INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM MOHOU VIBRACE ŘÍCI O (BIO)MOLEKULÁCH
Vladimír Baumruk
Seminář BCM094 „Úvod do problémů současné biofyziky“
Metody
vibrační spektroskopie ¾
infračervená spektroskopie (IČ)
¾
Ramanova spektroskopie (RS)
vibrační optická aktivita (VOA) ¾
vibrační cirkulární dichroismus (VCD)
¾
Ramanova optická aktivita (ROA)
2
Vibrační spektroskopie – princip CO2
- lineární molekula (O=C=O) se středem symetrie
n = 3 ⇒ 3n – 5 = 4
⇒ 2 valenční vibrace ⇒ nesymetrická ⇒ aktivní v IČ ⇒ symetrická ⇒ aktivní v RS ⇒ 2 deformační vibrace (degenerované) ⇒ aktivní v IČ
střed symetrie ⇒ alternativní zákaz vibrace aktivní v IČ spektru nejsou aktivní v Ramanově spektru a vice versa (tedy komplementarita IČ a Ramana)
frekvence vibrace f – silová konstanta (síla vazby) μ – redukovaná hmotnost
(průměrně velký protein má přibližně 20 000 vibračních stupňů volnosti !!!) 3
Vibrační spektroskopie – princip
hν R = hν0 ± ( E 2 − E1 ) Ramanův posuv νvib = ν0-νR
⇒ vibrace aktivní v IČ spektru (změna dipólového momentu) ⇒ vibrace aktivní v Ramanově spektru (změna polarizovatelnosti) 4
intenzita rozptylu
propustnost (%)
Vibrační spektroskopie – spektra
IČ
daleká IČ
Raman
Infračervené absorpční a Ramanovo spektrum kyseliny benzoové
5
Jednoduché molekuly – symetrie a vibrace (příklad CCl4)
ν2 214 cm-1 2x degenerovaná
ν4 313 cm-1 3x degenerovaná
ν1 460 cm-1 plně symetrická
ν3 780 cm-1 3x degenerovaná
polarizované spektrum depolarizované spektrum
6
Detailní pohled na ν1 pás v Ramanově spektru CCl4 C
35Cl 37Cl 2 2
C 35Cl337Cl C 35Cl4 ν1 - symetrická valenční vibrace
C 35Cl 37Cl3
Izotopické štěpení díky existenci dvou stabilních izotopů 35Cl a 37Cl (jednotlivé komponenty odpovídají různému zastoupení těchto dvou izotopů v molekule CCl4)
7
Proč vibrační spektroskopie ?
9 strukturní informaci lze získat v relativně krátkém čase (proto nachází využití například v proteomice) 9 neomezuje se pouze na statický obrázek (citlivost ke změnám, možnost dynamických studií) 9 velikost studovaných molekul a povaha okolního prostředí nepředstavují žádné omezení (a nebo jen výjimečně) 9 je to mimořádně vhodná metoda pro zkoumání vztahu mezi strukturou a funkcí biomolekul
8
Výhody vibrační spektroskopie ¾
RS a IČ jsou nedestruktivní metody (možnost testování biologické aktivity po skončení měření).
¾
Aplikovatelné na vzorky libovolné morfologie (roztoky vodné i nevodné, suspenze, precipitáty, gely, vrstvy, vlákna, prášky, monokrystaly, …). Pro biomolekuly lze tak ověřit nakolik se shoduje či naopak odlišuje jejich struktura v krystalu a v roztoku.
¾
Nenáročné na objem vzorku (cca 10 μl pro konvenční RS, 20 μl pro IČ).
¾
Rychlá časová škála absorpce i rozptylu (≈ 10-15 s) - využití vibrační spektroskopie pro časově rozlišené studie procesů, které nejsou přístupné pomocí fluorescence či NMR.
¾
Existence rozsáhlé databáze IČ a Ramanových spekter (včetně přiřazení pásů jednotlivým vibracím a známých strukturně-spektrálních korelací).
9
Specifické výhody Ramanovy spektroskopie ¾
Voda představuje ideální rozpouštědlo pro Ramanovu spektroskopii (na rozdíl od IČ).
¾
Intenzívní pásy v Ramanových spektrech pocházejí od vibrací, při kterých dochází k velké změně polarizovatelnosti (např. aromatické molekuly).
¾
Relativně snadné měření i v oblasti nízkých vlnočtů (pod 400 cm-1, daleká IČ oblast)
¾
Selektivní rezonanční zesílení (tzv. rezonanční Ramanův jev).
¾
Povrchem zesílený Ramanův rozptyl (SERS)
10
Nevýhody vibrační spektroskopie ¾
Spektrální rozlišení je sice vyšší než v elektronových spektrech, ale nižší ve srovnání s NMR. Nedostatečné rozlišení může být částečně kompenzováno chemickou (izotopická záměna) nebo biologickou (bodová mutace) modifikací.
¾
Jsou potřeba relativně vysoké koncentrace vzorku (≈ 10-100 μg/μl) byť v malých objemech.
¾
Jak H2O tak i D2O nejsou ideálním rozpouštědlem pro IČ spektroskopii
(na rozdíl od Ramanova rozptylu). ¾
Ramanův jev (nepružný rozptyl světla) je ze své podstaty slabý jev (ve srovnání s absorpcí nebo emisí světla). Je tedy nutná značná čistota vzorků a péče při manipulaci s nimi (velmi vadí fluorescence příměsí).
11
Vibrační konformační markery Pásy ve vibračním spektru představují detailní a jedinečný „otisk prstu“
dané molekuly.
Složité molekuly ⇒ vibrační módy a jim příslušející spektrální pásy
nemohou být přímo přiřazeny souřadnicím výchylek atomů ani z nich jednoduše vypočítány. ⇒ vibrační spektrum nelze použít pro výpočet struktury.
⇒ Vibrační spektrum daného strukturního motivu nemůže sloužit jako „otisk prstu“ této struktury dokud s ní není korelováno pomocí nezávislé metody. ⇒ Jako základ pro stanovení takové korelace zpravidla slouží struktury určené pomocí difrakčních nebo NMR metod. ⇒ Každý pás ve spektru odpovídá vibraci specifické skupiny atomů (tzv. normální vibrační mód) s dobře definovanými geometrickými charakteristikami (délka vazby, vazebné úhly, atd.) ⇒ správně přiřazený pás může sloužit jako jednoznačný indikátor (strukturní marker) tohoto strukturního rysu. 12
Vibrační strukturní markery Ve vibračních spektrech nukleových kyselin rozlišujeme dva základní typy strukturních markerů: ¾ nukleosidové konformační markery jako indikátory konformace cukru a torze glykosylu citlivé k torzním úhlům δ (C2´-endo nebo C3´-endo konformace cukru) a χ (anti nebo syn orientace báze) ¾ páteřní konformační markery jako indikátory fosfodiesterové torze citlivé k torzním úhlům α a ξ popisujícím rotaci kolem esterových vazeb 5´O-P a 3´O-P)
Ve vibračních spektrech proteinů rozlišujeme řadu strukturních markerů, které jsou citlivými indikátory bezprostředního okolí postranních řetězců, jejich interakce s ním a konformace (Trp, Tyr, Cys). Pásy amidu I, II a III jsou citlivými indikátory sekundární struktury. 13
Kanonické struktury DNA
Obrázky skeletu B-DNA, A-DNA, a Z-DNA. Každé vlákno B-DNA a A-DNA obsahuje 20 nukleotidů stejné sekvence. Z-DNA je tvořena alternujícími GC páry.
B-DNA C2’ endo/anti
A-DNA C3’ endo/anti
Z-DNA C2’ endo/anti (pyrimidiny) C3’ endo/syn (puriny) 14
Kanonické struktury DNA
Deoxyguanosine v B-DNA
C2´endo Sugar Pucker Deoxyguanosine v Z-DNA
A.
Poloha osy helixu (+) v rovině páru bazí pro B-DNA, A-DNA a Z-DNA.
B.
Konformace nukleosidů v kanonických DNA strukturách. Nahoře: C2’ endo pucker s anti torzí glykosylu vyskytující se u všech reziduí v B-DNA a u pyrimidinových reziduích v Z-DNA. Diagram také ilustruje páteřní (α, β, γ, δ, ε, ζ) a glykosylové torzní úhly (χ). Dole: C3’ endo/syn vyskytující se v purinových reziduích v Z-DNA. V A-DNA všechna rezidua zaujímají C3’ endo sugar pucker s anti glykosylovou torzí.
C3´endo Sugar Pucker
15
Spektra kanonických struktur DNA
Ramanova spektra krystalů A-, B-, a Z-DNA. Označeny jsou nukleosidové a páteřní konformační markery.
16
Určení struktury RNA·DNA hybridu v roztoku
A·B hybrid B-form A-form
A-form
Ramanova spektra A. B. C. D.
poly(rA).poly(dT), pH 7.5 v 0.1 M NaCl (A·B hybridní struktura) poly(dA-dT).poly(dA-dT), pH 7.5 v 0.1 M NaCl (B-form) poly(dA-dT).poly(dA-dT) fiber při 75% RH (A-form) poly(rA).poly(dT) fiber při 75% RH (A-form) 17
Interakce poly(rA) s poly(rU) v roztoku
Intensity (relative units)
200
0%A 5%A 10 % A 15 % A 20 % A 24 % A 30 % A 36 % A 42 % A 50 % A 56 % A 65 % A 75 % A 85 % A 95 % A 100 % A
Raman spectra of poly(rA)+poly(rU) mixtures
150
100
50
0 600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
1800
Raman shift (cm-1)
Soubor Ramanových spekter série vzorků poly(rA) a poly(rU) s postupně se měnícím poměrem A:U od čistého poly(rU) (červené) k čistému poly(rA) (fialové). Spektra byla normalizována a signál rozpouštědla byl odečten. 18
Interakce poly(rA) s poly(rU) Výsledky faktorové analýzy aplikované na první derivaci souboru Ramanových spekter směsi poly(rA) s poly(rU) s měnícím se poměrem A:U.
19
Interakce poly(rA) s poly(rU)
1.0
Relative fraction
Calculated fractions of species 0.8
single str. poly(rA) single stranded poly(rU) duplex poly(rA).poly(rU) triplex poly(rU).poly(rA).poly(rU)
0.6 0.4 0.2 0.0 60
1579
1305
1484 1509
1338
100
Absorbance / rel. units
20
1425
644
40
1177 1219 1252
811
60
1098
80
1008
727
100
80
0
0 220
1687 1627
240
260
wavelength / nm
280
300
Constructed UV abs. spectrum of poly(rU)
2
20 0
600
800
1000
1200
wavenumbers / cm -1
1400
1600
240
260
wavelength / nm
280
300
Constructed UV abs. spectrum of poly(rA).poly(rU)
1 0
1600
1576 1615 1670 1694 1729
1183
1091 1102
816 869 923 981 1006
632
727
782
Constructed RS of poly(rU).poly(rA).poly(rU)
1400
jednovláknová poly(rU), poly(rA).poly(rU) duplex a poly(rU):poly(rA)*poly(rU) triplex.
2
220
Absorbance / rel. units
1200
1480 1513
1000
wavenumbers / cm-1 1236
800
1262 1301 1348 1381
600
Absorbance / rel. units
1574 1622
1482 1510
1689
220
3
Byly identifikovány 4 složky: jednovláknová poly(rA)
1
1600
1338 1378
1302
919 985 1008
1232
784 814 630 647
80
1400
wavenumbers / cm-1
727
100
Intensity / rel. units
1
1600
1471
1397 1200
Constructed RS of poly(rA).poly(rU)
120
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
2
3
1092
998 1000
1101
Intensity / rel. units
1400
wavenumbers / cm-1
782 800
140
40
1200
Constructed UV abs. spectrum of poly(rA)
0
600
60
1000
Constructed RS of poly(rU)
643
Intensity / rel. units
220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
800
1230
600
3
Absorbance / rel. units
40
poly(rA) content / %
Constructed RS of poly(rA)
120
918
Intensity / rel. units
140
20
1379
0
3
240
260
wavelength / nm
280
300
Byla izolována spektra čistých komponent
Constructed UV abs. spectrum of poly(rU)poly(rA).poly(rU)
2 1 0 220
240
260
wavelength / nm
280
300
20
Vibrační spektroskopie proteinů
IČ spektrum proteinu v H2O (tučně) a D2O (slabě). Tloušťka kyvety byla cca 6 μm (H2O) respektive 20 μm (D2O).
21
Vibrační spektroskopie proteinů Ramanovo spektrum (R2R3) fragmentu proteinu c-Myb
200
540
400
677 643
200
νS-H
823 (Y) 759 (W18)
400
600
cysteine
876 (W17) 853 (Y)
600
1060 1011 (W16)
800
amide III 1175 δCH3 1126 (W13)
800
amide I
c-Myb(R2R3) fragment
1267
1000
1360 (W7) 1340 δCH2+ W7
1000
1461 δCH3 1446 δCH2
1200 1553 (W3)
1200
1654
1400
1621 (W1) 1579 (W2)
1400
2554
Raman intensity
(minimální sekvence pro specifickou vazbu k cílové sekvenci DNA)
0
0 2600
2400
-1
wavenumber (cm )
1600
1400
1200
1000
-1
800
600
wavenumber(cm )
Fragment c-Myb(R2R3) obsahuje 6 tryptofanů (3 v R2 i R3), 2 tyrosiny (1 v R2 i R3), a 1 cystein (v R2). Jejich pásy v Ramanově spektru dominují. 22
Ramanova a rezonanční Ramanova spektroskopie Volba excitace ⇒ selektivita !!! Rezonance s aromatickými zbytky (229 nm) – spektru dominují pásy Trp (W) a Tyr (Y) proteinových podjednotek
Nerezonanční excitace (514,5 nm) – spektru dominují pásy proteinových podjednotek obálky viru (tvoří cca 88% hmotnosti viru)
Phe
Rezonance s virovou DNA (257 nm ) spektru dominují pásy bazí jednovláknové DNA (A,G,T,C)
G @ 668 cm-1 ⇒ 3´endo/anti (A marker) amid I @ 1651 cm-1 ⇒ α helix Ramanova spektra (600-1800 cm-1) fd viru excitovaná 514.5 nm (dole, 50 mg/mL), 257 nm (uprostřed, 0.5 mg/mL) a 229 nm (nahoře, 0.5 mg/mL). 23
Vibrační spektroskopie a struktura peptidů a proteinů
Schematické znázornění vibračních módů amid I, amid II a amid III v molekule N-methylacetamidu, modelu peptidové skupiny v trans konformaci. Jejich frekvence odrážejí strukturu polypeptidového řetězce (NH2-CαHR1-CO-NH-CαHR2-CO-) nezávisle na typu postranního řetězce (R1, R2, …).
24
Vibrační spektroskopie a struktura proteinů Distribuce sekundárních struktur v referenčním souboru 19 proteinů (v % zastoupení jednotlivých konformací). Kabsch a Sander
sekundární struktura
helix
β-struktura
obrátka
ohyb
ostatní
minimum
0
0
6,9
1,9
11,1
maximum
77,1
47,7
20,9
20,5
33,0
střední hodnota
26,7
23,1
12,8
13,7
23,7
směrodatná odchylka
20,4
14,5
3,8
4,8
5,9
FT- IČ spektra
diferenční FT- IČ spektra
0.3
VCD spektra
0.2
0.8
5
ΔA x10
0.4
5
0.1
0.6
ΔA
absorbance
1.0
0.0 -0.1
0.2
-5
-0.2
0.0
0
-0.3 1700
1650
1600
1550
vlnočet (cm-1)
1500
1700
1650
1600
1550
vlnočet (cm-1)
1500
1700
1650
1600
1550
1500
vlnočet (cm-1)
Tvarová variabilita FT-IČ (vlevo), diferenčních FT-IČ (uprostřed) a VCD (vpravo) spekter referenčního souboru 19 proteinů v H2O v oblasti amidu I a II. FT-IČ spektra jsou normalizována na Amax = 1 amidu I. Diferenční spektra byla získána odečtením průměrného FT-IČ spektra referenčního souboru od jednotlivých spekter. 25
Stabilita proteinů (folding ↔ unfolding) WT (přirozený)
mutant (Pro → Ala)
26
Vibrační spektroskopie a počítačové modelování proteinů
27
Vazba progesteronu s orosomukoidem
Vlevo: kyselý α1-glykoprotein (orosomukoid) v nativním stavu. Vpravo: vazba progesteronu vede k transformaci α-helikálního segmentu ve smyčce nad β-barelem na antiparalelní β-strukturu (označeno šipkou). 28
Side-Chain Conformations and Local Environments Cysteine
S-H stretching vibration (2500 - 2600 cm-1)
Dependence of the Raman S-H frequency and bandwidth on hydrogen bonding
Raman spectrum (670-2800 cm-1) of the P22 trimeric tailspike protein at 10°C. The inset at upper right, which shows an amplification of the spectral interval 2480-2620 cm-1, exhibits the composite S-H stretching profile (bands at 2530, 2550, 2565 and 2585 cm-1) of the eight cysteine residues per unit. The data are not corrected for solvent contribution. From Raso et al. J. Mol. Biol. 307 (2001) 899. 29
Side-Chain Conformations and Local Environments Cysteine
Spectral contributions and hydrogen-bond strengths of cysteine sulfhydryl groups of the native P22 tailspike protein
S-H Raman signatures (2480-2630 cm-1) of tailspike cysteine residues
A.
The Raman S-H profiles observed for the wild-type tailspike and for each of eight Cys → Ser mutants, as labeled.
B.
Raman difference spectra computed as mutant minus wild-type, for each of the eight Cys → Ser mutants. In each trace, the S-H Raman signature of the mutated Cys site is revealed as a negative band. 30
Vibrační optická aktivita - princip pro molekulu (+)
ΔI = I R (+ ) − I L ( + )
pro molekulu (-)
−ΔI = I R (−) − I L(−)
20
L-Alanyl-L-Alanin
ROA
-5
I -I (x10 )
10
R L
0 -10 -20
D-Alanyl-D-Alanin
Raman
-8
40
R
I +I (x10 )
60
L
80
20
L-alanyl-L-alanin (+)
D-alanyl-D-alanin (-)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
-1
vlnočet (cm )
31
Vibrační optická aktivita (VOA) ¾ diferenční metoda – měříme rozdílnou odezvu chirální molekuly vůči pravo- a
levotočivě kruhově polarizovanému záření,
¾ spojuje stereochemickou citlivost konvenční optické aktivity s vyšším rozlišením a tudíž i bohatším strukturním obsahem a konformační citlivostí vibrační spektroskopie, ¾ v případě konformačně flexibilních molekul můžeme pomocí VOA rozlišit konformace, jež jsou stabilní z hlediska časové škály vibračních pohybů (na rozdíl od NMR, kde díky pomalejší časové škále (v porovnání s konformační konverzí) může dojít k vyrušení strukturních rysů, je vibrační spektrum váženým průměrem spekter jednotlivých konformerů).
¾
vibrační cirkulární dichroismus (VCD)
¾
Ramanova optická aktivita (ROA) 32
ROA – základní aplikace
¾ stanovení absolutní konfigurace bez krystalizace
33
ROA – určení absolutní konfigurace Chirálně deuterovaný neopentan
vlnočet (cm-1)
(R)-[2H1, 2H2, 2H3]-neopentan
vlnočet (cm-1)
Ramanova a ROA spektra (R)-[2H1,2H2,2H3]-neopentanu. Dvě horní křivky ukazují změřená spektra. Spodní křivky ukazují jednotlivá vypočítaná spektra devíti rotamerů R1 to R9 a zprůměrované spektrum směsi všech rotamerů. Haesler et al., Nature 446, 526 (2007).
34
ROA – základní aplikace
¾ stanovení absolutní konfigurace bez krystalizace ¾ přímé měření enantiomerního přebytku bez nutnosti separace enantiomerů
35
Měření enantiomerní čistoty ROA
f EE =
enantiomerní čistota
1.0
0.5
[%]
Lineární regrese 0.4
from ROA data
R = 0.99912
0.0 0.2
score Vi1
( IR-IL) x 10-6
c R − cS c R + cS
-0.5
0.0
-0.2
-1.0 -0.4 -100
-50
0
50
100
enantiomeric excess (%)
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
-1
-1)] wavenumber [cm vlnočet (cm
Soubor ROA spekter 19 vzorků trans-pinanu o různé enantionerní čistotě. J. Hrudíková, Bakalářská práce (2007).
36
ROA – základní aplikace
¾ stanovení absolutní konfigurace bez krystalizace ¾ přímé měření enantiomerního přebytku bez nutnosti separace enantiomerů
¾ určení konformace biologických molekul v roztoku (proteinů, nukleových kyselin, cukrů, virů …)
37
Simulace Ramanových a ROA spekter (1S)-(-)-α-pinene
exp
exp
ROA a Ramanova spektra (1S)-(-)-a-pinenu: (a) zjednodušený (tzv. polární) a (b) konvenční model výpočtu ROA intenzit, (c) experimentální ROA spektrum, (d) simulované a (e) experimentální Ramanovo spektrum. 38
Ramanova optická aktivita peptidů PLP in TFE
ROA spektra poly-L-prolinu v TFE
PLP in H2O
I -I
R L
ROA spektra poly-L-prolinu ve vodě
hinge peptide in H2O
200
500
800
1100
1400
ROA spektra hinge peptidu, paralelního dimeru oktapeptidu Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro ve vodě
1700
wavenumber (cm-1)
39
ROA proteinů X-ray PDB: 69,2% α-helix
valenční vibrace skeletu
1,7% 310-helix
(νCα-C, νCα-Cβ, νCα-N) ~ 870 – 1150 cm-1 rozšířená oblast amidu III (νCα-N, + δN-H a δCα-H) ~ 1230 – 1340 cm-1 oblast amidu I (νC=O)
Amid III
Amid I
43,5% β-list 1,7% α-helix 1.3% 310-helix
~ 1630 – 1700 cm-1
28,7% α-helix 10,9% 310-helix 6,2% β-list
40
ROA proteinů – PCA (Principal Component Analysis) disorder
order
α-helix
β-list 41
L-Alanine
¾ the simplest amino acid ¾ ideal benchmark system for studying:
conformational behavior interaction with solvent
42
L-Alanine – potential energy surface 1D scan B3LYP/6-31G** B3LYP/6-311G** B3LYP/6-31++G**
2D scan
B3P86/6-31G** B3P86/6-311G** B3P86/6-31++G**
3 E (kcal/mol)
B3LYP/COSMO/6-31++G**
ϕ, ψ 0
2
ϕ (NH3+) ψ (COO-)
1
-30
0 60
90
120
150
180
60
90
χ (CH3)
E (kcal/mol)
150
180
45
90
χ (CH3)
8
ϕ, χ
ϕ (NH3+) χ (CH3)
-30
6 4
-60
2 0 -90
-45
0
45
90
-90
-45
ψ (COO-)
0 ψ (COO-)
3 E (kcal/mol)
120
Dependencies of molecular energy (E, left) and dihedral angles (right) on the angles ϕ, ψ, and χ. The remaining coordinates in the onedimensional scans were allowed to fully relax.
ψ, χ 0
2
ψ (COO-) χ (CH3)
-30 1 -60 0 0
30
60 ϕ (NH3+)
90
120
0
30
60 ϕ (NH3+)
90
120
Kapitán et al., J. Phys. Chem. 110 (2006) 4689
43
Mode number:
3 4
5
6
7
8
9
10 11 12,13
I +I
L
105 60 115 0
R R
L
(I - I ) × 10
4
0
400
1
Wavenumber
400 -60
Wavenumber 10
20
4 R
L
(I - I ) × 10
400
60
800
70
-15
60
70
-55
-30
25 -40
15
400
25 -25
60 -25
ψ (COO-)
-351600 45
COO-
25
85 10
65
25
-35
1200
R
I +I
4
15
1600
55 to 90 -90 to -30
60
1600
χ (CH3)
Wavenumber 175 128
0
L
30
30
1200
-60 15
800
L
70
0
60
35
20
25
Wavenumber -15
0
NH3+
1600 85
-40 to -90
-75
-65
10 -5
1200
70 -55
-80
R
I +I
L
-35
80
105
55
800 0
40
15
25
25 60
1200
20
20
R
115
70
5
4
(I - I ) × 10
10 75
85
60
-1
4
20,21 22,23 24 25,26
55
95
20
800
0
-1
17 18,19
25
25
60
1
16
ϕ (NH3+)
4
0
14,15
1
400
68
153
800
65 to 85 Wavenumber
128
1200
135
113
1600
85
CH3
88
0 -1
98 138
400
Kapitán et al., J. Phys. Chem. 110 (2006) 4689
800
113 140 180 105
1200 -1
Wavenumber (cm )
173
135
1600
44
L-Alanine
7 4
0 5
5
6
8
9
400
17
14
11 12,13
Wavenumber
15
1200
1600 D-Ala
17 18
14
4 8
16
9
-5
12,13
10
ROA 1600
Wavenumber
I +I
R
0 5
2,3
4
8
400
0
11 12,13
9 800
18 14
15 16
-5
14 Wavenumber 15
24 25,26 1600
23
17
16
12,13
800
19 20,21
18
10
400
17
1200
11
8 9
L-Ala
1200
7 4 5 6
22
20,21
80010
Calculation
19
L
3
R
23
0
400
(I - IL) × 104
20,21
24 25,26
15
11
800
Raman
22,23
-5
19 18
R
L
(I - I ) × 10
10
Experiment
22,23
2
L
(I + IR) × 10-9
¾ Raman and ROA spectra can be reliably interpreted if the movement of flexible molecular parts is considered
1200
22 19 20,21
1600
-1
Kapitán et al., J. Phys. Chem. 110 (2006) 4689
Wavenumber (cm )
45
Model dipeptides
There is a significant difference between Ala-Pro x Pro-Ala Gly-Pro x Pro-Gly
ROA (Raman) can directly reflect flexibility of the molecule
46
Model dipeptides rigidity Gly-Pro ψ
×ϕ
×
flexibility Pro-Gly ψ
ϕ
47
Hinge peptide and its analogs HINGE peptide is a fragment 225-232/225’-232’ from the core of human immunoglobulin IgG1. It acts in this parent molecule as a swivel point crosslinking two rather heavy peptide chains. Being a parallel dimer of the octapeptide H-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-OH (C2 symmetry). The sequence is rich in proline residues and is expected to be quite rigid also due to a presence of two disulphide bridges. The peptide offers several advantages for use as a universal carrier of various active sequences (immunologically neutral, possesses six independent terminal groups: -NH and -OH on Thr residues and C-terminal carboxyl). S-S bridged single thread hinge peptide tetrapeptide Met analog (double thread) (H-Gly-Cys-OH)2 T T
T
S Model of an entire human IgG1 molecule.1 1Padlan
E.A, Mol. Immunol. 31 (1994) 169.
48
0 200 400 600
wavenumber (cm ) -1
4
800 1000 1200 1400 1600 1800 -2 200 400
-1
(H-Gly-Cys-OH)2 600
wavenumber (cm )
-1
1606
1459
1327
1622
1481
1351
1195
1453
1205 1255
1612
-1
1683
1415
poly(L-Pro)
1162
1003
1643
1481
1282 1320
1193
938 976
1352
1162
892
1
1208
946 978
-2 924
3
1328 1393
-1 1000
1 900
(H-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-OH)2
1456
1258
1612 1683
1415
924
834
95
1643
1480
1283 1320 1352
1162 1193
981
659
523
212
1454
893 937
IR-IL (x10-6)
1655
1205
1004
322
δ(CH2)
-1
1182 1230
1
523
2
922
-3
1037
-2
970
Amide I
668
2 535
0 403
Amide I
327
8
325
4
145
10
IR-IL (x10-6)
12
220
115
6
1655
H-Thr-Met-Pro-Pro-Met-Pro-Ala-Pro-OH 1452
14
Amide I
IR-IL (x10-6)
2
δ(CH2)
2
1
834
(H-Gly-Cys-OH)2
Amide III
IR-IL (x10-6)
1633
poly(L-Pro) 1453
1252
657 ν(C-S)
510 ν(S-S)
(H-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-OH)2
1286
2 1685
0 δ(CH2)
IR+IL (x10-9) 6
667
1 501
IR+IL (x10-9)
4
ν(C-S)
6 510
IR+IL (x10-9)
0 16
ν(S-S)
IR+IL (x10-9)
8
0
0
H-Thr-Met-Pro-Pro-Met-Pro-Ala-Pro-OH
0
0
800 1000 1200 1400 1600 1800
49
