a jelenlévő mikrobiális kultúrát használnánk bakteriális partnerként, ezáltal is csökkentve a bakteriális partner
mesterséges felnövesztésével és hozzáadásával járó jelentős költségeket. Abban az esetben, ha előzetes vizsgálataink kimutatják legalább egy hidrogéntermelésre képes algatörzs és a mellette élő mikrobiális partnerek jelenlétét, akkor vizsgálatainkat ezeken a kevert kultúrákon is végrehajtjuk majd. A szennyvizeken növesztett alga biomassza sem emberi, sem pedig állati fogyasztásra nem alkalmas. Potenciális felhasználási lehetőséget rejt magában a további energiatermeléshez történő szubsztrátként való felhasználása. Az alga biomassza szubsztrátként való lebontásához zárt fermentor szükséges, amelyben a lebontási folyamat sötét körülmények között megy végbe. Az alkalmazott módszertől függően két energiahordozó állítható elő: hidrogén és metán. Célunk mindkét módszer hatékonyságának a vizsgálata, valamint a fermentorok mikrobiális közösségének meghatározása metagenomikai módszerek alkalmazásával. A hidrogén előállítása során a biomassza fermentációját a bakteriális partner(ek) végzik, amelyek az alga sejtekben felhalmozott tápanyagokat bontják le. Az alga sejtek szerkezetének degradációjához előkezelés szükséges. Az eltérő feltárási módszerek, a fermentáció hőmérséklete, a kevertetés gyakorisága és további fermentációs paraméterek vizsgálata mindenképpen szükséges a költséghatékony és gazdaságos fermentáláshoz és hidrogéntermeléshez. A metán termelés hatékonyságát meghatározza az alga keményítő és zsírsav tartalma, valamint a lebontás szempontjából a sejtfal vastagsága. Ezen szempontok alapján keressük a biogáz termeléshez legalkalmasabb alga törzseket. Vizsgáljuk a biogáz iszap mikrobiális, fizikai és kémiai összetételének a változását. A termelődő biogáz metán - széndioxid arányát. A vizsgálataink során kiemelendő az egyes 17
[AZ IZOLÁLT ALGAFAJOK CÉLZOTT ALAPKUTATÁSA] algatörzsek monoszubsztrátként és koszubsztrátként való alkalmazásával
elért biogázhozamok tanulmányozása és összehasonlítása.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS A cikk az „Izolált algafajok célzott alapkutatása” c. project (TÁMOP-4.2.2.A-11/1/KONV2012-0007) támogatásával készült.
18
