Izolace a identifikace půdních mikroorganismů Mgr. Petra Straková Podzim 2014
Půdní mikroorganismy • Půda - stanoviště nesmírně různorodé mikrobiální komunity • Viry, bakterie, houby, řasy, protozoa • Normální/extrémní podmínky
Půda • Podporuje/umožňuje růst rostlin • Mikroorganismy výrazně přispívají k úrodnosti půdy • Rostliny mají velký vliv na mikrobiální komunity v půdy • Kořenové exudáty a staré části rostlin – potrava pro MO • Kolonie na půdních částicích, víc než ve vodním prostředí • Všeobecně dostatek živin - heterotrofové
Půdní mikroorganismy • Obligátní aerobové, fakultativní anaerobové, mikroaerofilní, obligátní anaerobové (záplavy – fak. a oblig. anaerobové)
• • • • • •
Teplota (roční období) – většina mezofilní, kompost - termofilové Vlhkost kyselost (plísně) – jehličnaté lesy půdní typ, dostupnost kyslíku, živin (C, N, P), atd. Bakterie, houby -> houby na povrchu, bakterie níže (nejvíc v prvních 15 cm) Archeae – extrémy v pH, polární půdy, pouštní půdy
Půdní mikroorganismy Půdní profil - Vzniká zvětráváním a následnými půdotvornými procesy - Specifické chemické a fyzikální vlastnosti - Odpovídající fauna a flora - Různá úrodnost půdy
Půdní mikroorganismy • Autochtonní druhy – přirozené; ta mikroflóra, která je schopna využívat odolné huminové látky; pomalá ale konstantní aktivita (G- tyčky, aktinobakterie)
• Zymogenní (oportunistické) druhy – závislost na přítomnosti zvýšené koncentrace; vysoká
růstová rychlost a aktivita díky jednoduše využitelných substrátech, ale stále autochtonní druhy
• Allochtonní druhy – nenachází v půdy dobré růstové podmínky • Běžné druhy: Acinetobacter, Agrobacterium, Bacillus, Celulobacter, Cellulomonas, Clostridium, Corynebacterium, Flavobacterium, Micrococcus, Mycobacterium, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus, Xanthomonas, Streptomyces, Myxococcus, Actinomyces
Půdní mikroorganismy • Houby - významná část půdní mikroflóry • Volně žijící, součást mykorhizy, nejvíce v horních 10cm, málo pod 30 cm • Nejčastěji: Aspergillus, Geotrichium, Penicillium, askomycety, bazidiomycety
• Většina hub – zymogenní (oportunistické), za
příznivých podmínek – adekvátní vlhkost, aerace a relativně vysoká koncentrace využitelného substrátu
Ekologická role -
dekompozitoři (rozkládači), koloběh prvků v přírodě mutualisti (N2 fixující organismy) patogeni (Clostridium) tvorba humusu – humifikace mineralizace tvorba půdní struktury interakce mezi mikroorganismy a prostředím -> aktuální stav
Izolace půdních mikroorganismů • 1) Mikroorganismy poutající vzdušný dusík (Azotobacter) • 2) Izolace klostrídií • 3) Izolace celulotytických mikroorganismů • Izolace v čistých kulturách, využití selektivních médií
• Čím jsou tyto skupiny zajímavé?
Azotobacter • Azotobacter - G- bakterie, aerobní, netvoří spóry, druh náročný na podmínky prostředí, ve vzduchu a ve vodě, cukry-zdroj E využit při fixaci N2
• Některé bakterie umí fixovat vzdušný dusík za pomocí enzymu nitrogenázy (energeticky velmi náročné), buď ve spojení s rostlinami nebo samostatně volně v půdě
• Redukce plynného dusíku na NH3 za striktně anaerobních podmínek !! • v našem případě – spotřebování kyslíku na povrchu buňky aerobní respirací
Azotobacter – postup izolace • Selektivní médium: Ashbyho agar – bezdusíkaté médium • Rozdrobíme zeminu a kultivujeme 72 hodin 25-30 °C • Vyrostou pouze ty bakterie, které umí fixovat dusík z atmosféry
Clostridium • G+ bakterie, obligátně anaerobní, tolerantní ke kyselému prostředí, dobře snáší i nižší teploty (rozmezí 10-65 °C), malé nároky na prostředí, tvoří endospory (oválné či kulaté), v počtu 103-105 buněk/g půdy, výskyt: voda, stoční kal, půda, mořské sedimenty, GIT
Clostridium – postup izolace • 10 min protřepáváme 10 g půdy v destilované vodě (100 ml), následně 2x přefiltrujeme; pasterizace 15 minut při 75-80 °C ve vodní lázni
• Do horkého sterilního média (MPB) pipetujeme 1ml pasterizovaného extraktu a převrstvíme 1 ml parafínu
Izolace celulolytických bakterií • Součástí buněčné stěny rostlin je celulóza + další těžce odbouratelné chemické látky (lignin, pektin, hemicelulóza)
• Na jejich rozkladu se podílí mikroorganismy, které je umí hydrolyticky štěpit až na glukózu
• Aerobní celulolytické organismy = ukazatele úrodnosti půdy !! • Cytophaga, Cellvibrio
Celulolytické bakterie – postup izolace • na Petriho misku do 2/3 rozdrobíme zeminu, navlhčíme a položíme: filtrační papír, buničinu a noviny a sledujeme jejich rozklad
Hodnocení • Azotobacter – po prvních dnech kultivace slizovité bílé/bezbarvé kolonie, po týdnu hnědé slizovité kolonie (stářím hnědnou)
• Clostridium – sediment; zápach; tvorba plynu • Celulolytické bakterie – pozorování rozkladu po 1.,2. a 3. týdnech, pigment kolonií?
• Hodnotíme úrodnost půdy
