ISOLASI DAN KARAKTERISASI SEKUENS PARSIAL cDNA HORMON PERTUMBUHAN IKAN GURAMI Osphronemrrs gozrratny
NOVI MEGAWATI
PROGRAM STUD1 TEKNOLOGI DAN MANAJEMEN AKUAKULTUR FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2008
SURAT PERYATAAN Dengan ini saya menyatakan bahwa Skripsi yang berjudul:
ISOLASI DAN KARAKTERISASI SEKUENS PARSIAL cDNA HORMON PERTUMBUHAN IKAN GURAMI Osphrortentus gournmy adalah benar merupakan hasil karya yang belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Semua sumber data dan informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir Skripsi ini.
Bogor, Januari 2008 Novi Megawati C14103058
RINGKASAN NOVI MEGAWATI. Isolasi dan Karakterisasi Sekuens Parsial cDNA Harmon Pe1,tumbuhan Ikan Gurami Osphronenlus gouramny. Dibimbing oleh ALIMUDDIN dan KOMAR SUMANTADINATA. Ikan gurami (Osphronemus gouramy) merupakan jenis ikan konsumsi yang memiliki nilai ekonomis yang tinggi. Namun demikian, pengembangan usaha ikan guranti masih mengalami hambatan yaitu membutuhkan waktu yang relatif lama dalam mencapai ukuran konsumsi. Masalah ini mungkin dapat diatasi dengan menggunakan teknik transgenesis. Tahapan awal yang harus dilakukan yaitu dengan pembuatan konstruksi DNA, salah satu komponen yang harus ada yaitu keberadaan gen target yang akan disisipkan, dalam ha1 ini GH (Growth Hormone) yang berasal dari ikan gurami. Dikarenakan gen GH yang berasal dari ikan gurami belum ada maka tahapan awal dalam mendapatkan gen tersebut adalah dengan isolasi cDNA (coinplementa~deoxyribonzlcleic acid) GH ikan gurami. cDNA disintesis berdasarkan mRNA (messenger RNA) hasil ekstraksi kelenjar pituitari ikan gurami. mRNA spesifik digunakan sebagai cetakan bagi sintesis enzimatik DNA komplementer dengan
menggunakan
enzim
reverse transkriptase.
Selanjutnya cDNA di PCR dengan Primer Frl Forward 5'-RCAYCTBCACCWRHTSGC -3' dan API Reverse 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'. Produk PCR diligasi ke pGEM-T Easy, transformasi ke bakteri E. coli DHSa, identifikasi transforman, dan sekuensing. Hasil penelitian ini menunjukan bahwa fragmen cDNA GH parsial ikan gurami mempunyai ukuran 700 bp yang menyandikan 169 asam amino dan mengandung elemen-elemen yang konserf untuk gen GI-I. cDNA GH gurami memiliki kesamaan antara 95%-85% dengan ikan lainnya, dimana kesamaan tertinggi 95% adalah dengan ikan sepat rawa
Trichogaster leerii.
ISOLASI DAN KARAKTERISASI SEKUENS PARSIAL cDNA HORMON PERTUMBUHAN IKAN GURAMI Osphroiten~usgoriramy
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Perikanan pada Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Institut Pertanian Bogor
Oleh: Novi Megawati C14103058
PROGRAM STUD1 TEKNOLOGI DAN MANAJEMEN AKUAKULTUR PAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2008
Judul Skripsi
: ISOLASI DAN KARAKTERISASI SEKUENS PARSIAL
Nama NRP
cDNA HORMON PERTUMBUHAN IKAN GURAMI Osphronemlcsgorrramy : Novi Megawati : C14103058
Menyetujui,
Pembimbing I1
Pembimbing I
u Dr. Alimuddin NIP 132 133 953
Prof. Dr. Komar Sumantadinata NIP 130 345 017
Mengetahui,
RIWAYAT HIDW Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 24 November 1985 dari ayah Surahmat dan ibu Nani Riani sebagai anak pertama dari dua bersaudara. Pendidikan formal yang dilalui Penulis adalah SMU Negeri 9 Bogor dan lulus pada tahun 2003. Pada tahun yang sama Penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB) di Program Studi Teknologi dan Manajemen Akuakultur, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Selama mengikuti perkuliahan, Penulis pernah magang di Taman Akuarium Air Tawar (TAAT) Taman Mini Indonesia Indah, dan di Balai Budidaya Laut Batam. Penulis juga pernah menjadi asisten mata kuliah Fisiologi Reproduksi Ikan semester genap (200412005)-(2005/2006),Dasar-dasar Genetika Ikan semester ganjil 200612007. Selain itu penulis juga aktif menjadi pengurus Himpunan Mahasiswa Akuakultur (HIMAKUA) periode 200512006. Tugas akhir dalam pendidikan tinggi diselesaikan dengan menulis skripsi yang berjudul "
Isolasi dan Karakterisasi Sekuens Parsial cDNA Horrnon Pertumbuhan Ikan Gurami Ospkronemusgouramy "
KATA PENGANTAR Puji dan syukur Penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan April s.d. Juli 2004 adalah genetika ikan, dengan judul "Isolasi dan Karakterisasi Sekuens Parsial cDNA Hormon Pertumbuhan Ikan Gurami Osphronenzus gourarny". Terima kasih Penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Alimuddin dan Bapak Prof. Dr. Komar Sumantadinata selaku dosen pembimbing yang telah banyak memberikan bimbingan dan saran dalam penelitian dan penulisan. Serta kepada Ibu Prof. Dr. Ing Mokoginta selaku dosen penguji. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu dan adik atas doa dan dukunganya. Selain itu penulis juga inenyampaikan terima kasih kepada mba Lina selaku teknisi Laboratorium Pengembangbiakan dan Genetika Ikan atas bantuannya. Untuk Anna, Lina, dan Tyas atas kebersamaanya, serta teman-teman BDP 40 dan pihakpihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu. Sebagai penutup, penulis mengharapkan semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Januari 2008
Novi Megawati
DAFTAR IS1 Halaman
...................................................................................... ix DAFTAR GAMBAR ........................................................................................x DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xi KATA PENGANTAR
I. PENDAHULUAN
................................................................................. 1 1.1. Latar Belakang ................................................................................. 1 . . ............................................................................. 1.2. Tujuan Penel~t~an 2
I1. TINJAUAN PUSTAKA
...................................................................... 3 2.1. Ikan Gurami (Osphronemus gouramy) ........................................... 3 2.2. Hormon Pertumbuhan ..................................................................... 3 2.3. Teknologi Rekombinan DNA .........................................................5 2.3.1. Isolasi Gen ............................................................................5 2.3.2. Kloning DNA ........................................................................ 6
111.BAHAN DAN METODE
..................................................................... 8 3.1. Waktu dan Tempat ......................................................................... 8 .. 3.2. Metode Penel~t~an .......................................................................... 8 3.2.1. Isolasi RNA Total ................................................................ 8 3.2.2. Sintesis cDNA dan Amplifikasi PCR .................................. 10 3.2.3. Isolasi Fragmen DNA dari Gel ............................................ 11 3.2.4. Ligasi cDNA ke pGEM-T Easy ........................................... 11 3.2.5. Transformasi ......................................................................... 11 3.2.6. Identifikasi Transforman & Pembuatan Master Plate ......... 12
..................................................................... 3.2.8. Sekuensing ........................................................................... 3.3. Analisis Data .................................................................................. 3.2.7. Isolasi Plasmid
12 13 14
.
............................................................ 15 4.1. Hasil ............................................................................................... 15 4.1 .1. Isolasi RNA Total ........................................................... 15 4.1.2. Sintesis cDNA .....................................................................15 4.1.3. Isolasi Fragmen DNA dari Gel ............................................ 15 4.1.4. Transformasi ke Bakteri E. coli DH5a ................................ 16 4.1.5. Identifikasi Transforman ...................................................... 17
IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1.5.1. Seleksi Koloni Bakteri Putih & Pembuatan Master
........................................ 17 Plate .......................... . .
....................................... 17 4.1.6. Analisis Urutan Nukleotida ................................................ 18 4.2. Pembahasan ................................................................................... 22 4.1.5.2. Isolasi Plasmid cDNA GH
.
...................................................................................... 26 DAFTAR PUSTAKA.................................................................................. 27 LAMPIRAN ................................................................................................30 V KESIMPULAN
DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Diagram alir penelitian isolasi cDNA ikan gurami (Osphronemusgourarny). 9 2. Hasil PCR dengan cetakan cDNA ikan gurami (Osphronemusgouratny) ...... 15 3. DNA (FIR) hasil purifikasi dari gel cDNA ikan gurami (Osphronemus gouramy) ......................................................................................................... 16
4. Koloni E. coli DH5a yang ditransformasikan dengan hasil ligasi pGEM-T Easy pada media seleksi yang mengandung ampisilin, X-gal, dan IPTG ...... 16 5. DNA hasil cracking koloni bakteri yang diduga membawa insersi
............... 17
6. DNA plasmid hasil isolasi dan klon bakteri no. 3 dan 4 yang membawa insersi .............................................................................................................. 17 7 . Alignment nukleotida hasil sekuensing 2 klon gen GH ikan gurami (Osphronernus gouramy) ................................................................................. 19
8. Alignment asam amino residu 2 klon gen GH ikan gurami (Osphronemus ................................................................................... gozrrarny ................ . . 19 9. Sekuens nukleotida dan hasil prediksi asam amino klon 3 gen GH ikan gurami menggunakan program GENETYX versi 7 ........................................ 20 10. Alignment sekuens asam amino gen GH ikan gurami dengan berbagai jenis ikan ................................................................................................................ 21
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman 31 1. peta Plasmad pGEM Ig-T Easy ........................................................................ 2. Desain primer yang digunakan untuk mendapatkan cDNA GH ikan gurami (Osphronemusgouranry) ..................................................................... 32 3. Hasil sekuensing cDNA GH ikan gurami (Osphronenzusgouramy)...............33 4 . Hasil analisis BLASTu .................................................................................... 35
I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang
Perkembangan
biologi
molekuler yang
secara
umum mencakup
manipulasi DNA dan RNA telah diaplikasikan ke berbagai bidang kehidupan (Muladno, 2002). Teknologi DNA rekombinan merupakan penyisipan gen ke vektor kloning (umumnya plasmid) untuk membentuk molekul DNA baru yang diperbanyak pada sel inang (Glick & Pasternak, 2003). Teknologi ini sudah mulai dikembangkan dalam dunia perikanan khususnya bidang budidaya perairan. Salah satu penelitian DNA rekombinan yang potensial untuk dikembangkan adalah penggunaan hormon pertumbuhan (growth hormone, GH) untuk memacu kecepatan tumbuh ikan budidaya. Hormon pertumbuhan adalah polipeptida essensial yang disekresikan oleh somatotrof kelenjar pituitari (Matty, 1985). Hormon ini berperan utama dalam pengaturan pertumbuhan somatik (Matty, 1985). Selain itu, GH juga berfungsi dalam sistem metabolisine (Matty, 1985), reproduksi (Le Gac et al., 1993; Van Der Kraak et at., 1990 dala~nLi et al., 2005) dan osmoregulasi (Sakamoto e f a]., 1993; Tatsuya & Hirano, 1993 dalam Li et al., 2005). Dengan fungsinya tersebut, kloning tentang gen GH dilakukan pada beberapa jenis ikan antara lain seperti salmon (Voigt & Botta, 1990), rainbow trout (Yao et al., 1991), patin (Lemaire & Panyim, 1993), ikan baronang (Ayson er al., 2000), lele India (Anathy et al., 2001) dan kerapu lumpur (Li et al., 2005). Ikan gurami (Osphuonemzisgournmy) merupakan jenis ikan air tawar yang sudah lama dikenal dan telah banyak dibudidayakan. Sebagai ikan konsumsi, ikan ini banyak disukai orang. Namun demikian pengembangan usaha ikan gurami masih mengalami hambatan yaitu meinbutuhkan waktu yang relatif lama dalam mencapai ukuran konsumsi. Masalah ini mungkin dapat diatasi dengan inenggunakan teknik transgenesis. Teknologi transgenesis adalah suatu proses mengintroduksikan DNA eksogenous atau DNA asing ke hewan uji dengan tujuan untuk memanipulasi struktur genetiknya (Glick & Pasternak, 2003). Teknologi ini telah dilakukan pada beberapa jenis ikan antara lain ikan salmon (Devlin, 1997), salmon Atlantik (Cook et al., 2000), gilthead sea breani (Perez, 2000), mud loach (Nam et al., 2004), dan ikan nila (Kobayashi et al., 2007).
Menurut Hacket (1993), ada tiga tahapan utama dalam menghasilkan ikan transgenik, yaitu (1) Mempersiapkan konstruksi DNA yang tersusun atas gen penyandi protein testentu dan elemen regulator; (2) Konstruksi rekombinan harus dimasukkan ke dalam inti sel pada embrio yang sedang berkembang supaya bisa didistribusikan ke semua jaringan ikan; (3) Identifikasi individu ikan yang mengekspresikan gen asing (transgen). Pada tahap awal pembuatan konstruksi DNA, salah satu komponen yang harus ada yaitu keberadaan gen target yang akan disisipkan, dalam ha1 ini GH yang berasal dari ikan gurami. Dikarenakan gen GH yang berasal dari ikan gurami belum ada maka tahapan awal dalam mendapatkan gen tersebut adalah dengan isolasi cDNA (cotnplementaiy deoxyribonucleic acid) GH ikan gurami. Dengan demikian ikan gurami dengan pestumbuhan cepat mungkin dapat dihasilkan melalui teknik transfer gen GH. 1.2 Tujuan Tujuan penelitian ini adalah untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi cDNA hormon pertumbuhan dari ikan gurami Osphronemus gouramy.
11.TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Ikan Gurami (Osphronemus gouramy)
Gurami mempunyai bentuk badan agak panjang, pipih, dan tertutup sisik yang berukuran besar, terlihat kasar, serta kuat. Punggungnya tinggi dan mempunyai sirip perut dengan jari-jari yang sudah berubah menjadi alat peraba. Badan gurami pada umumnya berwarna biru kehitaman dan bagian perut berwarna putih. Warna tersebut akan berubah menjelang dewasa, yakni pada bagian punggung berwarna kecokelatan dan pada bagian perut be~warna keperakan atau kekuningan. Pada badan guranli muda terdapat garis tegak berwarna hitam berjumlah 7-8 buah dan garis-garis ini akan hilang pada saat gurami dewasa (Jangkaru, 1999). Adapun klasifikasi gurami menurut Saanin (1 984) yaitu:
Filum
: Chordata
Kelas
: Pisces
Ordo
: Labirinthici
Sub ordo
: Anabantoidei
Famili
: Anabantidae
Genus
: Osphronenius
Spesies
: Osphronemus gourainy
Gurarni dapat tumbuh mencapai panjang 65 cm dan berat lebih dari 10 kg. Di Jawa ikan ini dikenal dengan nama gurami, grameh, atau brami. Sedangkan di Sumatera dan KaIi~nantandikenal dengan nama kalui, sialui, kalaa, kalau dan kalwe. Daerah penyebaran gurarni antara lain Thailand, Sri Lanka, Malaysia, Australia, Cina, India, dan Indonesia (Jangkaru, 1999) . 2.2 Hormon Pertumbuhan
Hormon adalah bahan kimia pembawa sinyal yang dibentuk dalam sel-sel khusus pada kelenjar endokrin. Hormon disekresikan ke dalam darah kemudian disalurkan ke organ-organ yang menjalankan fi~ngsi-fi~ngsiregulasi tertentu secara fisiologik dan biokimia. Sel kelenjar yang khusus mensintesis hormon dari prekursomya dapat menyimpan dan mensekresikanya ke dalam darah sesuai
kebutuhan. Hormon dan metaboliknya dikeluarkan melalui sistem ekskresi, kebanyakan melalui ginjal. Sel-sel sasaran pada organ sasaran memiliki reseptor yang dapat mengikat hormon, sehingga informasi yang diperoleh dapat diteruskan ke sel-sel dan akhirnya menghasilkan soatu respon (Koolman & Rohm, 2001). Pesan hormon disampaikan pada sel-sel sasaran menurut dua prinsip yang berbeda. Hormon lipofilik masuk ke dalam sel dan bekerja pada inti sel. Sedangkan hormon hidrofilik bekerja pada membran sel. Kelompok hormon hidrofilik merupakan hormon yang tersusun dari asam amino, semua peptida dan proteohormon. Hormon-hormon hidrofilik berikatan pada bagian luar sel sasaran pada reseptor spesifik yang difiksasi di dalam membran sel (Koolman & Rohm, 2001). Hormon pertumbuhan merupakan salah satu kelompok hormon hidrofilik. Hormon pertumbuhan (GH) merupakan hormon polipeptida yang dilepaskan dari adenohipofisa yang menginduksi hati agar mensintesis somatomedin yang berperan langsung dalam pertumbuhan, baik pertumbuhan tulang, otot maupun sel-sel lain. Hormon ini menunda katabolisme asam-asam amino dan memacu inkorporasinya ke dalam protein-protein tubuh. Kerja hormon ini dipermudah oleh pankreas, korteks adrenal dan tiroid yang berkerja bersa~nasama dalam rnemacu metabolisme lemak dan karbohidrat (Calduch-Giner et al., 2000; Walsh 2002). Hormon pertumbnhan mempunyai peranan yang penting pada proses transfer asam amino ekstraseluller melintasi membran sel, khususnya ke dalam sel-sel otot dan menahan asam amino tersebut tetap di dalam sel. Selain itu hormon ini dapat rnemacu retensi tubuh berbagai mineral dan elemen essensial lain untuk pertumbuhan normal (Walsh, 2002). Menurut Matty (1985) GH mampu meningkatkan nafsu makan, konversi pakan, sintesis protein, menurunkan ekskresi (loading) nitrogen, merangsang ~netabolismedan oksidasi lemak, serta memacu sintesis dan pelepasan insulin. Selain itu, GH juga mempengaruhi reproduksi (Le Gac et al., 1993; Van Der Kraak et al., 1990 dalam Li et al., 2005) dan osmoregulasi (Sakamoto ef al., 1993; Tatsuya & Hirano, 1993 dalam Li et al., 2005).
2.3 Teknologi Rekombinan DNA
Teknologi DNA rekombinan merupakan penyisipan ke vektor DNA pada umumnya plasmid, untuk membentuk molekul DNA baru yang diperbanyak pada sel inang (Glick & Pasternak, 2003). Kloning gen dapat dilakukan melalui beberapa tahap, yaitu: isolasi gen, penyisipan gen ke dalam sistem vektor untuk membentuk vektor rekombinan, dan introduksi vektor rekombinan yang membawa sisipan ke dalam sel inang (Suharsono, 2000). 2.3.1 Isolasi Gen
Menurut Lehninger (1982) gen dapat diisolasi dengan berbagai cara yaitu: (1) Pemotongan dengan enzim restriksi Gen yang sudah diketahui ukuran dan situs restriksinya dapat diisolasi secara langsung dari gel setelah dilakukan pemotongan DNA dan migrasi di dalam gel. Untuk gen yang berada pada organisme dengan genoln besar dapat dilakukan dengan pe~nbuatanpustaka genom. Genom suatu individu dipotong dengan enzim restriksi, disisipkan ke vektor rekombinan kemudian di inhoduksikan ke sel inang. (2) Pembuatan cDNA
DNA komplementer (cDNA) adalah DNA yang dibuat berdasarkan mRNA ( m e s s e n g e r M ) . mRNA spesifik digunakan sebagai cetakan bagi sintesis enzimatik DNA komplementer dengan menggunakan enzim reverse transkriptase sebagai katalisator. Pada metoda ini memerlukan primer DNA (Brown, 1991). Pada mRNA ini ditambahkan politimin yang bersifat
komplementer dengan
terminal 3 poliadenilasi. Politimin ini berperan sebagai inisiasi bagi reverse transkriptase yang melakukan transkriptasi mRNA untuk membuat untai komplementer cDNA dari campuran dNTP sehingga menghasilkan untai tunggal cDNA yang direplikasi oleh DNA polimerase I sehingga menghasilkan cDNA untai ganda. cDNA tersebut bersifat spesifik bagi protein yang gennya sedang diteliti.
2.3.2 Kloning DNA
Kloning adalah suatu teknik isolasi dan pemurnian fragmen DNA tunggal dari DNA genom yang kemudian digabung dengan suatu vektor untuk membentuk DNA rekombinan yang dapat bereplikasi dala~n inang bakteri (Kendrew & Lawrence, 1994 dalam Darmawan, 2004). Pada prinsipnya kloning DNA adalah proses penggandaan jumlah DNA rekombinan melalui proses perke~nbangbiakansel bakteri Escherichia coli, dilakukan dengan memasukkan DNA rekombinan yang dihasilkan dari proses penggabungan tersebut ke dalam sel E. coli. Selanjutnya sel ini diinkubasi pada suhu optimal sehingga sel dapat berkembangbiak secara eksponensial. Karena masuknya molekul DNA ke dalam sel akan mengubah fenotip sel tersebut, maka proses pemasukan molekul DNA ke dalam sel disebut juga transfor~nasi.Sedangkan sel yang digunakan dalani proses transformasi biasa disebut dengan sel kompeten (Darmawan, 2004). Secara ringkas, tahapan kloning terdiri atas: ligasi, transformasi dan identifikasi transforman. Ligasi adalah pemasukan sekuens DNA yang diinginkan ke dalam elemen genetik yang dapat bereplikasi sendiri yaitu plasmid, bakteriofag, atau yeast artgcial chro~izosorne(Voet & Voet, 1994). Enzim yang mengkatalis reaksi ini adalah DNA ligase. Proses ligasi ini menghasilkan produk yang disebut DNA rekombinan. Pada penelitian ini digunakan plasmid pGEM-T Easy yang berukuran sebesar 3015 bp dan peta plasmid pGEM-T Easy dapat dilihat pada Lampiran 1. Plasmid pGEM-T Easy merupakan plasmid sirkular terbuka memiliki dua buah
ori dan gen ketahanan terhadap ampisilin ( ~ m serta ~ ~mengandung ) multicloning site. Karena memiliki kelebihan Timin yang menggantung di ujung terbuka plasmid ini sering dipakai sebagai vektor dari produk PCR yang selalu terdapat kelebihan Adenin (A) pada ujungnya, sehingga penempelan gen insert tidak perlu menggt~nakanenzi~nrestriksi (Old & Primrose, 1994). Selain itu, plasmid pGEM-
T Easy termas~rkplasmid high copy number yang cocok untuk menyimpan gen insert dalam bakteri sebagai suatu inang . Menurut MuIadno (2002) sel inang yang membawa DNA sisipan dapat diketahui dengan penanda seleksi, yaitu sifat ketahanannya terhadap antibiotik tertentu. Bakteri yang mernbawa vektor rekoinbinan akan resisten terhadap
antibiotik tertentu. Sedangkan untuk mengetahui sel inang yang membawa vektor rekombinan yang membawa DNA sisipan atau tidak, dapat diseleksi dengan penambahan Isopropil thiogalaktosida (IPTG) dan 5-Bromo-4-cloro-3-indolylbeta-D-galactopyranocide (X-gal) pada media tumbuh, sehingga koloni akan benvarna biru dan putih. Adanya gen LacZ pada vektor kloning yang menyandikan P-galactosidase akan mengubah molekul X-gal dari tidak benvarna menjadi berwama biru. Gen Lac2 diinduksi oleh IPTG. Apabila gen LacZ tersisipi oleh molekul DNA lain, maka Lac2 tidak dapat diekspresikan, sehingga sel yang mengandung sisipan tidak mampu merubah X-gal menjadi benvarna biru.
111. BAHAN DAN METODE 3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan mulai bulan April sampai Agustus 2007 bertempat di Laboratorium Pengembangbiakan dan Genetika Ikan, Program Studi Teknologi dan Manajemen Akuakultur, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. 3.2 Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan melalui beberapa tahap seperti ditunjukkan pada Gambar 1. Tahapan tersebut meliputi isolasi RNA total, sintesis cDNA, PCR, ligasi hasil PCR ke pGEM-T Easy, transformasi ke bakteri E. coli DH5a, identifikasi transforman, sekuensing, dan analisis data. 3.2.1 Isolasi RNA Total
Ikan gurami
hidup yang
berukuran 300-500 gram dipotong bagian
kepalanya. Hipofisa dikeluarkan secara aseptis dan langsung dimasukkan ke dalam tabung mikro yang telah berisi 200 p1 ISOGEN yang disimpan on-ice. Untuk meminimalkan pengaruh RNase, semua alat dan bahan isolasi RNA diperlakukan dengan air yang mengandung dietylpyrocarbonate (DEPC). Sebelumnya alat-alat yang akan digunakan dalaln isolasi telah disterilisasi pada suhu 123OC selama 15 menit. Hipofisa digerus sampai hancur dengan menggunakan grinder, setelah hipofisa hancur lalu ditambahkan ISOGEN sarnpai volume akhir 800 PI. Kemudian disimpan pada suhu ruang selanla 5 menit agar lisis, setelah itu ditambahkan 200
111
klorofom, vortex selama 15 detik pada
kecepatan sedang, lalu disimpan pada suhu ruang selama 2-3 menit. Selanjutnya tabung mikro disentrifuse pada 12000 rpm, pada suhu ruang selama 5 menit. Kemudian supernatan yang terbentuk dimasukkan ke dalam tabung mikro yang telah berisi 400 p1 isopropanol, dihomogenasi menggunakan vortex pelan sampai homogen dan selanjutnya disimpan pada suhu ruang selama 5-10 menit. Tabung disentrifuse pada 12000 rpm, suhu 4°C selama 15 menit. Supernatan dibuang, lalu ditambahkan 1 ml etanol 70% dingin dan disenhifuse pada 12000 rpm, suhu
4'C selama 15 menit. Supernatan dibuang, lalu dikering udarakan. Setelah kering ditambahkan DEPC sebanyak 50 pl.
Hipofisa ikan gurami
I
Isolasi RNA total
I
4 Sintesis cDNA
t PCR Desain primer berdasarkan gen GH dari ikan-ikan lain yang terkonversi. Primer Frl Forward 5'- RCAYCTBCACCWRHTSGC- 3' AP1 Reverse 5'- CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'
4 Ligasi cDNA ke pGEM-T Easy
1 Transformasi ke bakteri E.coli DHSa
t
II
.
Identifikasi Transforman Seleksi koloni bakteri putih biru Isolasi plasmid reko~nbinan
I
I
tI Sekuensing
Gambar 1. Diagram alir penelitian isolasi cDNA ikan gurami (Osphronenlus gotrramny) Konsentrasi RNA total hasil isolasi diukur menggunakan alat pengukur konsentrasi RNAIDNA (merek mesin: GeneQuant). Absorbansi diukur pada panjang gelotnbang 260 dan 280 nm.
3.2.2 Sintesis cDNA dan Amplifikasi PCR
Sintesis cDNA GH menggunakan kit Ready-To-Go You-Prime FirstStrand Beads (Amersham pharmacia biotech, USA). Konsentrasi RNA dibuat 3 mikrogram dalam 30 p1 DEPC, kemudian dihomogenasi menggunakan vortex dengan kecepatan rendah. Sebelu~nnyatelah disiapkan inkubator dengan suhu 65OC, lalu tabong mikro dimasukkan ke dalam inkubator selama 10 menit. Selanjutnya tabung mikro dimasukkan ke dalam es selama 2 menit. Kemudian RNA dimasukkan ke dalam tabung
"
First Strand Reaction Mix Beads" (white
tube) yang telah berisi 2 butir bola putih. Kemudian ditambahkan 3 111 primer "dT3'RACE-VECT"
(5'-GTAATACGAATAACTATAGGGCACGCGTGGTC-
GACGGCCCGGGCTGG-TT-3')
dengan konsentrasi
1
pg/3 p1 lalu dibiarkan selama 1 menit, setelah itu dihomogenasi menggunakan vortex dengan kecepatan rendah. Tabung mikro dimasukkan ke dalam inkubator dengan suhu 37'C, diinkubasi selama 1 jam. Hasil sintesis cDNA ditambahkan 50 pl SDW steril. Dalam proses amplifikasi PCR untuk cDNA GH gurami digunakan primer nzix yang didesain berdasarkan database yang ada di Bank Gen (Lampiran 2) yaitu: salmon Atlantik (no. akses Bank Gen:
w Bighead ,carp (no. akses
Bank Gen: X60473), ikan mas (no. akses Bank Gen: D0350436), nila (no. akses Bank Gen: M26916), Rainbow trozit (no. akses Bank Gen: M22732), Seabream (no. akses Bank Gen:
m), Silver carp (no. akses Bank Gen: X60475), ikan
zebra (no. akses Bank Gen: AJ937858), dan tuna (no. akses Bank Gen: X06735). Primer
yang
didesain
tersebut
adalah
Frl
Forward
5'-
RCAYCTBCACCWRHTSGC-3' (18 pb). Sedangkan Reverse yang digunakan adalah AP-I 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (27 pb). Satu mikrogram cDNA digunakan sebagai sa~npeluntnk PCR, kemudian dicampur dengan 1 p1 primer Forward maupun Reverse (10 pmoll pl), 1 pl dNTP, 1 p1 Ex Taq buffer, 0.05 p1 Ex Taqpolytnerase (TAKARA) kemudian ditambahkan SDW sampai volume akhir menjadi 10 pl. Proses PCR dijalankan pada suhu 94°C selama 3 menit sebanyak 1 siklus; (94°C selama 30 detik; 59°C selama 30 detik; 72OC selama 1 menit) sebanyak 35 siklus; 72'C selama 3 menit sebanyak 1 siklus; dan 4°C (tak hingga).
3.2.3 Isolasi Fragmen DNA dari Gel
DNA diisolasi dari gel menggunakan kit Mobio Ultra CleanTM 15 DNA Purification (MoBio Laboratories, CA, USA). Hasil PCR digabung menjadi satu
dan dielektroforesis dengan gel agarosa 0,7%. Kemudian gel dipotong pada bagian yang terdapat band DNA dengan panjang yang sesuai yaitu 700 bp lalu gel ditimbang dan dimasukkan ke dalam tabung mikro. Selanjutnya ditambahkan TBE Gel Melt sebanyak % dari berat gel dan juga ditambahkan Sodium Iodide sebanyak 4,s kali berat gel, dicampur dengan cara vortex. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 55OC selama 5 menit, sementara itu vortex Glass Blind selama 30 detik. Selanjutnya Glass Blind ditambahkan sebanyak 6 p1, dibolak-balik beberapa kali. Selanjutnya diinkubasi kembali pada suhu ruang selama 5 menit. Kemudian sentrifuse pada kecepatan 13000 rpm selama 5 detik dengan suhu 4OC. Supernatan l Bzrffer dan Etanol, kemudian pelet yang ada dibuang, lalu ditambahkan 1 ~ n Wash divortex sampai hancur. Selanjutnya disentrifuse selarna 5 detik dengan kecepatan 13000 rpm dan Wash Buffer dibuang sampai bersih. Lalu ditambahkan 9 pi SDW, diaduk sampai pelet hancur kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit. Selanjutnya sentrifuse dengan kecepatan 13000 rpm selama 1 menit pada suhu ruang, supernatan dipindahkan pada tabung mikro selanjutnya DNA dilarutkan dengan 12 p1 SDW. Sebanyak 2 p1 hasil isolasi DNA dari gel dielektroforesis menggunakan gel agarosa 0,7% untuk mengetahui keberhasilan ekstraksi DNA dari gel. 3.2.4 Ligasi cDNA ke pGEM-T Easy
Tahap selanjutnya adalah ligasi fragmen DNA dengan vektor kloning pGEM-T Easy. Komposisi reaksi ligasi meliptiti 5 pl larutan DNA, 0,s pl pGEMT Easy, 6,5 p1 5x buffer ligasi, dan 1 pI enzim T4 DNA ligase (TAKARA). Inkubasi dilakukan selama 2 jam pada suhu ruang, kemudian inkubasi dilanjutkan semalaman di refrigerator (suhu sekitar 4'C). 3.2.5 Transformasi
Hasil reaksi ligasi digunakan dalam proses transformasi. Transformasi adalah suatu proses memasukkan plasmid yang mengandung fragmen DNA
insersi ke dalam bakteri Escherichia coli DH5a. Sebanyak 6,5 11 hasil reaksi ligasi dicampur ke dalam tabung mikro berisi sel kompeten. Transformasi dilakukan dengan cara kejutan panas suhu 42OC selama 45 detik. Setelah diinkubasi on-ice selama 2-3 menit, ke dalam tabung mikro ditarnbahkan Iarutan SOC sebanyak 900 pl. Larutan SOC mengandung 1,2 g polypeptone, 0,3 g yeast
extract, 0,035 g NaCI, 0,011 g KCI, 600 p1 MgC12 1 M, 600 pl MgS04 1 M, dan 60 pl glucose 2 M dalam 60 ml SDW. Selanjutnya tabung mikro berisi bakteri hasil transformasi diinkubasi pada suhu 37°C selama 1 jam. Ke~nudianbakteri disebar di atas cawan agarosa 2xYT
yang mengandung IPTG, X-gal dan
ampisilin (disingkat menjadi 2xYT (I, X, A)). 2xYT mengandung (1,6% polypeptone, 1% yeast extract, 0,5% NaCl dan 1,5% agarosa dalam SDW) inkubasi dilakukan pada suhu 37'C selama semalam. 3.2.6 Identifikasi Transforman dan Pembuatan Master Plate Koloni putih yang tumbuh di atas agarosa 2xYT diambil menggunakan tusuk gigi steril dan dioleskan ke tabung mikro 1,5 ml dan dilanjutkan dengan pembuatan master plate agarosa 2xYT (I, X, dan A). Master plate diinkubasi pada suhu 37°C sekitar 8 jam. Ke dalam tabung mikro berisi bakteri ditambahkan 10 1 1 buffer cracking, 10 pl larutan EDTA 1 M dan sekitar 2 p16x buffer loading berisi KC1 1 M dengan perbandingan volume 1:1. Buffer cracking mengandung 0,2 g saccharosa, 40 pi NaOH 5 M, 50 pl SDS 10% dan sisanya SDW hingga larutan menjadi 1 ml. Setelah diinkubasi sekitar 5 menit, dilakukan sentrifuse pada kecepatan 13.000 rpm selama 15 menit. Sebanyak 10 pl supernatan yang terbentuk dielektroforesis dengan gel agarosa 0,7%. Sebanyak 3 koloni bakteri yang membawa insersi kemudian diambil menggunakan tusuk gigi steril dan disentuhkan ke dalam media cair 2xYT berisi ampisilin.
Inkubasi bakteri
dilakukan pada suhu 37OC selama sekitar 14jam. 3.2.7 Isolasi Plasmid Isolasi plasmid dilakukan rnenggunakan kit FlexiPrep dari Amersham Pharmacia Biotech dengan prosedur sesuai dengan manual. Bakteri dari setiap tabung kultur dituang ke dalanl tabung mikro 1,5 ml. Bakteri diendapkan dengan
cara disentrifuse pada kecepatan 13.000 rpm sekitar 1 menit. Supernatan dibuang dan ke dalam tabung mikro berisi pelet bakteri ditambahkan larutan 1 sebanyak 200 pl, divortex hingga semua pelet bakteri lepas dari dasar tabung. Kemudian ditambahkan larutan 2 sebanyak 200 p1, tabung mikro dibolak-balik sekitar 10 kali sebelum ditambahkan dengan larutan 3 sebanyak 200 p1. Tabung dibolakbalik hingga terbentuk gumpalan-gumpalan putih, dilanjutkan dengan sentrifuse pada kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung mikro yang baru, disentrifuse sekali lagi pada kecepatan dan lama waktu yang sama dengan sebelumnya. Supernatan dipindahkan ke tabung mikro berisi isopropanol 420 pl. Dihomogenasi dengan vortex selama sekitar 1 menit, dan dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu ruang selama 10 menit.
Kemudian
dilakukan sentrifuse kecepatan 13.000 rpm selama 15 menit. Setelah isopropanol dibuang dengan bantuan aspirator, ke dalam tabung mikro berisi pelet DNA ditanlbahkan Sephaglass sebanyak 150 p1, dihomogenasi dengan vortex selama 1 menit dan dilanjutkan dengan sentrifuse 13.000 rpm selama 30 detik. Supernatan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan larutan Wash Buffer sebanyak 200 pl, dihomogenasi dengan vortex selama 1 ~nenitdan kemudian sentrifuse 13.000 rpm sela~na30 detik. Larutan Wash Buffer dibuang dan diganti dengan etanol 70% dingin sebanyak 300 p1, dihomogenasi dengan vortex sela~na 1 menit dan kemitdian disentrifuse 13.000 rpm selama 30 detik. Setelah semua etanol dibuang, tabung mikro dibiarkan kering udara selama sekitar 10 menit. Plasmid DNA dilarutkan menggunakan SDW sebanyak 30-50 p1, dihomogenasi dengan vortex dan tabung mikro berisi plasmid dibiarkan sela~na S menit di suhu ruang. Sentrifuse pada suhu ruang dengan kecepatan 13.000 rpm selama 1-2 menit. Supernatan
yang berisi plasmid DNA dipindahkan ke tabung yang baru.
Sebanyak 1 p1 hasil isolasi digunakan untuk elektroforesis. 3.2.8 Sekuensing
Plasmid yang telah diisolasi dikirim ke Departement of Marine Bioscience, Tokyo University of Marine Science and Technology, Tokyo, untuk disekuensing. Volume reaksi PCR untuk sekuensing adalah 20 pl dengan komposisi 2 p1 Ready Reaction Mix, 3 p1 BigDye buffer, 6,4 p1 primer "T7-BS"
(5'-TTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAA-3') atau DyeT-R (5'-GGAAT-
TGTGAGCGGATAACA-3') dengan konsentrasi 10 pmol, 300 ng DNA dan sisanya adalah ion-exchanged water. Sekuensing DNA dilakukan menggunakan mesin ABI PRISM@ 3100-Avant Genetic Analyzer dengan prosedur sesuai dengan protokol. Program PCR rnencakup 1 siklus dengan suhu 96OC selama 2 menit, dan 30 siklus dengan suhu 96'C selama 10 detik, 55OC selama 5 detik dan
60°C selama 3 menit. 3.3 Analisis Data
Nukleotida dan sekuens asam amino dibandingkan dengan database di Bank Gen dengan program BLAST. Alignment dan persentase kesamaan asam amino dianalisis menggunakan program GENETYX versi 7.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil 4.1.1 Isolasi FWA Total
RNA total dari hipofisa ikan gurami (Osphronemus gozrramny) telah berhasil dilakukan dengan kuantifikasi berdasarkan spektrofotometer. Dari 2 butir hipofisa ikan gurami didapatkan total RNA sebanyak 42,2 ng/pl dan rasio pada panjang gelombang h260lh280 adalah 1,701. 4.1.2 Sintesis cDNA
Hasil PCR dielektroforesis dengan gel agarosa 0,7%. Hasil elektroforesis ditunjukkan pada Gambar 2. Pita DNA dengan panjang sekitar 700 bp yang diberi tanda kepala panah di sebelah kanan gambar merupakan kandidat fragmen gen GH ikan gurami.
Keterangan: F: produk PCR dengan primer Forward saja, R: produk PCR dengan Reverse saja, FIR: Produk PCR dengan Forward dan Reverse, N: tanpa cetakan DNA, M: marker DNA 1 kb (BioLabs Inc., New England). Tanda kepala panah menunjukkan ukuran pita DNA hasil PCR, sekitar 700 bp. Gambar 2. Hasil PCR dengan cetakan cDNA ikan gurami (Osphronemus gouramy). 4.1.3 Isolasi Fragmen DNA dari Gel
Fragmen DNA produk amplifikasi PCR telah berhasil dipotong dari gel agarose dan diekstraksi dengan menggunakan kit purifikasi DNA sesuai instruksi
&lam manual. Sebanyak 2 pL hasil isolasi DNA dari gel dielektroforesis menggunakan gel agarosa 0,7% (Gambar 3).
Gambar 3. DNA (FIR) hasil purifikasi dari gel cDNA ikan gurami (Osphronemus gouramy)
4.1.4 Transformasi ke Bakteri E. coli DH5a cDNA GH ikan gurami diligasikan ke pGEM-T Easy, kemudian diintroduksikan ke &lam E. coli DH5a. Hasil seleksi koloni biru-putih pa& media seleksi yang mengandung antibiotik ampisilin, X-gal dan IPTG menunjukkan adanya koloni E. coli yang benvama putih.
Gambar 4. Koloni E. coli DH5a yang ditransformasikan dengan hasil ligasi pGEM-T Easy pa& media seleksi yang mengandung ampisilin, X-gal, dan IPTG. Koloni putih ditunjukan dengan tanda panah. Koloni putih yang tumbuh di media seleksi merupakan E. coli yang mengandung insersi, sedangkan koloni yang berwarna biru merupakan E. coli yang tidak mengandung insersi (Gambar 4).
4.1.5 Identifikasi Transforman 4.1.5.1 Seleksi Koloni Bakteri Putih dan Pembuatan Master Plate
Konfirmasi adanya sisipan cDNA GH di dalam koloni E.coli putih telah dilakukan dengan metode cracking. Sebanyak 10 pL supernatan yang terbentuk dielektroforesis dengan gel agarosa 0,7%. Hasil elektroforesis ditunjukkan pada Gambar 5.
Keterangan: 1-10 adalah koloni bakteri putih yang diduga membawa insersi DNA, K adalah kontrol sebagai penanda tanpa insersi DNA dari cawan koloni biru. Gambar 5. DNA hasil cracking koloui bakteri yang diduga membawa insersi. Sebanyak 2 klon bakteri (no. 3 dan 4 pada Garnbar 5) yang membawa insersi diambil dari nzaster plate menggunakan tusuk gigi steril dan disentuhkan ke media cair 2xYT yang mengandung ampisilin dalam tabung berbentuk "L". Inkubasi bakteri dilakukan pada suhu 37OC selama sekitar 14 jam. 4.1.5.2 Isolasi Plasmid cDNA GH
Hasil elektroforesis ditunjukkan pada Gambar 6. Ukuran vektor kloning pGEM-T Easy adalah 3015 bp. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6, ukuran fragmen DNA no. 1 dan 2 yang masing-masing dari koloni no. 3 dan 4, lebih besar dari 3 kb.
Gambar6. DNA plasmid hasil isolasi dari klon bakteri no. 3 dan 4 yang membawa insersi.
4.1.6 Analisis Urutan Nukleotida Urutan nukleotida diperoleh dari hasil sekuensing ditunjukan pada Lampiran 3. Selanjutnya dengan menggunakan program GENETYX didapatkan sekuen asam amino (Gambar 9). Nukleotida GH ikan gurami mempunyai ukuran 700 bp yang menyandikan 169 asam amino. Analisis kesejajaran (alignment) nukleotida dengan program BLAST antara cDNA GH gurami dengan gen-gen GH dari ikan lainnya yang terdapat di Bank Gen menunjukkan bahwa cDNA GH gurami mempunyai kesamaan 95% dengan
Trichogaster leerii (AY873789),
94% Trichogasfer tricopterus
(AF157633), 89% Epinephelus coioides (AY513647), dan 85% Oreochromis niloticus (M26916). Dua spesies pertama merupakan satu kelompok anabantid dengan ikan gurami, sedangkan untuk ikan yang lainnya masing-masing mewakili kelompok ikan serranid (tennasuk ikan laut), dan ikan cyclid (termasuk ikan tawar). Analisis kesejajaran nukleotida cDNA GH ikan gurami dengan gen-gen GH dari ikan lainnya berdasarkan BLASTn secara lengkap disajikan pada Lampiran 4. Dengan menggunakan program GENETYX versi 7, diketahui bahwa sekuens nukleotida kedua klon gen GH yang diperoleh adalah sama (Ga~nbar7), kecuali pada sekuens awal terminal 5. Deinikian juga halnya pada prediksi asam amino residu untuk kedua klon yang disekuensing (Gambar 8). Hasil prediksi asam amino residu gen GH klon 3 menggunakan program GENETYX ditunjukkan pada Gambar 9 . Stop kodon gen GH ikan gurami adalah TAG yang terletak pada nukleotida 409-51 1. Panjang sekuens terminal 3 tidak terkodekan (3'-UTR,
UnTranslated Region) adalah 192 nukleotida. Dalam
sekuens 3'-UTR tersebut terdapat sekuens konserf (conserve sequence) untuk penanda poliadenilasi (polyadenylation signal, AATAAA) pada nukleotida 661666, dan sekuens akhir poliadenilasi (polyadeylation tail) pada nukleotida 683703.
Clone 3 Clone 4
Clone 3 Clone4
1 ; ~
121
;:. :LA. u:.,,:.,,
....!:,:! - ..... - .j ,.... .... ~ ' .,::,~
.
...,, :.T..T . , j . % ....:.,, I:.,::: :T.'.T.::?.:I.:.?::.:::.a::.:
.Y :i~.'. r: T 'TT.T,- -a:.'
.
.
: .:
... ..d...,>..
;
- T T -,;..,:..l:
:, TTT., . ;..,A, T,,,. ' T T T T 4 ... ;.. '7:.
~
~
iu
~
t0
...,
. .:A . t , . .T.:I,,.~,, .TU:\...,, . ~ u . i . ~ . > .,.:I. . r l: . :::.,::,?:;.,::T:T4:T?:T.::.>.,:-7?TT.'.T: :;.T:T: 1%
...
3 Clone 4
i6i
Clone 3 Clone 4
29:
Clone 3 Clone4
361 :GGIRXCT~~TA~:~,BGAGT.TGGG~G~.TGRRGXGT'~G~TG~.GX~:GG.~~;~~TITGLXLTGC *do 361 ~C.G~P.+CT>.~:TS;CCA~~~TCTC.C.C.LC.AT~I~:GS;CTCGG~T~P.P~~.~~C.~~P.C.CTATG>~~CTG~ $20
Clone 3 Clone 4
4r.i 221
5,;-
- Ti.TT'
],::
:TI;:TT.:L.'.:.:.:.;I::::LT,I
Clone 3 4
it1 1
;.T.T.T.. T T.
Clone 3
5
Clonc4
1
ITTTI.,.~T .~;.r:.., . .T,;ST TTT:.. T .T,;T.,:...I..TLU. :.TTL. ..;. T: .:.TT. :TTT.:TT 'T.;T..,:' . Ta:T;TTT . 'T.-T,:T.). . T . . . ? ..TT.'.l: ..1;T..,: '..TT.:-
Clone 3 (:lone 4
dcq
Cl01le
1;:1
4 :
. I,:.
TTrT.,;.> . ~ I , _ . TI. U . ~ L .~TT . I .~ I ~ I . TT T'.T:.:.: -Tm; .T :..~:T..'T~::.:;.;X~ ..:.,:;.T.. ' T
. :..,;:.T~T -5.:.'. : : : : T 7 :
:.
:..,:
. . .J T . I ..C~-'T~.S.J,>.. . . ( ~ T T . . T JT
2dG
:s:T
Ci;:\
:T.:..T:
.:.:T.;T:.?,:;.;
:
T-T-YT..T: :..,:,:TT~'T~: .I;....:.;.:
..
:
T '.'
::.
I..,: -TI: T.;..T T
: T L T .
. - - ....,...,.. --. -. . ,...; ;,... .:,TT.., , . . .. ....,
;:,,
l.?
::.:.><.O.IT1:
...;..:,.,:T.;:~.T,j .
? T..
.. T
, G T . . TI:;.-T.:S.ji-T.'. ...T.? . ::_,1L:CTI ..I :TII-L:T(I-TC->: :T_:.:.TJI:-I
..T.TllTLj. T T T . : :
. . . . ::.T.Tj.j: ...I. T
. . .:.Tlj.;. T
....
TTT T , ; , ; T , : , ~ ~ T T T T T ~ ~ T T.:..; , - . ITT:. TT :T,:,jT<.?TTTTTT6TT: ::.C.a:TT.:iL
.. ...:.;.~~T.;:.T.IT : r . -:. :T,;T ::. :L1IT:.1T.:T:.. ':.:TGT::.
:CG
3D5
-.
..T..;T.G T .
i2.n
i?C J?D
540
T dClO . - T ' i'iCI
..'..:T::>.TG: :TL :.'.T,I:
560
Gambar 7. Alignment nukleotida hasil sekuensing 2 klon gen GH ikan gurami (Osphronemus gouramy)
Clone 3 s t Clone4 6 1
Gambar 8. Alignment asam amino residu kedua Mon gen GH ikan gurami (Osphronemus gouramy)
GENETYX: Translation of Nucleotides into Amino Acids for Thesis1 : 2007.08.11 Date Filename : clone-3 : 703 Sequence Size Sequence Position: 1 - 703 Translation Position: 1 - 703; Genetic Code : The Standard Code
10 20 30 40 50 60 GCACCTCCACCTGCTCGCCCAGAGACTCTTCTCCGACTTCGAGAGCTCTTTGCAGACTGA H L H L L A Q R L F S D F E S S L Q T E 70 80 90 100 110 120 GGAGCAGCGTCAACTCAACAAAATCTTCCTGCAGGATTTTTGTAACTCAGATTACATCAT E Q R Q L N K I F L Q D F C N S D Y I I --
-
~
CAGCCCTATCGACAAGCACGAGACCCAGCGCAGCTCTGTGCTGAAGCTGTTATCGATCTC S P I D K H E T Q R S S V L K L L S I S
190 200 210 220 230 240 TTATCGGCTGATCGAGTCCTGGGAGTTCCCCAGCCGGTCTCTGTATGGAGGTTCTGCTCA Y R L I E S W E F P S R S L Y G G S A Q 250 260 270 280 290 300 AAGATACCAGATTTCTCCCPAACTGTCGGAGCTGATGCGAGGAATCCAGCTGCTGATCM R Y Q I S P K L S E L M R G I Q L L I K 310 320 330 340 350 360 GGCCAATCAGGATGGAGCAGAGATGTTCTCTGACGGCGTGGTTCCGCAGCTCGCTCCGTA A
N
Q
D
G
A
E
M
F
S
D
G
V
V
P
Q
L
A
P
Y
370 380 390 400 410 420 CGGAAACTACTACCAGAGTCTGGGAGATGACGAGTCGCTGAGACGCAGCTATGmCTGCT G N Y Y Q S L G D D E S L R R S Y E L L GGCCTGCTTCAAAPAGGACATGCACAAGGTGGAGACGTACCTGACTGTGGCTAAATGCCG A C F K K D M H K V E T Y L T V A K C R
490 500 510 520 530 540 ACTCTCTCCAGAAGCTMCTGCACTCTGTAGcccccccatctggacaatgacatcatcgt L S P E A N C T L *
610 620 630 640 650 660 tttctggtggttttttgttgcaggttgaacacaaagtgatgtcacactgtcagtacatga 670
680
690
700
710
aataaagtttgtttgattctgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa -
Keterangan: Tanda asterisk adalah kodon stop (TAG). Sekuens nukleotida ditulis derlgan huruf kecil merupakan bagian terminal 3 yang tidak terkodekan (3'-UTR, UnTranslated Region). Penanda poliadenilasi (polyadenylation signal, AATAAA) terletak pada nukleotida 661-666 digaris bawahi. Ujung poliadenilasi @olyadenylation tail) pada nukleotida 683-703. Gambar 9. Sekuens nukleotida dan hasil prediksi asarn amino klon 3 gen GH ikan gura~nirnenggunakan program GENETYX versi 7.
Kerapu akaare Kerapu coiodcs Gurame Salmon Atlantik Bighead m lkTn mus ' Ikvn nila Rainbow uaut Kakap Silver carp Tuna I b zehm Kerapu akaara Kerapu miodes Gurnme Salmon Atlantik Bidlead oup lkan mas lkan nila Rainbow tiout Kakap Silver cnrp Tuna &an zebra
Keterangan: Ikan kerapu akaara (no. aksesi Bank Gen: AY326406), ikan kerapu coiodes (no. aksesi Bank Gen: AY038606), ikan salmon Atlantik (no. aksesi Bank Gen: X14305), bighead carp (no. aksesi Bank Gen: X60473), ikan mas (no. aksesi Bank Gen: D0350436.), ikan nila (no. aksesi Bank Gen: M26916), rainbow trout (no. aksesi Bank Gen: M22732), kakap (no. aksesi Bank Gen: S54890), silver carp (no. aksesi Bank Gen: X60475), ikan tuna (no. aksesi Bank Gen: X06735) dan ikan zebra (no. aksesi Bank Gen: AJ93. Gamhar 10. Alignment sekuens asam amino gen GH ikan gurami dengan berhagai jenis ikan. Analisis domain protein yang diturunkan dari cDNA GH gurami (Gambar 10) menunjukkan adanya heherapa situs, yaitu: somatotropin-1 (asam amino ke 34-67), somatotropin-2 (142-160), kinase kasein I1 fosforilasi (11-14), kinase protein C fosforilasi (47-49;59-61;87-89;132-134), N-miristoilasi (128-132) dan
Domain yang paling terkonservatif dari beberapa kelompok ikan adalah pada N-glikosilasi yang mempunyai kesamaan 100% terhadap kelompok ikan yang dianalisis. Domain N-glikosilasi mengandung 4 asam amino
yaitu
asparagine, sistein, threonine dan leucine. N-glikosilasi ini memiliki 2 asam amino essensial yaitu threonine dan leueine. 4.2 Pembahasan
Dari hasil ekstraksi RNA total didapatkan rasio absorban pada A260lA280 sebesar 1,7, ha1 ini menunjukkan bahwa RNA total yang diisolasi cukup bagus untuk digunakan pada proses selanjutnya (Saunders & Parker, 1999). Konsentrasi RNA total sebesar 42,2 ngIpL adalah mencukupi untuk sintesis cDNA. RNA total yang digunakan untuk sintesis cDNA adalah sebanyak 3 pg/pL. cDNA total telah berhasil disintesis melalui proses transkripsi balik. Keberhasilan sintesis cDNA dianalisis melalui PCR dengan primer yang konserf dari 9 aksesi data di Bank Gen. Hasil elektroforesis yang didapatkan berupa pita DNA dengan panjang sekitar 700 bp (Gambar 2) merupakan kandidat fragmen gen GH ikan gurami. Transformasi ke bakteri E. coli DH5a menunjukkan hasil seleksi biruputih pada media seleksi yang mengandung antibiotik ampisilin, X-gal dan IPTG terdapat koloni E. coli yang benvarna putih. Koloni putih yang tumbuh di media seleksi merupakan E. coli yang mengandung insersi sedangkan koloni yang benvarna biru merupakan E. coli yang tidak mengandung insersi. Gen lacZ nienyandikan Pgalaktosidase W g a l ) yang mengubah substrat X-gal menjadi benvarna biru. Ketika cDNA GH menyisip pada gen LacZ, maka gen Lac2 tidak dapat diekspresikan sehingga koloni E. coli benvarna putih. Bila tidak ada fragmen yang menyisip pada Lac2 maka gen Pgal diekspresikan sehingga koloni yang terbentuk benvarna biru. Hasil cracking menunjukkan bahwa ukuran pita DNA pada koloni bakteri no. 1-10 (Gambar 5) adalah lebih besar dibandingkan dengall koloni biru sebagai kontrol (K). Hal ini menunjukkan bahwa semua koloni bakteri putih dalam master
plate membawa plasniid dengan insersi DNA gen GH gurami.
Isolasi plasmid telah dilakukan dengan menggunakan kit FlexiPrep dari Amersham Pharmacia Biotech.Vektor kloning pGEM-T Easy mempunyai ukuran 3015 bp. Ukuran fragmen DNA no. 1-2 lebih besar dari 3 kb (Gambar 6). Hal ini memperkuat dugaan sebelumnya bahwa koloni bakteri putih membawa plasmid yang mengandung DNA insersi. Hasil sekuensing GH gurami mempunyai ukuran 700 bp. Dengat1 menggunakan
program GENETYX diketahui bahwa sekuens hasil kloning
menyandikan 169 asam amino. Bila dibandingkan dengan sekuens gen GH ikan lain, fragmen cDNA GH ikan gurami ini merupakan cDNA tidak lengkap karena tidak memiliki signal peptida. Panjang sekuens asam amino yang belum diisolasi adalah sekitar 37 asam amino. Program BLAST digunakan untuk mengetahui apakah sekuens nukleotida hasil sekuensing mirip dengan gen-gen GH yang ada di Bank Gen. Hasil analisis BLAST (Lampiran 4) menunjukkan bahwa sekuens yang diperoleh sangat mirip dengan gen-gen GH dari berbagai jenis ikan, khususnya kelompok anabantid. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa produk amplifikasi PCR merupakan sekuens gen GH ikan gurami. Pada penelitian ini sekuensing hanya dilakukan menggunakan 2 klon. Analisis sekuens menggunakan program GENETYX versi 7 menunjukkan bahwa sekuens nukleotida kedua klon gen GH yang diperoleh adalah sama (Gambar 7), kecuali pada ujung terminal 5 yang merupakan
sekuens primer 5'-
RCAYCTBCACCWRHTSGC-3' yang memang didesain mix, yaitu R=A atau G, Y=C atau T, dan S=G atau C. Demikian juga halnya pada prediksi asam amino residu untuk kedua klon yang disekuensing (Gambar 8), hanya berbeda 1 asam amino pada sekuens awal terminal 5. Hasil prediksi asam amino residu gen GH klon 3 menggunakan program GENETYX ditunjukkan pada Gambar 9 . Stop kodon gen GH ikan gurami adalah TAG yang terletak pada nukleotida 409-51 1. Panjang sekuens terminal 3 tidak terkodekan (3'-UTR,
UnTranslated Region) adalah 192 nukleotida. DaIam
sekuens 3'-UTR tersebut terdapat sekuens konserf (conserve sequence) untuk penanda poliadenilasi (polyadenylation signal, AATAAA) dan sekuens akhir
poliadenilasi (polyadenylation tail). Hal ini menui~jukkan bahwa keseluruhan terminal 3 gen GH gurami telah berhasil diisolasi. Analisis domain protein yang diturunkan dari cDNA GH gurami (Gambar 10) menunjukkan adanya beberapa situs yaitu : Somatotropin-1 (asam amino ke 34-67), sornatotropin-2 (142-160), kinase kasein I1 fosforilasi (11-14), kinase protein C fosforilasi (47-49;59-61;87-89;132-134),
N-miristoilasi (128-132) dan
N-glikosilasi (166-169), 4 cysteine (cys3', cysi4', cysI5', C ~ S ' ~ Domain~). domain tersebut juga umum ditemukan pada GH ikan. Domain yang mempunyai kesamaan 100% terhadap keloinpok ikan yang dianalisa adalah N-glikosilasi dan 4 cysteine. Domain N-glikosilasi mengandung 4 asam amino yaitu asparagine, cysteine, threonine dan leucine. N-glikosilasi ini memiliki 2 asam amino essensial yaitu threonine dan leucine. N-glikosilasi terlibat di dalam regulasi aktivitas transport dan ekspresi permukaan dari transporter neurotransmitter (Keynan et al. 1992; Bennet & Kanner, 1997 dalam Syaifudin, 2006). E~npatresidu cysteine dikenali dari ikatan disulfida di dalarn molekul GH, keberadaannya sangat penting untuk aktivitas biologi dan integritas struktural homon (Venugopal et al., 2002 dalam Li et al., 2005). Somatotropin-1 mempunyai domain yang bervariasi dibandingkan dengan somatotropin-2. Somatohopin-1 gurami memiliki kesamaan paling dekat yaitu dengan kelompok kerapu yang memiliki karakteristik pertuinbuhan lambat. Perbedaan pada gurami hanya terdapat pada asam amino isoleucine yang digantikan dengan valine pada kerapu. Sedangkan pada somatotropin-2 me~npunyaidomain yang lebih konserf. Asam amino yang bervariasi yaitu asam ainino threonine yang digantikan oleh arginine dan asam amino lysine yang digantikan oleh asparagine pada bighead carp, ikan mas, silver carp dan ikan zebra. Kinase kasein I1 adalah kinase serine yang banyak terdapat pada sel eukariotik. Kinase kasein I1 merupakan kinase protein multi fungsi karena berperan dalam bermacam-macam fungsi dan proses selular, terlnasuk mitosis dan transformasi selular (Promega, 2001 dalam Syaifudin, 2006). Kinase kasein I1 gurami memiliki 4 asam amino yang konserf yaitu serine, aspartic acid, phenylalanine dan glutainic acid. Namun pada beberapa ikan asam amino serine
digantikan oleh asparagine. Kinase protein mempunyai fungsi utarna sebagai penghubung sinyal intraseluler. N-miristoilasi adalah modifikasi protein eukariotik dan virus dalam pengikatan di membran sehingga mengubah fungsi protein seluler yang dimodifikasi (Maurer-Stroh, 2002 dalam Syaifudin, 2006). Protein hasil miristoilasi berperan dalam sinyal transduksi, apoptosis (ekspor protein ekstraseluler alternatio. Dalam domain N-miristoilasi tidak terdapat urutan asam amino yang terkonservatif, adanya variasi asam amino ini dimungkinkan terkait dengan fungsinya sebagai modifikasi protein dalam pengikatan ke membran. Selain itu N-miristoilasi mempunyai kesamaan paling kecil dengan ikan lainnya sehingga dimungkinkan sebagai karakter yang inembedakan pertumbuhan pada ikan gurami.
Sekuens parsial cDNA hormon pertumbuhan ikan gtrrame (Osphronemzfs
gouramy) mempunyai ukuran 700 bp yang rnenyandikan 169 asam amino dan mengandung elemen-elemen yang konserf untuk gen GH.
DAFTAR PUSTAKA Anathy V, Venugopal T, Koteeswaran R, Pandian TJ and Mathavan S. 2001. Cloning, sequencing and expression of cDNA encoding growth hormone from Indian catfish Heteropneustes fossilis. J. Biological Science 3:315324. Ayson FG, de Jesus EG, Amemiya Y, Moriyama S, Hirano T and Kawakuchi H. 2000. Isolation, cDNA cloning, and growth promoting activity of rabbitfish Siganus guttatus growth honnone. Gen. Comp. Endocrinol.l17:25 1-259. Brown TA. 1991. Pengantar kloning gen. S.A. Muhamad dan Praseno (editor). Yayasan Essentia Medika. Yogyakarta. Calduch-Giner JA, Duval H, Chesnel F, Boeuf G, Perez-Sanchez J and Bouhard D. 2000. Fish growth hormone receptor: Molecular characterization of two membrane-anchored forms. J. Endocrine Society 142: 3269-3273. Collas P, Husebeye H and Alestro~nP. 2000. Transferring foreign genes into zebrafish eggs by microinjection. Transgenic Animal: Generation and Use. p119-122. Cook JT, McNiven MA and Sutterlin AM. 2000. Metabolic rate of pre-smolt growth-enhanced transgenic Atlantic Sahnon Salmo salar. Aquaculture 188 : 33-45. Damawan N. 2004. Isolasi, kloning dan sekuensing gen putatif enzim PQQ glukosa dehidrogenase dari Agrobacterium tzimefaciens. Skripsi. Program Studi Kimia. FMIPA. IPB. Devlin RH. 1997. Transgenic salmonids. In : Houdebine, LM (Ed.). Transgerzic animal: generation and zrse. (pp.105-117). Harewood Academic Publishers. Amsterdam. The Netherlands. Glick BR and Pasternak JJ. 2003. Molecular biotechnology: Principles and aplications of recombinant DNA (Third Edition). ASM Press, Washington, D.C. Hacket PB. 1993. The Molecular biology of transgenic fish. In: Hocachka and Mommesen (Eds.). Biochemisfy and molecular biology offishes (pp.2 18 221). Elsevier Science Publishers BV. Jangkaru Z. 1999. Mernacu pertumbuhan gurami. Ref 2. Jakarta: Penebar Swadaya. Kobayashi S, Alimuddin, Morita T, Miwa M, Lu J, Endo M, Takeuchi T, and Yoshizaki G. 2007. Transgenic nile tilapia Oreochro~nisniloticus over-
expressing growth hormone show reduced Aq~taculture270:427-435.
ammonia excretion.
Koolman J dan Rohm KH. 2001. Atlas befwarna dan teks biokimia. Wanandi S.1, Penerjemah: Sadikin M, Editor. Jakarta: Hipokrates, 2000.427h. Lehninger. 1982. Dasar-dasar biokimia (Jilid 3). Penerjemah: Thenawidjaya. Erlangga. Jakarta. Lernaire C, Writ S and Panyim S. 1994. Giant catfish Pangasius pangasiodon gigas growth hormone-encoding cDNA cloning and sequencing by one sided polymerase chain reaction. Gene 49:271-276. Li WS, Chen D, Wong AOL and Lin HR. 2005. Molecular cloning, tissue distribution, and ontogeny of mRNA expression of growth hormone in orange-spotted grouper Epinephelus coioides. J. Endocrinol. 144:78-89. Matty AJ. 1985. Fish endocrinology. Croom Helm London and Sydney Timber Press. Portland, Oregon. 267 p. Muladno. 2002. Seputar teknologi rekayasa genetik. Pustaka Wirausaha Muda. Bogor. N a ~ nYK, Noh JK, Cho YS, Cho HJ, Cho KN, Kim CG,and Kim DS. 2004. Dramatically accelerate growth and exstraordinary gigantism of transgenic mud loach Misgurnus mizolepis. Transgenic Res. 10:353-362. Old RW and Primrose SB. 1994. Principles of genetic manipulation. 5" edition. Oxford: Blackwell Sciencetific. Perez-Sanchez J. 2000. The involvement of growth hormone in growth regulation, energy ho~neostatisand immune function in gilthead sea bream Sparus aurata: a short review. Fish. Physiol. Biotechnol. 22:135-144. Saanin H. 1984. Taksonomi dan kunci identifikasi ikan. Bina Cipta, Bandung. 256 hal. Saunders GC and Parker HP. 1999. Analytical Molecular Biology: Quality and Validation. Teddington: LGC Press.190 p. Suharsono S. 2000. Dasar-dasar pengklonan gen : Kumpulan bahan kuliah dala~n pelatihan peningkatan dan keterampilan teknisi laboratorium biologi molekuler. Bogor, 29-11 Maret 2000. Kerjasama Proyek Pembinaan Kelembagaan Penelitian dan Pengembangan Peitanian/ARMP 11, Badan Litbang Pertanian, Deptan dengan PAU Bioteknologi, IPB. Syaifudin M. 2006. Isolasi dan karakterisasi cDNA hormon pertu~nbuhanikan kerapu bebek Cronzileptes altivelis. Tesis. Institut Pertanian Bogor.
Voet D and Voet JG. 1994. Biochemistry. 2ndEdition. New York: John Willey and sons inc. Voigt MN and Botta JR. 1990. Advances in fisheries technology and biotechnology for increase profitability. Paper from the 341h Atlantic Fisheries Technological Conference and Seafood Biotechnology Workshop, August 271hto September Is: 1989. Walsh G. 2002. Proteins. Biochemistry and biotechnology. John Wiley & Sons, LTD. Yao K, Niu PD, Le Gac F, Le Bail PY. 1991. Presence of GH specific binding sites in rainbow trout Oncorhynchus nzykiss tissues: Characterization of the hepatic receptor. Gen. Comp. Endocrinol. 81:72-82.
LAMPIRAN
Lampiran 1. Peta Plasmid p
~
~ Easy ~
@
-
~
Lampiran 4. Hasil ailalisis BLASTn 1. gblAF157633.11AF157633 Trichogaster trichopterus growth hormone mRNA, complete cds Lengths896 score = 410 bits 18901, Expect = 5e-121 Identities = 1761187 (94%). Positives = 181/187 (96%). Gaps = 0/187 (0%) Frame = +2/+1 Qjcry
2
SSICL 184 Qjery
182
SSlct 364
HLHLI.AQRLTS3FESSLQTEE2i(Q-~l~KIFLQDTCNSDYIISPIS131ETQRSSVLKLLSIS181 IiLIiLLAURLFrDTESSLQ EEQRCL!IKIxQ3fCtiSCYIIS?1 DK?CU.L'IQRSSVLKLLSIS HLHLLh2RLF'CDFESSLQIL'i.Q3Q!.KKIFl.QD?CNSDYIISPIDl(ri~T)ASSVLSLLSIS 363 Y R L I E S R E t ' P S R S L Y G G S A Q R Y Q I S P K 1 S L ' L ! . l R G i P L 361 YRLICS EF?SRSLYGGSAQRYCISPKLSELI
Q ~ e r y 362
GI:YYQSLGUDESLP.RSYt:LLACFKKDY1IKVETILTV&.KCRLSPEP.NCTL~P?~LDNUIIV 541 G!I?YQSLGIDESLRRSYELL.~CPKXCY!!XVETILTVA~(C~LSPZANCTL'? LINIIISOICT. 548; GtiYYCSLGEDESLRRSYELLACi'i(KDMiiKVETYLTVAKCR!.S?EAl:CTL'PLDLNE:NIiI 723
Query
542
FVL*PCS
562
CVL'SCS
744
VL* CS Sbjct
724
2. gblAY873789.11 Trichogaster leerii gfowth hormone LGHI mRNA, complete cds Length=840
Score = 405 bits (878>, Expect = 2e-118 Identities = 175/184 (95%). Positives = 178/184 (9681, Gaps = 01184 (0%) Frame = +2/+3 Query
2
181
Sblcc
I-:LHLLhQRLPS3FESSLCTZEQRQLNKIFLQ3FCNSCYIISPIDMETQRSSVLKl.LSIS 11LtiLLACHIFrDFSSSL EZ@RQLIIKI7LQD~CtiS3YIISTIDMYTQRSSVLKLLSIS 150 YI.llLLAQRLFTDiESSLQI~EQRQLNKiFLQDFCNSDYIISPIDKil~:QRSSVL.KLLS1S
329
QLCry
i82
361
Y R L I i : S R E t ' P S R S I . Y G G S I i Q R Y C I S P K L S E L M R G I a P Y
YRLIES E7PS3SLYGGSAQRYQIS?KLSE1.!IRGIQLLI'(AI:QDG.~E!IFSDGVVPQlA?Y SSlc:
330 Y R I . I I S W . ? F P S R S L Y G S S h 3 R Y Q I S P K L S E L : I R G I a Q L A F Y
509
Qcery
362 GNYYQSLGD32SiRRSYE1LRCFKKD311KVETYLTVAKC2LSPSAl~C'CL?FHLDNUIIV
511
GNYYCSLGDDESLKIiSYZLLAC?KK~KE~VE'L'YLTVAXCKISPAlC?L'P i , N I ? ,
Sblc:
51C
Query
542 FVL* VL* 690 CVL'
Sbjct
GKYYQSLGDD~SLRRSYCLLACFi(tiD>IHKVETYLTVRKCRLS?ERIICTL'?!.DLNNYIII
689
553 701
3. qbiAY513647.11 Epinephelus coioides growth hoxmone mRNR, complete cds Length=938 Score =
352 bits (7631, Expect = 2e-97 Identities = 1521170 (89%). Positives = 157/170 (92%). Gaps = 0/170 (0%) Frame = +Z/+3 Query
2
HLHLLAQRLFSDFESSLQTEEQRQLNKIFLQDFCNSDYIISPIDKHETQRSSVLKLLSIS 181 HLHLLAQRLFSDFES+LQTEWQLNKIFLQDFCNSDYIISPIDKHETQRSSVLKLLSIS
Sbjct
165
Query
182 YRLIESREFPSRSLYGGSAQRYQISPKLSELMRGIQLLIKANQDGEMFSDGVVPQLAPY 361 YRLiES EFPSRSL GGSA R QISPKLSEL GI LLI+ANQDGAEtF D QLAPY 345 YRLVESWEFPSRSLSGGSRPRNQISPKLSELKTGILLLIRANQDGAELFPDSSQLAP 524
Sbjct
Query Sbjct
HLHLLAQRLFSDFESTLQTEEQRQLNKIFLQDFCNSDYIISPIDKHETQRSSVLKLLSIS 344
362 GNYYQSLGDDESLRRSYELLACFKKDMHKVETYLTYAKCRLSPEANCTL 511 GNYYQSLG DESLRR+YELLACFKKDMHKVETYLTVAKCRLSPEANCTL* 525 GNYYQSLGADESLRRTYELLACFKKDMHKVETYLTVAKCRLSPEANCTL 674
4. gblM26916.llORNTIGH 0.niloticus ltilapiai growth-hormone (tiGH1 mRNA, complete cds Length=847
Score = 332 bits (7191, Expect = 2e-88 Identities = 145/170 (8581, Positives = 153/170 (SO%), Gaps = 0/170 (0%) Frame = +2/*3
Query
182
Sbjct
321
Query
362
Sbjct
501
YRLIESREFPSRSLYGGSAQRYQISPKLSELMRGIQLLINQDGAEMFSDGVVPQLAPY Y LIES EFPSRSL GGSt R QISPtLSEL GI LLIIANQD AE + D Q APY YGLVESWEFPSRSLSGGSSLRNQISPRLSELKTGILLLIRANQDEAENYPDTDTLQPY GNYYQSLGDDESLRRSYELLACFKKDMHKVETYLTVAKCRLSPEANCTL 511 GNYYPSLG +ESLR++YELLACFKKDMHKVETYLTVAKCRLSPEANCTL* GNYYQSLGGNESLRQTYELLA~FKKDMHKVETYLTVAKCRLSPEANCTL* 650
361 500
