[in]onderzoek. Macht over de microben. Rationalisatie rukt op in de biotechnologie. Jos Wassink

Rationalisatie rukt op in de biotechnologie

Macht over de microben Voor de productie van geneesmiddelen, voeding, plastics en brandstoffen gaat

chemische industrie, wordt de biotechnologie nog beheerst door ambachtelijke ervaring en beperkt begrepen levende cellen. Onderzoek aan de TU wil het fundament leggen voor een rationeel ontwerp van biotechnologische processen.

Jos Wassink De proefopstelling in het Kluyverlaboratorium aan de Julianalaan is minuscuul. Het doorzichtige plastic frame is zo klein als een creditcard en aan de korte kant zijn twee putjes aangebracht. Ze zijn afgesloten met een dekseltje waaruit twee ragfijne slangetjes steken. Het zijn de aanvoer voor zuurstof en de afvoer van kooldioxide. Met een loep is nog net te zien dat er een roerstaafje aan een asje hangt en dat onder elk van de putjes een elektronische chip is aangebracht. Volgens hoogleraar bioscheidingstechnologie prof. dr.ir Luuk van der Wielen wacht zulke miniatuurfermentatievaatjes een grote toekomst. “De industrie heeft ze broodnodig. Je kunt er microorganismen mee screenen op hun geschiktheid. Maar je kunt ook kijken onder welke omstandigheden een katalysator het meest effectief is. In beide gevallen wil je verschillende micro-organismen bekijken. Je hebt het voordeel van kleinere volumina, waardoor je grote aantallen parallel kunt bekijken.” Micro-organismen kunnen gistcellen zijn, bacteriën, schimmels of zoogdiercellen, al naar gelang het gewenste product. Miniaturisatie, parallellisatie en rationalisatie zijn de mantra’s van het onderzoek van biotechnologische processen dat aan de TU plaatsvindt. In samenwerking overigens met industriële partners als dsm, Shell, Akzo Nobel, Organon (nu Schering Plough) en apparatenbouwer Applikon. De droom is om tot volledig controleerbare biotechnologische processen te komen met een optimale opbrengst. Van der Wielen, compact postuur, kort golvend haar en een stalen montuur, noemt die ontwikkeling ‘een gang van empirie naar controle’. De drijvende kracht is het streven naar efficiëntie. “Kostenbesparing klinkt banaal”, zegt hij. “Maar het is belangrijk. Zeker als het om bulkhoeveelheden gaat of om biobrandstoffen waar de kostprijs maar een paar

dubbeltjes per kilo mag bedragen.” Maar geld is niet het enige. Ook het milieu telt mee. Alles wat niet wordt omgezet in eindproduct betekent een verlies aan grondstoffen en energie. Het gaat vaak om procentuele verschillen, maar procenten van bulkhoeveelheden zijn enorme hoeveelheden materiaal en/of energie. “Beide routes zijn van belang”, zegt de hoogleraar, “duurzaamheid en economische competitiviteit”. Twee druppels Dr.ir. Michiel van Leeuwen promoveerde onlangs op de ontwikkeling van een microbioreactor met een inhoud van honderd microliter; het volume van twee of drie druppels. Hij werkt nu bij het biofarmaceutische bedrijf Centocor in Leiden. Het gesprek vindt plaats in een levendige maar rumoerige broodjeszaak. De jonge doctor draagt een gemillimeterd baardje en heeft een vrolijke oogopslag. Roerend in zijn koffie zegt hij: “Dit gaat moeilijk in een microreactor.” Mengen in zulke kleine hoeveelheden vloeistof gaat lastig omdat de oppervlaktespanning de vloeistof bijeen houdt. Je kunt schudden zoals met kolven gebeurt, maar dat heeft op microschaal nauwelijks nut. Je zou echt enorm hard moeten schudden voor enig effect en dat kan makkelijk desastreus uitpakken voor alle draadjes en leidinkjes waarmee de kleine microreactor verbonden is. “Je ziet altijd alleen dat kleine vaatje”, grapt Van Leeuwen. “Niemand vertelt dat er een tafel vol apparatuur naast staat.” Van Leeuwen promoveerde op 11 juni bij prof.dr.ir. Sef Heijnen, hoogleraar bioprocestechnologie (Technische Natuurwetenschappen) op zijn proefschrift ‘Development of a bioreactor with integrated on-line sensing for batch and fed-batch cultivator on a 100 µL-scale'. Hij zette gistcellen aan het werk in het piepkleine vaatje en ging na in hoeverre >> 8•4

Delft Integraal

[ in ]onderzoek

de industrie steeds vaker uit van biologische grondstoffen. Maar anders dan in de

23

22

8•4

Delft Integraal

Foto: Sam Rentmeester/fmax

[ in ]onderzoek

[ in ]onderzoek

De microbioreactor is een klein putje in een plastic houder, die plaats biedt aan 96 putjes of ‘wells’.

het gedrag van de beestjes overeenkwam met dat in een standaard vat (een fermentor genoemd) met vier liter inhoud. Nog voordat hij van zijn cappuccino drinkt, noemt hij twee andere promovendi op wier werk hij verder bouwt. Dr.ir. Xiaonon Li bouwde de zogenaamde microbioreactor en dr.ir. Erik Krommenhoek (Universiteit Twente) verzorgde de geïntegreerde meetchip. De microbioreactor is een klein putje in een plastic houder, die plaats biedt aan 96 putjes of ‘wells’. Van Leeuwen werkte met twee zulke putjes naast elkaar, maar in principe zou een heel plaatje dus bijna honderd microbioreactoren kunnen gaan bevatten.

‘We kunnen de beestjes zo goed dresseren dat ze hogere output leveren van het gewenste product’ Dat zou de mogelijkheid bieden om verschillende stammen van gistcellen in competitie met elkaar te vergelijken onder operationele omstandigheden. Nu worden vaak stammen geselecteerd die het snelst groeien op een petrischaaltje. Maar zijn dat ook de meest productieve in een industriële reactor? Een plaat vol microbioreactoren zou onderzoekers in staat stellen de prestaties van tientallen tot honderden verschillende stammen met elkaar te vergelijken. Zo ver is het nog niet, want de microbioreactor is nog een prototype. Onderin het putje bevindt zich

24

8•4

Delft Integraal

een multifunctionele chip die de zuurgraad (pH) meet, de temperatuur, de concentratie actieve gistcellen en het zuurstofgehalte in de oplossing. Daarnaast bevat de chip een verwarmingselement. En dat alles op een oppervlak van zeven bij zeven millimeter. Op een asje bevindt zich een magnetisch aangedreven roerstaafje en het geheel is afgesloten met een dekseltje met doorlaten voor voeding (suikeroplossing), zuurstof en kooldioxide. De reactor werkte en Van Leeuwen kon aantonen dat gistcellen zich in de microbioreactor vrijwel hetzelfde gedragen als in een vier-liter-fermentor. Met andere woorden: gistcellen zijn goed te beproeven op de submilliliterschaal. Natuurlijk blijven er nog wat uitdagingen staan. Zo blijkt de sensor gevoelig voor vervuiling. Men denkt dat met coatings op te kunnen lossen. Verder blijkt het heel lastig om controleerbaar een voedingsstroom van een microliter per uur te realiseren. Van Leeuwen: “Dan zit je tien uur te wachten op één druppel, daarna kun je naar huis.” Platen met tientallen of honderden volledig uitgeruste microbioreactoren zijn nog niet in de handel, maar volgens hoogleraar bioscheidingstechnologie Van der Wielen zit de industrie er op te wachten. De technologie zou hen in staat stellen om snel de meest productieve stammen te selecteren en vervolgens de productieomstandigheden te optimaliseren door temperatuur en zuurgraad in elk reactortje iets anders in te stellen. En dan maar kijken wat ‘de beestjes’ doen. Continu proces De chemische industrie werkt graag volcontinu. Biotechnologische processen lenen zich daar slecht voor. Een patent, aangevraagd door biotechnologe dr.ir. María Cuéllar Soares hoopt dat te veranderen. Productie verloopt in de biotechnologie bijna altijd batch-gewijs: met bakken (of bakjes) tegelijk. Dat

‘Dan zit je tien uur te wachten op één druppel, daarna kun je naar huis’ TU-alumnus dr.ir. Emile van de Sandt:

de oplossing weet te verwijderen, blijft de concentratie laag en blijven de beestjes produceren.” Promotor Van der Wielen spreekt over in-situ product recovery. Hij, prof. Heijnen en dr. Adrie Straathof tekenden voor Cuéllars proefschrift ‘Towards the integration of fermentation and crystallisation’. Het proces waarop patent is aangevraagd doet die onttrekking in een paar stappen. De opstelling bestaat uit een gesloten systeem van twee gekoppelde vaten. In de fermentor produceren bacteriën het aminozuur fenylalanine. Dat stofje wordt gebruikt bij de productie van de zoetstof aspartaam, maar hier gaat het om het proces, niet om het product. Het brouwsel verlaat de fermentor via een microfilter (om geen bacteriën af te voeren). Vervolgens wordt er water aan onttrokken door het over een halfdoorlatend membraan te persen. In het tweede vat kristalliseren de aminozuren onder gunstige condities uit, waarna het restant terugvloeit als voeding voor de bacteriën. Zo althans zou het gaan in een ideale wereld. Maar het stofje fenylalanine is nogal kritisch als het om kristalliseren gaat. Om te beginnen kent het twee vormen van kristallen: een naaldvorm en een platte kristalvorm. Het gaat bij de winning van het aminozuur om de best hanteerbare tweede vorm. Om die te bereiken moet de kristallisatie binnen een heel nauwe band van temperatuur (tussen 37 en 50 graden Celsius) en concentratie uitgevoerd worden.

“Het blijft een ingewikkeld proces.”

IgG eiwit (Immunoglobulin) Illustratie: RCSB PDG database

En alsof dat nog niet lastig genoeg is, gooien verontreinigingen ook nog eens roet in het eten waardoor er – ondanks nauwkeurig ingestelde temperatuur en concentratie – toch geen kristalvorming optreedt van het gewenste type. Iedere component in de soep van voedingsstoffen en bijproducten kan in principe de kristalvorming verstoren. Verder onderzoek moet duidelijk maken welke stof daarvoor verantwoordelijk is. Ondanks de deelname in het patent heeft dsm nog wel wat reserves bij het continue proces. Volgens Van de Sandt zijn eerst langdurige tests met pilot plants nodig om de betrouwbaarheid van het proces te beproeven. Daarnaast bestaat er een verhoogd besmettingsgevaar voor de micro-organismen, doordat het voedingsmedium telkens terugvloeit naar de fermentor. Van der Wielen verwacht dat continue productie vooral voor bulkproductie van bioplastics en biobrandstoffen interessant zal zijn, vanwege de >> 8•4

Delft Integraal

[ in ]onderzoek

is voor een deel terug te voeren op traditie, vertelt María Cuéllar Soares. Niettemin is een continu proces bijna altijd goedkoper. Het is dan ook geen wonder dat industrieën als dsm en Organon vanaf het begin betrokken zijn geweest bij het promotieonderzoek van de Colombiaanse procesontwerpster. Een onderzoek dat mede gefinancierd werd door stw en nwo. Voor TU-alumnus dr.ir. Emile van de Sandt (competence manager downstream processing bij dsm) die het onderzoek van Cuéllar begeleidde, is de belangrijkste motivatie voor het onderzoek het voorkomen van ‘productinhibitie’. “We kunnen de beestjes zo goed dresseren”, vertelt hij, “dat ze hogere output leveren van het gewenste product. Maar door die hogere concentraties treedt inhibitie op (de beestjes vergiftigen zichzelf als het ware, red.) en stopt de productie. Als je tijdens de fermentatie het product uit

25

[ in ]onderzoek

Biotechnologe dr.ir. María Cuéllar Soares:

“Productie verloopt in de biotechnologie bijna altijd met bakken tegelijk.”

26

mogelijk lagere kostprijs. Hij denkt dat de farmaceutische industrie veel minder geïnteresseerd zal zijn, vanwege de grote ervaring met batch-productie en de hoge eisen aan zuiverheid in die branche. Zuiver spel “De productie van eiwitten is het probleem niet meer”, stelt TU-alumnus dr.ir. Tangir Ahamed. “Maar de concentratie is meestal laag (typisch 0,1 milligram per milliliter) en er zijn tal van andere eiwitten in de oplossing die er veel op lijken. Bovendien zijn de biomoleculen vaak niet erg stabiel.” De Bangladeshi Ahamed, nu werkzaam bij het biofarmaceutisch bedrijf SynCo Biopartners, stelt daarom dat onttrekking en zuivering van (medicinale) eiwitten momenteel de grootste uitdaging is. Hij kijkt er erg helder bij en glimlacht veel. In vakkringen staat de winning van producten bekend als downstream processing. Als voorbeeld van farmaceutische eiwitten noemt Ahamed de vervaardiging van monoklonale antilichamen. Dat zijn eiwitten die zich specifiek hechten aan bepaalde cellen. Dat biedt nieuwe perspectieven voor de behandeling van kanker, reuma en tal van andere ziekten. In zijn proefschrift ‘High Troughput Technologies for Bioseparation Process Development’ constateert Ahamed dat de scheidingstechnologie van eiwitten nog vrij traditioneel verloopt, gebaseerd op ervaring en het uitproberen van verschillende mogelijkheden. “Ze kiezen gewoon op gevoel een bepaalde mogelijkheid en kijken wat eruit komt.” Het gevolg is dat het ontwikkelen van een 8•4

Delft Integraal

biotechnologisch scheidingsproces lang duurt en dat resultaat meestal niet optimaal is, aldus Ahamed. “Er bestaat nog steeds geen algemene strategie om biotechnologisch geproduceerde moleculen te kunnen zuiveren”, schrijft hij. Daar willen Ahamed en zijn begeleiders dr. Marcel Ottens en prof. Van der Wielen verandering in brengen. Wat hij voorstelt komt neer op een rationalisatie van het zuiveringsproces. Niet langer gebaseerd op ervaring, vuistregels en uitproberen, maar op een biochemische analyse van wat er allemaal in de soep ronddrijft. “Het ambitieniveau is echt heel hoog”, reageert Emile van de Sandt (dsm) desgevraagd. “Wat Ahamed voorstelt is bijna een droom: je hebt een fermentatiepotje. De inhoud sample je met een high throughput-apparaat (een apparaat dat geautomatiseerd veel parallelle tests kan uitvoeren, red.) Het apparaat analyseert dan de samenstelling van je mengsel, kijkt naar de eigenschappen van de componenten en ontwikkelt daaruit het ultieme zuiveringsproces. Dat is uiteindelijk de bedoeling.” Ahamed wil de link leggen tussen de eigenschappen van de fermentatiemix en het scala aan scheidingstechnieken dat voorhanden is. De eigenschappen van het mengsel karakteriseert Ahamed met acht tot tien parameters. “In een bioreactor zitten veel verschillende eiwitten, wij willen er maar eentje”,

‘Kostenbesparing klinkt banaal maar is belangrijk, zeker als het om bulkhoeveelheden gaat’ zegt hij. “Ik bepaal van de verschillende eiwitten de concentratie, de grootte en de identiteit. In ongeveer twee weken tijd heb ik alle waarden binnen voor een complete karakteristiek. Daaruit bepaalt mijn computermodel het beste scheidingsproces. Twee weken lijkt een lange tijd, maar in de farmacie duurt dat meestal een jaar.” Emile van de Sandt daarover: “Naarmate je de samenstelling van je mengsel beter kent, kun je aan de hand daarvan zeggen: dan kies ik die pH (zuurgraad, red.) en die hars om aan te binden, bij die geleidbaarheid. Dan bindt mijn hoofdcomponent en dan loopt de rest door. Dat is het idee. Maar het blijft een ingewikkeld proces.” Miniaturisatie, parallellisatie en rationalisatie. Zijn het academische aangelegenheden of slaat de

‘Er bestaat nog steeds geen algemene strategie om biotechnologisch geproduceerde moleculen te kunnen zuiveren’

systemen op de markt, schat hij. De eerste zaken zijn er al, zoals een chromatografische chip waarmee het gewicht van een eiwit te bepalen is. De rest zal wel komen. Van de Sandt (dsm) is voorzichtiger. “Ik zie dat nog niet binnen een paar jaar landen,” zegt hij. Dat neemt niet weg dat bepaalde technieken die Ahamed ontwikkelde al wel uitgetest worden bij dsm. “Ik denk dat miniaturisatie en parallellisatie voor de industrie absoluut van belang zijn”, zegt Van de Sandt. “Maar de nieuwe methoden moeten wel tijdwinst op gaan leveren in vergelijking met traditionele methoden van procesontwikkeling.” En daarmee slaat hij de spijker natuurlijk op z’n kop.

<< Meer informatie: prof.dr.ir. Luuk van der Wielen, bioscheidingstechnologie tel: +31 (0)15 27 82361 [email protected] prof.dr.ir Sef Heijnen, bioprocestechnologie tel: +31 (0)15 27 82341 [email protected] dr.ir. Marcel Ottens (onderzoekleider microbiosystems)

Tangir Ahamed twijfelt er niet aan dat bedrijfs­ laboratoria systemen zullen aanschaffen met microbioreactoren met daaraan gekoppeld snelle biochemische analyseapparatuur om hun processen te verbeteren. Over een jaar of vijf zijn zulke

Tel: +31 (0)15 2782151 [email protected] dr.ir. Adrie Straathof (onderzoeksleider bioprocesintegratie) Tel: +31 (0)15 2782330 [email protected]

[ in ]onderzoek

nieuwe biotechnologie ook aan bij de industrie? Naarmate de industrie zich meer richt op biologische grondstoffen, verwacht Van der Wielen meer belangstelling voor het zo efficiënt mogelijk maken van biotechnologische productieprocessen. De universiteit loopt daarbij soms ver voor de troepen uit met exploratief onderzoek, zoals genetisch onderzoek van micro-organismen, de ontwikkeling van een microbiochip om alle ins en outs van de beestjes te kunnen bestuderen, en de ontwikkeling van geavanceerde microscopische technieken.

Onderzoeker Kader Deshpande laat vloeistof door een chip stromen.

8•4

Delft Integraal

27