Spektroskopie v blízké infračervené oblasti (NIR)

Václav Míka a kol.

Spektroskopie v blízké infračervené oblasti (NIR) Výběr praktických aplikací v zemědělství Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i. v Ústavu zemědělských a potravinářských informací Slezská 7, 120 56 Praha 2

2008

METODIKA PRO PRAXI Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i.

2008

Metodika vznikla za finanční podpory MZe a je výstupem řešení výzkumného záměru VÚRV, v. v. i., reg. č.: MZE 0002700601 „Principy vytváření, kalibrace a validace trvale udržitelných a produktivních systémů hospodaření na půdě“.

Autoři:

Ing. Václav Míka, DrSc., Ing. Alois Kohoutek, CSc., Ing. Pavel Nerušil

Název:

Spektroskopie v blízké infračervené oblasti (NIR). Výběr praktických aplikací v zemědělství

Oponent:

Ing. František Novotný, CSc., ÚKZÚZ Brno

Vydal:

Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Drnovská 507, 161 06 Praha 6-Ruzyně

Redakce a sazba: Ing. Vladimír Pokorný, CSc.

Foto na obálce :

Tisk:

Ústavu zemědělské ekonomiky a informací Slezská 7, 120 56 Praha 2

Autor fotografií:

Ing. Alois Kohoutek, CSc.

Náklad:

200 ks

Vyšlo v roce 2008 Vydáno bez jazykové úpravy Kontakt na autory: [email protected] © Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i., 2008 ISBN 978-80-87011-53-9

© Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i., 2008 ISBN 978-80-87011-53-9

Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i. v Ústavu zemědělské ekonomiky a informací, Slezská 7, 120 56 Praha 2

Václav Míka, Alois Kohoutek, Pavel Nerušil

Spektroskopie v blízké infračervené oblasti (NIR) Výběr praktických aplikací v zemědělství

METODIKA PRO PRAXI

Praha 2008

Metodika shrnuje naše zkušenosti s provozem  přístroje NIRSystems 6500 na VS Jevíčko od roku 1995 při měření parametrů kvality objemné píce, semen řepky, půd a dalších vzorků. Vedle běžných rozborů byly kalibrace pořízeny rovněž k predikci frakcí N v krmivech (PDI), vodorozpustných sacharidů (WSC), energie (ME, NEV, NEL), některých specifických látek (IANP), k botanickému rozboru sena z dočasných a trvalých travních porostů a rozpracována je otázka predikce příjmu píce zvířetem. Jsou tu uvedeny příklady dalších aplikací NIR v  zemědělství, potravinářství aj. v přítomnosti i v nejbližším výhledu, včetně předností i omezení nasazení pro rutinní měření. Jedná se o metodu na výrazném vzestupu, která má reálné předpoklady se prosadit i v našem zemědělství s ohledem na rychlost (2 minuty jeden vzorek), přesnost, ekologickou nezávadnost rozboru, přičemž např. proměřená semena neztrácejí klíčivost a lze je vysít. Vzorek se měří v  suchém semletém stavu, lze však i v  přirozeném (neupravovaném) stavu, např. siláže, čerstvá píce, a při měření se nespotřebovává. Klíčová slova: NIR spektroskopie; kvalita rostlinných výrobků; metodiky rozborů; laboratorní kontrola

Metodika je určena pro zemědělskou praxi, poradce v  oblasti zemědělství, pracovníky ve výzkumu, zemědělském školství a šlechtění. Pro její využití byla uzavřena smlouva se Svazem marginálních oblastí se sídlem Horní Police č. 1. SMO doporučuje tuto metodiku pro využití v praxi. Metodika byla schválena Ministerstvem zemědělství ČR – odborem vědy a výzkumu k datu 29. 12. 2008 pod č.j. 47822/2008-18020 a doporučuje se její využití v zemědělské praxi.

Obsah Cíl metodiky Úvod 5 Srovnání novosti postupů 1. Historie vývoje techniky NIR a základy měření 1.1. Nástin teorie NIR spekter 1.2. Měření reflektance (odraženého světla, R) nebo transmitance (v procházejícím světle, T) 1.3. Derivatizace spekter 1.4. Referenční metody 1.5. Strukturalizace populací 1.6. Kalibrace 1.7. Regresní modelování 1.8. Externí validace 1.9. Ověření kalibrace „na slepo“ 1.10. Používání repeatability file při kalibracích 1.11. Globální, lokální a rozšířené kalibrační rovnice 1.12. Testy na outliery jejich interpretace 1.13. Přístrojové sítě 1.14. Rutinní měření 1.15. Statistika při měření NIR 2. Chemometrické metody analýzy NIR spekter 2.1. Kvalitativní analýza 2.2. Kvantitativní analýza pomocí NIR 3. Příklady aplikací 3.1. Aplikace na bázi kvalitativní NIR analýzy 3.2. Aplikace na bázi kvantitativní NIR analýzy 3.3. NIR v systému kontroly deklarované kvality zemědělských a lesnických produktů s chráněnou známkou 4. Potenciál NIR analýzy a výhled LITERATURA

5 6 7 8 10 13 14 15 15 18 18 19 20 20 21 21 22 24 26 26 26 27 27 30 40 40 42

Cíl metodiky Na základě téměř 15 letých zkušeností s  využíváním techniky NIRS k  hodnocení kvality rostlinných výrobků předložit v  uceleném pohledu předložit možnosti využití vysoce progresivního postupu, přitom ekologicky šetrném k  životnímu prostředí, v  oblasti operativního a exaktního hodnocení kvality potravinářských surovin a výrobků (např. kvalitu semen řepky, obilovin, luskovin), dále výživné hodnoty krmiv (např. objemné píce v čerstvém i konzervovaném stavu), rozbor složení směsných vzorků (botanické složení píce z travních porostů, zastoupení komponent v krmných směsích apod.), monitoringu půdních charakteristik aj. Metodika je určena pro potřeby kontroly v zemědělském provozu, ve sféře operativního rozhodování na základě exaktních rozborů, dále ve šlechtění a  odrůdovém zkušebnictví (šlechtitelé zemědělských plodin, ÚKZÚZ), zemědělské vědě a výzkumu a také dalších zájemců z řad odborné zemědělské praxe a poradenství. Přínosem je podstatné zvýšení efektivnosti a rychlosti prováděných exaktních rozborů ve smyslu naplnění praktických potřeb široké obce uživatelů, dále významná podpora ve sféře rozhodování, monitoringu procesů v oblasti primární zemědělské výroby až po oblast zušlechťování jejich produktů. Je v ní poukázáno na další směry rozvoje techniky NIRS a využití ve sféře zemědělské praxe, šlechtění a výzkumu opřené o fundované zkušenosti řešitelského kolektivu.

Úvod Čas širokého praktického využití spektroskopie v  blízké infračervené oblasti (NIR) již nastal i v  podmínkách ČR. Tato technika nabývá na popularitě zejména pro kvantitativní analýzu v průmyslu, službách, a ne naposledy i v zemědělství a lesnictví. Její potenciál je však daleko větší, proto v této publikaci chceme upozornit na další možnosti jejího praktického využití v zemědělství s upozorněním na event. limity nasazení. Pro potenciální uživatele proto podáváme průřezovou informaci, se zaměřením na rutinní analýzy velkých sérií poměrně stejnorodých vzorků, při

nichž se klade zvláštní důraz na rychlost, přesnost a nízké jednotkové náklady. Všechny tyto požadavky NIR může kvalitně plnit: Je to metoda nedestruktivní, t.j. vzorek se ani nerozkládá ani při analýze nespotřebovává, není potřeba žádné náročné přípravy vzorku k rozborům, měření s vyhodnocením trvá méně než ca 2 minuty, simultánně lze měřit více parametrů. Podstatné je, aby materiál obsahoval vazby C–H, N–H, S–H či O–H a koncentrace měřené látky v něm byla větší než ca 1 g.kg–1. V zásadě lze měřit vzorky všech tří skupenství, při obvyklé teplotě. Měřící přístroj ve spojení s počítačem může fungovat jako stacionární (např. v laboratoři s měřením přímo na místě či k  měření v  okruhu několika metrů pomocí externího čidla k  přístroji připojeného kabelem ze skleněných vláken) nebo jako mobilní (na sklízecím stroji, na dopravním prostředku pohybujícím se po pozemku a pod.). Měření lze provádět jako jednotlivá nebo kontinuální (ve zvoleném časovém intervalu). Pro konkrétní požadavky měření je třeba zvolit určité uspořádání a technické vybavení. Jelikož se jedná o metodu sekundární, tj. její přesnost se vždy musí testovat na metodu standardní (např. klasické metody „mokré chemie“), nelze a priori očekávat, že přesnost NIR analýzy bude vyšší než metody se kterou je tato srovnávána. Technika NIR může přinášet užitečné informace řídícím pracovníkům ve výrobě k operativnímu rozhodování, pracovníkům kontroly jakosti na všech stupních, nákupu zemědělských a potravinářských surovin a výrobků, ve sféře obchodu k objektivizaci ceny ve vazbě na kvalitu atd. Hodnota těchto rychlých informací se zužitkuje zvláště tenkrát, budou-li součástí určitého vytvořeného systému na podporu jakosti, jak je naznačeno u některých příkladů aplikací v druhé polovině publikace. Pokud čtenář nalezne alespoň pár pro něj zajímavých tipů, snaha autorů nebyla marná.

Srovnání novosti postupů Metodika shrnuje nejnovější tuzemské a zahraniční poznatky a zkušenosti s přístrojem NIRSystems 6500 na VS Jevíčko při měření parametrů kvality objemné píce, řepky, půd a dalších vzorků. Vedle běžných rozborů byly kalibrace nově pořízeny rovněž k predikci frakcí N v krmivech (PDI), vodorozpustných sacharidů (WSC), energie (ME, NEV, NEL), některých specifických látek (IANP), k botanickému rozboru sena z dočasných 

a trvalých travních porostů a rozpracována je otázka predikce příjmu píce zvířetem. Jsou tu uvedeny příklady dalších aplikací NIR v  zemědělství, potravinářství aj. v přítomnosti i v nejbližším výhledu, včetně předností i omezení nasazení pro rutinní měření. Jedná se o metodu na výrazném vzestupu, která má reálné předpoklady se prosadit i v našem zemědělství s ohledem na rychlost (2 minuty jeden vzorek), přesnost, ekologickou nezávadnost rozboru, přičemž změřená semena neztrácejí klíčivost a lze je vysít. Vzorek se měří v suchém semletém stavu, lze však i v přirozeném (neupravovaném) stavu, např. siláže, čerstvá píce, a při měření se nespotřebovává. V  evropském rozměru se rozvíjí vytváření sítí přístrojů měřících kvalitu semen řepky a dalších komodit s využitím jednotných kalibračních rovnic a jednotných metodických postupů.

1. Historie vývoje techniky NIR a základy měření Objev NIR energie se připisuje Williamu Herschelovi, který v  r. 1800 publikoval zprávu o záření za viditelnou oblastí červeného spektra. Až do začátku 2. světové války se oblast NIR pro spektroskopii nepovažovala za užitečnou, neboť NIR pásy se velice překrývají a bylo je obtížné interpretovat. NIR pokrývá přechod od viditelné oblasti spektra (VIS, 350–700 nm) do střední infračervené (MIR, 2 500–20 000 nm), tedy 700–2500 nm, resp. vlnočty 12 900–4 000 cm–1. V ní se nalézá většina vibrací vazeb –CH, –OH, –SH a –NH. Všechny absorpční pásy jsou výsledkem svrchních tónů (angl. overtones) či kombinací přechodů do základních MIR pásů /1/. O teorii NIR bylo vydáno mnoho příruček a vědeckých pojednání /např. 2, 3, 4/. Většina aplikací kvantitativní analýzy prováděné v reflektanci se odbývá v oblasti 1 200–2 500 nm. Pod 1200 nm jsou totiž absorpční pásy tak slabé, že měření reflektance je obtížné, zatímco nad 2500 nm jsou absorpční pásy příliš silné a měření je rovněž obtížné. Zájem o NIR vzrostl v  letech padesátých minulého století na základě zjištění, že vodíkové (X–H) stretching vibrace jsou odpovědné za téměř všechny absorpční pásy v NIR oblasti. To v letech šedesátých vedlo k vývoji metody monitorování obsahu vody v různých materiálech. Zjištění, že zrniny vykazují v  oblasti NIR specifické absorpční pásy, vedlo Karl Heinz 

?

Norrise v  r. 1968 k  převratnému návrhu, použít NIR spektrometru s  filtry 1680, 1940, 2100, 2180, 2230 a 2310 nm ke stanovení obsahu bílkovin, vody v zrnu obilovin, resp. bílkovin, oleje a vody v sojových bobech. V sedmdesátých letech Norris se spolupracovníky /5, 6/ na přístroji Cary* 14 se scanujícím monochromátorem ukázali, že v pícninách lze stanovovat parametry kvality, včetně stravitelnosti (bilančně stanovovanou na skopcích) a příjmu píce. Již v  r. 1978 Shenk se spolupracovníky /7, 8/ umístili NIR přístroj na dodávkový automobil tak, aby se mohl použít v terénu, přímo na amerických farmách a při obchodu se senem. Od r. 1983 byly dodávány komerční filtrové přístroje se softvérem pro analýzy pícnin a krmiv. Pro další rozvoj techniky NIR měl mimořádný význam technický pokrok ve vývoji přístrojů a též optických vláken, dovolující delokalizaci měření (pomocí optické sondy) v pevných a kapalných materiálech. Záření se vede optickými vlákny ze zdroje do vzorku a odtud zpět na detektor, kde se snímají NIR spektra vzorku /9/. Vedle toho pro další rozvoj techniky NIR měl velký význam též pokrok v  počítačích a vývoj nových matematických metod dovolujících globální zpracování obrovských datových souborů. Zatímco MIR spektra a zejména absorpční spektra lze přímo interpretovat díky specifickým vlastnostem chemických piků, NIR spektra se interpretují obtížně. K tomu je zapotřebí chemometrie. To je disciplina, využívající matematické a statistické metody pro výběr optimálního experimentálního postupu a zpracování dat chemické analýzy. Pokrývá problematiku uspořádání pokusu, metod získávání informací (modelování, klasifikace a testování hypotéz a techniky k pochopení chemických mechanismů (viz kap. 2). O ní byla vydána řada dobrých příruček /např. 10, 11, 12/. 1.1. Nástin teorie NIR spekter Molekula je schopna absorbovat elektromagnetické záření tím, že mění stav svého elektronového obalu vibračními pohyby atomů a svojí rotací jako celku. Tomu odpovídají tři druhy energetických přechodů: elektronový, vibrační a rotační. Vibrace a rotace molekul se řídí zákony kvantové mechaniky. Principiálně, vibrační pohyb v  nejjednodušším případě dvouatomové molekuly lze popsat modelem harmonického oscilátoru /4, * nyní společnost Varian



9/, kde vibrující hmoty m1 a m2 vedou ke změnám internukleární vzdálenosti < 10 %. Ve skutečnosti lze ve spektrech pozorovat kromě základních frekvencí i vibrace s násobným vlnočtem (harmonické) a vibrace součtové (kombinační). Odtud vyplývá, že molekula se ve skutečnosti chová jako anharmonický oscilátor. Pohyb molekuly tedy vede k emisi nebo amsorpci záření Vibrace polyatomové molekuly si lze představit jako soubor vibrací řady oscilátorů, jejichž pohyby jsou na sebe vázány a vzájemně se ovlivňují. S výjimkou plynné fáze a aplikací při vysoké teplotě NIR zahrnuje molekulární absorpci svrchních tónů (700–1 800 nm) a kombinačních pásů (1 800–2 700 nm) – obr. 1. NIR absorpční pás se vytváří, jestliže NIR záření při specifické frekvenci vibruje na téže frekvenci jako molekulární vazba ve vzorku. Údaje NIR bodů ze vzorku se obvykle sbírají ve formě log reciproké hodnoty reflektance (log 1/R). Pásy se definují umístěním, výškou a šířkou. Nejpřesněji lze měřit polohu pásu, avšak výška a šířka v případě překrývání vedle sebe ležících pásů se může projevit posunem pásu či změnou polohy zbývajících překrytých pásů. 0,300

C–H

vibrační spektrum kombinační pásy O–H N–H N–H

oblast overtónů

log(1/R)

0,225

0,150

O–H

N–H S–H

0,075

0,000 1 100 1 300 1 500 1 700

1 900

2 100

2 300

2 500

Vlnová délka (nm)

1. Obecné znázornění X–H vibračních informací v zemědělských produktech /13/



1.2. Měření reflektance (odraženého světla, R) nebo transmitance (v procházejícím světle, T) Jestliže světelný tok (I0) dopadá na vzorek, některé fotony mohou vzorkem procházet (It), odrážet se od vzorku (Ir) či být absorbovány (Ia) rezonujícími kovalentními vazbami vzorku, které fyzikálně fungují jako oscilační můstek, přesně zachycující frekvenci (nebo vlnovou délku) NIR záření. Absorpce je proto na určitých frekvencích selektivní a poskytuje informace o molekulárních skupinách v chemické struktuře vzorku. Absorbované protony vyvolávají molekulární vibrace, které se roztýlí ve vzorku a projeví jako jeho nepatrné zahřátí. Při měření R i při měření T se rovná dopadající I0 součtu Ia, It a Ir. Při měření T se I0 měří v černé kyvetě s roztokem (jako kontrolou) a Ir v neznámém vzorku (t.j. vzorku dodaném ke změření). U neznámého vzorku se tedy měří procházející tok It tak, že Ia se získává jako rozdíl. V případě měření T je vrstva vzorku dostatečně tlustá (neprůhledná, t.j. It = 0), zatímco I0 se měří v porovnání s matnou (nelesklou) difuzně odrážející „bílou“ plochou, která neabsorbuje. U neznámého vzorku se pak měří Ir a Ia se získává jako rozdíl. Odražený tok záření Ir představuje zrcadlovou reflexi, k níž je přidána difusní reflexe. Z toho vzniká problém rozptylu podle velikosti částic (angl. particle size scattering), k jehož překonání při NIR analýze je nutný počítač. Difuzně reflektující komponent proniká částicemi vzorku a je vystaven různému stupni absorpce než se dostane zpět či znovu vyzáří ze vzorku na různých frekvencích či vlnových délkách, vykazující zmenšení své intenzity o absorpci. Z toho je zřejmé, že T i R způsob měření poskytuje stejné absorpční profily. V případě T je absorbance (A) definována jako log 1/T (tedy log I0/ It) a v případě R je absorbance definována jako log 1/R (tedy log I0/ Ir). V obou případech platí Lambert–Beerův zákon, který říká, že absorbance při jakékoliv vlnové délce je úměrná počtu absorbujících molekulárních chromoforů na jeho délce dráhy průniku vzorkem, tedy molární koncentraci. A = k .c .d, kde k = konstanta, c = koncentrace a d = dráha. U opticky jasných roztoků se může dráha (síla kyvety) používat jako neměnná (obvykle 1 cm), takže vztah absorbance a koncentrace je lineární. Avšak při způso10

bu R, resp. u vzorků pevného skupenství obecně, rozptyl záření znamená, že dráha se nemůže kontrolovat a máme tu problém o dvou neznámých (c, d). Proto je třeba měření alespoň při dvou vlnových délkách k řešení dvojice rovnic. Při praktické kalibraci NIR se používají měření absorbance při více vlnových délkách, za použití multivariačních metod modelování k tomu, aby se ze spekter „vyextrahovaly“ potřebné informace. Obecně lze analyzovat směs látek řešením matric za použití měření mnoha vlnových délek. Tak je tomu např. při uměle vytvořených směsích čistých substancí (např. ve farmacii), ale je to způsob těžko použitelný při analýze přírodních produktů (např. píce). Úskalí je, že suchý semletý rostlinný materiál je složen z částeček, jejichž reflektanční spektra budou zahrnovat celou škálu v závislosti na velikosti částeček a rozdílech v refrakčním indexu mezi částečkami a póry (většinou vzduch). Naopak mokré vzorky (např. siláž o sušině 22 %) se bude zdát mnohem tmavší a mít větší hloubku průniku paprsků (vzhledem k výskytu vody převážně v pórech). V případě mokrých vzorků je způsob měření T zjevně vhodnější než R. Nicméně dnešní přístroje dokážou úspěšně a přesně měřit absorbanci na úrovni 2–3 jednotek absorbance, kde se dostává do detektoru pouze 1–0,1 % dopadajícího světla. Ačkoli jednotlivé údaje NIR snímané monochromátorem se zdají být jako spojité spektrum (obr. 2), protože se jedná o absorpční pásy, tyto se ve skutečnosti překrývají. Pásy jsou definovány třemi kritérii: polohou, výškou a šířkou. Protože šířka pásu se měří v polovině výšky, mnoho absorpčních pásů této výšky nedosahují a mají tvar „ramen“. To způsobuje závažné odchylky od běžného tvaru pásu, aniž by tento dosáhl místního maxima. Typické spektrum pícnin obsahuje 7–10 piků s mnoha „rameny“. Při překrývání pásů (složené pásy) může změna výšky jednoho pásu vyvolat posun polohy piku. Za této situace se poloha piku stanovuje z odvozených (derivovaných) spekter. Charakteristiky piků jsou tedy stanovovány kombinací rozvinutí a rozložení spekter, přičemž krok při rozvinutí bývá 5–10 nm. Např. transmisní spektrum čisté vody se jeví jako jednoduché ve tvaru log (1/R). Jestliže se rozloží, objeví se řada podružných piků. A tak absorpčí pásy vody v pícninách při 1 450 a 1 930 se sestávají z mnohonásobně překrývaných jednotlivých pásů, jejichž poloha se mění podle typu vzorku. 11

0,9

log(1/R)

0,7

0,5

0,5

0,1 400

700

1 000 1 300 1 600 1 900 2 200 2 500 Vlnová délka průměr (nm)

2. Průměrná spektra trav (spodní čára), jetelovin (prostřední čára) a bylin (horní čára) /20/

Pokud se jedná o vliv velikosti částic ve vzorku, hlavní efekt jejich kolísání je, že rozšiřují či zužují spektum součinitelem velikosti. Protože to není nezbytně třeba vztahovat k chemickému složení, efekt se hodnotí jako interference, která se eliminuje matematicky nebo se prostě ignoruje. Tak třeba mnohonásobnou lineární regresí se vyrovnává mnohonásobný rozptyl až na průměrnou hodnotu kalibračního souboru. Rovněž i transformace spekter minimalizují vliv různé zrnitosti, třebaže pouze eliminují posun od základny, nikoli však mnohonásobný efekt rozptylu. Matematicky se rušivý účinek odlišné velikosti částic ve vzorku může eliminovat Fourierovým rozvinutím (anglicky deconvolution), odklonem (detrending) a standardní transformací normálního rozdělení četností (standard normal variate transformations), mnohonásobnou korekcí rozptylu (multiplicative scatter corrections), vyloučením hlavních komponent (principal components elimination), a současným odstraněním vlivu velikosti částic a kolísání obsahu vody. Tyto korekce na velikost částic nemusí vždycky vést ke zlepšení přesnosti NIR analýzy. Jednak žádná z nich rušivé vlivy neodstraní 100%ně a jednak samo zastoupení velikostních částic ve vzorku poskytuje samo o sobě dobrou informaci pro kalibraci. Průměrná velikost částic ve vzorku a jejich rozdělení jsou nepřímým ukazatelem chemického složení 12

vzhledem k interakci s různými strukturami rostliny (stébla versus listy, způsob sušení a mletí atd.). Měřené zemědělské materiály však nejsou nikdy dokonale homogenní a vždy vyvolávají rozptyl dopadajícího záření. Dochází ke ztrátám energie, např. odrazem záření od vzorku. Proto se v NIR měří t.zv. difuzní reflektance a nemluví se o absorbanci nýbrž o optické hustotě. Běžně se využívá pro měření suchých vzorků (jemně zrnité až práškovité struktury). Měření v transmitančním modu se dává přednost u kapalných a kašovitých vzorků. V poslední době se začínají více prosazovat NIR spektrometry s Fourierovou transformací (FT NIR). Pracují na principu interference záření, kdy se získaný signál matematickou operací převede na infračervené spektrum. V podstatě jde o spojení s interferometrem, nejčastěji Michelsonova typu, s  citlivým detektorem a počítačem. Jako příklad budiž jmenován přístroj ANTARIS fy Nicolet Instruments (9), s  možnostmi výběru způsobu měření podle přání zákazníka v reflektanci, transmitanci či vláknivou optikou. Oproti disperznímu fotometru má tu výhodu, že stejný vzorek se proměřuje za stejnou dobu vícekrát a díky tomu je lepší výsledný poměr signálu a šumu (tzv. Felgetova multiplexní výhoda). Dále na jejich detektor dopadá většina emitovaného záření, a proto lze využívat i techniky s energetickými ztrátami (t.zv. Jacquinova energetická výhoda). Přistupují ještě další přednosti /9, 18/. Snímat spektra lze i akusticky (ultrazvukem), čímž se podstatně urychlí rychlost snímání a v přístroji absence pohyblivých částí zvyšuje jeho spolehlivost. Jsou to t.zv. AOTS spektrometry, které představují nejmodernější vývojový stupeň. Nacházejí uplatnění ve výrobě i v laboratoři /9/. 1.3. Derivatizace spekter Spektra zemědělských vzorků vykazují v oblasti NIR obvykle ca 10 piků /13/. Ke zlepšení vypovídací schopnosti (potlačení rušivých momentů, dát přednost užitečným informacím) je lze derivovat matematickými postupy D, G, S1 a S2, kde D znamená pořadí derivace, G vzdálenost mezi body, které se používají k  výpočtu rozdílů, S1 a S2 počet bodů k  vyhlazení dat (vyrovnání průběhu). Derivatizace log (1/R)1. řádu poskytuje křivku s piky a „údolími“, které korespondují s body inflexe na každé straně log (1/R) piku. Derivatizace 13

2. řádu bývá užitečná, neboť zachovává intensitu a polohu pásů a zlepšuje se rozlišitelnost pásů. Při použití malého kroku (G) při ní ve spektru většiny zemědělských produktů (2,2,2,1) se objevuje 35–40 piků. Hlavní výhodou je, že derivace 2. řádu generuje jen ojediněle piky v  negativním smyslu. Derivatizace třetího řádu se používá k interpretaci spekter zřídka a produkt se nechá interpretovat ještě obtížněji než při 1. derivatizaci. Derivatizace 4. řádu bývá velice užitečný matematický postup pro interpretaci spekter. Velmi krátký krok (G) při 4,4,3,1 vyvolává 60–70 zřejmých absorpčních piků. Jejich poloha se tak stává zřetelnější, neboť se tolik nepřekrývají. Na druhé straně mohou se objevovat některé matematické artefakty /13/. 1.4. Referenční metody NIR spektrum je přesně určeno na základě X–H vazeb ve vzorku. Je to souhrn NIR absorpčních pásů fukčních skupin určujících hlavní chemické a fyzikální vlastnosti píce. Naproti tomu referenční metoda, na jejíž výsledky se kalibruje NIR, mnohdy není dobře definována chemicky, takže není vždycky snadné k ní vztáhnout spektroskopická data s náležitou přesností. Např. obsah vody se běžně stanoví sušením vzorku při 105 °C do konstantní váhy nebo při 135 °C po 2 hodiny. Ve skutečnosti i po této proceduře rostlinný materiál obsahuje ještě zbytkovou vodu, zatímco jiné těkavé (nevodné) látky nekontrolovaně unikají. Proto NIR měření obsahu vody poskytlo shodnější výsledky s alternativní metodou podle Karl Fishera (titračně) než s uzanční metodou sušením. Při stanovení dusíkatých látek (NL)se podle klasického postupu vychází z obsahu N vynásobeného faktorem 6,25 (s ohledem na průměrný obsah N v „rostlinné“ bílkovině). NIR je schopna měřit N–H molekulární vazby, zastoupené v molekule bílkoviny. Nepřekvapuje, že shoda NIR měření byla lepší s obsahem N ve vzorku než s obsahem NL. Při predikci netto energie pomocí NIR jsme dosáhli daleko lepších výsledků byla-li tato vyjádřena jako NEL či NEV v porovnání se š.h. /25/. Vyplývá to ze samotného postupu výpočtu š.h., který používá odhad koeficientů stravitelnosti jednotlivých živin (subjektivní odečet z tabulek) a další průměrné koeficienty, korekci na vlákninu atd. Koncepce stanovení NEL či NEV se více blíží exaktním principům. Přesnější predikce NEL či NEV jsme dosáhli, pokud jsme predikovali obsah jednotlivých živin a výpo14

čet provedli standardním postupem, než když se predikovala NEL či NEV pomocí NIR přímo. Podobně i stravitelnost in vivo lze přesněji predikovat jako stravitelnost in vitro a s použitím regresních rovnic (in vitro vs. in vivo) provést následně kalkulaci na in vivo než ji predikovat přímo. Dalším zdrojem disproporcí se může stát vzorkování (odběr průměrného vzorku a následná homogenace), sušení (ke kalibraci celého souboru vzorků se doporučuje používat pouze jednu metodu sušení), mletí (vzorek se při něm nesmí zahřívat /26/, a velikost síta by měla být normalizována, např. ≤ 1 mm), promíchání vzorku a plnění do kyvet. Dříve se prezentace vzorku omezovala na suché semleté seno či semleté zrniny. Dnešní přístroje a software dovolují prezentaci celých semen (nasypaných do kyvety nebo analýzu jednotlivých semen), píce v jejich přirozené podobě (sena, siláží, čerstvé píce, napěchovaných ručně do kyvet většího objemu). Nám se osvědčilo měřit referenční vzorky vícekrát a z dílčích výsledků vypočítat medián. Průměr je méně vhodný. 1.5. Strukturalizace populací Pomocí postupu CENTER a SELECT lze vybrat z početných kolekcí vzorků zástupce s charakteristickými spektry, které jsou potřeba ke kalibraci. Oba postupy používají metodu hlavních komponent ke zhuštění informací o celém spektru na malý počet bodů, a hodnoty vzdálenosti sousedů „H“ (Mahalanobis distance). Postup SELECT vychází z předpokladu, že pro reprezentaci vzorků se stejnými sousedy postačí pouze jeden vzorek. Kalibrační soubor musí nejen stejnoměrně pokrývat celé rozpětí spekter a obsahových látek v měřené kolekci vzorků, ale i rozpětí typů vzorků. 1.6. Kalibrace Je to pojem používaný k popsání postupu konverze informací o NIR absorpci do hodnot laboratorní referenční metody. Přesnost této konverze se posuzuje na základě směrodatné odchylky kalibrace (SEC) a směrodatné odchylky predikce (standard error of performance, SEP). SEP při úspěšné NIR kalibraci bývá asi dvojnásobně veliká ve srovnání se směrodatnou odchylkou při laboratorním stanovení. Vlastní postup je znázorněn na obr. 3. 15

Vzorky ke kalibraci by měly být odebrány z podobných souborů, které by se měly měřit v budoucnosti. Rovněž i příprava (sušení, mletí, skladování atd.) by měla být podobná přípravě vzorků, které se budou sériově měřit. Je třeba získat co nejširší škálu vzorků s různým chemickým složením, nejen „svoji“ zájmovou oblast pro momentální měření. Získat dostatek extrémních vzorků však neznamená zařazovat sem vzorky, které do zájmového souboru exidentně nepatří! Naše zkušenosti ukazují, že kalibrace postavená na méně než 100 vzorcích bývá málokdy dostatečně robustní, ledaže by se jednalo o velmi jednoduchá stanovení (např. voda, N) u relativně homogenních materiálů (např. jednotlivé druhy obilovin). Referenční hodnoty by měly vycházet ze zaručených (přesných) rozborů, provedených duplicitně a zprůměrovaných (pokud vyhovují toleranci). Při dodatečné kontrole vzorků, které vybočovaly z běžného okruhu měření (outliers), se nám ve 45 % případů ukazuje, že se jedná o vzorky nepřesně analyzované klasickými postupy „mokré chemie“, a zbytek jsou vzorky spektrálně zvláštní. Důležitá je pečlivá kontrola identifikace vzorků (zda se nepomíchalo pořadí a pod.), neboť neuvěřitelně mnoho chyb měření (včetně kalibrace) jde na vrub „lidského“ faktoru. Vzorky je třeba chránit před extrémy světla, tepla a vlhkosti. Pokud se v obsluze střídají dvě osoby, obě by měly pracovat stejně pečlivě. Snímání NIR spekter musí předcházet každodenní kontrola monochromátoru (diagnostika) před měřením abychom byli jisti, že přesnost nastavení vlnových délek (± 0,3 nm), opakovatelnosti (± 0,2 nm) a charakteristiky pozadí (20 μOD, RSM) odpovídá specifikacím od výrobce. Laboratorní teplota a vlhkost by během měření neměla podstatně kolísat, naprosto nevhodný je průvan. Rovněž zacházení se vzorky a postup vlastního měření by měl být metodicky spíše pomalejší, aby se tím zajistilo, že hodnoty nebudou kvůli tomu vybočovat z řady. Duplicitní (paralelní) plnění materiálu do kyvet a jedno měření je rozhodně vhodnější než dvojí měření jedné naplněné kyvety. Duplicitní snímání spekter (měření) je sice instruktivní, ale ne striktně nezbytné. Na konci měření je vhodné zopakovat „diagnostiku“, abychom se přesvědčili o stabilitě přístroje. Spektra je vhodné zálohovat. Při prohlížení spekter na obrazovce je třeba kriticky posoudit každou abnormitu. 16

standardizovaná pĜíprava sušení, mletí, skladování vzorkĤ

vylouþení velkých H outlierĤ

standardizovat prostĜedí vþetnČ teploty

vylouþit nevhodné vzorky

výbČr kalibraþního souboru n > 100

chybná duplicitní stanovení

referenþní chemické rozbory

široké rozpČtí hodnot stejnomČrné rozdČlení pĜesné analýzy typické vzorky zkontrolovat laboratorní výsledky

scanování vzorkĤ, soustĜedČní spekter

stanovení H statistiky histogram

rekalibrace

zkontrolovat abnormity scanování pravidlo ukonþení SMLR

chemické zkušenosti

opakovaná analýza

kontrola diagnostiky pĜístroje

transformace dat regresní modelování PLS

PCA

SEC; r2 dílþí F statistika

vhodná rovnice

SEC; r2 dílþí F statistika

predikce validaþního souboru

F < 10 Bn > 10000 smČr. pĜímky ca 1,0

t outlieĜi H outlieĜi zkontrolovat pĤvod, autentiþnost a pĜípravu vzorkĤ

t outlieĜi H outlieĜi zkontrolovat pĤvod, autentiþnost a pĜípravu vzorkĤ

„nejlepší rovnice“ spojit kalibraþní a validaþní soubor

SEA; r2

precizovat „nejlepší rovnici“ regresní koeficienty nejlepší rovnice

adjustovat BIAS – dobré; adjustovat smČrnici pĜímky - riskantní

slepý test na otevĜenost souboru do budoucna

odolej pokušení zasahovat do kalibrace nedovoleným zpĤsobem

robustní kalibrace

zobrazení na monitoru

vþetnČ nových vzorkĤ

kompromis mezi šíĜí kalibrace a pĜesností seznam vzorkĤ stanovení limitĤ

3. Rámcové schéma postupu NIR kalibrace

17

1.7. Regresní modelování Nejdříve s vloží referenční hodnoty do souboru spekter (spectra file) a vyvolá se graf korelace vlnové délky oproti korelačnímu koeficientu za použití log 1/R (1. či 2. derivace log 1/R). Jestliže korelační graf je slabý, se „šumy“ či nestrukturovaný, je málo pravděpodobné, že mnohonásobné modelování bude úspěšné. Pomocí SMLR (postupná mnohonásobná lineární regrese) na log 1/R a její 1. či 2. derivace se nejdříve zjistí „outlieři“. Ti mohou být dvojí: Jednak tzv. t–outlieři (zjištěné pomocí t–statistiky), u  ichž jsou referenční hodnoty (z laboratoře) podezřelé, a H–outlieři (zjištěné pomocí H–statistiky), u nichž spektrum vzorku se odlišuje od jiných v kalibračním souboru. V prvním případě je kritická úroveň 2,5, ve druhém 3,0. Avšak rozdělení H–hodnot je rovněž důležité. Dále je třeba vyzkoušet, zda by technika rozkladu spekter za použití PCA (analýza hlavních komponent) zlepšila přesnost predikce. Nám se s jejím použitím podařilo snížit chybu predikce o pětinu ve srovnání s SMLR a obecně ji považujeme za velice spolehlivou. Je třeba se vyhnout t.zv. overfitting (přílišné precisování spektrálních dat různými derivacemi, až tyto ztratí výpovědní sílu informací). Je třeba mít na paměti, že korelace může vzejít z overfitting příliš velkého počtu vlnových délek a příliš malého počtu vzorků. Kritériem pro výběr rovnice je SEC a r2 (koeficient determinace). Zadáváním dalších vlnových délek se vždycky snižuje SEC a zvyšuje r2. Vybraná kalibrační rovnice by měla mít co nejmenší SEC při malém počtu vlnových délek, z nichž žádný by měl mít dílčí statistiku F  <  10. Regresní koeficienty v rovnici by neměly přesáhnout 10, jestliže analytická data jsou vyjádřena v %. Většina druhů software obsahuje postup zvaný vnitřní křížová validace (internal cross–valiation), jímž se kalibrační soubor opakovaně segmentuje na skupiny. Jedna skupina se ponechává pro validaci, zbylá (zbylé) pro kalibraci. Tento postup se opakuje, dokud všechny skupiny nebudou pro validaci použity alespoň jednou. 1.8. Externí validace Část souboru vzorků s referenčními hodnotami, ponechaná mimo kalibrační soubor, se označuje jako validační soubor a slouží k prvnímu ověření kalibračních rovnic. „Nejlepší“ rovnice se vybírá na základě SEP a r2. 18

Zatímco SEC se vždycky snižuje (tj. zlepšuje) s přidávanými vlnovými délkami, SEP nikoli. Ve skutečnosti SEP většinou dosáhne minima, pak má s přidávanými vlnovými délkami tendenci se znovu zvyšovat tak, jak stoupá nebezpečí overfitting. Směrnice přímky mezi „aktuálními“ versus „predikovanými“ hodnotami by mělo být blízké hodnotě 1,0, což udává, že přímka je postavena k osám pod úhlem 45°. Aby se toho dosáhlo, průměr a směrodatná odchylka validačního souboru by měla být velice podobná těmže u kalibračního souboru. Při výběru „nejlepší“ kalibrační rovnice se používají všechna tato kritéria, přičemž snaha je dodržet co nejmenší počet terms (jako vysvětlitelných proměnných). Jestliže má obsluha přístroje dostatečné zkušenosti s chemickou interpretací NIR spekter, je také vhodné se podívat, které vlnové délky byly vybrány pro rovnice. Jestliže máme dojem, že jsme vyvinuli nejlepší kalibrační rovnici, pak má teprve smysl provést křížovou validaci (cross–validation) souboru, aby se zvýšil počet vzorků a znovu vylepšily údaje při stejných segmentech vlnových délek a matematických úpravách s nadějí, že se tím zlepší dílčí regresní koeficienty (hodnoty B0) v kalibrační rovnici. Pro vylepšení kalibrační rovnice je k dispozici řada postupů, ovšem s jistými omezeními. Např. postupná mnohonásobná lineární regrese (stepwise multiple linear regression) je vystavena řadě nepříjemných vlastností, jako je kolinearita, špatná podmíněnost a overfitting, a stává se vážně nespolehlivou, jestliže údaje referenční metody jsou nepřesné nebo pocházejí z různých laboratoří s různými analytickými finesami. Většinou úspěšnější bývá zavedení regrese dílčích nejmenších čtverců (PLS). Algoritmus PLS redukuje spektrální data do několika málo proměnných. Kalibrační soubor vzorků se může předselektovat na základě samotných NIR spekter, dovolující aby se nechala referenčními metodami analyzovat dostatečně široká kolekce vzorků, avšak nebudou tam zbytečně vzorky, které nepřinášejí další informace. Vzorky pro testování se mohou vybírat podle samotných spekter, aby se definoval rozsah a nejzazší hranice populace. Software ISI poskytuje několik nabídek pro vlastní provedení. 1.9. Ověření kalibrace „na slepo“ Jakmile kalibrace dospěla do konečné fáze, její robustnost se ověřuje na nově vnesených vzorcích se známými referenčními hodnotami. Je však 19

třeba odolat pokušení adjustovat BIAS a SLOPE na základě těchto několika málo vzorků. Obnovení procesu kalibrace má smysl jen v případě, že bude k dispozici podstatně více vzorků s údaji. K průběžné kontrole přesnosti práce přístroje se používá kontrolní (zatavený) vzorek. Mimo něj se čas od času musí odesílat k referenčním rozborům pár vzorků, a na základě referenčích dat se vyhodnocuje přesnost predikce. Pokud se vyskytnou vzorky se zvláštními spektry (odchylně od profilu kalibračního souboru), na základě H–statistiky se pak rozhodneme, zda je vyloučíme nebo s nimi budeme dále pracovat. 1.10. Používání repeatability file při kalibracích Repeatability file (soubor k testování opakovatelnosti) je užitečný pro minimalizaci rozdílů mezi různými NIR přístroji a k minimalizaci vlivu teploty vzorku na kolísání výsledků při rutinní analýze. Další výhodou je, že k němu může být použito mnoho vzorků, aniž by tyto byly analyzovány referenčními metodami. 1.11. Globální, lokální a rozšířené kalibrační rovnice Globální (souhrnné, zvané též širší či univerzální) rovnice se používají při analýze až 95 % různých vzorků daného produktu. Je třeba však počítat s poněkud větší chybou predikce, nicméně ještě stále přijatelnou pro daný účel použití hodnot. Lokální (místní, zvané též užší či speciální) rovnice se užívají pro predikci hodnot v rámci menších souborů vzorků z dané geografické oblasti, nebo jednotlivého botanického druhu, seče, růstové fáze atd. Výběr vzorků pro tyto kalibrace lze provést např. z knihovny spekter podle standardizované hodnoty H nejbližších párů. V rámci těchto jednotlivých populací vzorků se většinou dosahuje větší přesnosti predikce, ale mimo hranice populace přesnost může selhat /25/. Rozšířené kalibrační rovnice představují nový koncept [5]. Jsou odvozeny od globálních či lokálních knihoven produktů, které jsou aktualizovány novými spektry s příslušnými referenčními hodnotami, aniž by měly přístup do souboru knihovny produktů. Rovnice tak jsou otevřeny pro rozšíření kdykoli je to třeba s ohledem na zlepšení BIAS a SLOPE. 20

1.12. Testy na outliery jejich interpretace V podstatě jsou k dispozici 4 testy využitelné při rutinním měření: test sousedství H (neighborhood „H“), globální H, T–test a test odmocnin průměrných čtverců (RMS). Globální H test definuje, zda právě snímaná spektra vzorku jsou příbuzná k průměru spekter kalibračního souboru. Test sousedství H určuje, zda daný vzorek má nějaké „sousedy“ v kalibračním souboru. T–test outlierů ukazuje, zda analyzovaný vzorek má extrémní hodnoty (ve vztahu ke kalibračnímu souboru). RMS test zjišťuje zda jednotlivé „podvzorky“, z nichž byl následně vytvořen jeden směsný vzorek, mají podobná spektra. 1.13. Přístrojové sítě Vývoj kalibrací je poměrně komplikovanou a málo příjemnou záležitostí. Proto se dnes prosazuje přenos kalibrací z řídícího (master) na satelitní (host) přístroj s minimální ztrátou na pohodlnosti ovládání. Jedním z nejdůležitějších požadavků přitom je, aby každý přístroj u daného vzorku dával stejné výsledky. K tomu slouží adjustace vlnových délek v rovnici a koeficientů, takže modifikovaná rovnice se může použít na různých přístrojích aniž by bylo potřeba adjustovat směrnici přímky (slope) a BIAS na referenční hodnoty. Praktickým měřením předchází ověření (např. v kruhovém testu), zda přesnost kalibrace vyhovuje v širším rozpětí vzorků daného produktu, a také aby všechny přístroje, laboratoře i obsluha pracovala naprosto stejně. K tomu musí obsluha projít dodatečným školením a dokonale pochopit technologii. Příkladem z poslední doby je síť různých přístrojů NIR (79 přístrojů Foss–Tecator Infratec a 24 přístrojů Foss–Grainspec), spolupracující s l5 dodavateli kukuřice a sóje ve státě Iowa, USA /27/. Jednotliví účastníci posuzují kvalitu svých měření na základě kontrolních vzorků týdně a na základě kruhového testu čtvrtletně. Odchylka SEP činí v průměru 33 % SEC. Kruhovým testem se zjistilo, že SEC a SEP u účastníků je poloviční oproti referenční metodě. Podobná síť (vesměs přístroje NIRSystems 6500) se vytvořila v EU pro potřeby šlechtění a obchodu s řepkou (stanovují vodu, NL, olej, glukosinoláty). Přenos kalibrací se děje s adjustací BIAS, standardizace podle různých vzorků, kalibrace spekter různých přístrojů pomocí repeatability file /28/. 21

1.14. Rutinní měření Rutinní měření vyžadují, aby přístroj byl řádně nastaven. Denně se kontroluje (před začátkem měření) pomocí check cell. Diagnostika přístroje se provádí alespoň jednou za měsíc. Hladina pozadí (šum, anglicky noise) u NIR s monochromátorem se posuzuje jako BIAS adjustovaný na odmocninu průměrných čtverců (RMS) mezi dvojím scanováním (snímáním spekter) keramické referenční destičky, vyjádřeným ve formě jednotek mikrooptické hustoty (μOD). Typická hodnota RSM pozadí je 20, povrchu vzorku pícnin 200 a opakovaná chyba plnění kyvety suchým semletým vzorkem ca 6 000 μOD. Pozadí tedy činí asi 1 % chyby nasýpání vzorku. Proto opakované plnění vzorků s následným měřením při rutinním měření zpravidla nevede k významnějšímu zlepšení přesnosti NIR analýzy. Většinou u přístrojů NIR v jednom spektru se zobrazuje 32 dílčích scanování, čímž se a priori snižuje chyba scanování. Avšak opakované scanování vede k mírnému zahřívání vzorku, což vyvolává určité změny spektra, zvláště v absorpčních pásech vody. Pokud se instalují kalibrační rovnice pořízené na jiném přístroji, musí se před jejich používáním kontrolovat shoda obou standardizovaných přístrojů (tab. 1). Vzorky s extrémními analytickými hodnotami (vysoké T hodnoty) a nezvyklými spektry (vysoké global H a neighborhood H hodnoty) je potřeba identifikovat. U vzorků s nezvyklými spektry je třeba nechat zopakovat referenční analýzy, a až se jich nashromáždí více než ca 10, může se o ně rozšířit kalibrace. Pokud se jedná o chyby NIR analýzy, jejich možných příčin je celá řada. O jejich identifikaci a odstranění pojednává manuál, dodaný s přístrojem. Překalibrování je nezbytné, jestliže se vyměnil přístroj, u vzorků z kalibračního souboru se objeví více vysokých H–hodnot, nebo výsledky u kontrolních vzorků se nadále dostávají mimo limity. Vzorky pro rekalibraci se vyberou na základě jejich spekter, přičemž neighborhood H hodnoty poslouží k vyloučení vzorků, které jsou již v kalibračním souboru zastoupeny. Vybrané vzorky se nechají analyzovat klasickým postupem. Rekalibrace se provede na rozšířeném kalibračním souboru. Následuje kontrola přesnosti predikce podle nové rovnice, zpravidla častěji než tomu bylo dříve, 22

1. Kontrolní limity (K.L.) pro monitorování NIR měření /13/ K.L. správně fungujícího přístroje

RMS < 30

K.L. pro správnou standardizaci NIR přístroje

SED < 1,3 (hodnota z továrny)

K.L. pro vhodný soubor testovaných vzorků

H průměr < 2,0; žádný vzorek > 3,0

K.L. pro duplicitní referenční hodnoty z jiné laboratoře

SEL < 1,3 (M SEL)

K.L. shody hodnot NIR analýzy a referenční metody

SEA < 1,3 (SEC)

K.L. pro shodu hodnot referenčních metod mezi dvěma laboratořemi

SED < 1,3 (M SEL)

K.L. pro shodu hodnot NIR analýzy mezi dvěma standardizovanými přístroji různých modelů

SED < SEC

Legenda: RMS = odmocnima šumu přístroje; SEC = směrodatná odchylka kalibrace každého konstituentu; SEA = směrodatná odchylka analýzy nebo rozdíl mezi hodnotami analýzy týchž vzorků, analyzovaných pomocí NIR a referenční laboratoře; SED = směrodatná odchylka rozdílu; SED hodnota z  továrny = směrodatná odchylka rozdílu mezi stejnými vzorky, analyzovanými na “master“–instrumentu (tj. tovární etalon) a „slave“–instrumentu (uživatelský přístroj s etalonem srovnávaný) při měření v různém časových termínech; H

= standardizovaná H–statistická hodnota;

SEL = směrodatná odchylka laboratorní referenční hodnoty. (Tato statistika může představovat buď rozdíl mezi duplicitou v jedné laboratoři nebo rozdíl mezi jedním vzorkem analyzovaným ve dvou různých laboratořích). M SEL = směrodatná odchylka slepého duplikátu v „master“–referenční laboratoři.

zvláště pokud měřený produkt se vzorek od vzorku podstatněji liší. Jestliže spektra starého kalibračního souboru už nejsou k dispozici, ale rovnici lze rozšířit, lze k ní dodat nová spektra s referenčními hodnotami (po equation monitoring test) a zlepšit tím přesnost predikce. Protože NIR je spíše fyzikální než chemickou metodou rozborů, v jiných případech není potřeba rekalibrace naléhavá. 23

1.15. Statistika při měření NIR Směrodatná odchylka laboratorního stanovení (SEL) může být vypočtena ze směrodatných odchylek rozdílu duplicitního stanovení referenční metodou u jednoho (či více) vzorku podle vztahu:

√

∑ (L1 – L2)2 SEL = ––––––––– , kde n je počet vzorků. n Jestliže směrodatná odchylka populace vzorků (SDpop) je známá, pak maximum vysvětlitelného rozptylu (r2) se může vypočíst z poměru

√

SEL n (1 – r2) ––––– = ––––––––– , n–2 SDpop kde n je počet vzorků a r2 je koeficient determinace. Podle tohoto poměru lze odhadnout spolehlivost laboratorního stanovení. Tento poměr je analogický k poměru signálu a noise v přístroji NIRS. Jestliže SEL je příliš velká nebo rozptyl u složení SDpop příliš úzký, pak vysvětlitelný rozptyl r2 bude klesat. Jestliže SEL bude činit polovinu hodnoty SDpop, pak přinejlepším hodnota r2 nemůže překročit 0,75. Pokud hodnoty r2 < 0,75, modelování regresí se stává nespolehlivým, což vyvolává potřebu více vzorků a kalibraci NIR se bude hůře validovat. V horní rovnici lze SEL nahradit SEC, která je definována jako:

√

∑ (L – M)2 SEC = ––––––––– , n– 1 – p kde L je laboratorní (referenční) hodnota, M je hodnota predikovaná pomocí NIRS, n je počet vzorků a p je počet členů (terms) v modelu. Jestliže kalibrační model je validován na validačním souboru, SEP se rovná:

√

∑ (L – M)2 SEP = ––––––––– , n

24

SEP(C) =

∑ (L

-M )

- (∑ L - ∑ M ) /n n -1

SEP obsahuje systematický komponent zvaný BIAS.

√

∑ (L – M) BIAS = L – M = ––––––––– n kde L je průměr laboratorního měření a M je průměr měření NIRS. Rozsah nevysvětlené chyby, známý jako SEP korigovaný s ohledem na BIAS (SEP(C)), se rovná:

√

(L – M)2 – ∑L – ∑M)2/n SEP(C) = –––––––––––––––––– n–1 Je třeba připomenout, že rozptyly jsou aditivní, nikoliv standardní chybou. Proto SEC či SEP(C) obsahuje chybu laboratorní (SEL) i chybu z NIR měření včetně procesu modelování (SENIR): SEC či SEP(C) = √SEL2 + SE2NIR Jestliže SEL = SENIR, pak SEC bude činit 1,41 SEL; jestliže SEL = 2 SENIR, pak SEC bude činit 1,12 SEL; jestliže SEL = 0,5 SENIR, pak SEC bude činit 2,24 SEL. Při dobré kalibraci SEP bývá zpravidla dvojnásobně veliká ve srovnání se směrodatnou odchylkou laboratorního měření. Vzdor tomu bývá opakovatelnost měření NIRS lepší než opakovatelnost referenčního rozboru. Např. rutinní měření in vitro DMDTilley&Terry zahrnovalo na 600 vzorků různých druhů trav, z různých lokalit Norska, z různých let. Hodnota r2 pro kalibraci na hodnoty in vitro DMD činila 0,75 a SEC 1,93. Z tohoto souboru bylo měřeno 39 vzorků bojínku každý týden (celkem 20x) jednak referenčním postupem v laboratoři a jednak pomocí NIRS. Naměřené hodnoty se v  prvním případě pohybovaly v rozpětí 75,5–78,9 a ve druhém případě 76,3–76,9. Směrodatná odchylka v prvém případě byla 1,24 jednic, ve druhém 0,39. Rovněž i vzájemný vztah byl velice těsný (r = 0,92) bez systematického posunu (BIAS). Stanovení DMD pomocí NIRS se v tomto světle jeví jako citlivější a vhodnější pro potřeby šlechtění trav (při běžných rozdílech v DMD mezi vzorky o 5–10 %) než laboratorní metoda. 25

2. Chemometrické metody analýzy NIR spekter Lze je rozdělit do tří skupin: 1. matematická příprava k zachování hledané informace a potlačení vlivu vedlejších (nepodstatných) informací obsažených ve spektrech. Jsou to především normalizace, derivatizace (viz kap. 1.3.) a „vyhlazování“ (smoothing) /12/. 2. klasifikační metody, kterými lze vzorky setřiďovat do skupin podle spektrálních charakteristik (kap. 2.1.) 3. regresní metody, které slouží k propojení spektra s kvantifikovatelnými vlastnostmi vzorku (kap. 2.2.) 2.1. Kvalitativní analýza Slouží ke klasifikaci vzorků podle jejich NIR spekter, např. k identifikaci a kvalifikaci surovin i konečných produktů. 2.1.1. Automaticky probíhající klasifikační metody K  vizualizaci dat lze použít např. metodu hlavních komponent (PCA) s cílem snížit počet proměnných (scores) a vzorky zobrazit např. v malorozměrovém grafu (obvykle v oktaedru). 2.1.2. Automaticky neprobíhající klasifikační metody Jsou to metody založené na korelacích nebo na měření vzdáleností (distanční), lineární diskriminační analýza (LDA), dále ty, které kladou více důrazu na podobnost vzorků uvnitř třídy (např. SIMCA), diskriminační analýza částečných nejmenších čtverců (PLS–DA) a umělých neuronových sítí (ANN). ANN je nejmodernější metoda, jejíž algoritmy se dále vyvíjejí. Ze všech predikčních metod poskytuje nejlepší výsledky, avšak pro svou správnou funkci se ke kalibraci požaduje > 500 vzorků. Přední světoví výrobci NIR analyzátorů dodávají s  přístrojem též kalibrační rovnice, vypracované z pečlivě vyselektovaných > 6 000 vzorků pro jeden hodnocený znak. 2.2. Kvantitativní analýza pomocí NIR Nejstarším bylo stanovení obsahu vody ve vzorcích zrnin, a to díky dvěma výrazným absorpčním pásům pro vodu (při 1 450 a 1 940 nm). 26

Z  chemometrických postupů byla dříve hojně využívána vícenásobná lineární regrese (MLR). S vývojem výpočetní techniky však její význam postupně klesá. Jiným postupem je regrese na hlavních komponentách (PCR), zahrnujících v sobě 2 kroky: nejdříve se data zpracují pomocí PCA, poté MLR. PCA sice potlačuje spektrální kolinearitu, avšak hlavní komponenty nemusí korelovat se sledovanou vlastností (obsahem dané látky). Jinou metodou je regrese částečných nejmenších čtverců (PLS) a konečně ANN.

3. Příklady aplikací 3.1. Aplikace na bázi kvalitativní NIR analýzy Predikce botanického složení porostu V první fázi jsme vytvořili knihovnu spekter lučních rostlin. S použitím diskriminační analýzy jsme predikovali hmotnostní podíly (v sušině) agrobotanických skupin (trávy, jeteloviny, byliny) v dvojkomponentních (vojtěškotrávy) a trojkomponentních směsích (vzorky z dočasných a trvalých travních porostů). V binárních (t.j.dvojkomponentních) směsích činil průměr ± směrodatná odchylka laboratorního stanovení podílu vojtěšky 35,45 ± 26,11 % a predikovaný (NIR) 34,90 ± 26,23 %, přičemž vzájemný vztah byl velice těsný (r2 = 0,94; n = 297), SEC = 4,49; SEP = 6,25; BIAS = 0,54 /19/. U ternárních (t.j. trojkomponentních) směsí se přesnost predikce podílu trav a jetelovin pohybovala téměř na stejné úrovni, u bylin byla nepatrně horší, nicméně přijatelná. U některých bylin totiž dochází ke kladnému systematickému posunu (Leonthodon hispidus, Geranium pratense, Galium sp.), u jiných k zápornému posunu predikovaných hodnot (Sonchus asper, Glechoma hederacea, Aegopodium podagraria), v závislosti na molární absorpci některých přírodních látek (rostlinných polyfenolů, terpenů, alkaloidů a j.) – /20/. Nespornou výhodou predikce botanického složení je rychlost (analýza trvá ca 2 minuty, zatímco klasická ruční separace 0,5–1 hodinu), přijatelná přesnost a možnost tyto rozbory provádět mimo pracovní špičku (po semletí usušeného vzorku). S tím souvisí vysoká kapacita měření a nízká jednotková cena rozboru.

27

Predikce olistění ve šlechtitelských programech trav, jetelovin a j. Stanovení podílu listů mechanickou separací od stébel a květenství je rovněž časově náročná práce, jehož výsledek je zatížen chybou až 30 % v  důsledku ztrát při manipulaci i vysýcháním zelené hmoty v  průběhu separace. Proto se šlechtitel často spokojí s vizuálním hodnocením (bodově, stupnice 9–1) na vegetující rostlině. Hmotnostní podílu listů ve sklizené píci lze stanovit pomocí NIR postupem podobným předchozímu: Nejdříve se vytvoří knihovna spekter měřených frakcí , tj. listy (čepele s nebo bez pochev či řapíků), zbylé části rostliny, a celá rostlina. Dále se proměří jednotlivé vzorky. Konečně s použitím diskriminační analýzy se stanoví velmi rychle a přesně olistění v %. Přesnost měření lze dále zvýšit grupováním druhů trav podle morfologických charakteristik (např. „hrubé“, „jemné“ druhy), růstové fáze, a proměřovat každou skupinu zvlášť (viz kap. 2, ad 1), v ideálním případě jeden botanický druh a všechny měřené vzorky ve stejné růstové fázi. Podíly jednotlivých komponent v krmných směsích Aplikace techniky NIR nachází plné využití nejen v krmivářském průmyslu, ale se sílícím tlakem na zdravotní hlediska racionální a zdravé výživy se týká snad ještě více výroby potravinových doplňků, farmaceutického průmyslu (léčivé rostliny a j. suroviny) a dalších výrob. Fyzikální forma příchozího materiálu do výroby je velice pestrá. Ke snímání (zpravidla kontinuálnímu) spektrálních charakteristik se využívá optických vláken či vzorkovacích oken. Nekontaktní technika jednak zabraňuje možné kontaminaci měřeného materiálu a na druhé straně nevystavuje lidskou obsluhu kontaktu s  ním. Konfigurace přístrojového systému i metody měření, vyhodnocování a registrace dat musí být pružné, rychlé a velmi citlivě reagující. Databáze a jednotlivé kalibrace musí dovolovat uživateli rutinní update (doplnit o nejnovější informace, modernizaci). Přírodní materiály se liší mnohdy „pytel od pytle“. Pomocí matematického algoritmu (např. clustrová analýza) se musí stanovit hranice přípustné variability (různých částí rostliny, kvalita extraktů a pod.). Velice zásadní je otázka testování čistoty produktu, např. odlišení kvalitního a drahého ručně sbíraného rostlinného materiálu od komerčního laciného zboží /21/. 28

Mnohým těmto požadavkům vyhovují přístroje NIR lépe než MIR, z nich pak především FT–NIR. Změření jednoho spektra s identifikací u nich netrvá déle než 10 sekund. Navíc FT–NIR světlo proniká do vzorku hlouběji. Jelikož se vzorek úpřed scanováním neupravuje, měří se jak chemické, tak i fyzikální vlastnosti. Odlišení amorfní od krystalické formy Např. u chemikálií, v rostlinách (lignin, SiO2 a j.) – /14/. K tomuto účelu se hodí spíše FT–NIR přístroje. Přetřídění pomíchaných materiálů či rozdělení různorodých souborů do podskupin (viz kap. 2, ad 1). Postup se podobá tomu, který byl popsán u predikce botanického složení porostu. Měření barvy Barva pokrývá spektrální oblast 400–700 nm. Tento segment elektromagnetického vlnění lze rozdělit do šesti oblastí: (1) oblast 400–425 nm je fialová, (2) od 425 do 492 nm je žlutá, (3) od 492 do 575 nm je zelená, (4) od 575 do 585 nm je žlutá, (5) od 585 do 645 nm je oranžová, (6) od 645 do 700 nm je červená. Tyto barevné charakteristiky se měří třemi kritérii (L, A, B). Hodnota L je definována jako jas, A je osa zelená–hnědá, B je osa žlutá–modrá [7]. Tato měření lze provést např. na VIS–NIR přístrojích velice přesně [5], ovšem problém je v tom, že pro hodnocení barvy čerstvé či konzervované píce nejsou k dispozici žádné standardy, umožňující kvantifikaci. Měření výživového stavu travního porostu, vodního stresu rostlin John Shenk nás informoval, že jedna firma v USA dodává NIR přístroj (průmyslový systém II, Direct Light), který při pohybu po greenu snímá v  režimu reflektance spektrální informace (určené barvou, strukturou porostu a pod.) a podle nich operativně vyhodnocuje zásobenost rostlin dusíkem, resp. dodává doporučení (hnojení, zavlažování atd.). Přístroj se údajně těší velké oblibě v oblasti trávníkářského poradenství .

29

3.2. Aplikace na bázi kvantitativní NIR analýzy Stanovení výživné hodnoty krmiv Výživná hodnota píce je významným činitelem, určujícím živočišnou produkci, není však jediným /26/. Proto u jednotlivých parametrů výživné hodnoty se připojuje přívlastek „potenciální“ (stravitelnost, degradovatelnost v bachoru) a v případě měření NIR, že se jedná o predikci (odhad). To nezmenšuje skutečné problémy standardizace krmivářských pokusů u zvířat a přínos metod in vitro k měření těchto důležitých atributů. Predikce obsahu NL je jednou z nejlepších aplikací NIR u krmiv. S několika málo vlnovými délkami lze měřit obsah NL s SEC i < 0,5 % /29/. Dnes se využívá NIR k měření kvality bílkovin a kinetiky degradace v bachoru, ADAS (poradenská služba v zemědělství ve Spojeném Království) nakalibrovala obsah rozpustného N a čpavku v intaktních (mokrých) silážích. Všechny čisté bílkoviny mají zřetelné dva absorpční pásy (2 050 a 2 180 nm) vzhledem k absorpci amidických skupin. Poněkud vyšší chyba predikce dsi a PDIE (tab. 2) jde minimálně z poloviny na vrub určitých nepřesností a technických problémů při měření referenčních hodnot in vivo, použitých ke kalibraci.

2. Predikce výživné hodnoty travního sena (Jevíčko) technikou NIR /35/ x±s

SEP

SEP (C)

r2

Směrnice přímky

NL [g/kg]

151,26 ± 62,52

8,141

7,550

0,990

1,075

tuk [g/kg]

26,70 ± 6,42

2,566

2,277*

0,860

1,188

vlák. [g/kg]

241,26 ± 69,48

19,648

17,805

0,953

1,161

popel [g/kg]

111,84 ± 26,86

9,398

9,365

0,917

1,259

OMD [%]

73,11 ± 8,48

5,232

4,979

0,712

0,780

PDIN [g/kg]

96,22 ± 38,54

10,006

9,026

0,960

1,144

PDIE [g/kg]

88,20 ± 11,98

5,439

4,705

0,850

0,934

ME [MJ/kg]

9,83 ± 0,97

0,452

0,460

0,810

0,832

NEL [MJ/kg]

5,88 ± 0,70

0,371

0,378

0,751

0,808

Konstituent

30

Měření vlákniny a jejích frakcí (NDF, ADF, ADL) poskytuje SEC kolem 1 % (v sušině) a r > 0,9 /25/ pro vztah hodnot NIR a laboratorních (tab. 2). Velice rozšířenou aplikací je měření stravitelnosti. Hojně ji využívají šlechtitelé pícnin a pratotechnický výzkum. Velký podíl spektrální variability je způsoben nehomogeniotou vzorků píce. Při kalibraci je třeba vycházet ze vzorků s dostatečně širokým rozpětím hodnot. Při měření cizorodých vzorků s parametry za hranicemi hodnot, které vykazovaly vzorky použité ke kalibraci to vede k predikci zatížené velkou hodnotou BIAS. Pro naše šlechtitele v širokém rozsahu stanovujeme rovněž i vodorozpustné sacharidy, pozitivně ovlivňující silážovatelnost, chutnost a příjem píce a ne naposledy i její fermentační charakteristiky v průběhu trávení. Protože NIR spektra se silně mění v průběhu stáří píce, lze metodu NIR využít rovněž i k posouzení stáří píce a jejího složení. Jsou zprávy, že s určitou chybou lze predikovat i stupeň zaplísnění sena. SEC pro predikci NEL u rozličné píce činila < 0,5 MJ/kg suš. při přímém odhadu /29/ a < 0,35 pokud se predikoval pouze obsah organických živin a konečný výpočet se prováděl separátně (mimo NIR). Minerální látky se predikovaly podstatně hůře, přičemž prakticky využitelná predikce by přicházela v úvahu pouze u obsahu Ca, P a Mg /29/. Kontraverzní hodnocení v literatuře odpovídá faktu, že v NIR oblasti většina minerálních látek nemá absorpční pásy (pouze holmium a didymium). Protože některé prvky vytvářejí v rostlinách cheláty, organometalické sloučeniny či jsou zabudovány do struktur bílkovin, u intaktních rostlin je jejich měření možné. Z řady obsáhlých studií vyplývá, že NIR predikce in vitro – charakteristik (např. stravitelnost organické hmoty) a charakteristik spojených se zvířetem (např. dobrovolný příjem píce) vyplývá, že se musí brát v úvahu více než jedna referenční metoda /13/, neboť každá v sobě nese určitou chybu. Pak nepřekvapí, že pomocí NIR scanovacího přístroje lze dobrovolný příjem a průběh trávení krmiv v čase u přežvýkavců stanovit velice přesně, dokonce v  některých případech přesněji než pomocí uzančně používaných referenčních metod či jejich kombinací /22/. Nelze však očekávat, že technika NIR je schopna postihnout rozdíly ve stravitelnosti in vivo a v příjmu píce, podmíněném fyzikálními faktory (např. mletím, peletováním). Zahřátí a peletování pozměňuje strukturu píce a zvyšuje rozdíly ve velikosti jednotlivých částic. Peletování se samo o sobě projevuje zvýšením 31

příjmu a snížením stravitelnosti v důsledku rychlejší pasáže vyvolané fyzikálními, nikoli chemickými vlastnostmi /23/. Chyby predikce živočišné odezvy (užitkovosti) bývají obecně větší než chyby predikce chemického složení. Může se na tom podílet už samotné shromažďování dat použitých pro kalibraci i možným výskytem třeba pár outlierů. Pomocí in vivo–dat živočišné odezvy mnohdy nelze znovu prověřit podezřelé vzorky /23/. Je třeba mít na paměti, že kalibrace je prostý matematický postup k tomu, abychom „naučili“ počítač přesně predikovat parametry kvality píce, založený na vztahu mezi jejich NIR spektry a chemickým složením. Proto nelze očekávat, že NIR bude přesně predikovat jakýkoli vzorek či populace vzorků, jejichž charakteristiky nebyly zařazeny do kalibrace. Velice dobře lze pomocí NIR predikovat obsah tříslovin a některých dalších fenolických látek, resp. frakcí (např. IANP /26/, kondenzovaných tříslovin /30/) a nadýmavost jetelovin ve vztahu k obsahu polyfenolů /31/. Celosvětově se však NIR nejvíce využívá k analýze semen obilovin (na prvém místě pšenice, kukuřice, sója), olejnin (slunečnice, řepka) a luskovin /13/. Kvalita semen řepky Zlepšení chemického složení semene řepky je jedním z hlavních šlechtitelských cílů. Při šlechtění na kvalitu jsou ceněny genotypy s vyšším obsahem tuku a bílkovin a nižším obsahem glukosinolátů /30/. Má-li se olej použít pro technické účely, požaduje se navíc vysoký podíl kyseliny erukové, zatímco při použití oleje pro lidskou výživuje třeba obsah kyseliny erukové naopak minimalizovat a zvyšovat obsah kyseliny olejové a linolové. Vyšší obsah kyseliny linolenové není vítaný, neboť s ním klesá uchovatelnost oleje. Na přístroji NIRSystems 6500 (na VS Jevíčko) jsme v  roce 1997 měřili v  režimu reflektance spektrální charakteristiky celých semen řepky a na jejich základě predikovali obsah tuku a glukosinolátů v sušině, resp. obsah kyseliny erukové v triglyceridické frakci (tab. 3). Vzhledem k tomu, že genotypy s vysokým obsahem kyseliny erukové měly odlišná spektra od těch, které vytvářejí více kyseliny olejové a málo erukové, nejdříve jsme odvodili globální (broad) kalibrační rovnici pokrý32

3. Vyhodnocení přesnosti predikce obsahu glukosinolátů (GSL), tuku, kyseliny erukové (podle globální kalibrační rovnice (KE bro) a lokální kalibrační rovnice (KE nar) v celých semenech řepky /32/ n

x

SEC*

r2

SE lab **/

GSL [µmol.g–1 v suš.]

124

32,29

5,31

0,89

3,2

tuk [ % v suš.]

125

46,04

0,44

0,96

0,25

KE bro [ % v triglyceridické frakci]

46

21,40

2,95

0,98

0,6

KE nar [ % v triglyceridické frakci]

27

0,51

0,15

0,74

0,1

* SEC = chyba kalibrace (směrodatná odchylka) **SE lab = chyba laboratorní metody (abs.)

4. Vyhodnocení přesnosti predikce obsahu glukosinolátů (GSL) a mastných kyselin v celém semeni řepky technikou NIR. Jevíčko 2005 n

x

SEP

SEP(C)

r2

Směrnice přímky

GSL [µmol.g–1 v suš.]

160

16,93

2,67

2,73

0,94

0,963

C18:1 (kyselina olejová) [% v triglyceridové frakci]

262

71,80

2,40

2,42

0,74

0,828

C18:2 (kyselina linolová) [% v triglyceridické frakci]

262

15,31

1,89

1,84

0,67

0,888

C18:3 (kyselina linolenová) [% v triglyceridické frakci]

262

4,83

1,13

0,77

0,73

0,908

C22:1 (kyselina eruková) */ [% v triglyceridické frakci]

57

22,45

2,35

2,37

0,98

1,027

* vzorky s obsahem > 5 %

vající celé rozpětí hodnot (0–56 % v triglyceridické frakci). Pro oblast 0–2 % kyseliny erukové, na které má šlechtitel řepky pro potravinářské účely mimořádný zájem, jsme v roce 1997 následně vypracovali lokální (narrow) kalibrační rovnici. 33

Přeložit do češtiny ????? Scatter plot

63

KE (predicted)

47 Slope: 1 027 ASQ: 0,979 SEP: 2 348 CHAS: 0,049 SEP (C): 2 368

31 16 –0 –0

15

31 KE (actual)

46

62

4. Přesnost predikce obsahu kyseliny erukové (KE) % v triglycerické frakci technikou NIR v celých semenech řepky, provedené v Jevíčku v roce 2005: y = predikce NIR, x = plynová chromatografie.

V  dalším období jsme precizovali kalibrační rovnice a v  roce 2005 dosáhli těchto hodnot: při validaci kalibrační rovnice pro predikci kyseliny olejové (C18:1) byla zjištěna příznivě nízká standardní odchylka predikce (SEP) 2,40 % (tab. 4). Tato skutečnost dovoluje využit predikci pomocí této rovnice ke spolehlivé detekci genotypů s  vysokým obsahem C18:1 (nad 70% v triglycerické frakci). Podobně i nízká hodnota (SEP = 1,89 %), dosažená u kyseliny linolové (C18:2) dává předpoklad pro efektivní selekci genotypů s obsahem této mastné kyseliny pod 15 % v triglycerické frakci. Při validaci predikce obsahu kyseliny linolenové (C18:3) pomocí této kalibrační rovnice byla stanovena SEP = 1,13 %. Kyselina eruková (C22:1) byla u erukových řepek predikována s chybou 2,35 % a koeficient determinace predikovaných a laboratorních hodnot činil 0,98 (tab. 4, obr. 4). Oddělené kalibrace obsahu mastných kyselin dovolují stanovení kyseliny olejové a erukové na „bezerukovém“ materiálu, resp. na míchaném materiálu, jako jejich podíl na celkovém obsahu mastných kyselin. Přitom opakovatelnost NIR stanovení obsahu kyseliny erukové činila 1,0 %, glukosinolátů 2,3 %, NL 0,8 % (rel.). 34

Pomocí analýzy NIR tedy lze efektivně detekovat genotypy řepky olejné s žádoucím obsahem mastných kyselin v triglycerické frakci. Měření je dostatečně přesné /36/, vzorky semen mohou být v celém stavu analyzovány současně na řadu důležitých znaků ve velmi krátkém čase (250 vzorků za pracovní směnu), což dovolí zpracovat celou kolekci materiálu během krátkého období a vybrané vzorky ještě týž rok zasít. V  případě, že šlechtitel má k  dispozici jen malé množství vzorku, do měřící kyvety (k jejímu naplnění je potřeba 4–5 g semen řepky) lze vložit kruhovou vložku se středovým otvorem (k jejímu naplnění stačí 0,6 až 0,8 g) *. Tak lze proměřit i vzorky jinak pro nedostatečný objem materiálu, které nelze běžně změřit. Tento způsob měření se na VS Jevíčko v roce 2008 rozpracoval a ověřil k rutinnímu použití. Šlechtitelé obilovin mohou rovněž využít speciální nástavec na měření dokonce jednotlivých zrn, avšak semeno řepky je na rozdíl zrna obilovin k takovému měření příliš malé a výsledek analýzy by byl zatížen nepřijatelně vysokou chybou. Jako drobná finesa se nám osvědčila kondicionace semen (vyrovnání vlhkosti celé kolekce usušených semen po sklizni) na hodnotu < 8 % a vyčištění semen na hodnotu > 98 %, snižující počet potřebných paralelních scanování (≤ 2). Naopak při výskytu barevných odchylek (nedozrálé semeno) bylo třeba provést až 7 paralelních scanování u každého vzorku. Kvalita potravinářských surovin a výrobků K nejlépe predikovatelným parametrům kvality patří takové, které jsou podloženy referenční látkou (např. obsah N podle Kjeldahla), zatímco predikce obsahu látek na základě vlastností v několika stupních laboratorní práce (např. vlákniny) bývá méně reprodukovatelné a při regresní analýze s cílem odvodit dobrou robustní globální kalibraci činí určité problémy. Predikce obsahu vodu byla prvním příkladem praktické aplikace NIR v analýze zemědělských produktů a potravinářských surovin. NIR absorpční spektrum čisté vody má pět absorpčních pásů (s maximy při 1940, 1450, 1190, 970 a 760 nm při 20 °C). V závislosti na teplotě a vazbě vody (rozpouštědlo, voda v matrici) dochází k posunu pásů. SEC pro obsah vody * dodal Dr. P. Tillmann, VDLUFA Kassel

35

v obilovinách, výrobcích z nich, olejninách, chmelu, sladu, bramborových lupíncích, chlebu, sušeném mléce atd. v rozpětí 0–20 % činí 0,1–0,4  %. Ke kalibraci u semleté pšenice se používá optická hustota při 1 940 až 2 080 nm, kdy první údaj reprezentuje absorpční maximum pro vodu a druhý absorpční maximum pro sušinu. Jinou možností je způsob měření T (transmitance) při 800–1 100 nm (obsah vody v pivu, mase, obilí a j.)  průměrem absorpčních pásů 970 nm. Predikce obsahu dusíku: Stanovení bílkovin v pšenici se stala historicky nejvýznamnější aplikací NIR. Dokonce nekvalifikovaný (zaučený) pracovník dokázal pomocí NIR predikovat obsah bílkovin přesněji než byla schopna stanovit zručná laborantka klasickou Kjeldahlovou metodou. To dalo podnět k velké popularitě a zavádění přístrojů NIR do sféry nákupu pšenice a do mlýnského průmyslu. Jestliže směrodatná odchylka Kjeldahlovy metody byla v těchto případech 0,25 %, pokud bylo zrno semleté, pomocí NIR lze dosáhnout SEP 0,20 %. Vhodné aplikace byly záhy rozšířeny na ostatní obiloviny, dále na olejniny, sóju a výrobky z nich. Obsah bílkovin může být měřen též způsobem T při 800 – 1100 nm a síle vrstvy 1 cm (maso) nebo 2 cm (celá zrna). V těchto případech je však SEP vyšší než při způsobu měření R na semletém materiálu. Praktické měření je díky snazší přípravě vzorku při T rychlejší. Predikce obsahu tuku: Hlavní absorpční pásy NIR v olejích a tucích jsou podmíněny povahou mastných kyselin s dlouhým řetězcem, poskytující informaci o CH2 skupině při 1 200, 1 734, 1 765 a 2 345 nm. Pásy při 2 140 a 2190 nm bývají ve spektru olejů, nikoli u parafinu. Tyto jsou vyvolány cis–nenasycenými jednotkami mastných kyselin a  mohou být použity k hodnocení stupně nasycenosti tuků a olejů ve vzorku. Při dnešních postupech se SEP pohybuje kolem 0,2 % obsahu tuku v pekařských výrobcích. Vzdor negativnímu vztahu obsahu oleje k bílkovinám a vodě, absorbance vztahující se k oleji jsou výrazné natolik, že semeno řepky není třeba před NIR měřením šrotovat. Rovněž i při měření tuku (např. ve vepřovém sádle) lze využít způsobu T při 800–1 100 nm. Sacharidy jsou početnou skupinou, která se v potravinách vyskytuje velice hojně, a to v nejrůznějších kombinacích. Protože všechny obsahují C–H a O–H vazby, jejich spektra jsou si velice podobná. Přesto určité rozdíly lze nalézt zvláště v oblasti C–H kombinací. Takové rozdíly byly využity 36

například ke stanovení celulózy v mouce jakožto indexu mlynářské kvality. U přírodních ovocných šťáv se nejčastěji jednalo o stanovení jednotlivých sacharidů. Sacharóza byla mnohokrát stanovována ve víně, čokoládě, v pekařském zboží a laktóza v sušeném mléce. Celkový obsah sacharidů v ovocných šťávách byl měřen též způsobem T při 2 200 nm. V poslední době je NIR nasazována též k měření tzv. DF (dietární vlákniny) s ohledem na zdravou lidskou výživu. Využívá se absorpční pás celulózy (2 336 nm) a dále 1 544 nm. NIR skýtá možnost monitorovat strukturní změny škrobu, ke kterým dochází během výroby a úpravy potravinářských výrobků. Měření ve formě 1/R při 1 934 nm a druhá derivace při 1 414 nm a 1 465 nm bývá v tomto ohledu využívána nejčastěji Dále jsou pomocí NIR predikovány organické kyseliny (ve víně, chmelu, aminokyseliny v potravinářské pšenici), etanol ve víně, pivu i během jeho výroby. Bývají predikovány i příměsi (např. vejce v pastách), anorganické látky, chlorofyl (v semenech řepky), stupeň zaplísnění (podle absorpčních pásů glukosaminu a chitinu). Další aplikace jsou uvedeny v souhrnném referátu /33/. Rozmach v nasazení NIR spektrometrů v  potravinářském průmyslu zažívá hodnocení granulátorů různých druhů potravin a sprejových sušiček. NIR analýza mléka a mléčných produktů má tu výhodu, že tyto vzorky vykazují větší homogenitu a odtud chyba predikce je nízká. Tato rychlá a přesná analýza mléka na tuk, bílkoviny a celkový obsah sušiny se v mlékárenství v USA používá jako AOAC metoda. V zásadě, takto /15/ se stanovuje (1) v mléce přicházejícím do mlékárny obsah tuku, bílkovin a laktózy a podle nich dodavatelům vyplácena cena, (2) provádí standardizace mléka, které jde do výroby a sprejově sušených meziproduktů, v ukazatelích obsah tuku, bílkovin a sušiny, a (3) analýza konečných produktů pro kontrolu, zda tyto vyhovují zákonným předpisům a deklarovaným hodnotám na balení. Kontrola kvality krmiv pro drobná domácí a okrasná zvířata Aplikace techniky NIR ve výrobě i kontrole kvality finálních výrobků – krmiv tzv. „pet-foods“ ve světě nabývá v posledních letech velkého rozmachu. 37

Predikce frakcí C v půdách Literatura přináší řadu důkazů, že predikce obsahu Ntot a organic carbon patří při rozborech půdy pomocí NIRS nejčastěji k úspěšným postupům. Jak ukazuje obr. 5, spektra vzorků minerálních půd (s obsahem < 35 g.kg–1 Ctot ) byla na rozdíl od vzorků řepky a trav nápadně plochá. Tato okolnost spolu s nízkými obsahy Cox, Ctot, Chwl, Ntot a zejména Stot se promítá v poněkud horší predikci u vzorků půdy, které byly před skenováním rozemlety /17/. Mletí vzorků nepřineslo významné zlepšení predikce, spíše se projevilo jako nehodný způsob přípravy vzorku. Z toho lze soudit, že spektrální variabilita vlivem velikost částic je menší v porovnání s variabilitou vlivem chemického složení půdy. V NIR spektrech lze nalézt též užitečné informace o fyzikálních vlastnostech půdy (zrnitost, agregace částic, povrchové vlastnosti). Vedle chemických vlastností i tyto lze efektivně měřit. Vzorky půdy byly měřeny v  celém rozsahu viditelného (400–800 nm) a blízkého infračerveného spektra (800–2 500 nm), neboť počáteční orientace pouze na NIR oblast se pro predikci ukázala jako významně horší. Viditelná oblast přináší cenné další informace pro predikci uvedených vlastností. Přitom půdní vzorky ve svých spektrálních charakteristikách vykazují větší variabilitu uvnitř populace než matrice v pícninách. Půdy se ukazují jako skutečně komplexní směs tvořená minerály, organickou hmotou, vodou a vzduchem v proměnlivém poměru, což reflektuje půdní strukturu a texturu. To se pochopitelně projevuje v nižší přesnosti predikce. Protože vzorky validačního souboru podle „neighborhood H“ mají podobné spektrální vlastnosti jako calibration set, nepřekvapuje, že bylo dosaženo přijatelné přesnosti predikce obsahu Ntot, Cox, Chwl, Ctot. Pouze predikce obsahu Stot byla horší (tab. 5). W. Wenzel z BAL Gumpenstein, Rakousko, nyní vyvíjí metodu monitoringu obsahu vodorozpustných organických látek v půdách a v kombinaci se zásobou N jako podklad pro ekologicky šetrné a opodstatněné doplňování živin s akcentem zásad multifunkčního zemědělství. Rovněž sílí snahy zavedení metody NIR při kontrole Corg–frakcí v  biokompostech /24/ a v kejdě.

38

5, Přesnost kalibrační rovnice pro predikci vybraných parametrů v nemletých půdních vzorcích (jemnozem, částice < 2 mm) Konstituent

Směrnice přímky

r

2,20

0,95

0,80

0,01

2,00

0,99

0,79

0,20

0,01

0,20

0,94

0,84

122,9 ± 39,9

26,80

2,97

26,80

0,90

0,75

0,43 ± 0,12

0,07

0,01

0,07

0,93

0,80

n

x±s

Celkový obsah Cox (g.kg–1)

147

14,2 ± 3,6

Celkový obsah C (g.kg–1)

147

Celkový obsah N (g.kg–1)

147

Celkový obsah S (mgS. g.kg–1)

147

Obsah Chwl */ (gC. kg–1)

147

SEP

Bias

SEP(C)

2,10

0,02

11,6 ± 3,2

2,00

1,4 ± 0,4

*/ Chwl = v horké vodě extrahovatelný uhlík

1,389

Log (1/R)

1,046

řepka (celá semena)

0,703

půda (orná)

0,361

tráva (usušená, semletá) 0,010 408 925

1 449 Vlnová délka (nm)

1 974

2 498

5. Spektra půdních vzorků /17/ v porovnání se spektry řepky a trávy (Nerušil, Jevíčko, nepublikované výsledky)

39

3.3. NIR v systému kontroly deklarované kvality zemědělských a lesnických produktů s chráněnou známkou Kvalita různých delikates, chráněných známkou původu a kvality, musí být v zemích EU kontrolována orgány terénní kontroly a jednak alespoň jednou za rok ve fázi produkce, zpracování či přípravy závaznými laboratorními postupy. Např. ve Španělsku k  výrobě Iberijské šunky se smí používat pouze maso prasat volně se pasoucích na travnatých porostech a sbírajících žaludy ve španělských dehesas (silvopastorální systémy). Typ krmení během finalizačního období výkrmu před porážkou určuje o zařazení šunky do třech komerčních kategorií s odlišnou cenou: „acorn“ (125 €/kg), „recebo“ (60 €/kg) a „koncentráty“ (25 €/kg).. Kvalita a jedinečnost Iberijské vepřové šunky je dozorována regulačním úřadem inspekcí na farmách a  též laboratorním stanovením mastných kyselin (C16:0, C18:0, C18:1, C18:2) v tukové tkáni, dosud plynovou chromatografií (GC). Náklady na GC analýzu a též výkonnost však dovoluje hodnotit jen silně omezených počet vzorků. Nyní se na jatkách i v kontrolních laboratořích stanovují pomocí NIR u každého poraženého kusu /16/. Podobně se kontrolují deklarované vlastnosti olivového oleje podle mezinárodní dohody zatříděného do 9 kategorií. „Extra panenský olej“, který se hodnotí nejvýše a nese ochrannou známku, se snadno, rychle a  spolehlivě odliší pomocí NIR od ostatních, neboť vykazuje obsah volných mastných kyselin < 1 % a PTS (panel test scores) ≥ 6,5. Nicméně, NIR není jediným senzorem potřebným pro provozování a  průhlednost celého zemědělského a lesnického systému hospodaření /16/.

4. Potenciál NIR analýzy a výhled Budoucnost NIR v oblasti krmiv se bude ze suchých semletých materiálů přesouvat zřejmě k měření krmiv in situ (čerstvé píce, mokrých intaktních siláží). Sušením totiž dochází k nekontrolovatelným ztrátám na těkavých látkách (alkoholy, estery, kyseliny, čpavek aj.), přičemž na druhé straně je vysušená hmota silně hygroskopická a rychle přijímá z prostředí vodu. Pokud jde o frakce dusíkatých látek, bude snaha lépe postihnout jejich přeměny v bachoru (bachorová rozpustnost NL) a využití v tenkém střevě. 40

Rovněž kinetiku trávení ve vztahu k dobrovolnému příjmu píce zvířetem (VI) bude možno pomocí NIR zřejmě sledovat lépe. Jelikož VI nelze predikovat s přijatelnou přesností jinými laboratorními metodami, právě do techniky NIR se v tomto ohledu vkládají velké naděje. Rozhodně budou dále rozvíjeny sítě „klonovaných“ přístrojů, přesahující hranice států, využívající společných kalibrací. To otvírá cestu k mezinárodní „harmonizaci“ analýz NIR. Kalibrace, které byly vždycky největší překážkou pro NIR, zřejmě budou nahrazovány novými přístupy, jako využívání samotných spekter ke klasifikaci, klastrování či diskriminačnímu postupu u populací rostlinného materiálu za použití PCA. Přetrvávající nevýhodou NIR je, že se stále považuje za sekundární metodu, poplatnou metodám „mokré chemie“, pocházejících často z minulého století. Tyto referenční metody bývají (pokud se jedná o rozbory krmiv) mnohdy kritizovány, ale postihnout lépe komponenty určující užitkovost zvířat, se vzdor veškerému úsilí o modelování atd. stále nedaří, a budou zřejmě ještě dlouho v tomto stavu používány. Možná, že NIR se bude pokoušet jít též svou cestou, ale to jsou spíše jen úvahy. Jinou nevýhodu se zřejmě v blízké budoucnosti podaří překonat, totiž stacionární umístění přístroje, díky speciálnímu snímání, které umožní přímé vpichy sondy do materiálu bez potřeby jeho plnění do kyvet. Náhrada monochromátoru laserovým zdrojem monochromatického světla dovolí miniaturizaci přístrojů, možnost přenášení a snad také podstatné zlevnění /34/. Potenciál a budoucnost techniky NIR spočívá v rukách výrobců přístrojů, akademické obce výzkumníků, které by měly pomoci mnoha lidem, včetně zemědělské praxi. Její přednosti, včetně šetrného zacházení se životním prostředím (ve srovnání s chemickými rozbory) její nevýhody daleko převyšují. Spektroskopie v blízké infračervené oblasti před 25 lety otevřela novou kapitolu v hodnocení zemědělských produktů a má všechny předpoklady významně se dále profilovat.

41

LITERATURA /1/ Siesler, H. W. – Ozaki, Y. – Kawata, S. – Heise, H. M. (eds), 2002, Near–Infrared Spectroscopy Principles Instruments Application, Wiley–VCH, Weinheim /2/ Siesler, H. W., 2007, Basic Principles of Near-Infrared Spectroscopy. In: D. A. Burns, E. W. Ciurczak (eds): Handbook of Near-Infrared Analysis. 3rd ed. CRC Press, Boca Raton, FL (USA): 7 – 20. /3/ Griffiths, P. R. – Dahm, D. J., 2007, Continuum and Discontinuum Theorie of Diffuse Reflection. In: D. A. Burns, E. W. Ciurczak (eds): Handbook of Near-Infrared Analysis. 3rd ed. CRC Press, Boca Raton, FL (USA): 21 – 64. /4/ Schneider, B. – Štoka, J., 1988, Infračervená a Ramanova Spektroskopie. Analytická příručka II. SNTL, ALFA. /5/ Norris, K. H. – Barnes, R. F., 1976, Infrared Reflectance Analysis of Nutritive Value of Feedstuffs. In: Proc. First Int. Symp. Feed Comp., Utah Agr. Exp. Stn, Logan, p. 237. /6/ Norris, K. H. – Barnes, R. F. – Moore, J. E. – Shenk, J. S., 1976, Predicting forage quality by infrared reflectance spectroscopy. J. Anim. Sci., 43: 889 – 897. /7/ Shenk, J. S. – Westerhause, M. O. – Hoover, M. R., 1978, Infrared reflectance analysis of forages. In: Proc. Grain and Forage Harv. Conf., Am. Soc. Agr. Eng., St. Joseph, MI: 242 – 244 /8/ Shenk, J. S. – Westerhause, M. O. – Hoover, M. R. – Mayberry, K. M. – Goering, H. K., 1978, Predicting forage quality by infrared reflectance spectroscopy. In: Proc. 2nd Int. Green Crop Drying Conf., Univ. of Saskatchewan: 298 – 299. /9/ Čižmár, D., 2006, Využití NIR spektroskopie v zemědělské analytice. Doktor. dis. pr., MZLU Brno, 132 s. /10/ Otto, M., 1999, Chemometrics Statistics and Computer Application in Analytical Chemistry. Wiley-VCH, Weinheim. /11/ Brereton, R. G., 2003, Chemometrics Data Analysis for the Laboratory and Chemical Plant. John Willey & Sons, Chichester. /12/ Massart, D. L. – Vandeginste, B. G. M. – Deming, S. M. – Michotte, Y. – Kaufmann, L., 2003, Chemometrics: a textbook. Elsevier, Amsterodam. /13/ Shenk, J. S. – Workman, J. J., jr – Westerhause, M. O., 2007, Application of NIR Spectroscopy to Agricultural Products. In: D. A. Burns, E. W. 42

Ciurczak (eds): Handbook of Near–Infrared Analysis. 3rd ed. CRC Press, Boca Raton, FL (USA): 347 – 386. /14/ Roggo, Y. et al., 2007, A review of near infrared spectroscopy and chemometrics in pharmaceutical technologies. J. Pharm. and Biomed. Anal., 44: 683 – 700. /15/ Frankhuizen, R., 2007, Analysis of Dairy Products. In: D. A. Burns, E. W. Ciurczak (eds): Handbook of Near-Infrared Analysis. 3rd ed. CRC Press, Boca Raton, FL (USA): 415 – 437. /16/ Garrido–Varo, A. – de Pedro, E., 2007, The Role of Near–Infrared Spectroscopy in Verifying Label Information in Agro-Forestry Products. In: D. A. Burns, E. W. Ciurczak (eds): Handbook of Near-Infrared Analysis. 3rd ed. CRC Press, Boca Raton, FL (USA): 387 – 397 /17/ Kubát, J. – Kohoutek, A. – Nerušil, P. – Nováková, J., Possibilities of determination of the soil organic matter content and quality in arable soils by means of NIR spectroscopy. V tisku. /18/ McClure, W. F., 2007, Analysis using Fourier Transforms. In: D. A. Burns, E. W. Ciurczak (eds): Handbook of Near-Infrared Analysis. 3rd ed. CRC Press, Boca Raton, FL (USA): 93 – 121. /19/ Míka, V., 1997, The use of discrimination analysis for the prediction of botanical composition of grassland sward. In: 8th Int. Conf. on nearinfrared spectroscopy, Poster abstracts, Essen, P21agro. /20/ Míka, V. – Smítal, F. – Nerušil, P. 1998, Predikce botanického složení travních porostů pomocí spektroskopie v blízké infračervené oblasti (NIR). Rostl. výr., 44, 6: 245 – 249. /21/ Kradjel, C., 2007, NIR in the Dietary Supplement Industry: Quantitative Analysis of Ingredients, Process Blends, and Final Products. In: D. A. Burns, E. W. Ciurczak (eds): Handbook of Near-Infrared Analysis. 3rd ed. CRC Press, Boca Raton, FL (USA): 613 – 630 /22/ Abrams, S. M. – Shenk, J. S. – Westerhaus, M. O. – Barton, F. E. II, 1987, Determination of forage quality.by near-infrared reflectance spectroscopy. Efficacy of broad-based calibration equation. J. Dairy Sci, 70: 806 – 813. /23/ Windham, W. R. – Coleman, S. W., 1989, Animal Response Prediction. In: Near Infrared Reflectance Spectroscopy (NIR): Analysis of Forage Quality. USDA ARS Agric. Handbook, No. 643: 32 – 35. /24/ Horst, H. – Pape, H. – Asche, E. – Steffens, D., 1995, Bestimmung organischer C-Fraktionen in Biokomposten mittels Nah-Infrarot-Spektroskopie (NIR). VDLUFA Kongressband. 43

/25/ Paul, Ch. – Míka, V., 1989, Set up NIR calibration populations for predicting protein and net energy content in forage grasses and legumes. Proc. 16th Int. Grassl. Congr., Nice: 903 – 904. /26/ Míka, V. et al., 1997, Kvalita píce. ÚZPI Praha, 227 s. /27/ Hurburgh, Ch. R. et al., 1997, Performance of a network of whole grain NIR unit for coarse rains. . In: 8th Int. Conf. on near-infrared spectroscopy, Poster abstracts, Essen, P16agro. /28/ Tillmann, P. – Paul, Ch., 1997, Networking of NIR instruments for rapeseed analysis using different procedures. In: 8th Int. Conf. on near–infrared spectroscopy, Poster abstracts, Essen, P38agro. /29/ Míka, V. – Paul, Ch., 1989, Hodnocení kvality objemné píce spektroskopií v blízké infračervené oblasti (NIR). Rostl. výr., 35, 10: 1109 – 1114. /30/ Kalač, P. – Míka, V., 1997, Přirozené škodlivé látky v rostlinných krmivech. ÚZPI Praha, 325 s /31/ Míka, V. et al., 2001, Fenolické látky v lučních rostlinách. VÚRV Praha, 116 s. /32/ Míka, V. – Bartko, A. – Nerušil, P. – Smítal, F., 1997, Využití metody NIR pro hodnocení kvality řepky. Rostl. výr., 43, 6: 283 – 286 /33/ Míka, V., 1996, NIR analýza potravinářských surovin. In: Blízkoinfračervená (NIR) spektroskopie (M. Holík, ed.), Letní škola NIR, Kat. teor. a fyz. chem., PřF MU Brno: 19 – 36. /34/ Míka, V., 1998, Mezinárodní konference o NIR spektroskopii. Czech J. Food Sci, 16, 2: 74. /35/ Míka, V., Pozdíšek, J., Tillmann, P., Nerušil, P., Buchgraber, K., Gruber, L., 2003, Development of NIR calibration valid for two different grass sample collections. Czech J. of Anim. Sci., vol. 48, no.10, pp. 419–424. /36/ Koprna, R., Nerušil, P., Kolovrat, O., Kučera, V., Kohoutek, A., 2006, Estimation of the fatty acids content in intact seeds of oilseed rape (Brassica napus L.) lines using near-infrared spectroscopy. Czech J. Genet. Plant Breed. 42 (4): 132–136.

44

Metodika vznikla za finanční podpory MZe a je výstupem řešení výzkumného záměru VÚRV, v. v. i., reg. č.: MZE 0002700601 „Principy vytváření, kalibrace a validace trvale udržitelných a produktivních systémů hospodaření na půdě“.

Autoři:

Ing. Václav Míka, DrSc., Ing. Alois Kohoutek, CSc., Ing. Pavel Nerušil

Název:

Spektroskopie v blízké infračervené oblasti (NIR). Výběr praktických aplikací v zemědělství

Oponent:

Ing. František Novotný, CSc., ÚKZÚZ Brno

Vydal:

Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Drnovská 507, 161 06 Praha 6-Ruzyně

Redakce a sazba: Ing. Vladimír Pokorný, CSc.

Foto na obálce :

Tisk:

Ústavu zemědělské ekonomiky a informací Slezská 7, 120 56 Praha 2

Autor fotografií:

Ing. Alois Kohoutek, CSc.

Náklad:

200 ks

Vyšlo v roce 2008 Vydáno bez jazykové úpravy Kontakt na autory: [email protected] © Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i., 2008 ISBN 978-80-87011-53-9

© Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i., 2008 ISBN 978-80-87011-53-9

Václav Míka a kol.

Spektroskopie v blízké infračervené oblasti (NIR) Výběr praktických aplikací v zemědělství Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i. v Ústavu zemědělských a potravinářských informací Slezská 7, 120 56 Praha 2

2008

METODIKA PRO PRAXI Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i.

2008