informační magazín číslo

informační magazín číslo 6 - 2007

BIOMARKERY V TĚLNÍCH TEKUTINÁCH – JEHLA V KUPCE SENA? DIAGNOSTICKÝ A PROGNOSTICKÝ VÝZNAM THYMIDINKINÁZY (TK) INDIKÁTOROVÉ PROTEINY V MOČI (1)

Současné postavení imunologie v medicíně a možnosti dalšího vývoje Toto číslo našeho časopisu jsme se rozhodli věnovat zejména imunologii, a proto jsme oslovili profesorku MUDr. Jiřinu Bartůňkovou, DrSc., přednostku Ústavu imunologie 2. lékařské fakulty University Karlovy a Fakultní nemocnice v Praze Motole, aby nás seznámila se svými názory na současné postavení imunologie v medicíně a na možnosti dalšího vývoje tohoto oboru. Paní profesorko, jak podle vašeho názoru napomáhá v současné době imunologie ostatním klinickým oborům a pro který obor očekáváte největší přínos? Postavení imunologie mezi tradičními lékařskými obory je stále problematické. Někteří jej považují stále „jen“ za laboratorní obor a skutečně i v některých evropských zemích tomu tak je. Tyto země včetně USA však vyvíjejí obrovskou snahu, aby imunologie byla oborem opravdu klinickým, což odráží pokrok v poznání patogeneze řady chorob. My – myslím tím v České republice – máme určitý náskok v tom, že díky našim učitelům se podařilo již koncem sedmdesátých let minulého století prosadit klinickou imunologii a alergologii jako skutečně klinický obor. Koncepce tohoto oboru, vycházející z mezinárodního doporučení IUIS (Mezinárodní unie imunologických společností), a EFIS (Evropská federace imunologických společností) říká, že alergologie a klinická imunologie je interdisciplinárním oborem a je klinickou i laboratorní disciplinou. Zabývá se studiem, diagnostikou, léčbou a prevencí onemocnění vyvolanými poruchami imunitních mechanismů nebo patologickými stavy, na jejichž vzniku, průběhu a prognóze se imunologické mechanismy významně podílejí. Jsou to stavy, kdy imunomodulace tvoří důležitou část terapie a prevence. Nedílnou součástí oboru je specializovaná laboratorní diagnostika. Laboratorní imunologické vyšetření dává odpověď na některé otázky diagnostické, prognostické a napomáhá při monitorování aktivity onemocnění, respektive účinnosti nasazené terapie. Tím, že imunitní systém je funkční celek, který zasahuje do každé části lidského těla, mohou být projevy imunopatologických stavů opravdu v kterékoliv klasické „orgánové“ lékařské specializaci. Nedá se tedy jednoznačně říci, pro který obor je imunologie největším přínosem. Zobecnit se do určité míry dá, že přínos imunologického laboratorního vyšetření spočívá ve všech oborech medicíny, především ve včasnosti diagnostiky. Laboratorní patologie totiž může dlouhou dobu předcházet klasickým klinickým projevům onemocnění. Cílené a správně interpretované laboratorní vyšetření napomůže časné diagnostice imunopatologických stavů, což umožní klinickým imunologům, alergologům i dalším specialistům, kteří imunologickou laboratorní diagnostiku využívají, přijmout adekvátní léčebná nebo režimová opatření dříve, než dojde u pacienta k nevratnému poškození orgánů. Jak se odráží pokrok v technologiích v laboratorní diagnostice? Laboratorní diagnostika prošla za posledních třicet let významným technologickým pokrokem. Přístrojové vybavení, automatizace a komerční kvalitní reagencie zkvalitnily diagnostiku. Výpočetní technika pak umožnila jednodušší analýzu výsledků a přinesla laboratorní informační systémy. Je však třeba přiznat, že špičkové technologie jsou více přínosné pro výzkumnou práci, než pro zcela rutinní diagnostiku. Automatizace je sice přínosná, ale zejména v imuno-

2


logickém laboratorním vyšetření je stále celá řada metod, které jsou „manuální“ a vyžadují zkušenost laboratorního personálu. Někdy i příliš velká citlivost metodik je na závadu – uvedu například vyšetřování autoprotilátek. Pokud použijeme některou velmi senzitivní metodu, může se stát, že detekujeme „přirozené“ autoprotilátky, které jsou fyziologickou součástí séra, a můžeme při nesprávné interpretaci pacientovi přiřknout diagnózu autoimunitního onemocnění. Některá onemocnění bychom nebyli schopni bez moderních technologií vůbec diagnostikovat. Opět mohu uvést příklad z klinické imunologie – vzácná imunodeficience, deficit membránových adhezivních molekul LAD (absence molekuly CD18) by nešla bez průtokové cytometrie diagnostikovat, stejně tak jako některé další vrozené imunodeficience. Podobně bez technologie průtokové cytometrie se neobejde typizace leukémií a diagnostika POKRAČOVÁNÍ NA STRANĚ 4

Obsah Naše praktické zkušenosti s detekcí autoprotilátek imunofluorescencí

5

Ještě jednou ANCA ... tentokrát z metodického hlediska

6

Tématu stanovení autoprotiátek proti cytoplasmě neutrofilních leukocytů (ANCA) jsme se v našem časopise věnovali na jaře 2006. Od té doby máme k dispozici několik dalších, doufáme, že užitečných, informací.

ASP 1200TM nově v České a Slovenské republice

7

Prostřednictvím naší společnosti uvádí britská společnost The Binding Site na náš a slovenský trh automat na zpracování substrátových skel pro stanovení autoprotilátek nepřímou fluorescenční mikroskopií.

Nové monoklonální protilátky pro průtokovou cytometrii

8

Konjugované protilátky řady IOTest® jsou univerzální reagencie pro průtokovou cytometrii určené pro všechny typy průtokových cytometrů.

Časopis vydává a distribuuje IMMUNOTECH a.s., Radiová 1, 102 27 Praha 10

Časopis připravují Mgr. Jiří Moos, CSc. Mgr. Pavel Kružík Mgr. Patrik Šaf RNDr. Helena Kurzweilová RNDr. Běla Říčařová, CSc. Ing. Petr Suchan Mgr. Markéta Krupařová Ing. Roman Šandrik, PhD. Ing. Kateřina Ťuková Ing. Lukáš Palivec, PhD.

Do časopisu přispěli Prof. MUDr. Jiřina Bartůňková, DrSc., 2. LF UK a FN Motol RNDr. Běla Říčařová, CSc. Mgr. Pavel Kružík RNDr. Marcela Jarešová, IKEM Mgr. Jiří Moos, CSc. Ing. Roman Vlček RNDr. Mária Knapková, NsP F.D. Roosevelta Banská Bystrica MUDr. Dana Kantarská, NsP F.D. Roosevelta Banská Bystrica Prof. MUDr. Ondřej Topolčan, CSc., FN Plzeň MUDr. Jana Granátová, Fakultní Thomayerova nemocnice Mgr. František Vičar Mgr. Markéta Krupařová

Grafická podoba Nina Nováková

Tiskárna REPRO servis s. r. o. Starochuchelská 15/195, 159 00 Praha 5

Náklad čísla 1400 výtisků

Biomarkery v tělních tekutinách – jehla v kupce sena?

9

Termín biomarker se v posledních letech stal, zvláště pak ve spojení s termínem klinická proteomika, jedním z nejfrekventovanějších pojmů v oblasti biomedicínckého výzkumu.

Izolace a purifikace nukleových kyselin metodou Agencourt SPRI

11

Agencourt Bioscience Corporation je jedním z největších automatizovaných sekvenačních center v USA, které patří do koncernu Beckman Coulter. Toto centrum se mimo jiné podílelo na projektu sekvenace lidského genomu (HUGO).

Naše nálezy AFP v plodovej vode a korelácia s fenotypom

12

Štandardizácia prenatálneho biochemického skríningu vrodených chýb v Slovenskej republike

14

Změny hladin thymidinkinázy (TK) v průběhu adjuvantní a paliativní chemoterapie

15

Indikátorové proteiny v moči (1)

18

Stanovení celkové proteinurie je rutinním požadavkem, ne vždy však poskytuje klinickému lékaři dostatečnou informaci. Patologická exkrece plazmatických bílkovin do moče je často projevem renálních i některých extrarenálních onemocnění.

Slavnostní otevření laboratoře v Nemocnici Kyjov

23

Dne 21.března 2007 byla v areálu Nemocnice v Kyjově slavnostně otevřena laboratoř na oddělení klinické biochemie.

Kde se můžeme setkat (červen – září 2007) Konference/seminář s účastí společnosti Immunotech, a.s. formou stánku


3

24

americké Federace klinicko-imunologických společností (FOCIS). V loňském roce jsme byli také akreditováni k postgraduální profesní výuce dle zákona 95/2004 v oboru alergologie a klinické imunologie. Tradicí se stalo každoroční pořádání jarní konference na téma primárních imunodeficiencí (ESID Prague spring meeting), které se stalo platformou pro setkávání vědeckých, laboratorních a klinických pracovníků z východních i západních zemí. Zapojeni jsme také do několika mezinárodních projektů včetně 6. rámcového programu EU.

minimální reziduální nemoci. Na druhou stranu některé nemoci dokážeme diagnostikovat stále pomocí zcela „primitivních“ metodik – například chronickou granulomatózní chorobu (deficit NADPH oxidázy) – diagnostikujeme jednoduchým (a levným) barevným NBT testem pod mikroskopem stejně jako před padesáti lety. Ke konfirmaci pak samozřejmě použijeme moderní metody (např. chemiluminiscenci) a také přesná molekulární diagnostika této choroby je beze sporu závislá na moderních technologiích. Jaké nároky klade zavádění nových technologií na kvalifikaci laboratorních a klinických pracovníků. Jaké největší problémy jsou s tím spojeny? Moderní přístroje jsou zajisté pokrokem a usnadněním laboratorní práce, ale tím více kladou nároky na vzdělání lékařů, ev. přírodovědců, aby dokázali laboratorní výsledky správně interpretovat. A samozřejmě také klinici musí vědět, co indikovat. Spolupráce laboratorních a klinických pracovníků je základem racionální diagnostiky. Technologie, ať již je jakkoliv moderní, nesmí přerůst do samoúčelného vyšetřování. Dnes se bohužel často setkáváme s „převyšetřováním“ pacientů, kteří potom chodí se stohem laboratorních nálezů od lékaře k lékaři a nikdo si s interpretací neví rady. A nezanedbatelný fakt je, že se tato vyšetření účtují zdravotním pojišťovnám, čímž laboratorní komplement, zejména v soukromé sféře, odčerpává ze systému zdravotního pojištění nemalé finance, které pak chybí jinde. Není to samozřejmě chyba laboratoří, ale současného systému, který nemá účinné kontrolní a regulační mechanismy. Jak se na vašem pracovišti kloubí laboratorní a klinická práce? Jakých úspěchů jste v posledních letech dosáhli? Naše pracoviště má laboratoře rutinní a výzkumné a ambulantní složky pro děti i dospělé. Jako součást Fakultní nemocnice v Motole a 2. lékařské fakulty úzce spolupracuje s dalšími ústavy i klinikami. Poskytujeme tedy komplexní laboratorní i konzultační činnost pro hospitalizované i ambulantní pacienty. Snažíme se naplňovat koncepci oboru klinické imunologie a alergologie v celé šíři a propojovat léčebně-preventivní složku s výzkumem a výukou. Právě komplexnost naší činnosti vedla nedávno k uznání našeho pracoviště jako Centra Excelence

4


Jaké výstupy očekáváte v ne příliš vzdálené budoucnosti? V naší výzkumné práci jsme se v posledních deseti letech zaměřili zejména na protinádorovou imunologii, konkrétně na imunoterapii nádorů pomocí dendritických buněk. V rámci preklinických studií jsme se naučili pěstovat z monocytů periferní krve dendritické buňky, optimalizovali jsme přípravu nádorových antigenů a propracovali jsme metodologii postupu u ovariálního karcinomu. Zároveň jsme studovali biologii dendritických buněk za různých podmínek a řadu výsledků jsme publikovali v impaktovaných zahraničních časopisech. Ve výzkumu mají nezastupitelnou úlohu zejména naši postgraduální studenti, dvě studentky letos obhájily na toto téma svoje PhD. Aplikace nádorových vakcín pacientům podléhá zákonu o léčivech, proto bylo zapotřebí vybudovat superčisté prostory, které vyhovují zásadám správné výrobní praxe (GMP). To se nám na sklonku minulého roku díky podpoře vedení fakultní nemocnice a za finančního přispění sponzorů podařilo. V současné době provádíme zkušební přípravu nádorových vakcín v těchto prostorách a připravujeme složité písemné podklady ke schválení klinického protokolu pro Státní ústav pro kontrolu léčiv. I když je stále mnoho otázek kolem vakcinace dendritickými buňkami nevyřešeno, výsledky zahraničních studií ukazují, že je tato metoda v rámci imunoterapeutických postupů jednou z nejúčinnějších. Možnost poskytnout tuto léčebnou metodu jako součást komplexní protinádorové terapie onkologickým pacientům ve FN Motol bych považovala za završení našeho mnoholetého výzkumného úsilí. Děkujeme Vám za rozhovor a za inspirující odpovědi. BĚLA ŘÍČAŘOVÁ [email protected] PAVEL KRUŽÍK [email protected]

Naše praktické zkušenosti s detekcí autoprotilátek imunofluorescencí RNDr. Marcela Jarešová, vedoucí laboratoře imunologické diagnostiky IKEM Praha ednou ze základních metod stanovení autoprotilátek je stále metoda nepřímé imunofluorescence, obecně považovaná za „zlatý standard“. K tomuto účelu se nyní používají výhradně komerční substráty, které dodává na trh množství firem. Dříve používané „home-made“ řezy výhradně připravované z myších a krysích tkání byly nahrazeny komerčně vyráběnými řezy. V nabídce jsou také tkáně opičí, které jsou lidským tkáním bližší, a proto jsou ve většině případů vhodnější. V naší laboratoři používáme převážně substráty firmy The Binding Site, která je naším hlavním dodavatelem. Vzhledem k tomu, že v našem institutu je velkým oddělením nefrologie, velmi často vyšetřujeme kromě ostatních autoprotilátek také autoprotilátky ANCA, a-dsDNA, a-GBM. Ačkoliv při imunofluorescenčním vyšetřování sér přesně dodržujeme postup práce podle návodu výrobce, občas se během naší práce setkáváme s určitými problémy. Při přípravě preparátů musí laboratorní pracovník dbát na to, aby nedošlo ke kontaminaci jamek pozitivní kontrolou nebo jednotlivými séry navzájem. Máme zkušenost, že v případě, kdy jsou jednotlivé jamky sklíčka umístěné blízko sebe (například u 12-jamkových skel), ke kontaminaci může dojít i při největší pečlivosti velice snadno. Proto je výhodnější používat skla, kde nejsou jamky druhé řady přímo pod první řadou, ale jsou trochu posunuté do strany. V minulosti jsme měli období, kdy jsme pozorovali slabě pozitivní obraz C-ANCA na všech polích, včetně negativní kontroly. (Jako pozitivní kontrolu zásadně používáme P-ANCA kontrolu.) Tento problém pak fir-

Obr. 4: Protilátky u paraneoplastického syndromu (namířené proti nekolagenním doménám α-1 řetězce kolagenu IV)

ma The Binding Site vyřešila změnou konjugátu. Při dobarvování preparátu Evansovou modří se nám osvědčilo přidávat do promývací lázně větší množství Obr. 1 :ANCA – negativní kontrola modři (5 – 6 kapek), obraz negativní kontroly je pak (5 - 6 kapek Evansovy modři čistě červený, bez náznaků jakékoliv pozitivity v promývací lázni) (porovnejte obr. 1 a 2). To je důležité pro správné odečtení pozitivních sér pacientů se začínající nebo naopak zaléčenou Wegenerovou granulomatosou (obr. 3). Jistě je výhodou používat soupravu jako celek objednaný od výrobce, protože pak máme zaručeno, že používáme ty správné reagencie. S téměř nevysvětlitelnou záhadou jsme se setkali, když preparáty připravované jednou, jinak velmi precizní laborantkou, začaly mít závoj béžové barvy, který nebylo možné proostřit. Teprve po dlouhém pátrání jsme zjistili, že tato pracovnice začala popi- Obr 2: Negativní kontrola (2 kapky sovat preparáty červeným fixem na sklo místo Evansovy modři v promývací lázni) původní černé a barva fixu (byť určeného na popis skla) se v promývací lázni rozpouštěla. Proto je výhodnější popisovat sklíčka obyčejnou tužkou. Při jakékoliv nejasnosti při odečítání (např. příliš slabá intenzita fluorescence, kdy nelze rozlišit, zda se jedná o granulární fluorescenci či ne), musíme imunofluorescenční vyšetření doplnit ELISA testem. Velmi dobré zkušenosti máme se soupravou na stanovení a-GBM autoprotilátek. Použitím urey dojde na nekolagenních doménách α-3 řetězce kolagenu IV k odkrytí epitopů a tím tedy ke snadnějšímu Obr. 3: C-ANCA v séru pacienta navázání eventuelně přítomných autoprotilátek. s Wegenerovou granulomatosou Signál je navíc zesílený vazbou biotin-streptavidin, takže u pacienta se zaléčeným Goodpasteurovým syndromem byla linie membrány viditelná ještě v okamžiku, kdy ELISA vyšetření již bylo negativní. Protilátky mohou být však namířené proti nekolagenní doméně jiného řetězce než je α-3 řetězec kolagenu IV, například α-1 řetězce (paraneoplastický syndrom) (obr. 4) a v imunofluorescenci vidíme naprosto stejný obraz jako u Goodpasteurova antigenu (obr. 5). Proto je nezbytné každý pozitivní nález na fluorescenci konfirmovat ELISA testem. Výše uvedené příklady jsou jen zlomkem nástrah, které mohou laboratoř při stanovování autoprotilátek potkat. Důsledné dodržování doporučených postupů výrobcem jsou skutečně samozřejmostí a jakékoli odchylky v metodice mohou způsobit nevysvětlitelné záhady, jejichž řešení pak stojí příliš cenného času. V neposlední řadě je důležitá i spolupráce s klinickými odděleními, řádné vyplňování skutečných diagnóz může velmi přispět ke komplexnímu pohledu na věc a může fungovat i jako zpětná kontrola laboratoře. RNDR. MARCELA JAREŠOVÁ, LABORATOŘ

Obr. 5: Autoprotilátky a-GBM (namířené proti nekolagenním doménám α-3 řetězce kolagenu IV)

IMUNOLOGICKÉ DIAGNOSTIKY, IKEM, VÍDEŇSKÁ 800, 140 00 PRAHA 4, E-MAIL: [email protected]


5

Ještě jednou ANCA ... tentokrát z metodického hlediska Tématu stanovení autoprotiátek proti cytoplasmě neutrofilních leukocytů (ANCA) jsme se v našem časopise věnovali na jaře 2006. Od té doby máme k dispozici několik dalších, doufáme, že užitečných, informací. ůležitým mezníkem pro standardizaci tohoto stanovení bylo vypracování závazného mezinárodního doporučení sestav jednotlivých typů testů a testů na ně navazujících a zásad pro jejich vyhodnocování, které bylo publikováno skupinou vedenou Judy Savige v roce 1999 (1). O čtyři roky později byl vydán dodatek k původnímu dokumentu (2) týkající se zásad kontroly jakosti, ověřování specificity imunofluorescentních vzorů a vydávání výsledků. Vedle již zavedeného využití stanovení ANCA v diagnostice vaskulitid předkládá tato publikace možnosti využití ANCA v diagnostice dalších autoimunitních chorob, především zánětlivých střevních onemocnění, autoimunitní hepatitidy 1. typu a dalších. Dodržování doporučených algoritmů při vyšetřování ANCA je skutečně základním předpokladem pro vydávání správných výsledků. Druhým předpokladem pro správné vyhodnocení ANCA jsou konkrétní podmínky laboratorního stanovení. Nepochybujeme o tom, že zajištění vhodných laboratorních podmínek pro spolehlivý záchyt přítomnosti ANCA a správné určení specificity věnují pracovníci laboratoří klinické imunologie u nás velkou pozornost. Při použití metody nepřímé imunofluorescenční mikroskopie (IIFA) má zásadní význam jak dodržování správného postupu a podmínek stanovení, tak volba vhodných reagencií specificky nastavených pro toto použití. Pracovníci výzkumných a vývojových laboratoří společnosti The Binding Site věnují výrobkům určeným pro stanovení ANCA metodou nepřímé imunofluorescenční mikroskopie (IIFA) systematickou pozornost. Před více než 10 lety proběhla revize postupů přípravy substrátových skel s neutrofily (izolace, fixace etanolem nebo formalinem) vylučující aktivaci těchto buněk, v minulém roce došlo i k úpravě konjugátu. Vhodný konjugát je složkou, která má pro výslednou kvalitu preparátů velký význam. Při výrobě konjugátu hraje důležitou roli volba vhodného fluorochromu, optimální molární poměr mezi molekulou imunoglobulinu a fluorochromu i obsah konjugátu v pracovním roztoku; to vše podstatnou měrou přispívá k optimálnímu „výkonu“ stanovení. V polovině roku 2006 uvedla TBS novou verzi konjugátu anti IgG s fluoresceinem pro ANCA (FA003.A). Pro stanovení ANCA je důležitá volba vhodného montovacího média pro imunofluorescenční preparáty. V montovacích médiích pro imunofluorescenční mikroskopii se často s výhodou uplatňuje přídavek polyvinylalkoholu (PVA). Obecně PVA zvyšuje jasnost fluorescence a zlepšuje zřetelnost imunofluorescentních vzorů u buněčných i tkáňových substrátů. Neutrofilní leukocyty jsou

Nepochybujeme o tom, že zajištění vhodných laboratorních podmínek pro spolehlivý záchyt přítomnosti ANCA a správné určení specificity věnují pracovníci laboratoří klinické imunologie u nás velkou pozornost.

6


však výjimkou. Pro stanovení ANCA je tento typ montovacího média zcela nevhodný, protože PVA poškozuje buněčnou strukturu neutrofilů, takže může následně dojít k vytvoření nesprávného imunofluorescentního vzoru a tím k odečtu nesprávného výsledku. Používání montovacího média speciálně určeného pro neutrofilní leukocyty je tedy víc než doporučováno (CON46.2 a CON46.3) Správná laboratorní práce samozřejmě předpokládá používání kontrolních vzorků. Kvalita komerčně dodávaných kontrol musí vyhovovat řadě přísných kriterií; na prvním místě je to pro pozitivní kontroly určené pro IIFA monospecificita – testovaná na odpovídajícím substrátu a dále potvrzená dalšími nezávislými metodami (dál je to vhodné ředění a záruka použitelnosti do data exspirace). Používání tzv. vnitřních kontrolních vzorků (tedy získaných při testování pacientských vzorků v laboratoři) je rovněž doporučováno, ale jen pokud jsou současně použity profesionálně

připravené komerční kontroly. Vnitřní kontrolní vzorky mohou jen těžko splňovat všechna kritéria a spoléhat se z úsporných důvodů jen na ně může představovat značné riziko. Kompletní soupravy pro stanovení ANCA obsahují všechny reagencie specificky nastavené; při objednávání jednotlivých složek samostatně doporučujeme věnovat pozornost nejen specificitě, ale i tomu, k jakému použití je výrobek určen. Zmínka o vhodných podmínkách stanovení rovněž stojí za pozornost, a to především dodržení správné hodnoty pH tlumivého roztoku PBS, která je 7,2. Neodpustím si historickou poznámku. Během téměř 15 let, kdy společnost TBS zastupujeme, jsme se několikrát setkali s problémy nedostatečné citlivosti stanovení ANCA a vždy trvalo delší dobu, než jsme se dopátrali příčiny. Křížovým testováním jednotlivých složek ve standardních podmínkách jsme v těchto případech nikdy nenašli žádnou závadu. V závěru došlo na kontrolu pH PBS: byla kolem 6,5 nebo dokonce nižší. Vzhledem k tomu, že tyto laboratoře používaly totéž PBS také na další tkáňové a buněčné substráty, a to bez problémů, otázka kontroly PBS zůstávala v pozadí. Je dobré mít na paměti, že ze všech běžně používaných substrátů pro IIFA jsou neutrofilní leukocyty nejzranitelnější, tedy že stanovení ANCA provedené i v mírně nestandardních podmínkách může být ohroženo nesprávnými výsledky a že se tato odchylka na odolnějších substrátech nemusí projevit. Ať už používáte pracovní PBS připravený z 20x koncentrovaného roztoku z TBS (při problémech s pracovním roztokem PBS bývá na vině mimořádně nízká hodnota pH destilované vody použité k ředění), nebo jste odběratelem PBS z lékárny, kontrola pH je vždy, kdy výsledky kontrol neodpovídají definovanému obrazu, na místě. Literatura 1. Savige J, Gillis D, Benson E, et al. International Consensus Statement on Testing and Reporting of Antineutrophil Cytoplasmic Antibodies (ANCA), Am J Clin Pathol 1999;111: 507-513. 2. Savige J, Dimech W, Fritzler M, et al. Addendum to the International Consensus Statement on Testing and Reporting of Antineutrophil Cytoplasmic Antibodies. Quality Control Guidelines, Comments, and Recommendations for Testing in Other Autoimmune Diseases, Am J Clin Pathol 2003; 120: 312-318.

ASP 1200TM nově v České a Slovenské republice Prostřednictvím naší společnosti uvádí britská společnost The Binding Site na český a slovenský trh automat na zpracování substrátových skel pro stanovení autoprotilátek nepřímou fluorescenční mikroskopií. Automat ASP 1200TM* je určen pro velké, střední i malé laboratoře. Jde o prostorově úsporný, plně automatizovaný, velmi spolehlivý přístroj, který během své činnosti nevyžaduje přítomnost obsluhy. Jedná se o otevřený systém, kde lze použít různé typy substrátových skel. Rozměry: výška: 50 cm, šířka: 50 cm, hloubka: 55 cm, hmotnost: 19,5 kg Přístroj umožňuje provedení až čtyř různých typů testů současně, testy se mohou lišit dobou inkubace, požadavky na promývání, typem kontrol i typem konjugátu, tím je zabezpečeno docílení optimálních imunofluorescentních vzorů. Maximální kapacita je 96 vzorků. Automat umožňuje jak záchyt přítomnosti autoprotilátek (screening), kdy jednotlivá séra naředí vhodně pro daný typ stanovení, tak stanovení titru pacientského séra, kdy jsou vzorky ředěny geometrickou řadou do zvoleného stupně. Oba typy stanovení mohou probíhat současně. Pro programování a řízení činnosti je ASP1200 vybaven samostatným softwarem. Nastavení softwaru pro pracovní protokoly umožňuje uživateli zvolit si z předem naprogramovaných sestav testů. Sestavy testů výrobce připravuje individuálně podle požadavků konkrétního uživatele, tyto sestavy lze i kdykoliv později upravit nebo rozšířit. Výrobce rovněž zaručuje poskytnout stávajícím uživatelům každou aktualizovanou verzi softwaru. Společnost The Binding Site upravila v předstihu diagnostické IFA soupravy pro použití na ASP 1200 tak, aby objemy všech reagencií umožňovaly bezproblémové zpracování. *ASP1200TM je ochranná známka společnosti The Binding Site Ltd., Birmingham, Velká Británie.

BĚLA ŘÍČAŘOVÁ

BĚLA ŘÍČAŘOVÁ

[email protected]

[email protected]

Obr. 8: Systémové roztoky


7

Nové monoklonální protilátky pro průtokovou cytometrii Konjugované protilátky řady IOTest® jsou univerzální reagencie pro průtokovou cytometrii určené pro všechny typy průtokových cytometrů. Tyto reagencie jsou určeny pro značení povrchových a intracelulárních antigenů. IOTest® Anti-HLA-DR-PC7 Objednací číslo: A40579 Klon: Immu-357 Izotyp: IgG1 Fluorochrom: PC7 (Phycoerythrin-Cyanine 7) Počet testů: 50 testů; 10 μL na test

IOTest® CD138-PE Objednací číslo: A40316 Klon: B-A38 Živočišný druh: myš Izotyp: IgG1 Množství: 100 testů, 20 μL na test

Antigen HLA-DR je exprimován na aktivovaných lymfocytech T, lymfocytech B a monocytech periferní krve, buňkách různých typů leukemií a lymfomů, subpopulacích dendritických buněk periferní krve a lymfoidních tkání. Během vývoje reagencie HLA-DR-PC7 byly také testovány vícebarevné kombinace s dalšími monoklonálními protilátkami včetně tetraCHROME CD45-FITC/ CD4-PE/CD8-ECD/CD3-PC5 (objednací číslo 6607013) a lyzačním systémem IMMUNOPREP v postupu bez promývání. HLA-DR-PC7 je také kompatibilní s postupem VersaLyseTM (Lyse & Fix protocol). Vhodnou izotypovou kontrolou je IOTest® IgG1, PC7, objednací číslo 6607099.

Vysoká exprese antigenu CD138 (Syndecan-1) je typická pro buňky mnohočetného myelomu (Dhodapkar et al., 1998, “Syndecan-1 is a multifunctional regulator of myeloma pathobiology: control of tumor cell survival, growth, and bone cell differentiation“, Blood, 91:2679-2688). Dále je tento antigen exprimován na dlaždicových buňkách epitelu, zrajících lymfocytech B v kostní dřeni a plazmatických buňkách v lymfoidních orgánech. Exprese antigenu CD138 není pozorována na normálních lymfocytech B periferní krve. V doporučeném postupu pro přípravu vzorků se používá reagenční systém pro lýzu erytrocytů VersaLyseTM (Lyse & Fix protocol) s promytím suspenze buněk Vhodnou izotypovou kontrolou je IOTest® IgG1, PE, objednací číslo A07796.

Další monoklonální protilátky s fluorochromem PC7: CD2, IOTest®, PC7

IM3625

CD20, IOTest®, PC7

IM3629U

CD3, IOTest®, PC7

6607100

CD34, IOTest®, PC7

A07509

CD4, IOTest®, PC7

6607101

CD41, IOTest®, PC7

6607115

CD5, IOTest®, PC7

IM3627

CD45, IOTest®, PC7

IM3548U

CD8, IOTest®, PC7

6607102

CD56, IOTest®, PC7

A07508

CD14, IOTest®, PC7

A22331

CD61, IOTest®, PC7

IM3716

CD16, IOTest®, PC7

6607118

CD117, IOTest®, PC7

IM3698

CD19, IOTest®, PC7

IM3628U

Tubulin, IOTest®, PC7

6607114

Kombinace monoklonálních protilátek s fluorochromem PC7 6607119

CD64-PE/CD16-PC7, IOTest®

6607103

CD8-FITC/CD4-PE/CD3-PC7, IOTest®

6607114

CD62L-FITC/CD45RA-PE/CD4-PC7, IOTest®

6607115

CD62L-FITC/CD45RA-PE/CD8-PC7, IOTest®

6607106

CD62L-FITC/CD45RO-PE/CD8-PC7, IOTest®

8


PAVEL KRUŽÍK [email protected]

Vysoká exprese antigenu CD138 je typická pro buňky mnohočetného myelomu.

Biomarkery v tělních tekutinách – jehla v kupce sena? Termín biomarker se v posledních letech stal, zvláště pak ve spojení s termínem klinická proteomika, jedním z nejfrekventovanějších pojmů v oblasti biomedicínského výzkumu. Co je vlastně tak důležitého a zajímavého na hledání nových proteinových biomarkerů?

e to na jedné straně potřeba stále přesnějších a specifičtějších diagnostických metod a postupů, na druhé straně neúprosný tlak ekonomický. Ideální biomarker je protein vyskytující se v krvi pouze u pacientů s jedním konkrétním syndromem/nemocí, nevyskytuje se v měřitelných koncentracích u zdravé populace a jeho asociace s nemocí je 100 %. Navíc se vyskytuje v dostatečné koncentraci (nejlépe g/L) v krevní plasmě/séru, je stabilní, má minimální biologickou variabilitu v populaci … Takový biomarker je samozřejmě dost nepravděpodobný, nicméně můžeme se pokusit se k tomuto ideálu aspoň přiblížit. Proteomické přístupy směřují k novému diagnostickému markeru ve třech krocích: ■ Mezi všemi dostupnými proteiny najít a identifikovat ty, jejichž exprese má vztah k nemoci/syndromu. Neformulovat hypotézu! ■ Mezi kandidátními proteiny vyhledat ten, který může nejlépe sloužit jako diagnostický marker. ■ Připravit soupravu a klinicky ověřit diagnostický postup. Hledání nových proteinových biomarkerů v lidských tělních tekutinách můžeme přirovnat k pověstnému hledání jehly v kupce sena nebo také k hledání několika zlatých zrnek v tunách hlušiny. Důvod je zřejmý: lidský genom obsahuje 30 000 genů, v typické buňce je pak exprimováno asi 10 000 genů. Dalším zdrojem diverzity proteinů je alternativní sestřih mRNA, a na úrovni proteinu pak zejména opracování polypeptidů pomocí proteáz (typicky např. aktivace proenzymů na aktivní enzym) a postranslační modifikace (typicky fosforylace či glykosylace). Nejpoužívanější metodou mapování komplexních proteinových směsí – buněčných lyzátů - je dvourozměrná elektroforéza v polyakrylamidovém gelu (2D PAGE). Při použití této metody se každá forma téhož proteinu, každá postranslační modifikace, projeví jako nový spot = nový protein. Takovéto chápání proteomu je jistě

správné, nicméně musíme očekávat 5x104 – 106 (odhady se liší) různých proteinů v každé individuální buňce. Tím ovšem možnosti variability proteomu nekončí. Metoda 2D PAGE pracuje s denaturovanými proteiny a nezachytí tak nekovalentní interakce proteinů, jako jsou komplexy s dalšími proteiny či vazba nízkomolekulárních kofaktorů a léčiv. Diagnostické metody jsou však obvykle založeny na kvantifikaci nativního proteinu v tělních tekutinách pomocí specifických protilátek a tam se nekovalentní interakce projeví často velmi zásadně. Mezi typické tělní tekutiny pro diagnostické účely zahrnujeme krevní sérum/plasmu a moč. Méně časté, o to však zajímavější matrix, jsou tekutiny jako sliny, mozkomíšní mok, amniotická tekutina, bronchoalveolární laváž či folikulární tekutina. Zůstaneme-li u nejběžněji používané tělní tekutiny - krevní plasmy/séra, více než 50% proteinové hmoty tvoří sérový albumin. Po odstranění 10 nejběžnějších (= abundantních) sérových proteinů (sérový albumin-ALB, Imunoglobulin G-IGG, transferin-TRF, Imunoglobulin A-IGA, Alfa-2-makroglobulin-AMG, Imunoglobulin M-IGM, Alfa-1-antitrypsin-AAT, Apolipoprotein A (I, II)-APA, haptoglobin-HPT, Alfa-2-kyselý glykoprotein/orosomukoid-AAG) zbude přibližně 10 % hmotnosti proteinů, a to je oblast potenciálních biomarkerů. Ve skutečnosti na biomarkery připadá mnohem menší podíl. Snadno se o tom přesvědčíme z literárních údajů i experimentem. Když místo séra použijeme plasmu, která je pro většinu proteomických experimentů vhodnější, a když kromě zmíněných proteinů odstraníme i fibrinogen, zásobárna potenciálních biomarkerů se zmenší na 5-7 % celkové hmoty proteinu. Protože krevní plasma je základ i pro mnohé jiné tělní tekutiny, podívali jsme se, jak významnou součást tvoří sérové proteiny např. v tekutině ovariálních folikulů. Většina abundantních proteinů lidské plasmy/séra je přítomna ve vysoké koncentraci i ve folikulární tekutině. Například sérový albumin představuje dvě třetiny celkové hmoty proteinů a 8 abundantních sérových proteinů představuje 94-95 % hmoty veškerých proteinů folikulární tekutiny – viz. obr. Folikulární tekutina. Na 2D elektroforéze vypadá díky abundantním proteinům lidská plasma/sérum jako poměrně jednoduchá proteinová směs. Ve skutečnosti je pravdou pravý opak. Krev je jednak prostředím pro mezibuněčnou komunikaci a obsahuje jednak proteiny jako cytokiny či růstové faktory, jednak proteiny uvolněné při rozpadu buněk v tkáních či při přestavbě extracelulární matrix. Tyto proteiny jsou ovšem maskovány přítomností abundantních proteinů.


9

Sérum

Folikulární tekutina

Sérové koncentrace

pg/ml

IgY kolonky jsou nabízeny pro odstraňování lidských proteinů (12 proteinů) nebo proteinů laboratorního potkana nebo myši (7 proteinů) ve třech formátech. ■ Spin kolonky s kapacitou 20 μL lidské plasmy a výtěžkem 160 μg celkového proteinu/cyklus. ■ 2 mL chromatografické kolonky s kapacitou 50 μL lidské plasmy a výtěžkem 400 μg celkového proteinu/cyklus. ■ 10 mL chromatografické kolonky s kapacitou 250 μL lidské plasmy a výtěžkem 2 mg celkového proteinu/cyklus. Každá souprava je určena pro 100 cyklů.

Metodika: Problém abundantních proteinů vynikne ještě lépe, srovnáme-li koncentrace Vzorky tělních tekutin byly získány v rámci společnéhlavních sérových proteinů s koncentrací některého existujícího biomarkeru. Jako ho projektu z Centra asistované reprodukce Všeobeczástupce biomarkerů jsme si vybrali Inhibin A v séru pacientek stimulovaných k in né fakultní nemocnice v Praze, řešitel: MUDr. Karel vitro fertilizaci. Koncentrace Inhibinu A jsou srovnávány s koncentrací sérového Řežábek,CSc. albuminu a s koncentrací sérových proteinů podobné velikosti, konkrétně s proteiSpecifické proteiny v séru a folikulární tekutině byly ny o velikosti 40-77 kDa. měřeny na analyzátoru Immage (Beckman Coulter) Ze srovnání je patrné, že koncentrace Inhibinu A jsou od koncentrací nejbližšího a celkový protein na analyzátoru Unicel DxC 800 sérového proteinu vzdáleny více než o 6 řádů. (Beckman Coulter). Inhibin A byl měřen soupravou Protože 2D PAGE i negelové techniky sloužící k separaci proteinových směsí ELISA (DSL). (např. ProteomeLab PF2D) mají omezenou kapacitu vzhledem k množství analyzoJIŘÍ MOOS vaných proteinů, je zřejmé, že se musíme nejprve zbavit abundantních proteinů, [email protected] a pak teprve hledat mezi potenciálními biomarkery. VANDA FILOVÁ Odstranění abundantních proteinů musí být kvantitativní a hlavně [email protected] kovatelné. Beckman Coulter nabízí k odstranění (depleci) abunZájemce o klinickou proteomiku co nejsrdečněji zveme na: dantních proteinů systém, který se nazývá IgY. Jak již název napovídá, systém je založen na depleci proteinů Joint meeting of 3rd Czech Proteomic conference pomocí imobilizovaných slepičích protilátek. Použití sle& 1st Central and Eastern European Proteomic pičích protilátek přináší dvě nezanedbatelné výhody ve srovnání se systémy používající savčí protilátky: Conference ■ lidské a slepičí sérové proteiny jsou si fylogeneticky vzdálenější než lidské a jakékoliv savčí proteiny. Z toho Konference se koná 29.-31. října v Praze v hotelu Top hotel a je organizována vyplývá, že slepičí imunitní systém je lidskými proteiny Proteomickou sekcí ČSBMB. Na jejích stránkách se také můžete zaregistrovat stimulován mnohem účinněji a výsledné antisérum je http://www.czproteo.cz/ pak schopno odstranit abundantní proteiny z plasmy/ séra opravdu kvantitativně. Beckman Coulter je hlavním sponzorem konference ■ Fc fragment slepičího imunoglobulinu neváže složky [email protected] ského komplementu, Fc receptory ani revmatoidní faktor.

10


Izolace a purifikace nukleových kyselin metodou Agencourt® SPRI® pomocí automatizované stanice Biomek® Agencourt® Bioscience Corporation je jedním z největších automatizovaných sekvenačních center ve Spojených státech, které patří do koncernu Beckman Coulter. Toto centrum se mimo jiné podílelo na projektu sekvenace lidského genomu (HUGO).

eagencie Agencourt® využívající technologii SPRI® (Solid Phase Reversible Immobilization) jsou určeny pro izolaci a purifikaci nukleových kyselin v různých typech matric. Princip metody spočívá v navázání paramagnetických partikulí na nukleovou kyselinu v roztoku a jejich následné fixaci pomocí magnetického separátoru. Ostatní složky roztoku mohou pak být odsátím odstraněny ze směsi. Tento postup je společný pro všechny druhy reagencií Agencourt®, ať už určených pro izolaci geonomové či plazmidové DNA, izolaci RNA z tkání či buněk, nebo purifikaci sekvenační PCR reakce či PCR clean-up. Veškeré postupy jsou realizované bez použití filtrace nebo centrifugace a jsou tak přímo předurčeny pro případnou automatizaci těchto metod na automatizovaných stanicích Biomek®.

Nejčastější aplikací zejména v klinických molekulárně biologických laboratořích je izolace geonomové DNA z plné krve. Pro tuto aplikaci je určena reagencie Agencourt® GenfindTM, která je k dispozici ve formátech pro 96-jamkové destičky nebo mikrozkumavky 2 ml, přičemž lze vycházet z 200 μl resp. 400 μl plné krve, a to jak čerstvé, tak i zamražené, s vysokým výtěžkem DNA pohybujícím se v rozmezí 10-15 μg na 200 μl krve. Stejně jako ostatní reagencie Agencourt® je možné i Agencourt® GenfindTM použít jak pro manuální izolaci pomocí klasické pipety, tak s výhodou především na automatizované stanici- pipetoru Biomek® NXP nebo Biomek® FXP. Software automatického pipetoru Biomek® je pro tyto účely doplněn o softwarové okno obsahující kompletní nastavení metody pro izolaci pomocí reagencie Agencourt® GenfindTM, takže uživatel nemusí nastavovat celou metodu pipetace, ale pouze zadá vstupní požadavky pro pipetované objemy. Biomek® NXP a Biomek® FXP mohou pracovat s moduly pro pipetaci pro formát 96-jamek, 384-jamek nebo tzv. Span-8 (pipetovací hlava obsahující na sobě naprosto nezávislých 8 pipet jak z pohledu pipetovaného objemu, tak pozice), případně jejich kombinacemi. Všechny platformy Biomek® jsou ovládany stejným softwarem s intuitivním ikonovým zadáváním pipetačních kroků. Pro purifikaci sekvenační PCR reakce před vlastní sekvenací na genetickém analyzátoru je určen kit Agencourt® CleanSEQ®, umožňující jednoduchou tříkrokovou purifikaci sekvenační reakce. Reagencie Agencourt® CleanSEQ® je optimalizována jak pro systémy Beckman Coulter, tak pro sekvenátory Applied Biosystems (ABI). Výborných signálů sekvenace je při použití Agencourt® CleanSEQ® dosaženo i při významném ředění Big Dye reagencií (ABI). Purifikaci lze automatizovat pomocí platforem Biomek® 3000, Biomek® NXP a Biomek® FXP. Pro tuto aplikaci je rovněž dostupný softwarový modul, umožňující jednoduché zadání metody uživatelem. Více informací lze získat na www.Agencourt.com a www.beckmancoulter.com/ products/specifications/automatedsolutions/default.asp ROMAN VLČEK [email protected]


11

Naše nálezy AFP v plodovej vode a korelácia s fenotypom Úvod

■

Laboratórium prenatálneho skríningu pri Detskej fakultnej nemocnici v Banskej Bystrici a Oddelenie lekárskej genetiky pri Fakultnej nemocnici s poliklinikou F. D. Roosevelta v Banskej Bystrici spolupracujú pri vyhodnocovaní výsledkov prenatálneho skríningu vrodených vývojových chýb. Laboratórium vyšetruje séra aj plodové vody gravidných žien a výsledky vyhodnocuje ako tzv. Triple test, aj ako samotné sérové AFP (MS AFP) a tiež AFP v plodovej vode (AF AFP). Pozitívne výsledky z plodových vôd sú nahlasované Ambulancii rizikovej gravidity a Oddeleniu lekárskej genetiky pri FNSP F. D. Roosevelta. Rozhodli sme sa spracovať obdobie 9. mesiacov roka 2006 z pohľadu laboratórnych nálezov AFP v plodovej vode a genetických nálezov plodu.

■

Metóda Alfafetoproteín je hlavný globulín fetálneho séra. Vstupuje do plodovej vody močom plodu a presakuje cez placentu do materskej cirkulácie. Je produkovaný z väčšej časti pečeňou plodu. Hladiny AFP u plodu a matky sú rozdielne v rôznych obdobiach vývoja plodu. Hladina AFP v plodovej vode dosahuje vrchol okolo 14. – 15. gestačného týždňa, potom klesá. Naopak, hladina AFP v materskom sére kontinuálne stúpa počas gravidity. Prenatálna diagnostika rázštepových vád je založená hlavne na ultrasonografickom gynekologickom vyšetrení pacientky, ale aj vyšetrení alfafetoproteínu v sére a plodovej vode. AFP preniká v dôsledku porušenia integrity povrchu plodu a komunikácie likvorového priestoru plodu s plodovou vodou vo zvýšenom množstve do plodovej vody a krvi matky. Hladina AFP je zvýšená pri rázštepových defektoch neurálnej trubice (anencefália, myelokéla, meningomyelokéla), defektoch brušnej steny (gastroschíza), fetálnom alebo placentárnom krvácaní a pri viacplodovej gravidite. Plodová voda tvorí najobjemnejšiu súčasť extracelulárneho fetálneho priestoru. Má dôležitý význam pre vývoj jednotlivých orgánov, aj pre celkový rast plodu. Tvorba, obmena a resorbcia plodovej vody je spoločným podielom matky a plodu. Na tvorbe plodovej vody sa podieľa: ■ priama filtrácia z materskej plazmy ■ prenikanie z fetálnej plazmy kožou plodu ■ prehĺtanie plodovej vody, vylučovanie obličkami plodu (plod do plodovej vody močí) Obrázok č.1.

dýchacie ústrojenstvo – spätná resorbcia pľúcami pupočník

Množstvo plodovej vody je stanovované ultrazvukom (napr. „technikou štyroch kvadrantov“) ako tzv. AFI – index plodovej vody. Hodnotí normálny, zvýšený a znížený objem plodovej vody. Normálne množstvo plodovej vody v 35. – 38. gestačnom týždni je 1000 ml, v 40. gestačnom týždni cca 800 ml. Zmeny objemu plodovej vody sú v zmysle zníženého objemu – oligohydramnion, až neprítomnosť plodovej vody – anhydramnion a zvýšeného objemu – polyhydramnion. Hladina AFP v plodovej vode môže byť zvýšená pri oligohydramnione, ako falošná pozitivita. Spracovanie plodovej vody Odber plodovej vody vykonávame na špecializovanom pracovisku ultrasonongrafie príslušného gynekologického oddelenia. Materiál je doručený do Cytogenetického laboratória Oddelenia lekárskej genetiky, kde sa stanovuje karyotyp plodu. Plodová voda sa centrifuguje, sediment sa naloží na kultiváciu amniocytov s výslednou karyotypizáciou. Plodová voda, určená na genetickú kultiváciu karyotypu, nesmie byť po odbere zmrazená. Supernatant plodovej vody je odoslaný do laboratória na vyšetrenie AFP. Pokiaľ sa nevyšetrí do 12 hodín od odberu, musí byť zmrazený pri -20 °C. Analýza AF AFP AFP v plodovej vode vyšetrujeme pomocou kitu IRMA AFP MONOCLONAL firmy Immunotech Beckman Coulter. Ide o imunorádiometrické in vitro

Graficke znázornenie pozitivného skríningu

12


stanovenie s dvomi monoklonálnymi protilátkami v dvojkrokovom stanovení. Viazaná aktivita I125 je meraná gamameračom. Koncentrácia AFP v IU/ml sa odčíta z kalibračnej krivky a je priamo úmerná odmeranej rádioaktivite. Plodová voda je nariedená fosfátovým pufrom 1 : 100. Výsledky AF AFP vyhodnocujeme softwarom, ktorý hodnotí referenčný rozsah hladiny AFP v plodovej vode v jednotlivých gestačných týždňoch gravidity. Hodnotíme 17. – 22. gestačný týždeň. Pozitívne výsledky sú hodnotené ako znížené alebo zvýšené. Gestačný Rozsah hladiny týždeň AF AFP v IU/ml 17 7000 – 18000 18 6000 – 14000 19 6000 – 13000 20 5000 – 12000 21 4000 – 11000 22 2000 - 10000

Výsledky V období od januára do konca septembra 2006 sme vyšetrili hladinu AFP v 259 plodových vodách. Boli odobraté v 17. – 22. gestačnom týždni gravidity. Vyšiel nám pozitívny výsledok u 55 pacientiek (21 %). Korelácia pozitívneho skríningu s genetickým nálezom Pozitívny skríningový výsledok bol vyhodnotený u 55 pacientiek. Potvrdené patológie plodu genetikom boli u 10 pacientiek. Pozitívne prediktívna hodnota, ako podiel skutočne pozitívnych ku súčtu skutočne pozitívnych a falošne pozitívnych predstavuje 15,38 %. PPV = 10/55+10 PPV = 15,38 % Pozitívne prediktívna hodnota u zníženej hladiny AF AFP predstavuje 16,21 %. Pozitívne prediktívna hodnota u zvýšenej hladiny AF AFP predstavuje 22,2 %. Distribúcia patologických hodnôt AF AFP v grafickom znázornení.

Chromozomálne aberácie tvoria v našom súbore polovicu záchytov, tieto sú vždy potvrdené cytogeneticky. Hodnoty AF AFP u chromozómových aberácií sa pohybovali v rozsahu 0,2 - 0,4 MOM, hodnoty rázštepových aberácií a iných vád sa pohybovali v rozsahu 1,87 – 4,2 MOM. Indikácie, ktoré viedli ku odberom plodovej vody boli nasledovné Pozitívny Triple test Vek USG pozit MS AFP Genetická indikácia Toxoplazmóza Farmakologická indikácia IVF

19 19 10 2 2 1 1 1

Patologické nálezy z karyotypizácie plodových vôd, vyšetrené v Cytogenetickom laboratóriu Oddelenia lekárskej genetiky sú zhrnuté v nasledujúcej tabuľke: Prenatálne zistené chyby celkom 10 Chromozomálne vady celkom 5 Trisomia 21 2 Trisomia 18 1 Turnerov s. 1 XYY 1 Rázštepové VVCH celkom 4 Gastroschisis 2 NTD 2 Iné: holoprosencefália s fac. dysmorfiou 1 Z potvrdených nálezov je skríningom zachytená diagnóza lipomeningomyelokéla, anomália krytá kožou, ktorá nebola viditeľná pri sonografickom vyšetrení. Nález bol najprv zachytený Triple testom, riziko NTD 1 : 160 a následne aj v plodovej vode v 19. týždni gravidity, MoM 1,87. Zaujímavý je záchyt VVV centrálneho nervového systému – holoprosencefália s faciálnou dysmormfiou. Indikáciou ku odberu plodovej vody bol pozitívny nález ultrasonografie, AF AFP malo hodnotu 2,60 MoM, diagnóza bola potvrdená patologicko-anatomickým vyšetrením. Chromozomálne aberácie tvoria v našom súbore polovicu záchytov, tieto sú vždy potvrdené cytogeneticky.

Záver Pozitívne prediktívna hodnota AF AFP v našom súbore bola 15,38 %. Riziko patológie plodu u rázštepových vád bolo 22,2 %, u chromozómových aberácií 16,21 %. Patologické nálezy AFP v plodovej vode a ich korelácia s fenotypom priniesli zaujímavé výsledky. Odhalili sme významný počet vrodených vývojových chýb plodu z relatívne malého súboru vzoriek. Náš nález potvrdzuje význam spätnej väzby laboratórneho výsledku a klinickej diagnózy. Naďalej budeme porovnávať a vyhodnocovať skríningové nálezy AF AFP s genetickým záverom. RNDR. MÁRIA KNAPKOVÁ, E-MAIL: [email protected] PRIM. MUDR. DANA KANTARSKÁ, E-MAIL: [email protected] NSP F.D. ROOSEVELTA BANSKÁ BYSTRICA, NÁM. GEN. SVOBODY 1, 975 17 BANSKÁ BYSTRICA


13

Štandardizácia prenatálneho biochemického skríningu vrodených chýb v Slovenskej republike. (Odborné usmernenie MZSR 2006) zistili aj zvyšovanie záchytu chromozómových abeDiagnostika vývojových chýb plodu (VVCH) v gravidite sa vykorácií. V súčasnosti je záchyt chromozómových abenáva buď priamo (sonografický skríning, laboratórne genetické rácií na úrovni okolo 3 % z počtu PGD. vyšetrenie), alebo nepriamo (sonografické a/alebo biochemické Významný impulz pre štandardizáciu výkonu PGD markery pre VVCH). Cieľom biochemického skríningu je vypočítať v II. trimestri gravidity prináša novoprijaté Odborné individuálne riziko pre VVCH, najčastejšie Downovho syndrómu usmernenie MZSR o prenatálnom multimarkerovom (DS) a rázštepu nervovej trubice (NTD). O vypočítanom individuálskríningu vrodených vývojových chýb (VVCH), (Vestnom riziku VVCH a paušálnom populačnom riziku VVCH informujeme ník MZSR 2006, 122, čiastka 56-60, 15. novembra tehotnú ženu. 2006). Odborné usmernenie 2006 vyjadruje zásadnú Zvýšené riziko VVCH nad určitú hranicu je indikáciou na ponuku špecializovapožiadavku na štandardizáciu výkonu skríningu všeného vyšetrenia, napríklad prenatálneho vyšetrenia chromozómov plodu, DNA obecne a menovite biochemického skríningu VVCH. analýzu alebo sonografiu s vysokou rozlišovacou schopnosťou. Ak má tehotná Zdôrazňuje sa uplatnenie systému kontroly správnej žena o špecializované vyšetrenie záujem, tak po podrobnej konzultácii tieto klinickej a laboratórnej praxe. Tento zámer je presne vyšetrenia vykonáme. definovaný pre podmienky vykonávania základného Pre výpočet rizika DS pomocou biochemického skríningu sa používa vyšetrenie „povinného“ skríningu v II. trimestri. tzv. biochemických markerov. Je ich viacero a triedia sa na markery I. a II. trimesOdborné usmernenie reaguje aj na najnovší vývoj tra. V období I. trimestra sa najčastejšie používa vyšetrenie tehotenského plazmav skríningových stratégiách, ktoré sa posúvajú do I. tického proteínu A (PAPP-A) a voľnej beta podjednotky hCG (free beta hCG). trimestra. Skríning VVCH v I. trimestri je veľmi V druhom trimestri sú to alfa-l-fetoproteín (AFP), choriongonadotropín (najčaspožadovaný, významne efektívny, vyžaduje kontrotejšie total hCG), nekonjugovaný estriol (uE3) a inhibin A. lovanú kvalitu vo výkone merania sonografických Výkon prenatálneho skríningu VVCH bol do roku 2006 odvodený od Odbornémarkerov, preto je aj omnoho náročnejší. Úloha ho usmernenia MZSR o preventívnych prehliadkach v odbore gynekológia kvality tímu a jeho spolupráca sú tu extrémne a pôrodnictvo z roku 1996 (Odborné usmernenie MZ SR zo 16.2.1996 : Prevendôležité. Vyžadované špecializované sonografické tívne prehliadky v odbore gynekológia a pôrodníctvo: Skríningové vyšetrenie vyšetrenia a náročné biochemické parametre neutehotných: v 16.–20. týždni gravidity: odber krvi na AFP (VVCH)). možňujú plošnú organizáciu skríningu v I. trimestri V tom období bola povinnosť skríningovo vyšetriť len AFP ako jeden skríningona úrovni praktického gynekológa. Skríning v I. trivý parameter. Postupne sme vďaka aktivitám laboratórnych pracovísk došli ku mestri sa spravidla poskytuje v špecializovaných rozvoju skríningu a používaniu viacerých skríningových parametrov (hCG, estricentrách. Z toho dôvodu Odborné usmernenie 2006 ol), ako aj špecializovaného softvéru na výpočet individualizovaného rizika Dowzatiaľ len charakterizuje vyšetrované markery novho syndrómu. Najčastejšie sa v SR používa softvér ALPHA (Logical Medical a správny postup. Zdôrazňuje sa nutnosť certifikátu Systems Ltd, London, UK). Tato snaha pracovísk však nestačila, pretože zhruba na pre sonografické vyšetrenie nuchálnej translucencie polovici územia SR sa ešte v roku 2006 vykonával biochemický skríning len (NT) a výpočet rizika pomocou špecializovaného vyšetrením AFP. softvéru. V posledných rokoch sme taktiež konštatovali, že biochemický skríning VVCH je Skríning VVCH v II. trimestri zostáva základom. Za v SR vykonávaný v obmedzenom rozsahu a existujú mimoriadne veľké regionálne minimálny rozsah výkonu sa považuje vyšetrenie rozdiely v dostupnosti. Ukázalo sa, že Odborné usmernenie MZSR z roku 1996 je AFP a hCG a výpočet rizika sa musí vykonávať pomouž prekonané. Chýbala nám požiadavka na kontrolu kvality výkonu biochemického skríningu, ktorá by definovala detailný miniTýždeň gravidity 11 12 13 15-18 málny záväzný vykonávací algoritmus. Našu požiadavku na samostatné Odborné Skríningová stratégia % záchytu usmernenie MZSR o biochemickom skríningu Kombinovaný (NT+PAPP-A+freebeta hCG) 87 VVCH potvrdzovali aj používané indikácie na preKombinovaný (NT+PAPP-A+freebeta hCG) 85 natálne cytogenetické vyšetrenia (PGD). V roku 1991 sme v SR vykonali 1298 PGD a v roku 2006 to Kombinovaný (NT+PAPP-A+freebeta hCG) 82 bolo 3000 takýchto vyšetrení. V rokoch 1991-1999 Quadruple (AFP+hCG+E3+inhibin A) 81 bol dominantnou indikáciou PGD vek matky nad Sekvenčný (kombinovaný + quadruple) 87 85 82 95 35 rokov (44 %) a „pozitívny biochemický skríning“ bol indikáciou len u 30 % výkonov PGD. V roku Integrovaný biochemický (všetky biochemické) 88 2006 bol vek matky indikáciou u 40 % výkonov Integrovaný kombinovaný (sono + biochémia) 96 PGD ale „pozitívny biochemický skríning“ už u 46 % (NT= nuchálna translucencia) výkonov PGD. V období rokov 2002 až 2006 sme

14


Skríning VVCH v I. trimestri je veľmi požadovaný, významne efektívny, vyžaduje kontrolovanú kvalitu vo výkone merania sonografi ckých markerov... cou certifikovaného softvéru. Odber krvi a zadanie potrebných údajov pre výpočet rizika VVCH organizuje praktický gynekológ. Vyšetrujúce laboratóriá majú byť zapojené do externého hodnotenia kvality a musia spĺňať požiadavky správnej laboratórnej praxe. Hodnotiace pracovisko má vykonávať najmenej 1000 hodnotení skríningov ročne, aby sa zabezpečilo spoľahlivé určenie mediánov stanovovaných analytov pre daný gestačný vek. V oblastiach so sťaženou transportnou dostupnosťou a počtom vyšetrení 500 -1000 ročne má byť pracovisko napojené na najbližšie štandardizované hodnotiace pracovisko. Usmernenie definuje aj úlohu genetika v tom, že indikáciu na prenatálne genetické vyšetrenie stanovuje lekár-genetik v spolupráci s gynekológom. Genetik má totiž za úlohu zabezpečiť genetické testovanie plodu štandardným spôsobom. Má teda vykonať genetickú konzultáciu pred PGD a odbornú interpretáciu výsledkov genetického vyšetrenia plodu . Aktuálny stav výkonu skríningu v SR sa zohľadňuje pri jednaniach so zdravotnými poisťovňami o financovaní niektorej skríningovej stratégie. Podľa súbornej práce Malone F.D. et al (2005) sa zisťuje záchytnosť DS, pri výbere na úrovni 5 % falošnej pozitivity, podľa rôznych skríningových stratégií v tabulke. Štandardizovaný výkon skríningu podľa Odborného usmernenia 2006 umožní v SR prenatálne odhaliť teoreticky okolo 60 % prípadov DS. Pri zohľadnení záujmu zo strany populácie a ostatných faktorov je reálne očakávať prenatálnu záchytnosť DS medzi 40 – 50 %. Ďalšie zvýšenie záchytnosti DS a iných chromozómových aberácií alebo VVCH je možné len rozšírením využívania prenatálneho skríningu v I. trimestri. Literatúra: Malone F.D. et al.: First-Trimester or Second-Trimester Screening, or Both, for Down´s Syndrome, N Engl J Med 353, 19,Nov 10,2005 s. 2001-2011. PRIM. MUDR. FRANTIŠEK CISÁRIK, CSC., ODDELENIE LEKÁRSKEJ GENETIKY, NSP ŽILINA, V. SPANYOLA 43,012 07 ŽILINA, E-MAIL: [email protected]

Změny hladin thymidinkinázy (TK) v průběhu adjuvantní a paliativní chemoterapie u kolorektálního karcinomu Úvod Thymidinkináza (TK) je důležitý enzym v metabolismu nukleových kyselin, a je proto považována za významný marker buněčné proliferace (1,2). Rozhodli jsme se proto sledovat dynamiku thymidinkinázy v průběhu adjuvantní a paliativní chemoterapie u pacientů s kolorektálním karcinomem.

Materiál a metodika Thymidinkináza byla sledována u 30 nemocných s diagnózou karcinomu tlustého střeva a rekta a léčených chemoterapií na Oddělení onkologie a radioterapie Fakultní nemocnice Plzeň. Thymidinkináza byla stanovována radioreceptorovou analýzou (RRA, Immunotech Praha). Podmínkou zařazení do studie bylo, že thymidinkináza byla sledována vždy před zahájením cyklu chemoterapie a po jejím skončení, a to u 3 cyklů adjuvantní či paliativní chemoterapie. Jednalo se vždy o režim s 5-fluorouracilem (De Gramonte, Mayo režim). Hodnoty TK byly korelovány s klinickým průběhem onemocnění a s typem terapie.

Výsledky Základní charakteristika souboru nemocných je uvedena v tabulce č. 1. V následujících grafech jsou uvedeny jednotlivé hodnoty u všech 30 nemocných před a po jednotlivých cyklech. Z grafu č. 1 až 3 vyplývá, že ve většině případů byly hodnoty na začátku 1. cyklu nízké a výrazně stoupaly až po skončení 1. cyklu chemoterapie. Do následujícího cyklu hodnoty opět klesly. Obdobnou dynamiku jsme zaznamenali po druhém i třetím cyklu chemoterapie. Na základě těchto dynamických změn byly hodnoty thymidinkinázy korelovány s typem chemoterapie (adjuvantní, paliativní) a klinickým průběhem onemocnění. Příklady typických změn hodnot thymidinkinázy před a po adjuvantní chemoterapii jsou uvedeny na grafu č. 4. Charakteristické změny pozorované při paliativní chemoterapii jsou na grafech č. 5 a 6. U adjuvantní chemoterapie byly hodnoty thymidinkinázy při zahájení každého cyklu terapie nízké a po skončení terapie vždy vysoké (viz graf č. 4). U paliativní chemoterapie byla dynamika hodnot TK různá. Obecně lze konstatovat, že pokud se dynamika TK u paliativní chemoterapie podobala typické dynamice adjuvantní terapie, zaznamenali jsme u pacientů příznivou odpověď na léčbu. Pokud zůstávaly hodnoty trvale vysoké či dokonce vzrůstaly, nebyla zaznamenána terapeutická odpověď (viz grafy č. 5 a 6). Současně s thymidinkinázou jsme u nemocných sledovali i další nádorové markery (CEA, CA 19-9, TPA, TPS). Tato sledování nejsou součástí tohoto sdě-


15

Graf č. 1: Vzestup thymidinkinázy v průběhu prvního cyklu chemoterapie

Graf č. 2: Vzestup thymidinkinázy v průběhu druhého cyklu chemoterapie

Thymidinkináza se jeví jako vhodný parametr pro kontrolu efektu adjuvantní a paliativní chemoterapie kolorektálního karcinomu. lení, ale v souhlase s literaturou jsme prokázali, že při adjuvantní i paliativní chemoterapii vykazují tyto markery na rozdíl od TK poměrně malou variabilitu.

Diskuse

Graf č. 3: Vzestup thymidinkinázy v průběhu třetího cyklu chemoterapie

Graf č. 4: Vzestup thymidinkinázy v průběhu adjuvantní chemoterapie (6 cyklů)

Na základě našich výsledků a údajů z literatury je zřejmé, že thymidinkináza je použitelná pro sledování průběhu a efektu chemoterapeutické léčby (3,4). Zdá se, že je jediným markerem, který lze použít u adjuvantní terapie, vzhledem k tomu, že u těchto nemocných jsou ostatní nádorové markery, včetně cytokeratinů, v mezích normy a vykazují minimální variabilitu. U paliativní léčby sice ke změnám ostatních nádorových markerů dochází, ale dynamika změn je podstatně pomalejší a méně signifikantní, než jsou pozorované změny thymidinkinázy. Z těchto důvodů většina autorů sledování nádorových markerů pro monitoraci terapie nedoporučuje (5, 6). Pokud jsou údaje o vztahu nádorových markerů k efektu terapie, jde o hodnocení hladin markerů získaných nejméně tři měsíce po skončení terapie (7). Taková sledování umožňují hodnocení konečného efektu chemoterapie, ale nehodí se pro individualizaci a optimalizaci terapie (8). Thymidinkinázu lze k tomuto účelu použít především proto, že má krátký biologický poločas a účastní se při syntéze DNA (9,12). U nádorů kolon a rekta souvisí přítomnost thymidinkinázy a thymidylát syntetázy přímo s etiopatogenezí nádoru a je diskutována i otázka využití thymidinkinázy v léčbě (10,11). Naším dlouhodobým cílem je vypracovat systém optimalizace a individualizace terapie pomocí sledování změn biologické aktivity nádorového procesu.

Závěr Ze sledovaných nádorových markerů se v průběhu chemoterapie typicky měnila pouze thymidinkináza, která u adjuvantní chemoterapie byla většinou nízká při zahájení cyklu a po skončení cyklu obvykle docházelo k výraznému zvýšení hodnot. Naproti tomu u paliativní chemoterapie byla dynamika thymidinkinázy různá a závisela především na efektu terapie. Ostatní nádorové markery se chovaly nestandardně a se změnami

16


TK korelovaly minimálně. Thymidinkináza se jeví jako vhodný parametr pro kontrolu efektu adjuvantní a paliativní chemoterapie kolorektálního karcinomu. Literatura 1. Kralovanszky J, Koves I, Orosz Z, Katona C, Toth K, Rahoty P, Czegledi F, Kovacs T, Budai B, Hullan L, Jeney A. Prognostic significance of the thymidylate biosynthetic enzymes in human colorectal tumors. Oncology 62(2):167-74, 2002. 2. Wu J, Mao Y, He L, Wang N, Wu C, He Q, Skog S. A new cell proliferating marker: cytosolic thymidine kinase as compared to proliferating cell nuclear antigen in patients with colorectal carcinoma. Anticancer Res 20(6C):4815-20, 2000. 3. O‘Neill KL, Buckwalter MR, Murray BK. Thymidine kinase: diagnostic and prognostic potential. 7: Expert Rev Mol Diagn: 1(4):428-33, 2001. 4. Bidart JM, Thuillier F, Augereau CH et al. Kinetics of Serum Tumor Marker Concentrations and Usefulness in Clinical Monitoring. Clinical Chemistry 45 (10): 1695-1707, 1999. 5. Bast, RC., Bates,S., Bredt,AB., et al.: Clinical practice guidelines for the use of tunor markers in breast and colorectal cancer. J Clin Oncol 14, 1996, s.2843-2877. 6. De Vita, VT., Vincent, T., Hellman, S., Rosenberg, A.: Cancer of the Colon. In: Cancer: Principles Practise of Oncology. Lippincott - Raven Publishers 1997, s. 1144-1182. 7. European Group on Tumor Markers: Consensus Recommendations. Anticancer Research 19: 27852820, 1999. 8. Lothar,T.: Tumormarker. In: Labor und Diagnose. Frankfurt am Main: TH Books: 976-979, 1998. 9. Akbay A, Demirtas S, Yavuz Y. Increased serum thymidine kinase following chemotherapy. Ann Clin Biochem 36 (6):771-773, 1999. 10. Thomas WM, Robertson JF, McKenna PG, O‘Neill KL, Robinson MH, Hardcastle JD. Serum thymidine kinase in colorectal neoplasia. Eur J Surg Oncol. 21(6):632-4, 1995. 11. Fujii R, Seshimo A, Kameoka S. Relationships between the expression of thymidylate synthase, dihydropyrimidine dehydrogenase, and orotate phosphoribosyltransferase and cell proliferative activity and 5-fluorouracil sensitivity in colorectal carcinoma. Int J Clin Oncol. 8(2):72-8, 2003. 12. Tanigawa N, Katoh Y, Fujii H, Shimomatsuya T, Aotake T, Yamakawa M. Prediction of prognosis of patients with gastrointestinal cancer based on thymidine uptake. Gan To Kagaku Ryoho. 21(3):38894, 1994. PROF. MUDR. ONDŘEJ TOPOLČAN, CSC., ODDĚLENÍ IMUNOCHEMICKÉ DIAGNOSTIKY, FN PLZEŇ, DR.E.BENEŠE 13, 305 99 PLZEŇ, E-MAIL: [email protected]

Ze sledovaných nádorových markerů se v průběhu chemoterapie typicky měnila pouze thymidinkináza, ... Graf č. 5: Vzestup thymidinkinázy v průběhu paliativní chemoterapie (6 cyklů) - příznivá prognóza

Graf č. 6: Vzestup thymidinkinázy v průběhu paliativní chemoterapie (6 cyklů) - nepříznivá prognóza

Tabulka č.1: Základní charakteristika skupiny pacientů Adjuvantní chemoterapie

Paliativní chemoterapie

Počet pacientů

15

15

Průměr věk (roky)

60,7

62,9

Medián (roky)

61,0

64,0

37,0 – 76,0

53,0 - 71,0

Minimum-maximum (roky)


17

Indikátorové proteiny v moči (1) Stanovení celkové proteinurie je rutinním požadavkem, ne vždy však poskytuje klinickému lékaři dostatečnou informaci. Patologická exkrece plazmatických bílkovin do moče je často projevem renálních i některých extrarenálních onemocnění. okud koncentrace bílkovin v moči překročí 100-150 mg/l, projeví se obvykle klinicky manifestní proteinurií, prokazatelnou testačními proužky nebo zkouškou s kyselinou sulfosalicylovou. Stanovení celkové proteinurie může vyhovovat jako orientační hodnota pro odhad ztráty bílkoviny močí nebo jako součást vyšetření u nemocných s předpokládaným onemocněním ledvin. Pro sledování nemocných s již známým renálním onemocněním hodnota celkové proteinurie neposkytuje dostatek informací. Celková hodnota může být (a často je) tvořena více proteiny a jejich vzájemný poměr se může měnit. Je známé, že i pokud celková proteinurie nepřesahuje dohodnutou hodnotu 150 mg/d, může být svým složením patologická (mikroalbuminurie, řada tubulárních proteinurií, některé malé paraproteinurie). Pro časnou diagnostiku mohou být však významné již první změny v exkreci plazmatických bílkovin, při nichž ještě klinicky manifestní proteinurie není prokazatelná. Představu o kvalitativním složení proteinurie poskytuje elektroseparační analýza močových bílkovin. V praxi se jedná o různé modifikace elektroforézy v polyakrylamidovém gelu, nověji i na podkladě reakce se specifickými protilátkami proti jednotlivým tzv. indikátorovým bílkovinám nebo elektroforéza nezahuštěné moče v agarózovém gelu při vyšším napětí. Elektroseparační techniky poskytují informaci o spektru většiny vylučovaných bílkovin a jejich vzájemných vztazích, avšak rutinně neumožňují kvantifikaci jednotlivých složek ani vyjádření závislosti exkrece jednotlivých složek na velikosti diurézy. Perspektivním cílem vyšetřování protinurií je automatizovaná analýza vhodných indikátorových bílkovin v moči a vzájemné posouzení jejich exkrecí pomocí indexů a grafů, případně expertních systémů. V základní verzi je využíváno stanovení albuminu jako glomerulárního markeru, alfa-1-mikroglobulinu jako tubulárního markeru, celkové proteinurie pro kontrolu úplnosti proteinurie a detekci event. prerenální proteinurie. Diagnostická výtěžnost vzroste v kombinaci se screeningovým vyšetřením močovými reagenčními proužky (bílkovina, krev a leukocytární esteráza). Rozšířená verze je doplněna o stanovení NAG pro diferenciaci akutní a chronické tubulární léze, IgG pro rozlišení glomerulárního a tubulointersticiálního poškození a alfa-2-makroglobulinu pro diferenciaci hematurie; všechny hodnoty exkrece jsou vztažené na močový kreatinin a jako optimální vzorek je považována druhá ranní porce. Popsaný systém umožňuje: ■ časnou detekci již v prvních fázích. Při screeningovém posuzování renální funkce pomocí konvenčního vyšetření na základě celkové proteinurie a na základě exkrece specifických proteinů močí (celková proteinurie, albumin a alfa-1-mikroglobulin) je druhým ze způsobů zachyceno o cca 50 % renálních dysfunkcí (glomerulárních i tubulárních) ■ vyšší záchyt tubulárních a prerenálních proteinurií ■ vyloučení renálního postižení spolehlivěji než pouze na podkladě stanovení celkové proteinurie ■ neinvazivní diferenciaci glomerulopatií a tubulointersticiálního postižení

18


■

neinvazivní diferenciaci renální a postrenální hematurie (s omezením vlivu subjektivního hodnocení při posuzování dysmorfních erytrocytů mikroskopicky ve fázovém kontrastu) ■ sledování průběhu nefrologických onemocnění včetně event. reakce na terapii ■ doplnění morfologické informace z histopatologického nálezu ■ upozornění ošetřujícího lékaře na vhodnost invazivního vyšetření, např. renální biopsie V následujícím miniseriálu bychom vás rádi seznámili s tímto systémem hodnocení proteinurií; nejprve s jednotlivými tzv. indikátorovými bílkovinami v moči a jejich výpovědní hodnotou a poté s možnostmi hodnocení proteinurie a hematurie na podkladě exkrece tzv. indikátorových bílkovin.

Albumin je (s výjimkou některých paraproteinurií) v různé míře součástí prakticky všech proteinurií. Jedná se o protein s Mr 67 kD, který je filtrovaný glomeruly. Albumin se ve filtrátu váže na receptorovou bílkovinu megalin (s nízkou afinitou, ale vysokou kapacitou). Transtubulárně se většina intaktního albuminu dostává do extracelulární tekutiny a v kartáčovém lemu tubulárních buněk se váže na receptorovou molekulu cubulinu (s vysokou afinitou, ale nízkou kapacitou), která zprostředkovává transport albuminu do lyzosomů, kde probíhá jeho degradace. Degradační produkty, kterých je cca 1 300 mg/d, zatím neumíme rutinně stanovit. Na izolovaný vzestup exkrece albuminu (mikroalbuminurii) se donedávna pohlíželo jako na projev poklesu nebo zániku účinnosti elektrostatické repulze glomerulární stěny a projev generalizované dysfunkce endotelu. Podle novějších poznatků patologická albuminurie (mikro- i makroalbuminurie) odráží také změny mezi exkrecí intaktního a degradovaného albuminu. Jako normální exkrece albuminu při klidovém režimu se udává koncentrace 4 -12 mg/l s horní hranicí 20 mg/l (20 μg/min), resp. 30 mg/d při průměrné diuréze 1,5 l/24 hod, v přepočtu na močový kreatinin 2,26 g/mol (20 mg/g), pokud budeme exkreci vztahovat podle pohlaví, uvádí se jako horní hranice u mužů 2,0 g/mol, u žen 2,8 g/mol kreatininu. Exkrece albuminu močí má velkou intraindividuální variabilitu (průměrně 30 %). Mikroalbuminurie je vylučování malého množství albuminu 30-300 mg/d (20-200 μg/min; resp. 2,8-22,8 g/mol kreatininu) pod detekčním limitem močových reagenčních proužků pro bílkovinu (obvykle 150 mg/l), které lze prokázat citlivými metodami na bázi imunoturbidimetrie a imunonefelometrie. Exkrece albuminu je ovlivněna řadou fyziologických faktorů (příjem tekutin a míra kon-

centrace moče, fyzická aktivita, stres, …), proto se jako mikroalbuminurie označuje až přítomnost pozitivních alespoň dvou ze tří nezávislých vzorků vyšetřených během 6 měsíců. Při nálezu zvýšené exkrece albuminu nad horní fyziologickou mez je třeba vyloučit jiné příčiny – infekci močových cest, fyzickou námahu, systémovou infekci, srdeční selhávání, špatně kontrolovanou nebo dosud nepoznanou hypertenzi apod. Stanovení mikroalbuminurie má několik klinických indikací. V první řadě je jedním z diagnostických kritérií diabetické nefropatie. U 30-40 % nemocných s diabetem I. typu se po průměrné době trvání diabetu 15 let vyvíjí nefropatie, více než 80 % nemocných s diabetem I. typu a perzistentní mikroalbuminurií progreduje do diabetické nefropatie, u nemocných s diabetem II. typu jen 25 %. U nemocných s diabetem II. typu je však perzistentní mikroalbuminurie především rizikovým faktorem kardiovaskulární morbidity a mortality. Při současné prevalenci cca 7 % diabetu v populaci je 40 % pacientů v chronickém dialyzačním programu pro chronické renální selhání na podkladě pokročilé diabetické nefropatie. Nemocní s mikroalbuminurií představují pacienty rizikové a pacienty s nefropatií v časném stadiu (stadium III diabetické nefropatie), kdy adekvátní terapie (striktní normotenze, optimalizace kompenzace diabetu včetně metabolických poruch, terapie inhibitory angiotenzin konvertujícího enzymu) může zabránit nebo alespoň zpomalit progresi poklesu renálních funkcí. Přítomnost makroalbuminurie (více než 300 mg/d) je obvykle spojena se IV. a V., již ireverzibilním, stupněm diabetické nefropatie a manifestní glomerulární nebo smíšenou glomerulotubulární proteinurií prokazatelnou testačními proužky pro bílkovinu. Mikroalbuminurie je rovněž rizikovým faktorem rozvoje vaskulární nefropatie u nemocných s hypertenzí, při úspěšné terapii a kompenzaci hypertenze mizí. Mikroalbuminurie je obecným indikátorem endoteliální dysfunkce (nejen v ledvině), je nezávislým rizikovým faktorem pro kardiovaskulární morbiditu, tak jako např. nadměrná tělesná hmotnost, dyslipidémie, kouření, hypertenze, inzulinová rezistence apod.

lektivity při strukturních změnách glomerulární stěny (např. u glomerulonefritid) nebo při funkční aktivaci zkratových pórů bazální membrány (např. u ponámahové proteinurie). V obou případech se exkrece IgG zvyšuje souběžně a proporcionálně s exkrecí albuminu a permeabilita glomerulární stěny zůstává v určité reziduální míře zachována. Proporcionální vzestup exkrece IgG (současně s plazmatickými makroproteiny) je rovněž projevem postrenální proteinurie při krvácení a zánětech v močových cestách. Permeabilita kapilární sítě vývodných močových cest je vysoká a nedokáže zabránit úniku plazmatických makroproteinů do moče. Izolovaný vzestup exkrece IgG je projevem jeho lokální syntézy v ledvinách při zánětlivých intersticiálních nefropatiích. IgG v moči se používá rovněž pro posuzování tzv. selektivity glomerulární proteinurie. Za předpokladu, že určujícími momenty renální exkrece bílkovin je jejich filtrace podle efektivního hydrodynamického poloměru, tzv. index selektivity vyjadřuje procentuální podíl clearance bílkoviny s větší Mr (obvykle IgG) na clearanci referenční plazmatické bílkoviny s menší Mr (obvykle albuminu). Hodnoty indexu menší než 0,1 (10 %) charakterizují vysokou selektivitu, hodnoty větší než 0,2 (20 %) neselektivní glomerulární proteinurii. Výsledky vyšetření je třeba hodnotit s určitou rezervou, protože mohou být ovlivněny tubulární resorpcí bílkovin a změnou Mr vylučovaných bílkovin. V klinické praxi má význam průkaz vysoké selektivity u nefrotického syndromu s minimálními změnami.

Alfa-2-makroglobulin je makromolekulární protein s Mr 720-900 kD, který se fyziologicky v moči vyskytuje jen ve stopovém množství, zřejmě důsledkem jeho difúze stěnou kapilár vývodných močových cest (stejně tak jako apoAI, který se však rutinně nestanovuje). Ve zvýšeném množství ho lze detekovat v moči jen při její kontaminaci alfa-2-makroglobulinem z krve, protože vzhledem ke své molekulové hmotnosti alfa-2-makroglobulin nepřestupuje bazální membránu glomerulu. Vzestup jeho exkrece je tedy indikátorem postrenálních proteinurií při zánětech a krvácení ve vývodných močových cestách. Stanovení se využívá především pro diferenciaci renálních a postrenálních hematurií. Průměrná exkrece se pohybuje kolem 2,1 mg/d, jako horní hranice se nejčastěji udává 7 mg/g (0,79 g/mol kreatininu)

NAG (N-acetyl-D-glukozaminidáza)

je některými autory doporučován jako citlivější indikátor funkce elektrostatické repulze, vzestup jeho clearance může předcházet změnám v exkreci albuminu v nejčasnějších fázích vývoje glomerulárních proteinurií. Jako horní hranice fyziologické exkrece se udává 1,2 mg/l (2 mg/d), resp. 1,9 mg/g kreatininu; střední hodnoty exkrece se pohybují kolem 0,2 mg/d.

je enzym lokalizovaný v lyzosomech tubulárních buněk. Podílí se na štěpení glykoproteidů ve fagolysosomech obsahujících bílkoviny z ultrafiltrátu. Rezidua štěpení společně s NAG jsou uvolňována do moče. Vzestup exkrece NAG močí je často prvním, ale nespecifickým indikátorem změn v tubulech. Zvýšená exkrece může být vyvolána nejen apoptózou nebo nekrózou tubulárních buněk působením nefrotoxických látek (léků, bakteriálních toxinů, kontrastních látek apod.), ale i zvýšenou metabolickou aktivitou tubulárních buněk při jejich regeneraci (např. po akutním selhání ledvin) nebo intenzivní resorpcí bílkovin z ultrafiltrátu při jejich vysoké nabídce (u nefrotické proteinurie nebo tzv. overflow proteinurie při vysoké nabídce např. volných lehkých řetězců imunoglobulinů při některých monoklonálních gamapatiích (mnohočetný myelom, primární systémová AL-amyloidóza, light chain deposition disease), hemoglobinu při intravaskulární hemolýze nebo myoglobinu při rhabdomyolýze) nebo intersticiálními změnami v rámci pokročilých onemocnění ledvin. Stanovení NAG je proto vhodné kombinovat s vyšetřeními méně citlivými, ale specifičtějšími – zejména exkrecí některé z tzv. volně filtrovatelných bílkovin (v praxi alfa-1-mikroglobulinu) a albuminu. Jako horní fyziologická hranice se udává 6,3 U/l, tj. 5 U/g resp. 0,56 U/mol kreatininu.

Imunoglobulin IgG

Beta-2-mikroglobulin

je protein, který se vyskytuje ve více molekulárních formách, hlavní složka 7S s Mr 150 kD. Vzestup jeho exkrece je nejčastěji projevem glomerulární nese-

je mikroprotein o Mr 11,8 kD, který vykazuje strukturní analogii s částmi těžkého řetězce IgG. Je nekovalentně vázaný na glykoproteinový řetězec HLA antigenů I. třídy na membráně jaderných buněk. Procesy spojené s prolifera-

Transferin


19

cí buněk (hematologické malignity, některé záněty) mohou ve svém důsledku zvyšovat plazmatickou koncentraci beta-2-mikroglobulinu, stejně tak jako všechna onemocnění, která vedou k poklesu glomerulární filtrace. Beta-2mikroglobulin je totiž podobně jako alfa-1-mikroglobulin vylučován převážně glomerulární filtrací; udává se, že se může v určité míře uplatňovat i tubulární sekrece. Beta-2-mikroglobulin z ultrafiltrátu je resorbován a katabolizován v buňkách proximálních tubulů. Při překročení tubulárního resorpčního maxima se zvyšuje jeho exkrece močí, stejně tak jako při toxickém poškození tubulárních buněk nebo při vysoké nabídce jiných bílkovin z ultrafiltrátu. Jako horní hranice fyziologické exkrece se udává hodnota 0,3 mg/d (0,22 mg/g kreatininu), střední hodnota exkrece se pohybuje kolem 0,07 mg/d. Exkrece nezávisí na pohlaví, s věkem a fyziologickým poklesem glomerulární filtrace se hodnoty mírně zvyšují. Hodnoty beta-2-mikroglobulinu v moči jsou významně ovlivněny jeho nestabilitou. Při pH moče < 5,5 dochází k jeho rychlé a kvantitativně významné dekompozici. Dekompozici lze omezit alkalizací před sběrem moče (p.o. 10 g/d NaHCO3, jako méně spolehlivá varianta se udává krátkodobý sběr s alkalizací moče těsně po mikci pomocí NaOH na pH moče ≥6). K dekompozici beta-2-mikroglobulinu dochází i vyšším pH se současnou leukocyturií při infekcích močových cest (vlivem proteolytických enzymů z leukocytů), může se uplatňovat i teplota v močovém měchýři při sběru přes noc. S přihlédnutím k uvedeným preanalytickým faktorům je stanovení beta-2mikroglobulinu v moči jako indikátoru funkce proximálního tubulu stále častěji nahrazováno stanovením jiných bílkovin, v praxi nejčastěji alfa-1-mikroglobulinu. Beta-2-mikroglobulin v moči je však v některých studiích zmiňován jako časný ukazatel virové infekce (CMV aj.) u nemocných s transplantovanou ledvinou. Udává se, že izolovaný vzestup exkrece beta-2-mikroglobulinu močí předchází pozitivitu serologických markerů infekce o 12-40 dnů.

dne na den může být redukována po vztažení hodnot exkrece jednotlivých proteinů na močový kreatinin (který odráží stupeň koncentrace moče) až na 30%. Koncentrace vykazují dobrou srovnatelnost s hodnotami ze 24-hod sběru. Tzv. standardizovaná 2. ranní porce je za podmínek lačnění a vyloučení fyzické aktivity do vymočení (ranní cvičení může vést k relativní dehydrataci, krátkodobému zvýšení filtračního tlaku a cvičením indukované benigní proteinurii), někteří autoři doporučují mírnou, kofeinem indukovanou vodní diurézu. Prosté koncentrace (nevztažené na močový kreatinin) jsou použitelné jen za předpokladu relativně stabilní diurézy a stupně koncentrace moče.

Srovnání beta-2mikroglobulinu a alfa-1-mikroglobulinu jako markerů funkce proximálního tubulu, resp. tubulárního poškození

Alfa-1-mikroglobulin je glykoprotein s Mr 26-33 kD. Syntetizuje se v hepatocytech a lymfocytech a jeho fyziologická funkce v krvi není zcela jasná. V plazmě je z větší části vázaný na monomer IgA a albumin; současně se vyskytuje i volný alfa-1-mikroglobulin asi v 10 x nižší koncentraci než vázaná forma. Alfa-1mikroglobulin patří mezi tzv. volně filtrovatelné bílkoviny, z ultrafiltrátu je z více než 90 % zpětně resorbován a následně katabolizován v buňkách proximálních tubulů. Močí je denně vyloučeno 2-9 mg/l volného alfa-1mikroglobulinu. Udává se, že exkrece se mírně liší podle pohlaví s maximem ve 4.-5. deceniu u mužů a 6.-7. deceniu u žen. Jako horní hranice fyziologické exkrece se udává ve věku do 40 let 11,2 mg/g (resp. 1,27 g/mol kreatininu), nad 40 let 19,4 mg/g (2,2 g/mol kreatininu), bez věkového rozlišení je nejčastější hranice 12 mg/l, resp. 20 mg/d, což odpovídá hodnotě 14 mg/g (1,58 g/mol). Stanovení alfa-1-mikroglobulinu v moči se využívá v současnosti jako metoda volby při hodnocení změn resorpce tzv. volně filtrovatelných bílkovin, resp. jako jednoho z indikátorů funkce proximálního tubulu. Při toxickém poškození proximálního tubulu a všech formách intersticiálních nefropatií včetně sekundárních tubulointersticiálních lézí při pokročilých stadiích onemocnění postihujících primárně glomeruly nacházíme v moči zvýšenou exkreci alfa-1-mikroglobulinu. Objem moče závisí na řadě faktorů – teplotě okolí, příjmu stravy a tekutin, míře a intenzitě fyzické aktivity, stresu apod. a během 24 hod vykazuje vysokou intraindividuální variabilitu. Obecně je tedy doporučován 24-hod sběr moče. Vzhledem k tomu, že sběr moče je zatížený značnou chybou (spolupráce nemocného, dodržení podmínek skladování, správná doba a objem), jako ideální vzorek se doporučuje druhá ranní moč (za předpokladu vyloučení nadměrné fyzické aktivity a není-li polyurie). Intraindividuální variabilita ze

20

i n f o r m a č n í m a g a z í n č í s l o 56 - 2 0 0 7

Je obecně známé, že alfa-1-mikroglobulin je vzhledem ke stabilnějším preanalytickým podmínkám lepším indikátorem funkce proximálního tubulu. V letech 2003-2005 se naše laboratoř podílela na výzkumné studii společně s klinikou nefrologie a klinikou anesteziologie a resuscitace IKEM Praha. Studie se týkala sledování renálních funkcí v perioperačním období po ortodopické transplantaci jater. V rámci studie jsme měřili také exkrece některých proteinů močí (celkovou proteinurii, koncentraci močového kreatininu, albuminu, alfa-1-mikroglobulinu a beta-2-mikroglobulinu v moči). V době designu studie naše laboratoř ještě nestanovovala alfa-1-mikroglobulin; stanovení jsme zavedli až koncem roku 2004. U části pacientů, jejichž vzorky močí jsme v rámci studie vyšetřovali, jsme tedy měli možnost porovnat hodnoty alfa-1-mikroglobulinu (imunonefelometricky na analyzátoru IMMAGE, Beckman Coulter) a beta-2-mikroglobulinu (LEIA na analyzátoru Immulite-1, BioVendor, resp. DPC). Jednalo se o 188 vyšetření od 51 pacientů provedených v průběhu 5-7 dnů. Jako horní hranici fyziologické exkrece jsme uvažovali obecně doporučenou hodnotu pro beta-2-mikroglobulin 0,3 mg/l, resp. 0,22 mg/g kreatininu, pro alfa-1- mikroglobulin 12 mg/l, resp. 14 mg/g kreatininu. Hodnoty exkrece beta-2mikroglobulinu v souboru se pohybovaly v rozmezí 020,5 mg/l (resp. 0-199,2 mg/g kreatininu), exkrece alfa-1-mikroglobulinu v rozmezí 0-317,9 mg/l (resp.

0-634,2 mg/g kreatininu). Z původního souboru všech pacientů (n=216) jsme vyřadili výsledky pacientů s exkrecí beta-2-mikroglobulinu vyšší než 20,5 mg/l, protože hodnoty přesahující rozsah měření nebyly vyčíslovány (pro potřeby studie nebylo požadováno). Pokud jsme porovnali párové hodnoty a stanovili regresní funkci, je vidět malá lineární závislost hodnot (r = 0,396 pro hodnoty vyjádřené v mg/l (p < 0,01), pro hodnoty vztažené na kreatinin je vztah o něco těsnější, r = 0,525, p < 0,001). Počet vyšetření, která byla v jednom testu pozitivní (resp. výsledek nad dohodnutou rozhodovací mezí) a v druhém negativní (resp. v rámci fyziologického rozmezí) jsme porovnávali pomocí koeficientu kappa. Koeficient kappa udává míru spolehlivosti dvou veličin, resp. nakolik je pozitivní výsledek jedné metody shodný s pozitivním výsledkem druhé metody při použití určitých diskriminačních mezí. Hodnota koeficientu κ = 0,4-0,75 odpovídá dobré, κ > 0,75 velmi dobré shodě. Pro diskriminační mez 0,3 mg/l u beta-2-mikroglobulinu a 12 mg/l u alfa-1-mikroglobulinu je κ = 0,622, pro diskriminační hodnoty vztažené na exkreci močo-

Pro exkrece tubulárních indikátorových proteinů s diskriminační hranicí vyjádřenou jako prostá koncentrace v mg/l (cut-off 0,3 mg/l pro beta-2-mikroglobulin a 12 mg/l pro alfa-1-mikroglobulin): beta-2-mikroglobulin

n = 188

pozitivní (> 0,3 mg/l)

negativní (≤ 0,3 mg/l)

pozitivní (> 12,0 mg/l)

109

26


8

45

alfa-1-mikroglobulin

Pro exkrece tubulárních indikátorových proteinů s diskriminační hranicí vyjádřenou jako koncentrace vztažená na močový kreatinin v mg/g (cut-off 0,22 mg/g pro beta-2-mikroglobulin a 14 mg/g pro alfa-1-mikroglobulin: n = 188

beta-2-mikroglobulin pozitivní (> 0,22 mg/l) negativní (≤ 0,22 mg/l)

alfa-1-mikroglobulin pozitivní (> 14,0 mg/l)

134

8


12

31

Závislost hodnot alfa-1-mikroglobulinu a beta-2-mikroglobulinu vyjádřených v mg/l, regresní funkce y = 5,3x+32,5, r = 0,396 (p < 0,01)

Závislost hodnot alfa-1-mikroglobulinu a beta-2-mikroglobulinu vyjádřených v mg/g močového kreatininu, regresní funkce y = 3,01x+93,4, r = 0,525 (p < 0,001).


21

vého kreatininu 0,22 mg/g pro beta-2-mikroglobulin a 14 mg/g pro alfa-1-mikroglobulin dokonce κ = 0,700. Tato shoda ovšem předpokládá správné preanalytické i analytické hodnocení, což je u stanovení beta-2-mikroglobulinu v praxi obtížně dosažitelné. Porovnáním párových hodnot při vyjádření exkrece v mg/l bylo možné označit jako hodnoty ovlivněné pravděpodobnou dekompozicí beta-2-mikroglobulinu minimálně 17 ze 188 výsledků (9,0 %), při vztažení na exkreci močového kreatininu pak minimálně 7 z 188 (3,7 %). Závěrem lze tedy říci, že stanovení alfa-1-mikroglobulinu v moči je metodou volby při automatizovaném screeningovém posuzování tubulární funkce (namísto dříve stanovovaného beta-2-mikroglobulinu). Stanovení má některé analytické výhody: ■ koncentrace alfa-1-mikroglobulinu v moči je stabilní, nezávisí na pH ani teplotě moče, ■ rozsah měření je mnohem širší bez nutnosti ředění, ve srovnání s beta-2-mikroglobulinem jsou koncentrace obecně vyšší, ■ korelace konkrétních hodnot alfa-1-mikroglobulinu a beta-2-mikroglobulinu je velmi slabá. Pro posouzení přítomnosti/nepřítomnosti tubulárního poškození je citlivějším indikátorem exkrece alfa-1-mikroglobulinu vztažená na močový kreatinin než prostá koncentrace. Za statistické zhodnocení patří poděkování ing. Věře Lánské, CSc., IKEM (POKRAČOVÁNÍ PŘÍŠTĚ) MUDR. JANA GRANÁTOVÁ, OKB, FAKULTNÍ THOMAYEROVA NEMOCNICE VÍDEŇSKÁ 800, 140 59 PRAHA 4, E-MAIL: [email protected]

Použitá literatura: Teplan, V.: Praktická nefrologie, Grada, Praha, 1998 Schück, O., Tesař, V., Teplan, V.: Klinická nefrologie, Medprint, Praha, 1995 Engliš, M.: Proteinurie, Stapro, Pardubice, 1993 Boege, F.: Urinary proteins, in Thomas, L.: Clinical Laboratory Diagnostics, TH Books, 1 st English Edition, Frankfurt am M., 1998 Thomas, L.: Proteindiagnostik, Diagnose und Therapiekontrolle, Behring Diagnostika, Frankfurt am M., 1991 Hofmann, W., Guder, W.G.: A diagnostic programme for quantitative analysis of proteinuria. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., Vol. 27, 1989, 589-600 Hofmann, W. et al.: Diagnostic strategies in urinanalysis, Kidney Int., Vol. 46, Suppl. 47 (1994), 111-114 Ivandič, M. et al: Development and evaluation of an urin protein expert system. Clin. Chem. 42:8 (1996), 1214-1126 Dati, F., Lammers, M.: Immunochemical methods for determination of urinary protein (albumin and α1microglobulin) in kidney diseases. J. Int. Fed. Clin. Chem., 1989; 1: 68-76 Nováčková, L.: Proteinurie včera a dnes, Uživatelské dny Beckman Coulter, Přerov, 3/2007

22


Slavnostní otevření laboratoře v Nemocnici Kyjov Dne 21. března 2007 byla v areálu nemocnice v Kyjově slavnostně otevřena laboratoř na oddělení klinické biochemie. omuto otevření byli přítomni zástupci vedení nemocnice v čele s ředitelem ing. Igorem Kalixem, pracovníci laboratoře i s primářem ing. Rostislavem Kotrlou a zástupci firmy Beckman Coulter včetně obchodního ředitele RNDr. Štěpána Tintěry. V laboratoři dosluhovaly přístroje Hitachi, a proto vedení nemocnice vypsalo výběrové řízení na dodávku diagnostik pro stanovení biochemických a imunochemických vyšetření a laboratorního vyšetřovacího systému. Firma Beckman Coulter jako přední dodavatel diagnostik a laboratorních systémů se tohoto výběrového řízení samozřejmě zúčastnila a nabídla komplexní řešení vybavení laboratoře. Tato nabídka byla vyhodnocena jako nejlepší, a tak koncem roku 2006 došlo k instalaci biochemických analyzátorů UniCel DxC 800 a UniCel DxC 600 a imunochemických analyzátorů UniCel DxI 800 a Access 2. Součástí dodávky byla také centrifuga Spinchron a řídící systém Remisol, který umožňuje řízení všech analyzátorů z jednoho místa. Takto navržená konfigurace přístrojů a metod plně dostačuje provozu a laboratoř je schopna analyzovat mnohem větší množství vzorků než dříve. Biochemická laboratoř v Nemocnici Kyjov je tudíž už teď připravena na nárůst vzorků nebo nárůst jednotlivých rutinních či speciálních analýz. Instalace všech přístrojů proběhla za chodu laboratoře ve velmi krátké době včetně zaškolení obsluhy. Již na konci roku 2006 laboratoř plně přešla na rutinní diagnostiku na nových analyzátorech firmy Bec-

kman Coulter. Dle pracovníků laboratoře jsou tyto přístroje „o něčem jiném“ a všichni jsou s prací na nových systémech velmi spokojeni. „Přístroje mají co do počtu možných analýz dvakrát větší rychlost a třikrát větší kapacitu než jejich o čtrnáct let starší předchůdci. Urgentní vzorky jsme schopni zpracovat a vydat do šedesáti minut, rutinní stíháme do dvou až tří hodin“ říká primář Rostislav Kotrla. Celá laboratoř byla od 13 hodin otevřena a přístrojové vybavení bylo představeno kolegům z jiných oddělení nemocnice a také pracovníkům laboratoří z okolních zdravotnických zařízení. Všem zúčastněným bylo předvedeno, že stačí „naskládat vzorky do stojanu, vložit do analyzátoru a stisknout start“. Po „oficiálním“ slavnostním otevření laboratoře následovalo společné bowlingové klání pracovníků nemocnice a firmy Beckman Coulter. Celý den byl protkán pracovní, ale přátelskou atmosférou. Nové vybavení laboratoře přispěje k lepší práci celého oddělení a v podstatě i celé nemocnice. Firma Beckman Coulter k tomu chce přispívat rozšiřováním další spolupráce a partnerskou pomocí Nemocnici Kyjov. FRANTIŠEK VIČAR [email protected]


23

Kde se můžeme setkat (červen – září 2007) Konference/seminář s účastí společnosti Immunotech formou stánku 1. 6. 2007

11. - 12. 6. 2007

13. - 14. 9. 2007

ESTOOLS Brno

Seminář Moravskoslezského kraje Žermanice

XVIII. Izakovičov memoriál Košice

1. - 2. 6. 2007

16. - 19. 6. 2007

V. dvoudenní konference imunologických laborantů Brno

XI. Olomoucké hematologické dny Olomouc

19. - 21. 9. 2007

21. - 22. 9. 2007 23. - 26. 6. 2007

4. 6. 2007 Pracovní konference sekce biochemických laborantů Hradec Králové

40. výroční cytogenetická konference Praha

Česká společnost analytické cytometrie Brno

Severočeský imunologický seminář Ústí nad Labem

23. - 25. 9. 2007 6. - 7. 9. 2007 VIII. Slovensko-české dni laboratórnej hematológie a transfuziológie Šamorín - Čilistov

VIII. Celostátní sjezd ČSKB České Budějovice

informační magazín číslo

Recommend Documents