Spektroskopie v UV-VIS oblasti
UV-VIS spektroskopie pracuje nejčastěji v oblasti 200 - 800 nm • lze měřit i < 200 nm či > 800 nm UV
Ultra Violet
VIS
IR
VISible Infra Red
Roztok KMnO4 • roztok KMnO4 je červenofialový • odstín červenofialové závisí na koncentraci
c(KMnO4)
1
Proč je roztok barevný? • KMnO4 absorbuje doplňkovou barvu k červenofialové - zelenou (526 a 546 nm) 1.2
1
absorbance
0.8
vložit ukázku spektra KMnO4
0.6
0.4
0.2
0 250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
vlnová dé lka (nm )
Proč je roztok barevný?
Stavy atomů a molekul spin up = 1/2 down = - 1/2
elektronový obal elektony spin up, down orbitaly jádro spin = |n.up + m.down|
1 orbital = max. 2 elektrony (1 up, 1 down) 2.1/2 + 2.-1/2 = 0
2
Stavy atomů a molekul
s=0 singlet
s = 1/2 dublet
s=1 triplet
multiplicita stavu S = 2.s + 1 S=1
S=2
S=3
excitovaný stav vzbuzený stav S1 Excitace
Energie
Proč látka absorbuje? excitovaný singletový stav elektrony obsazují vyšší en. hladiny, porušuje se párování elektronů na hladinách
spin elektronů se při excitaci nemění rychlý proces (10-15 s) nemění se geometrie – vertikální přechod, Frank-Condonův princip UV-VIS spektroskopie se nazývá také elektronová spektroskopie
S0
světlo (energie) základní stav
singletový stav - všechny elektrony jsou spárovány
Excitace molekul
3
Typy přechodů u molekul
Absorpce světla
Absorbance a transmitance intenzita světla
I0
T= transmitance
I
I I0
A = − log T absorbance
4
Transmitance T nabývá hodnot od 0 do 1 (0 - 100 %) • bezrozměrná veličina • T=1 vzorek pro světlo dokonale propustný • T=0 vzorek světlo dokonale absorbuje
Absorbance A nabývá hodnot od 0 do ∞ • • • • • •
bezrozměrná veličina A = 0 vzorek neabsorbuje A = ∞ vzorek absorbuje vše s rostoucí koncentrací c, A roste s rostoucí délkou vzorku l, A roste ε je charakteristikou látky • c se udává v mol/dm3, l se udává v cm
Spektrum • závislost A na λ 1.2
1
absorbance
0.8
0.6
0.4
0.2
0 250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
vlnová dé lk a (nm )
Pozn. spektrum vodného roztoku KMnO4 (λmax 526 a 546 nm)
5
Spektrum • závislost A (T) na λ
1.2
120
absorbance
0.8
80
0.6
60
0.4
0
250
300
350
400
450
500
550
600
650
Abs %T
40
pík (peak) maximum
0.2
transmitance %
100
1
20
700
750
0
vlnová délka (nm)
Pozn. spektrum vodného roztoku methyloranže (λmax 465nm)
Absorbance a transmitance Krystalová violeť 0.7
120
0.6
100
absorbance
80 0.4 0.3
60
0.2 40
transmitance %
0.5
Abs %T
0.1 20
0 -0.1
0
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
vlnová délka (nm)
Proč je roztok barevný? KMnO4 absorbuje doplňkovou barvu k červenofialové - zelenou (526 a 546 nm) 1.2
1
absorbance
0.8
vložit ukázku spektra KMnO4
0.6
0.4
0.2
0 250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
vlnová dé lka (nm )
6
Doplňkové barvy
Doplňkové barvy Vlnové délky a barvy absorbovaného záření a příslušné doplňkové barvy (barvy roztoku) Absorbované Barva Barva doplňková záření (nm) absorbovaného záření (barva roztoku) 400-435 fialová žlutozelená 435-480 modrá žlutá 480-490 zelenomodrá oranžová 490-500 modrozelená červenooranžová 500-560 zelená purpurová 560-580 zelenožlutá fialová 580-595 žlutooranžová modrá 595-610 červenooranžová zelenomodrá 610-760 červená modrozelená
Roztok KMnO4 • roztok KMnO4 je červenofialový • odstín fialové závisí na koncentraci
c(KMnO4)
s rostoucí koncentrací c roste intenzita zbarvení, tedy roste i absorbance A
7
Spektrum krystalové violeti 0.7 0.6
koncentrace
absorbance
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 -0.1 250
350
450
550
650
750
vlnová délka (nm)
Vliv délky optické dráhy
S rostoucí délkou optické dráhy paprsku, tedy s širší kyvetou, roste i absorbance
Lambert-Beerův zákon
I0
I l
koncentrace c Lambert - Beerův zákon platí pro konstantní T, λ, ...
délka
A = clε koncentrace
molární absorpční koeficient platnost zákona je spolehlivě zajištěna v oblasti do cca A < 1-2
8
Lambert – Beerův zákon
Aλ = ε λ lc • s rostoucí koncentrací c, A roste • s rostoucí délkou vzorku l, A roste • ε je charakteristikou látky – konstanta (pro danou λ) c se udává v mol/dm3, l se udává v cm
Vícesložkový systém • za přítomnosti více složek platí n
A = l ∑ ε i ci i =1
• výsledná absorbance je součtem příspěvků všech složek v systému
Směsi A
Absorbance
B
λ1
λ2
bez překrytí pásů
Absorbance
A
B
λ1
λ2
s překrytím pásů
9
Schéma spektrometru
zdroj
hranol
vzorek
detektor
obsluha
Experimentální měření • měří se intenzita světla I0 a I • za konstantní délky kyvety l (1 cm) • uspořádání
zdroj
detektor jednopaprskové
dvoupaprskové
Experimentální uspořádání jednopaprskové • nutno měřit 2x Æ1 měření slepý vzorek (blank) Æ2 měření zkoumaná látka
dvoupaprskové • měří se přímo proti slepému vzorku
10
Experimentální měření zdroje • pro UV oblast - deuterové lampy • pro VIS oblast - halogenové, kryptonové lampy
kyvety • pro UV oblast - křemenné sklo • pro VIS oblast - sklo, plasty
detektory • diode array vs. mřížka + detektor
Schema diode-array spektrofotometru
Charakteristiky přístrojů • • • •
rozsah (např. 200 - 1100 nm) přesnost (např. 2 nm) čas na sejmutí spektra (např. 1 s.) příslušenství - zásobník na více kyvet, směšovací nástavec atp. • programové vybavení
11
Přístroje na měření spektrometry • měření pouze za jedné vlnové délky • snímání spekter
kolorimetry • zjednodušený spektrometr • zejména pro terénní praxi
UV spektroskopie sklo a plasty absorbují < ~300 nm • používají se křemenné kyvety
vzduch absorbuje < 200 nm • nutná evakuace aparatur • oblast 10 - 200 nm - vakuová UV oblast
Spektrum skla 5
90
4.5
80
4
70 60
3 50 2.5 40 2
transmitance %
absorbance
3.5
Abs %T
30
1.5
20
1
10
0.5 0
0 200
300
400
500
600
700
800
vlnová délka
12
Spektrum křemenné kyvety 100 90
0.8
80
0.7
70
0.6
60
0.5
50
0.4
40
0.3
30
0.2
20
0.1
10
0
transmitance %
absorbance
1 0.9
Abs %T
0 200
300
400
500
600
700
800
vlnová délka (nm)
Kyvety pro UV/VIS ukázky kyvet pro UV/VIS spektroskopii
vlastnosti komerčních materiálů pro výrobu kyvet
nm
Využití • • • • •
detekce a stanovení kinetická měření stanovení pKa stabilita látek vliv prostředí
13
Detekce pomocí UV-VIS • řada látek má charakteristické spektrum • obvykle však bývají ve vzorcích směsi látek a jednoznačná identifikace se stává nemožnou
Stanovení látky kalibrační přímka • proměří se A pro několik hodnot c ze změřené A se odečte c A = 0,634
X
A = 0,462
c = 5.83 mM
Stanovení ε • • • •
sestrojí se kalibrační přímka A = kc jelikož A = εcl , l = konst. = 1 cm směrnice k je rovna ε [ε] = dm3.mol-1.cm-1
14
Spektrum krystalové violeti 0.7 0.6
absorbance
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 -0.1 250
350
450
550
650
750
vlnová délka (nm)
Lambert-Beerův zákon ε(591nm)
0.7
krystalová violeť
65523
0.6
dm3.mol-1.cm-1 0.5
ε(303nm) 15928
0.3
dm3.mol-1.cm-1
y = 15928x 2 R = 0.9966
0.2
vypočteno
0.1
lineární regresí 0.0 0.0E+00
2.0E-06
4.0E-06
6.0E-06
8.0E-06
1.0E-05
1.2E-05
Koncentrace (mol/l)
Směs Tyrosin a Tryptofan A = Tyrosin (Tyr) B = Tryptofan (Trp) λ1 = 240 nm λ2 = 280 nm ε240(Tyr) = 11,300 M-1cm-1 ε280(Tyr) = 1,500 ε240(Trp) = 1,950 ε280(Trp) = 5,380
A Absorbance
absorbance
y = 65523x 2 R = 0.9976 0.4
B
λ1
λ2
A240 = [ε240(Tyr)•c(Tyr) + ε240(Trp)•c(Trp)]•L A280 = [ε280(Tyr)•c(Tyr) + ε280(Trp)•c(Trp)]•L
15
Kinetická měření měří se změna A v závislosti na čase • snímá se celé spektrum • měří se za konstantní λ
Kinetické křivky
Kinetická měření měří se reakce s T1/2 > 1 s pro rychlejší reakce je nutné • použít směšovací nástavec • použít techniku stop-flow • kinetickou laserovou spektroskopii
16
Stanovení pKa • měří se A v závislosti na pH • HB + H2O B- + H3O+ Ka =
aH O + aB −
pK a = pH + log
3
aHB
pK a = pH + log
a HB aB −
aHB AB − − A = a B − A − AHB
AB − − A A − AHB
Isozbestický bod Absorbance
A B
isozbestický bod
λ1 λ2 Jestliže při určité vlnové délce jsou molární absorpční koeficienty dvou látek rovny, tato vlnová délka se označuje jako isozbestický bod. V isozbestickém bodě lze snadno vypočítat celkovou koncentraci obou látek: εA = εB =ε
A = εAcAL + εBcBL = ε•L•[cA + cB]
Isozbestický bod
17
Vliv prostředí • pH • polarita prostředí • přítomnost tenzidu
Vliv pH pH = 6
pH = 13
O H2N
CH
C
O O
-
H2N
CH
CH2
CH2
OH
O
C
O
-
-
pKa(OH) = 10.1
Spektrum tyrosinu s rostoucím pH dochází k posunu abs. maxima λmax k delším vl. délkám a růstu absorbance v důsledku deprotonace fenolické OH skupiny
Vliv solventu Solvent = H2O Solvent = 20% Ethylene Glycol / 80% H2O
v méně polárním prostředí se λmax posouvá k delším vlnovým délkám - batochromní posun (červený posun) solvatace ovlivňuje rozložení energetických hladin základního a exitovaného stavu
spektrum tyrosinu
absorpční spektrum může ovlivnit i přítomnost povrchově-aktivních látek!
18
