INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM MOHOU VIBRACE ŘÍCI O (BIO)MOLEKULÁCH
Vladimír Baumruk Univerzita Karlova v Praze Matematicko-fyzikální fakulta Fyzikální ústav UK
Metody
vibrační spektroskopie ¾
infračervená spektroskopie (IČ)
¾
Ramanova spektroskopie (RS)
2
Vibrační spektroskopie – princip CO2
- lineární molekula (O=C=O) se středem symetrie
n = 3 ⇒ 3n – 5 = 4
⇒ 2 valenční vibrace ⇒ nesymetrická ⇒ aktivní v IČ ⇒ symetrická ⇒ aktivní v RS ⇒ 2 deformační vibrace (degenerované) ⇒ aktivní v IČ
střed symetrie ⇒ alternativní zákaz vibrace aktivní v IČ spektru nejsou aktivní v Ramanově spektru a vice versa (tedy komplementarita IČ a Ramana)
frekvence vibrace f – silová konstanta (síla vazby) μ – redukovaná hmotnost
3
Vibrační spektroskopie – princip CO2
- lineární molekula (O=C=O) se středem symetrie
n = 3 ⇒ 3n – 5 = 4
⇒ 2 valenční vibrace ⇒ nesymetrická ⇒ aktivní v IČ ⇒ symetrická ⇒ aktivní v RS ⇒ 2 deformační vibrace (degenerované) ⇒ aktivní v IČ
střed symetrie ⇒ alternativní zákaz vibrace aktivní v IČ spektru nejsou aktivní v Ramanově spektru a vice versa (tedy komplementarita IČ a Ramana)
frekvence vibrace f – silová konstanta (síla vazby) μ – redukovaná hmotnost
4
Vibrační spektroskopie – princip
hν R = hν0 ± ( E 2 − E1 ) Ramanův posuv νvib = ν0-νR
⇒ vibrace aktivní v IČ spektru (změna dipólového momentu) ⇒ vibrace aktivní v Ramanově spektru (změna polarizovatelnosti) 5
Vibrační spektroskopie – spektra IČ
intenzita rozptylu
propustnost (%)
daleká IČ (FIR)
Raman
vlnočet (cm-1)
Infračervené absorpční a Ramanovo spektrum kyseliny benzoové
6
Jednoduché molekuly – symetrie a vibrace (příklad CCl4)
ν2 214 cm-1 2x degenerovaná
ν4 313 cm-1 3x degenerovaná
ν1 460 cm-1 plně symetrická
ν3 780 cm-1 3x degenerovaná
polarizované spektrum
infračervená absorpce
depolarizované spektrum
vlnočet (cm-1 ) 7
Detailní pohled na ν1 pás v Ramanově spektru CCl4 C
35Cl 37Cl 2 2
C 35Cl337Cl C 35Cl4 ν1 - symetrická valenční vibrace
C 35Cl 37Cl3
vlnočet (cm-1)
Izotopické štěpení díky existenci dvou stabilních izotopů 35Cl a 37Cl (jednotlivé komponenty odpovídají různému zastoupení těchto dvou izotopů v molekule CCl4)
8
Vyzařování oscilujícího dipólu
směr šíření
Oscilující elektrický dipól
Úhlové rozdělení amplitudy E (---) a zářivosti I ( ) oscilujícího elektrického dipólu.
9
Rozptyl
(a)
(b)
Rozptyl lineárně polarizovaného světla molekulou
10
Rozptyl
Rozptyl nepolarizovaného světla molekulou 11
Polarizovaný Ramanův rozptyl Depolarizační poměr
tenzor polarizovatelnosti
3β (α ) I ρ= ⊥= I & 45α 2 + 4 β (α ) 2 2
IG μ = αE G
izotropní invariant
1 3
α = ααα β (α ) = 2
1 ( 3ααβ ααβ − αααα ββ ) 2
anizotropní invariant Totální spektrum I tot = I & + I ⊥ = 45α 2 + 7 β (α )
Měření polarizovaných Ramanových spekter v pravoúhlé geometrii experimentu
2
12
x(yz)y
monokrystal síranu adeninu
x z rozptyl
y
y
excitace
y(xz)x
Polarizovaná Ramanova spektra orthorombického monokrystalu z
rozptyl
x z
z(xy)x
excitace
y
Portova notace x(yy)z
rozptyl
x excitace
y
y(zz)x
z rozptyl
x x
x(yy)z
excitace
y rozptyl
z z
excitace
z(xx)y
x rozptyl
y excitace
T=300K oblast vnitromolekulárních vibrací 13
x
monokrystal síranu adeninu
y
rozptyl
z
x(zx)z
Polarizovaná Ramanova spektra orthorombického monokrystalu
excitace
x y
rozptyl
z
bez analyzátoru
y
bez analyzátoru
x(zx+zy)z excitace
x y
x(zy)z
rozptyl
z excitace
z x
rozptyl
z(yx+yz)y excitace
z x
z(zy)y
rozptyl
y excitace
T=10K nízkofrekvenční oblast (mezimolekulární vibrace) 14
15
16
ρ′ = I p
(I
p
+ Ia )
ρ = ρ ′ ⎡⎣ ρ ′ + y ( 1 − ρ ′ ) ⎤⎦ y = 0.88
pás polykrystalické komponenty pás amorfní komponenty
Dvoufázový systém - mikrokrystalický křemík v amorfní matrici Tsu et al. Appl. Phys. Lett. 40, 534 (1982)
17
Proč vibrační spektroskopie ?
9 strukturní informaci lze získat v relativně krátkém čase (proto nachází využití například v proteomice) 9 neomezuje se pouze na statický obrázek (citlivost ke změnám, možnost dynamických studií) 9 velikost studovaných molekul a povaha okolního prostředí nepředstavují žádné omezení (a nebo jen výjimečně) 9 je to mimořádně vhodná metoda pro zkoumání vztahu mezi strukturou a funkcí biomolekul
18
Výhody vibrační spektroskopie ¾
RS a IČ jsou nedestruktivní metody (možnost testování biologické aktivity po skončení měření).
¾
Aplikovatelné na vzorky libovolné morfologie (roztoky vodné i nevodné, suspenze, precipitáty, gely, vrstvy, vlákna, prášky, monokrystaly, …). Pro biomolekuly lze tak ověřit nakolik se shoduje či naopak odlišuje jejich struktura v krystalu a v roztoku.
¾
Nenáročné na objem vzorku (cca 10 ml pro konvenční RS, 20 ml pro IČ).
¾
Rychlá časová škála absorpce i rozptylu (≈ 10-15 s) - využití vibrační spektroskopie pro časově rozlišené studie procesů, které nejsou přístupné pomocí fluorescence či NMR.
¾
Existence rozsáhlé databáze IČ a Ramanových spekter (včetně přiřazení pásů jednotlivým vibracím a známých strukturně-spektrálních korelací).
19
Specifické výhody Ramanovy spektroskopie ¾
Voda představuje ideální rozpouštědlo pro Ramanovu spektroskopii (na rozdíl od IČ).
¾
Intenzívní pásy v Ramanových spektrech pocházejí od vibrací, při kterých dochází k velké změně polarizovatelnosti (např. aromatické molekuly).
¾
Relativně snadné měření i v oblasti nízkých vlnočtů (pod 400 cm-1, daleká IČ oblast) v jediném experimentu se základní oblastí
¾
Selektivní rezonanční zesílení (tzv. rezonanční Ramanův jev).
¾
Povrchem zesílený Ramanův rozptyl (SERS) (design SERS aktivního povrchu spadá do oblasti nanotechnologií)
20
Nevýhody vibrační spektroskopie ¾
Spektrální rozlišení je sice vyšší než v elektronových spektrech, ale nižší ve srovnání s NMR. Nedostatečné rozlišení může být částečně kompenzováno chemickou (izotopická záměna) nebo biologickou (bodová mutace) modifikací.
¾
Jsou potřeba relativně vysoké koncentrace vzorku (≈ 10-100 μg/μl) byť v malých objemech.
¾
Jak H2O tak i D2O nejsou ideálním rozpouštědlem pro IČ spektroskopii (na rozdíl od Ramanova rozptylu).
¾
Ramanův jev (nepružný rozptyl světla) je ze své podstaty slabý jev (ve srovnání s absorpcí nebo emisí světla). Je tedy nutná značná čistota vzorků a péče při manipulaci s nimi (velmi vadí fluorescence příměsí).
21
