informační magazín číslo

informační magazín číslo 10 - 2008

BIOMEDICÍNSKÝ VÝZKUM NA PRAHU DALŠÍHO TISÍCILETÍ NOVINKY PRO STANOVENÍ ANEMIÍ INDIKACE A INTERPRETACE ONKOGENNÍCH MARKERŮ MEMBRÁNOVÉ MOLEKULY NA BUŇKÁCH (MINULOST-PŘÍTOMNOST-BUDOUCNOST)

Biomedicínský výzkum na prahu dalšího tisíciletí

(vědecké ústavy, nemocnice, vysoké školy)

V současné době dochází k obrovskému nárůstu vědeckých poznatků prakticky ve všech směrech lidského bádání. Tato exploze přináší tolik informací, že není v silách jednoho člověka ji obsáhnout, a to ani v jednotlivých oborech.

oučasné intelektuální úsilí lidského rodu vyúsťuje v relativně dokonalé poznání procesů a pochodů na naší planetě. Mimořádně se posouvá naše znalost o elementární povaze a struktuře jednotlivých molekul nezbytných pro životní pochody. Je až neuvěřitelné, že kombinace několika málo chemických prvků je zdrojem bezpočtu organických molekul nejrůznějších vlastností a funkcí. Vznikly nové obory jako genomika a proteomika, které souvisejí s rozvinutím dvou celosvětových projektů – HUGO („Human Genome Organization“) a HUPO („Human Proteome Organization“). Mezi tyto obory lze zařadit i transkriptomiku, čímž jsou na molekulární úrovni dokonale uzavřeny pochody ve vztahu fenotyp – genotyp, a to nejen u lidského organismu. V tomto úvodníku se omezíme pouze na pár poznámek týkajících se postavení biomedicínského výzkumu a jeho organizace v naší zemi. Zamyslíme se tedy nad schopnostmi našich výzkumných pracovníků pohybujících se v experimentální a klinické medicíně a nad jejich přínosem v této oblasti. Už při detailnějším pohledu je zřejmé, že biomedicínský výzkum představuje zcela zásadní trend, ve kterém se musí velmi rozumně sladit jednotlivé složky nejen z hlediska strukturovatelnosti, ale především z hlediska vhodného využití finančních prostředků při řešení daných úkolů. Každý vědecký pracovník je ve své výzkumné činnosti postaven před základní otázku obhajoby náplně své činnosti náplně své činnosti i její

RNDr. Kristián Koubek, DrSc. se narodil v Sušici. V roce 1969 absolvoval Přírodovědeckou fakultu UK v Praze (specializace obecná biologie a genetika) a úspěšně obhájil diplomovou práci na téma „Izoenzymy lidské sérové alkalické fosfomonoesterázy a krevní skupiny“, kterou vypracoval na oddělení klinické genetiky Biologického ústavu Fakulty všeobecného lékařství UK a v Ústavu hematologie a krevní transfúze v Praze. Vědeckou aspiranturu v Ústavu experimentální biologie a genetiky ČSAV završil kandidátskou dizertační prací na téma „Transplantační antigeny“. V roce 1973 nastoupil na klinické oddělení Ústavu hematologie a krevní transfúze, kde v roce 1993 obhájil v oboru genetika doktorskou práci na téma „Leukocytární antigeny v diagnostice a patogenézi krevních chorob“. V roce 1979 nastoupil na základě mezinárodního konkurzu na jednoroční studijní pobyt na Royal Free Hospital v Londýně, zaměřený na výzkum leukémií. Jako první v Československu rozpracoval imunodiagnostiku krevních chorob (leukémií a lymfomů) pomocí monoklonálních protilátek a zavedl detekci hematopoetických kmenových buněk (CD34+) průtokovou cytometrií.

2


úspěšnosti. Záleží tedy na něm, jak dalece je schopen formulovat tuto činnost, aby svým dílem obohatil lidské poznání a posunul dosavadní stav znalostí. Tím, že je vědecký pracovník odkázán na různé ústavy, instituce či vysoké školy, se jeho úsilí promítá do existence ústavů či škol, v nichž badatel pracuje, a také se spolupodílí na jejich renomé. V podstatě se jedná o velmi aktuální otázky: kde, kdo, co a jak by se mělo řešit a navíc v tom pro řešení nalézt ta nejlepší propojení. Jsou to v podstatě otázky spolupráce mezi vědeckými ústavy České akademie věd, fakultními nemocnicemi a i vysokými školami. Stručně řečeno, každá instituce má své výhody, ale je možné poukázat i na některé jejich problémy. Není třeba zdůrazňovat přínos vysokých škol jako líhně pro budoucí odborné pracovníky, kteří časem převezmou otěže v pokračování již stávajících institucí a ústavů. Není také třeba poukazovat na činnost fakultních nemocnic s jejich snahou zavádět nejmodernější metody pro nemocné a také s jejich možností záchytu souborů nemocných různých diagnóz. V neposlední řadě vědecké akademické ústavy se svojí tradicí a vybavením či potenciálem jsou přímo stvořené k řešení těch nejsložitějších otázek. POKRAČOVÁNÍ NA STRANĚ 4

Obsah

Časopis vydává a distribuuje IMMUNOTECH a.s., Radiová 1, 102 27 Praha 10 www.beckman.cz Časopis připravují Mgr. Pavel Kružík Mgr. Patrik Šaf RNDr. Helena Kurzweilová, CSc. RNDr. Běla Říčařová, CSc. Ing. Petr Suchan Mgr. Markéta Krupařová Ing. Kateřina Kožaná Ing. Eva Králová RNDr. Jozef Smolka Do časopisu přispěli RNDr. Kristián Koubek, DrSc. - Ústav hematologie a krevní transfúze RNDr. Běla Říčařová, CSc. Ing. Petr Boudal Ing. Mgr. Tereza Tietze Ing. Kateřina Lapišová RNDr. Štěpán Tintěra Prof. MUDr. Ondřej Topolčan, CSc. - FN Plzeň RNDr. Helena Kurzweilová, CSc. Mgr. Patrik Šaf Ing. Eva Králová Mgr. Pavel Kružík Ing. Petr Šmídl, CSc. Ing. Jitka Černá Mgr. Martina Salátová Ing. Lukáš Palivec, PhD. Mgr. Helena Bazovská RNDr. Iva Ouhrabková - Krajská nemocnice Liberec RNDr. Mária Gavelová, CSc. RNDr. Miroslav Kušiak RNDr. Jozef Smolka Mgr. Markéta Krupařová Monika Lahodová - titulní foto Ivan Šarkan - autor křížovky Grafická podoba Nina Nováková Tiskárna REPRO servis s. r. o. Starochuchelská 15/195, 159 00 Praha 5 Náklad čísla 1600 výtisků

Biomedicínský výzkum na prahu dalšího tisíciletí (vědecké ústavy, nemocnice, vysoké školy)

2

Obsah

3

Elektronická externí kontrola kvality eIQAP v hematologických laboratořích

5

Solubilní transferinový receptor (sTfR) – nová souprava pro analyzátory řady Access a DxI

6

Protilátky proti vnitřnímu faktoru (IFAb)

8

Nabídka pro stanovení anemií

8

Laboratorní proces do posledního šroubku

9

Onkogenní markery Indikace a interpretace

13

Manuální soupravy Immunotech na podzimní vlně dobrých zpráv

18

Membránové molekuly na buňkách Minulost - přítomnost – budoucnost

19

Nové Eia Soupravy pro diagnostiku Celiakie

30

ParadigmTM

31

Časopis Cellular Research

31

Průtokový cytometr CellLab Quanta SC MPL

31

Validace a verifikace IVD

32

EDMA už má svoje zastúpenie aj na Slovensku

34

Kongres ISAC v Budapešti

34

Vision Centrum v Paříži

35

Integrovaný systém UniCel DxC 880i – Panochova nemocnice Turnov

35

XV. Slovensko-Česká konferencia o hemostáze a trombóze s medzinárodnou Účasťou

38

Uživatelské setkání FreeliteTM

39

Laboratórna diagnostika v medicíne 2008

40

Výrobní útvar

41

Útvar zabezpečování jakosti a regulatory affairs (ÚZJ)

42

Křížovka o ceny

43

Kde se můžeme setkat (září – prosinec 2008)

44

Konference/seminář s účastí společnosti Immunotech a.s. formou stánku


3

Propojením našich univerzit se špičkovými vědeckými ústavy by se určitě dala zvýšit úroveň výzkumu. POKRAČOVÁNÍ ZE STRANY 2

Takže by se dalo na první pohled říci, že naše země má velmi dobrou strukturu k řešení těch nejzávažnějších problémů, které v medicíně vyvstávají. Navíc naše země není sužována nemocemi jako malárie a některá virová onemocnění ohrožující její populaci, jak je tomu v jiných zemích, a tak není zdánlivě takový tlak je v naší zemi studovat. O to víc je potěšující přínos českých vědců v otázkách léčby nemoci AIDS a některých krevních chorob (např. chronické lymfoidní leukémie). Měnící se potřeby naší společnosti, do kterých pronikají i názory široké veřejnosti, mohou upravit organizační a institucionální struktury, aby podpora výzkumu z veřejných prostředků byla co nejracionálnější. To sice může vyznít jako zažitá záležitost, protože již bylo mnoho řečeno o výkonnosti a efektivnosti výzkumu a o odstranění některých jeho nedostatků. O případných změnách v politice výzkumu a vývoje se dozvídáme z oficiálních dokumentů vlády nebo parlamentu. Zde se uvádí, že v porovnání se zahraničím lze nalézt nižší výkonnost českého výzkumu, vyjádřenou nižšími počty publikací a citací v renomovaných časopisech.

Jednou ze snah o zlepšení některých nedostatků je vytvoření center špičkového výzkumu. Není ani tak problém v tom, co by se mělo očekávat od výzkumných center, jako v otázce jejich praktického naplnění. Z veřejné diskuse o programu národně výzkumných center zaznívaly názory, že se jedná hlavně o dosažení špičkových výsledků, o konkrétní, věcný i časový program práce za spolehlivého systému řízení a kontroly. Je chvályhodné, že se v těchto centrech mohou soustřeďovat pracovníci stávajících výzkumných organizací, kteří na řešení komplexních úkolů mají zajištěnou finanční podporu ze státního rozpočtu. O špičkové výzkumné činnosti na vysokých školách se dá velmi těžko hovořit, protože k tomu mnohde nejsou vytvořeny adekvátní podmínky. Např. Univerzita Karlova, jako jedna z nejstarších univerzit v Evropě, vyznívá ve srovnání s ostatními univerzitami velmi špatně, takže se nachází až na chvostu tří set hodnotitelných univerzit. Tato univerzita nemá vhodné zázemí pro provozování biomedicínského výzkumu ve srovnání se špičkovými zahraničními univerzitami. Propojením našich univerzit se špičkovými vědeckými ústavy by se určitě dala zvýšit úroveň výzkumu, aby jeho výsledky byly adekvátní vynaloženým finančním prostředkům. Může vyvstat problém, který lze charakterizovat jako kvalita vědeckých pracovníků. Kvalita vědeckých pracovníků se posuzuje počtem publikací a citací v renomovaných časopisech, a tak je výkonnost českého výzkumu daleko nižší, než je tomu v anglicky mluvících zemích. Z toho vyplývá, že dobrou práci s dopadem do renomovaných časopisů lze nejsnáze provádět na zahraničních pracovištích, a to nejlépe v zemi, kde je angličtina národním jazykem. O přínosu vědy nemá smysl vůbec pochybovat, protože dosažené poznatky pronikají do činnosti lidí na každém kroku. Prozatím není v naší zemi mnoho vědců, kteří na biomedicínském poli vynikli a jsou i mezinárodně uznáváni. Lze si tedy jenom přát, aby se lepší podmínky v našem biomedicínském výzkumu odrazily také v kvalitních výsledcích práce a ocenění osobností vědeckého života, na které bude naše země právem hrdá. RNDR. KRISTIÁN KOUBEK, DRSC. KLINICKÝ ÚSEK, ÚSTAV HEMATOLOGIE A KREVNÍ TRANSFÚZE, U NEMOCNICE 2, 128 20 PRAHA 2 E-MAIL: [email protected] BĚLA ŘÍČAŘOVÁ E-MAIL: [email protected]

4


Vlastní registrace má tři kroky:

Elektronická externí kontrola kvality eIQAP v hematologických laboratořích oncern Beckman Coulter nabízí uživatelům všech typů hematologických analyzátorů Coulter rychlý, jednoduchý a pohodlný cyklus elektronické externí kontroly kvality eIQAP (electronic Interlaboratory Quality Assurance Program), který je postaven na vámi již používaných kontrolních materiálech Coulter 4C® a Coulter 5C®. Pouhým stisknutím několika kláves pošlete vybrané výsledky svých kontrol na zabezpečenou webovou stránku a dostanete zpět komplexní analýzu včetně úplné statistiky; srovnání vašich dat s daty velké skupiny účastníků tohoto cyklu na celém světě. Navíc je tato služba pro uživatele analyzátorů, reagencií a kontrol Beckman Coulter bezplatná. Výhody tohoto kontrolního cyklu jsou zřejmé: úspora času a materiálu využitím výsledků, získaných při rutinních denních kontrolách, jednoduchý přístup na zabezpečené webové stránky pomocí hesla a přiděleného kódu, aktuální výsledky vždy po expiraci příslušné šarže kontrol (nejméně 12 cyklů ročně pro každého účastníka!), trvalá možnost prohlížení historie minulých cyklů (zálohování 1 rok), elektronická forma umožňuje redukci obtížného „papírování“, kontrolní cyklus eIQAP je mezinárodně uznávaný při akreditacích. Jak postupovat při registraci do kontrolního cyklu eIQAP? Prvním krokem je přihlášení uživatele na stránkách www.beckmancoulter.com. Po otevření stránky zadáte do lišty s adresou novou adresu www.beckmancoulter.com/eiqap. Otevře se stránka kontrolního cyklu a na ní zvolíte „Registrace“. Obdržené dva kódy spolu s vaším přihlašovacím jménem a heslem vám umožní vstup do programu eIQAP tlačítkem „Login“ na stejné stránce jako v prvním kroku registrace www.beckmancoulter.com/eiqap. Uvnitř programu eIQAP již budete postupovat krok za krokem přesně podle pokynů nápovědy a průvodce pro nové uživatele. Podrobný návod

Zadání uživatelského jména a hesla pro pozdější přístup na stránky kontrolního cyklu.

Potvrzení zadaných informací nebo jejich případná oprava a odeslání k registraci.

Po úspěšné registraci vám bude během několika dnů přidělen pětimístný IQAP Participant Number a Passcode identifikační kód (písemně e-mailem i poštou).

(Help) a veškerou dokumentaci k programu eIQAP také najdete na webových stránkách koncernu Beckman Coulter www.beckmancoulter.com, pokud do malého okénka vyhledávače (Search) zadáte heslo eIQAP. Bezplatný cyklus externích kontrol je dalším z mnoha kroků koncernu Beckman Coulter ke zkvalitnění služeb našim zákazníkům a jistě také vítaným příspěvkem k vyšší spolehlivosti výsledků a ekonomičtějšímu provozu vašich laboratoří. PETR BOUDAL E-MAIL: [email protected]


5

Solubilní transferinový receptor (sTfR) – nová souprava pro analyzátory řady Access a DxI Panel firmy Beckman Coulter pro stanovení anemií se v tomto roce opět rozrostl, tentokrát o soupravu pro stanovení solubilního transferinového receptoru. V následujících řádcích vás stručně seznámíme s možností využití tohoto stanovení v klinické praxi. udeme se věnovat anemii z nedostatku železa (Iron Deficiency Anemia – IDA), která je nejčastějším typem anemie, a také druhému nejběžňějšímu typu - anemii způsobené chronickým onemocněním (Anemia of Chronic Disease - ACD), např. zánětem, nádorem, autoimunitním onemocněním nebo chronickým onemocněním ledvin.

Metabolismus železa Po absorpci enterocyty se železo váže na transferin, protein přítomný v cirkulaci. Ten zajišťuje transport železa mezi místem absorpce, skladování a využití železa. Hlavním místem využívání železa je kostní dřeň. Laboratorní diagnostika nedostatku železa je založena na vyhodnocení stavu železa v organismu a hematologických parametrech. Běžné diagnostické testy jsou založeny na stanovení železa v séru, transferinu, ferritinu a saturace transferinu. Ferritin v séru je markerem zásoby železa v organismu.

Transferinový receptor a solubilní transferinový receptor Transferin předává železo do buněk pomocí Obr. 1: Lidský transferinový receptor interakce se specifickým membránovým receptorem nazývaným transferinový receptor (TfR). TfR je homodimer složený ze dvou 95 kDa jednotek svázaných disulfidickými můstky. Každá část má 61 aminokyselin, N-terminální cytoplasmatickou doménu, krátký transmembránový úsek a velkou extracelulární doménu (viz. obr. 1). Každý TfR může vázat jednu, případně dvě molekuly kompexu Fe-transferin. Solubilní transferinový receptor (sTfR) vzniká proteolýzou extracelulární domény na specifickém místě TfR a může být měřen v séru nebo v plasmě. Vztah mezi koncentrací TfR a sTfR v séru a plasmě je konstatní, proto koncentrace sTfR v séru nebo plasmě slouží k nepřímému měření celkového množství TfR.

Klinické využití stanovení sTfR 1. Diferenciální diagnostika IDA a ACD Hlavní oblastí využití stanovení sTfR je diferenciální diagnostika IDA a ACD. Diagnostikovat ACD může být složité z důvodu možné interference dalších vlivů jako nedostatku železa, krevních ztrát, užívání léků nebo přítomnosti jiných forem hemoglobinu (např. thalasemie). Stanovení distribuce železa v organismu se používá při diagnostice ACD k vyloučení přítomnosti IDA. Standardní měření stavu železa v organismu jako ferritin, celková vazebná kapacita železa a železo v séru ovšem může být přímo ovlivňováno chronickou nemocí, způsobující nejisté výsledky. Například ferritin je protein akutní fáze, proto jeho cut off hodnoty neplatí pro pacienty s infekcí nebo zánětem. Naproti tomu sTfR není protein akutní fáze a nekoreluje s markery zánětu, jako je CRP nebo sedimentace erytrocytů. Použití poměru sTfR/log ferritinu může

6


zvýšit specificitu stanovení anemie u pacientů s chronickým onemocněním (viz. tab. 1, obr. 2). 2. Monitorování erytropoézy a odezva na léčbu erytropoetinem Další studie ukazují použití sTfR k monitorování erytropoézy. Po poklesu sTfR před transplantací kostní dřeně nebo kmenových buněk se po obnovení erytropoézy vrací hladina sTfR na původní hodnoty. Při léčbě lidským rekombinantním erytropoetinem se změny v hladině sTfR projevují dříve, než mohou být detekovány změny v hodnotách hematokritu. Z tohoto důvodu může být při sledování sTfR dříve provedena korekce podávání erytropoetinu a železa.

Shrnutí Použití stanovení sTfR v kombinaci s ferritinem v séru a ostatními markery stavu železa může zlepšit diagnózu a léčbu pacientů s anemií. Poměr sTfR/log ferritin pomáhá rozlišit IDA a ACD. Stanovení sTfR lze rovněž využít k monitorování erytropoézy po transplantaci kostní dřeně. Pro objednání: PN A32493 A32494 A32495

Název Access sTfR 2x50 tests Access sTfR Calibrators Access sTfR QC

Literatura 1. WHO/UNICEF/UNU, Iron deficiency anaemia: assessment, prevention, and control. Geneva, World Health Organization, 2001 (WHO/NHD/01.3). 2. Weiss G, Goodnough LT. Anemia of chronic disease. N Engl J of Medicine 2005;352(10): 1011-1023. 3. Andrews N. Disorders of iron metabolism. N Engl J of Medicine 1999;341:1986-95. 4. Goodnough LT, Skikne B, Brugnara C. Erythropoietin, iron, and erythropoiesis. Blood 2000;96(3):823-833. 5. K/DOQI, National Kidney Foundation. Clinical practice recommendations for anemia in chronic kidney disease. Am. J. Kidney Dis. 2006; 47(5 Suppl 13):S86-S108. 6. Beguin Y. The soluble transferrin receptor: biological aspects and clinical usefulness as

quantitative measure of erythropoiesis. Hematologica 1992;(77):1-10. 7. Feelders R. Structure, function and clinical significance of transferrin receptors. Clin Chem Lab Med 1999;37:1-10. 8. Worwood M. Serum transferrin receptor assays and their application. Ann Clin Biochem 2002;(39):221-230 9. Mast AE et al. Clinical utility of the soluble transferrin receptor and comparison with serum ferritin in several populations. Clinical Chemistry 1998;44(1):45-51. 10. Sawhney MS, et al. Should patients with anemia and low normal or normal serum ferritin undergo colonoscopy? Am. J. Gastroenterol. 2007, 102(1):82-88. 11. Punnonen K, Irjala K, Rajamaki A. Serum transferrin receptor and its ratio to serum ferritin in the diagnosis of iron deficiency. Blood 1997;89(3):1052-1057. 12. O’Brion S. Evaluation of serum transferrin receptor assay in a centralized iron screening service. Clin Lab Haem 2005;(27):190-194. 13. Suominen P, Punnonen K, Rajamaki A, Irjala K. Serum transferrin receptor and transferrin receptor-ferritin index identify healthy subjects with sub clinical iron deficits. Blood 1998;92(8):2934-2939. 14. Shih, Y.J. et al. Serum transferrin receptor is a truncated form of tissue receptor. J. Biol. Chem. 1990;(265):19077. 15. Baynes, R.D. et al. Production of soluble transferrin receptor by K562 erythroleukemia cells. Proc. Soc. Exp. Med. 1993;(204):65. 16. Beguin, Y. et al. Transferrin receptors in rat plasma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 1988;(85):637. 17. Cook, J.D. et al. Serum transferrin receptor. Annu. Rev. Med. 1993;(44):63. 18. Ferguson, B.J. et al. Serum transferrin receptor distinguishes the anemia of chronic disease from iron deficiency anemia. J. Lab. Clin. Med. 1992;(119):385. 19. Baer, A.N. et al. The pathogenesis of anemia in rheumatoid arthritis: a clinical and laboratory analysis. Sem. Arth. Rheum. 1990;(19):209. 20. Allen J, Backstrom KR, Cooper JA, Cooper MC, Detwiler TC, Essex DW, Fritz RP, Means, Jr. RT, Meier PB, Pearlman SR, Roitman-Johnson BR, Seligman PA. Measurement of soluble transferrin receptor in serum of healthy adults. Clinical Chemistry 44:135–39 (1998) 21. Baillie FJ, Morrison AE, Fergus I. Soluble transferrin receptor: a discriminating assay for iron deficiency. Clin. Lab. Haem. 2003, 25, 353–357.

Tab. 1: Markery sloužící k rozlišení anemie z chronické nemoci a anemie z nedostatku železa Marker

ACD

IDA

ACD + IDA

Železo

snížené

snížené

snížené

Transferin Transferinová saturace Ferritin

snížený až normální

zvýšený

snížený

snížená

snížená

snížená

normální až zvýšený

snížený

snížený až normální

sTfR Poměr sTfR/log ferritinu Cytokiny

normální

zvýšený

normální až zvýšený

nízký (< 1)

vysoký (>2)

vysoký (>2)

zvýšené

normální

zvýšené

Copyright © 2005 Massachusetts Medical Society

Obr. 2: Navrhovaný algoritmus použití poměru sTfR/log ferritin k diferenciální diagnostice IDA, ACD a ACD s nedostatkem železa

Anemie

Biochemické nebo klinické projevy zánětu

Saturace transferrinu < 16 %

Vyloučení ostatních příčin anemie

Ferritin < 30 ng/mL

E-MAIL: [email protected]

Ferritin > 100 ng/mL

Stanovení solubilního transferrinového receptoru

sTfR / log ferritin > 2

IDA TEREZA TIETZE

Ferritin 30 – 100 ng/mL

sTfR / log ferritin < 1

ACD s nedostatkem železa

ACD

KATEŘINA LAPIŠOVÁ E-MAIL: [email protected]

Copyright © 2005 Massachusetts Medical Society


7

Protilátky proti vnitřnímu faktoru (IFAb)

Nabídka pro stanovení anemií

irma Beckman Coulter nabízí na imunochemických analyzátorech řady Access/DxI jako jediná soupravu na stanovení protilátek proti vnitřnímu faktoru (IFAb) Vnitřní faktor (Intristic Factor) hraje důležitou roli při vstřebávání vitaminu B12. Vitamin B12 je z potravy uvolňován trávicími proteiny v žaludku, kde je poté vázán B12-vazebnými proteiny. V tenkém střevu se z nich opět vitamin B12 uvolní a váže se na vnitřní faktor. Komplex vitamin B12 – vnitřní faktor je vázán sliznicí ilea a vitamin B12 je uvolněn do krve. Perniciózní anemie, nejčastější příčina nedostatku vitaminu B12, je chronické autoimunitní onemocnění charakterizované destrukcí žaludeční sliznice. Přítomnost protilátek proti buňkám žaludeční sekrece a přímo proti vnitřnímu faktoru svědčí o perniciozní anemii (viz. obr. 1). Pro objednání: PN

Název

387992

Access IFAb 2x50 tests

387993

Access IFAb Calibrators

387999

Access IFAb QC

e stále pokračujícím procesem konsolidace laboratoří do velkých laboratorních komplexů přestala být diagnóza anémií výsadou hematologických laboratoří. Stále více je kladen důraz na kompletní hodnocení stavu pacienta v širších souvislostech. Doplněním výsledků z hematologických analyzátorů o další testy lze jednoduše a v krátkém čase zjistit i drobné odchylky od fyziologických hodnot. To ve výsledku vede k přesnějšímu určení diagnózy a současně šetří čas, který by pacient a lékař musel strávit podrobnějším vyšetřením v hematologické ambulanci. Zároveň většina laboratoří směřuje k minimalizaci počtu analyzátorů na pracovišti v rámci omezení nákladů a snížení nároků na obsluhující personál. Firma Beckman Coulter proto nabízí na svých analyzátorech kompletní spektrum markerů pro stanovení anemií. Pro toto široké spektrum vyšetření postačí mít v laboratoři pouze 2 přístroje – kombinovaný systém řady UniCel a hematologický analyzátor HmX/LH. Tyto přístroje navíc zvládnou kompletní rutinní provoz.

TEREZA TIETZE E-MAIL: [email protected] KATEŘINA LAPIŠOVÁ E-MAIL: [email protected]

Obr. 1: Navrhované schéma laboratorní diagnózy pernicióní anemie za použití protilátek proti vnitřnímu faktoru (IFAb)

Makrocytární anemie

Folát

Vitamin B12

IFAb

Jiné příčiny

Hematologické analyzátory řady AcT/HmX/LH RBC HGB – hemoglobin MCV – střední objem erytrocytů MCH – barvivo MCHC – koncentrace hemoblobinu RDW – míra anizocytózy Retikulocyty MRV – střední objem retikulocytů IRF – maturační index retikulocytů NRBC – normoblasty (erytroblasty) MAF – microcytic anemia factor Analyzátory řady UniCel (DxC/DxI/DxC880i)/Access Haptoglobin IBCT Železo Transferin Ferritin Vitamin B12 Folát EPO - erytropoetin Solubilní transferinový receptor (sTfR) Protilátky proti vnitřnímu faktoru (IFAb)

Perniciózní anemie TEREZA TIETZE E-MAIL: [email protected]

8


Laboratorní proces... …do posledního šroubku Vážený čtenáři, možná oceníš moji neodbytnost a přečteš si další článek, pokračování popisu laboratorního procesu, nebo naopak otráveně otočíš list. Přesto pro ty, které toto téma v minulých číslech našeho časopisu zaujalo, přinášíme další pokračování. a začátek malá rekapitulace. V minulých článcích jsem hovořil o výhodách znalosti laboratorního procesu pro jeho efektivní řízení. Dále jsem se v minulém čísle snažil popsat metodiku, jak přistoupit k popisu laboratorního procesu formou kladení otázek a zaznamenávání odpovědí a jejich kombinaci zaznamenat formou vývojového diagramu, jako základní kostru laboratorního procesu v laboratoři. Na konci minulého článku jsem upozornil i na skutečnost, že k popisu procesu je potřeba se po čase vrátit. To právě teď učiním. Předpokládejme, že na základě vaší analýzy formou otázek máte nyní schéma vašeho laboratorního procesu. Pokud se k vašemu schématu vracíte po delší době, může se stát, že vám některé kroky procesu, tak jak jste je zaznamenali posledně, nejsou srozumitelné nebo že byste je dnes zaznamenali jinak. V tom případě se na tu část procesu zaměřte a pokuste se jej popsat znovu. Zvolte k tomu stejný přístup jako minule, tj. hledejte odpovědi na to, jaký je váš proces formou otázek. Původní variantu nezavrhujte a archivujte ji. V další části článku bych se rád zaměřil na charakteristiku jednotlivých kroků procesu z hlediska jejich vlivu na zpracovávaný materiál a data, z pohledu vlivu na rychlost procesu, jeho kapacitu, vlivu na kvalitu výsledku, z pohledu možného vzniku chyb, vlivu lidského faktoru a také vlivu procesu na personál laboratoře. Účelem je vyhledat v procesu klíčová místa, která zásadně ovlivňují kapacitu procesu a kvalitu výstupu. I zde můžeme použít metodu otázek a odpovědí, v tomto případě tzv. uzavřených otázek, tj. otázek, kde odpověď zní buď „ano“ nebo „ne“. Pokud máte všechny kroky ve vašem schématu z hlediska vykonávané činnosti popsané srozumitelně, nemělo by se stát, že nebudete schopni odpovědět.

Hrozí destrukce vzorků? Ohrožuje v tomto kroku zpracovávaný vzorek personál? Hrozí v tomto kroku chyba způsobená lidským faktorem? Liší se v tomto kroku způsob zpracování rutinních a STAT vzorků? …atd. Na základě odpovědí (ANO/NE) jste nyní schopni do vašeho schématu popisu laboratorního procesu zaznamenat vliv daného kroku na kvalitu vzorku, a tedy i na kvalitu výstupu procesu, na vliv personálu, vliv na personál, vliv na kapacitu a výkon procesu atd. Vlivy jednotlivých kroků můžete do schématu zaznamenat formou „ikon“ charakteristických pro jednotlivé vlivy. Já osobně používám symboly dopravních značek. Například pro nárazové nahromadění vzorků používám dopravní značku „kolona“, pro krok, kdy vzorek ohrožuje své okolí, dopravní značku „odletující štěrk“. Pro úzké hrdlo procesu značku „zúžené komunikace“, pro krok, kde vzorky čekají na další zpracování, symbol „parkoviště“ atd. (viz. tabulka č. 1 a příklad schématu). Na tomto místě doporučuji vytvořit si vlastní legendu k vámi použitým symbolům. Volba sady symbolů je čistě na každém z vás. Tady se může projevit vaše nápaditost a tvořivost, vaše představivost, dokonce i vaše mimopracovní zájmy a záliby. Například symboly používané v říční dopravě, symboly námořní komunikace, symboly bezpečnosti práce apod. mohou posloužit stejně, ne-li lépe pro charakteristiku jednotlivých kroků v procesu. Tab. 1: Příklad legendy Hromadění vzorků (např. na příjmu při zadávání informací do LISu). Hromadění vzorků je způsobeno nedostatečnou kapacitou personálu, způsobem práce. Vzorky čekají (například pro vložení vzorků do centrifugy), čekání je způsobena kapacitou technologie. Okolí, zpracování vzorku ohrožuje jeho kvalitu. Vzorek dává přednost jinému typu vzorku, zpracování jiného typu. Čekání vzorku ohrožuje kvalitu výstupu, vzorek nesmí čekat například STAT. Úzké hrdlo procesu (například centrifugace, alikvotace vzorku).

Příklad uzavřených otázek: Hromadí se v tomto konkrétním kroku vzorky? Čekají v tomto kroku vzorky na další zpracování? Je tento krok úzkým hrdlem procesu z pohledu jeho výkonu (kapacity)? Ohrožuje tento krok kvalitu vzorku? Ohrožuje tento krok kvalitu výsledku?

Nutná visuelní kontrola vzorku. Vzorek ohrožuje okolí (kontaminace technologie, kontaminace ostatních vzorků, kontaminace obsluhy).


9

Názorné schéma

10


Tab. 2: Popis činností, vlivy a rizika Pracoviště

Prováděné činnosti

Popis činnosti

Vliv/Riziko

Příjem

Příjem vzorku

Fyzické převzetí vzorků personálem příjmu

Možná ztráta vzorku, poškození

Fyzické převzetí dokumentace vzorků (žádanky)

Možná ztráta žádanky/nemožnost provedení vyšetření Nekvalitní vzorek, vliv na kvalitu výsledku, zmatečná identifikace vzorku Nekompletní žádanka, chybějí údaje pro identifikaci vzorku, nečitelnost žádanky Časově náročná operace, rutinní operace

Kontrola integrity vzorků, kontrola identifikace vzorku Kontrola kompletnosti žádanky Třídění vzorků

Dle typu vzorku (materiál vzorku) Dle naléhavosti (rutina/STAT)

Časově náročná operace, riziko záměny, větvení procesu dalšího zpracování

Další/jiná (možná) kritéria třídění vzorků Zpracování žádanky

Zadaní pacienta/vzorku do LISu Označení žádanky

Označení primární zkumavky

Centrifugace

Příprava centrifugace

Urgentní činnost pro zaznamenání vzorku v systému, možný zdroj chyb Možná záměna

Přiřazení jednotlivých požadovaných vyšetření ke Možná záměna vzorku Tisk čárových kódů pro označení primárních zkumavek Určující činnost pro další zpracování vzorku v procesu Označení primární zkumavky štítkem s čárovým Možná záměna, znehodnocení vzorku kódem špatným nalepením štítku na zkumavku Obsluha přebírá roztříděné (rutina/STAT) vzorky Čekání na vzorek, různé zpracování z příjmu na zpracování centrifugací různých typů vzorku dle naléhavosti Významný vliv na výkon a kapacitu Obsluha se rozhoduje o vytíženosti jednotlivých procesu, riziko prostojů, vliv na TAT centrifug, množství vložených vzorků (workload) na vzorku základě momentálního počtu vzorků čekajících na zpracování Vyvažování rotoru centrifugy (množství vzorků) Časově náročná operace, vliv na kvalitu centrifugace Vkládání centrifugačních kyvet do rotoru centrifugy Nehrozí významné riziko

Vlastní centrifugace

Obsluha dohlíží na vlastní průběh centrifugace

Ukončení centrifugace

Obsluha po ukončení vlastní centrifugace rozhoduje o prostojích vzorku (stání vzorků v centrifuze po ukončení separace) Vyjmutí kyvet z centrifugy

Prostoj

Vyjmutí zkumavek z centrifugačních kyvet Kontrola kvality vzorku po centrifugaci

Alikvotace

Příprava alikvotace

Třídění vzorků pro další zpracování (alikvotace, transport k analýze), vkládání vzorků do patřičných stojánků Příprava sekundárních zkumavek/capů, eppendorfek atd. Tisk štítků pro označení sekundárních zkumavek Příprava pipet, špiček a jiného materiálu pro alikvotaci Odvíčkování primární zkumavky

Vlastní alikvotace Ukončení alikvotace

Přenesení požadovaného objemu vzorku do sekundární zkumavky Uzavření/Neuzavření sekundární zkumavky s alikvotem Uzavření/Neuzavření primární zkumavky se vzorkem Označení sekundárrní zkumavky identifikačním štítkem s čárovým kódem Umístění sekundární a primární zkumavky do stojánku/Třídění Transport stojánku se vzorkem k dalšímu zpracování


11

Tab. 3: Sumarizace vlivů a rizik 5

1

1

5

2

0

3

2

6

4

1

1

2

Legendu můžete vytvářet postupně tak, jak přicházíte u jednotlivých kroků procesu k jejich možným vlivům, případně charakteristickým znakům pro daný krok. Pokud ale nebudete okamžitě po zavedení symbolu zaznamenávat jeho význam do legendy, může se stát, že později budete mít problém s definicí významu nebo pro daný rys, vliv nebo riziko kroku budete mít více symbolů. Je rovněž dobré význam symbolu popsat konkrétním příkladem. A nyní přistupme k praktickému procvičení na konkrétním příkladě. Jako příklad jsem zvolil zjednodušený proces příjmu a preanalytického zpracování vzorku v laboratoři. Volba sady symbolů je čistě na každém z vás. Tady se může projevit vaše nápaditost a tvořivost, vaše představivost, dokonce i vaše mimopracovní zájmy a záliby. Například symboly používané v říční dopravě, symboly námořní komunikace, symboly bezpečnosti práce apod. mohou posloužit stejně, ne-li lépe pro charakteristiku jednotlivých kroků v procesu. Legendu můžete vytvářet postupně tak, jak přicházíte u jednotlivých kroků procesu k jejich možným vlivům, případně charakteristickým znakům pro daný krok. Pokud ale nebudete okamžitě po zavedení symbolu zaznamenávat jeho význam do legendy, může se stát, že později budete mít problém s definicí významu nebo pro daný rys, vliv nebo riziko kroku budete mít více symbolů. Je rovněž dobré význam symbolu popsat konkrétním příkladem. A nyní přistupme k praktickému procvičení na konkrétním příkladě. Jako příklad jsem zvolil zjednodušený proces příjmu a preanalytického zpracování vzorku v laboratoři. Uvedené schéma je za účelem přehlednosti záměrně zjednodušené. Jednotlivé kroky lze popsat podrobněji a doplnit celou řadu dalších symbolů k jejich popisu. Pro popis procesu je vhodné si na základě již vytvořeného vývojového diagramu vytvořit tabulku jednotlivých činností na jednotlivých úsecích zpracování vzorku a dat s konkrétním popisem činnosti a s uvedením možného vlivu či rizika prováděného kroku (viz. tabulka č. 2) na konečný výsledek stanovení, poškození materiálu, ohrožení personálu, technologie, možnost vzniku chyby atd. Při tvorbě takové tabulky se může stát, že proces popsaný formou vývojového diagramu je potřeba upravit. V tom případě tak učiňte a nezapomeňte si opět zálohovat (archivovat) původní verzi. Konfrontace vývojového diagramu a tabulky je další návodem, jak lépe, podrobněji a přesněji popsat laboratorní proces do posledního šroubku. Označení, kategorizace a roztřídění jednotlivých kroků v laboratorním procesu je důležité z pohledu vlivu na konečnou kvalitu, možné eliminace rizika, které daný krok s sebou nese. Po kategorizaci kroků je potřeba provést jejich sumarizaci, tedy součet vlivů jednotlivých kategorií v celém procesu (viz. tabulka č. 3). V příštím čísle si obdobný proces zopakujeme na analytické, popř. postanalytické fázi laboratorního provozu. V dalších pokračováních tématu „Laboratorní proces“ bych se rád věnoval i možnostem, jak tento proces na základě jeho popisu, poznání a analýzy zjednodušovat, inovovat a automatizovat. Dalším ze zajímavých témat je i metrika procesu, která objektivně charakterizuje

12


kvalitu, výkon a ekonomičnost procesu. Zajímavými tématy je situační lokalizace procesu v prostoru laboratoře, uplatnění tzv. midleware a firmware prostředků a bezpochyby i laboratorního informačního systému. Co je na laboratorním procesu to zajímavé z pohledu chápání světa? Pro mě je to poznání, že tady funguje to, co i v jiných lidských činnostech, jako je teorie relativity, teorie neurčitosti, metafyzika, dialektika a celá řada dalších teorií. Například pokud budeme popisovat zpracování jednoho vzorku, pravděpodobně nám to nebude dělat problém. Jakmile daný popis aplikujeme na větší množství vzorků, zjistíme, že vše je relativní, a dokonce, že naší laboratoří procházejí vzorky, u kterých ani netušíme, jak jsou zpracovávány. Pokud nebudeme schopni přesně říci, kde se v dané chvíli vzorek v laboratoři nachází, nebudeme schopni určit, jakou fází zpracování prochází. Stejně tak pokud nebudeme vědět, jaká vyšetření již byla provedena, budeme mít pravděpodobně problém vzorek v laboratoři dohledat. Jistá filosofická teorie říká, že je možné stoprocentně popsat cokoliv, tedy i laboratorní proces. Jiná nás od toho bude odrazovat, protože než dosáhneme přesného popisu laboratorního procesu, budeme vlastně popisovat něco, co již neexistuje. Život je plný překvapení a laboratorní proces je život sám, někdy možná i světem sám pro sebe. Pevně věřím, že téma „Laboratorní proces“ je pro vás zajímavé, a proto se těším na vaše ohlasy, připomínky, případně dotazy, které zasílejte do naší redakce. ŠTĚPÁN TINTĚRA E-MAIL: [email protected]

Onkogenní markery Indikace a interpretace Vyšetření nádorových markerů je bráno mnohdy nejenom laickou veřejností jako základ úspěšné diagnostiky a následného sledování nemocných se zhoubnými nádory. yšetření nádorových markerů je bráno mnohdy nejenom laickou veřejností jako základ úspěšné diagnostiky a následného sledování nemocných se zhoubnými nádory. Je jejich význam skutečně tak veliký nebo je to jen sugestivní název těchto analytů či touha po jednoduché kvantitativně vyjádřené veličině? Pokud něco změřím a je-li to vyšší než minule, je vše špatně? Tento článek se pokusí odpovědět na otázku, kdy a proč indikovat nádorové markery, a současně s tím, jak je interpretovat. Nelze začít jinak než otřepanými a neustále opakovanými frázemi - nádorové markery lze charakterizovat jako látky produkované maligními buňkami či organizmem jako odpověď na nádorové bujení. Může se jednat o antigeny lokalizované na povrchu buněčných membrán, enzymy metabolických drah či fragmenty cytoplazmatických struktur uvolňované do okolí při zániku buněk. Nádorové markery lze detekovat imunoanalytickými metodami v séru či jiných biologických tekutinách, popřípadě v buněčném cytozolu a extraktech z tkáňových kultur. Imunohistochemicky je můžeme detekovat přímo v tkáních. Metody molekulární biologie nám umožňují detekovat genovou expresi nádorových buněk. Šlágrem současnosti je stanovení nádorových markerů v cirkulujících buňkách v periferní krvi. Jejich produkce je závislá na diferenciaci buněk. Málo diferencované buňky produkují pouze chemicky jednoduché sloučeniny, které jsou nezbytné pro buněčné dělení – proliferační markery, jako je thymidinkináza (TK) nebo markery vznikající přeměnou buněčného skeletu (růst, nekróza, apoptóza) – a my je detekujeme jako solubilní fragmenty cytokeratinů. Teprve diferencované buňky jsou schopny tvořit složité polypeptidické či mucínové struktury. Dalším předpokladem stanovení nádorových markerů je vaskularizace nádoru a vyplavení nádorového markeru do tělních tekutin. Kromě vaskularizace souvisí hladina nádorových markerů samozřejmě i s velikostí nádoru. Nádorové markery umožňují v příznivých případech odhalit nádor o hmotnosti 1 mg (cca 106 nádorových buněk), zatímco klinická diagnóza pomocí zobrazovacích technik bývá stanovena až u nádoru, který obsahuje 109 nádorových buněk. Při indikaci a interpretaci nádorových markerů musíme vzít v úvahu ještě následující dva faktory, a to: biologický poločas a biologickou variabilitu. Respektování biologického poločasu je důležité především tehdy,

pokud využíváme nádorové markery pro kontrolu efektu terapie – kdy volba doby po operaci nebo po skončení chemoterapie musí být minimálně dvoj- až trojnásobkem biologického poločasu. Znalost biologické variability markeru je důležitá při dynamickém sledování nádorových markerů pro posouzení významnosti změny hladiny nádorového markeru. Název „Nádorové markery“ je značně nepřesný, protože do této skupiny patří látky, které ve velké většině případů nejsou ani nádorově ani orgánově specifické (tabulka č. 1). Neexistuje zatím univerzální nádorový marker, který by vyhovoval statistickým parametrům používaným k jejich hodnocení, tj. senzitivita (správný záchyt nemocných) při dostatečné specificitě (správná negativita u lidí bez nádorového onemocnění), a tím nemá ani optimální spolehlivost. Při indikaci vyšetření nádorových markerů je vhodné se řídit : 1) Klinickou otázkou – proč nádorový marker určujeme a co od výsledku očekáváme. To by měl být základ uvažování lékaře, protože s tím i úzce souvisí interpretace. V praxi se velice často s setkáváme s tím, že tato základní podmínka není dodržena a důsledkem pak je, že lékař obdrží výsledek, který pouze založí, a význam vyšetření pro pacienta je nulový. Věřím, že takováto situace se vyskytuje vzácně. Možné klinické situace, kdy a jak vyšetřovat nádorové markery, jsou rozebrány v další části článku. 2) Jaký je přínos vyšetření – největším přínosem by bylo, kdyby markery umožnily diagnostiku časných stadií nádorového onemocnění, ale to je stále sen budoucnosti. Při monitoraci onemocnění existují zcela extremní názory – nedělat sledování vůbec, protože tím, že zjistíme recidivu, progresi, event. generalizaci onemocnění dříve – v asymtomatickém období – se nic nezmění na perspektivě nemocného. Druhý názor předpokládá intenzivně sledovat nádorové markery a již pouze při změně hladin nádorových markerů léčbu zahájit nebo změnit. Oba přístupy jsou extrémní. V současné době nové chirurgické přístupy umožňují reoperace, operaci metastáz apod. Obdobně i onkologická léčba má zcela jiné možnosti než dříve. Proto čím dříve určíme progresi onemocnění, tím lépe. Na druhé straně tam, kde je možná již pouze paliativní léčba, je otázkou, zda má sledování nádorových markerů význam. Jedná se například o pokročilá stadia nádorů jícnu, pankreatu apod. 3) Pro výběr konkrétního nádorového markeru musíme vycházet z lokalizace nádoru a předpokládané TNM klasifikace, stádia onemocnění, histologické struktury a s tím i úzce související buněčné diferenciace nádorových buněk, jak již bylo výše zmíněno. Obecně platí, že čím je nádorové bujení pokročilejšího stadia, tím je větší pravděpodobnost zvýšené hodnoty nádorových markerů. Co se týká histologického typu, je nutné si na prvním místě uvědomit, že nádorové markery nejsou tkáňově ani orgánově specifické. Jen velice obecně lze říci, že nádory vycházející z dlaždicového epitelu produkují SCC, CEA, event. CYFRU. U karcinomů mucinosního charakteru vyšetřujeme nádorové markery CA typu. U nádorů vycházejících ze zárodečného listu jsou pozitivní AFP a hCG. Proliferaci nejlépe vystihují změny hladiny thymidinkinázy. Někdy jsou mezi proliferační markery řazeny i cytokeratiny, což však řada autorů odmítá s tím, že jejich zvýšení je důsledkem poškození buňky (nekrózy nebo apoptózy), nikoliv proliferace. 4) Klinickým stavem nemocného a fází onemocnění – před operací, po radikální operaci, po paliativním výkonu, před onkologickou a po onkologické terapii, v částečné či úplné remisi, pokud existuje podezření na progresi, či je-li progrese nebo generalizace onemocnění zcela zřejmá .


13

5) Frekvence vyšetření nádorových markerů je nejčastěji 1x za 3 – 4 měsíce v prvních třech letech po vzniku nádorového onemocnění. Později stačí 2 x do roka. Frekvence však závisí i na vývoji onemocnění. Při progresi nádoru je samozřejmě nutné frekvenci vyšetření zvýšit na 1 x za měsíc nebo 1x za dva měsíce.

K čemu slouží vyšetření nádorových markerů? Skríning Obecnou podmínkou skríningu je, aby při 95 % specificitě byla senzitivita 97 %. Této senzitivity musí být dosaženo nejlépe v časném stadiu nádorového onemocnění. Pro skríning byla snaha použít CEA u nádorů kolorecta, CA 125 pro nádory ovarií a PSA pro karcinom prostaty. Žádný z markerů této podmínce nevyhověl. U karcinomu prostaty by se proto mělo hovořit nikoliv o skríningu, ale o časné diagnostice ve vybrané populační skupině. Primární diagnostika Podobně jako pro skríning nejsou nádorové markery vhodné ani pro primární diagnostiku, a to ze stejných důvodů; navíc i proto, že jejich orgánová specificita je většinou malá. Diferenciální diagnostika Podobně jako při primární diagnostice se zde obecně nádorové markery nedoporučují. U vybraných následujících diagnóz je však naopak použití velice účelné. Jedná se o nádory testes, chorioepiteliom, neuroendokrinní nádory a v současné době stále více i diferenciální diagnostika nádorů plic. Monitorování průběhu choroby V praxi je nejvýznamnější indikací pro sledování nádorového markeru monitorování průběhu onemocnění a s tím úzce související diagnostika recidivy nebo progrese (1, 2, 3). Dodržuje se určité schéma, které je odvozeno ze senzitivit získaných z předoperačních vyšetření nebo dlouhodobých monitorovacích studií. Hovoří se o hlavních a doplňkových nádorových markerech. Tento empirický přístup má své výhody, ale, jak si dále ukážeme, i své nevýhody. V průběhu nádorového onemocnění se mění řada markerů. Některé změny umíme vysvětlit – souvisí s biologickou aktivitou nádorového procesu. Další změny sice neumíme vysvětlit, ale jsou natolik signifikantní, že marker zařadíme buď do skupiny hlavních, nebo doplňkových nádorových markerů. Někdy změny nádorových markerů existují, jejich diagnostická cena je omezená nebo vůbec žádná. Označujeme je v odborné terminologii jako falešnou pozitivitu. Klasifikace na hlavní a doplňkové markery není v ČR jednotná, nejobvyklejší klasifikaci ukazuje tabulka č. 2. Doplnil jsem tabulku pouze o sloupec nádorové markery „se mění“, bez diagnostického významu. Diskutovanou otázkou je, kdy se sledováním nádorových markerů začít a jaká má být frekvence. Zde se již mísí úvahy o současném víceúčelovém využití stanovení nádorového markeru – tedy nejen pro monitoraci nádorového onemocnění, ale současně pro sledování efektu léčby, prognózy s ohledem na všechny aspekty průběhu onemocnění. Dle naší zkušenosti je nejvhodnější provést první vyšetření před léčbou, tj. nejčastěji před operací,14 dní po operaci a pak vyšetřovat v prvních třech měsících 1 x za měsíc a na to navázat vyšetřením 1x za 3 – 4 měsíce až do konce třetího roku od zahájení sledování. Později je dostačující frekvence 2 x ročně. Samozřejmě dojde-li k progresi onemocnění, je nutné frekvenci sledování zvýšit. Vyšetření předoperační hodnoty má dvojí význam. Jak naše dlouhodobé zkušenosti ukazují, pokud je nádorový marker zvýšen předoperačně, bude zvýšen i při progresi, a to v 88 – 95 % , naproti tomu tam, kde předoperační hodnoty byly v normě, dojde při progresi k vzestupu jen v 30 %. Předoperační vyšetření vhodně voleného nádorového markeru umožňuje do jisté míry individualizovat dispenzární péči. Při předoperační pozitivitě markeru se na něj můžeme spolehnout i při follow up, při negativitě by měl být dán důraz především na klinické sledování nemocného, event. na zobrazovací techniky. Kromě toho absolutní výše sérové hladiny nádorového markeru souvisí s prognózou nemocného.

14


Sledování efektu terapie Sledování efektu terapie pomocí nádorových markerů je, pokud se systematicky a indikovaně provádí, neocenitelným pomocníkem lékaře. Vzhledem k různým biologickým poločasům jednotlivých markerů je nutno správně volit intervaly odběrů krve k vyšetření tak, aby se skutečně postihl efekt terapie a ne „lysis fenomen“, tj. krátkodobý prudký nárůst hladiny markeru jako odpověď na terapii. Vyšetřujeme nádorové markery pro posouzení úspěšnosti terapie nejdříve koncem třetího týdne, lépe ve 4. týdnu od aplikace terapie. Tato oblast se v poslední době dostává do centra zájmu onkologů. Nezanedbatelnou výhodou pro markery, oproti zobrazovacím metodám, je fakt, že jejich elevace může upozornit na progresi i v jiném orgánu, než který je sledován zobrazovacími metodami. Existuje tedy potřeba lepšího systému pro sledování terapie, než je současně dostupný. Toto je oblast, ve které v budoucnu markery najdou své ocenění a snad nedůležitější roli v praxi. Důležitou výhodou vyšetřování sérových nádorových markerů je, že jejich měření odráží dynamiku stavu nemocného a vyšetření může být opakováno, jak je třeba. Pozitivní korelace mezi změnami některých sérových nádorových markerů a odpovědí k systémové terapii u onkologických pacientů byla popisována nejčastěji u karcinomu prsu. Další práce potvrzují zvýšení přežívání u nemocných léčených na základě zvýšených hodnot sérových nádorových markerů při negativním nálezu zobrazovacích metod u nemalobuněčného plicního karcinomu. Při terapii ovariálních karcinomů byl prokázán význam stanovení CA 125 pro optimalizaci léčby. U nehodgkinských lymfomů a leukémií vyšetřování sérové TK i B-2-M umožňuje sledovat efekt chemoterapie i predikci vývoje choroby.

Obecná pravidla při interpretaci nádorových marketů Předpokladem správné interpretace výsledku v laboratoři je respektování podmínek preanalytiky, analytiky a samozřejmě existující interní a externí kontroly kvality. Na rozdíl od enzymů, hormonů a dalších analytů jsou nádorové markery relativně odolné zevním vlivům. Hemolýza zvyšuje významnou měrou pouze sérovou hladinu NSE – což je způsobeno jeho vysokou hladinou v erytrocytech. Nevyžadují odběr nalačno a pro standardizaci výsledků je doporučeno provádět odběr vždy v ranních hodinách. Nádorové markery podléhají relativně minimální denní variabilitě, výjimkou jsou cytokeratiny a TK, kde se denní variabilita podle našich zkušeností pohybuje mezi 10 – 25 %. Biologická variabilita je různá a pohybuje se od 5 – 70 %, extrémně vysokou biologickou variabilitu má podle některých autorů CA72 - 4 – až 300 %. Při monitoraci

Tab. 1: Základní charakteristika nádorových markerů Marker Onkofetální antigeny Karcinoembryonální antigen Alfa -1 - fetoprotein Lidský choriový gonadotropin Cancer antigen 15 -3 Cancer antigen 19-9 Cancer antigen 125 Cancer antigen 72-4 Enzymy Neuronspecifická enolasa Prostatický specifický antigen celkový Prostatický specifický antigen volný Thymidinkinasa Hormony Adrenokortikotropin Calcitonin Parathormon Prolaktin Solubilní cytokeratinové fragmenty Monototal Tkáňový polypeptidický antigen

Zkratka

Tkáňový polypeptidický specifický antigen Cytokeratinový fragment 21 -1 Ostatní Antigen skvamosních buněk Thyroglobulin Chromogranin A Ferritin Beta -2 mikroglobulin

Charakteristika

M. h. kDa Biologický poločas

CEA AFP hCG CA 15 -3 CA 19-9 CA 125 CA 72-4

glykoprotein glykoprotein glykoprotein glykoprotein glykolipid , mucin glykoprotein glykoprotein

NSE TPSA FPSA TK

polypeptid glykoprotein glykoprotein polypeptid

100 34 10

ACTH CT PTH PRL

polypeptid polypeptid hormon polypeptid

4,5 3,5 9,4 23

12 min. do 5 min. 15 - 20 min.

MT TPA

polypeptid, fragmenty 8, 18, 19 polypeptid fragmenty 8, 18, 19 polypeptid fragment 18 (M3 epitop) polypeptid, fragment 19

40

7 dnů

40

7 dnů

40

dosud neznám

48 660 49 až 440 11,8

20 min. 15 - 96 hod.

TPS CYFRA 21-1 SCC hTg CHgA B2- M

glykoprotein protein kyselý glykoprotein protein železné jádro protein

180 70 400 100 200 >10³

14 dnů 3 - 6 dnů 1,5 - 2,5 dnů 7 dnů 5 dnů 4 dny 3 - 7 dnů 24 hod 2 - 3 dny 7 hodin 2 dny

40 min.

Tab. 2: Změny nádorových markerů u nádorových onemocnění Lokalizace maligního nádoru a typ Nádory hlavy a krku Horní dvě třetiny Nádory jícnu Dolní třetina Squmosní Nádory plic Adenokarcinom nemalobuněčné NSCLC Velkobuněčný Nádory plic malobuněčné - SCLC Nádory žaludku Nádory colorecta Nádory jater a žlučových cest Nádory pankreatu Neuroendokrinní nádory Nádory ledvin Nádory močových cest Nádory prostaty Nádory prsu Nádory varlat

Hladiny markerů, které se mění Diagnostický význam

Doplňkový marker

Mění se, ale změna nemá dg. význam

TPS, CYFRA 21-1 SCC CA 72 -4 CYFRA, TPA, MT TPA, MT, CYFRA TPA, MT, CYFRA NSE, PrGNp CA 72 - 4 CEA CA 19-9, CEA, Chg A CA 19-9, AFP ChgA, NSE

TPA, Monototal, CEA, TPA, TK CEA, TPA, TK SCC CA 125 TK MTl, CYFRA CEA CA 19-9, TPS, TK CA 15-3, SCC, CYFRA TK TK NSE, TPS, Chg A CYFRA TPS, TK Chg A TK, TPA, ChgA, CYFRA

TK, CEA, CYFRA, TPS CYFRA, TPS, CA 19-9 PSA, TPS, NSE, CA 125 PSA, TPS, SCC, NSE PSA, CA 125, TPS TPA, SCC CA 19-9, hCG, CA 72-4, CA 125, AFP, TPA, MT TK, TPS, TPA, MT CA 72-4, TPS, CA15-3, CA125 TPS, TPA, CEA řada markerů CEA, MT, SCC CA 19-9 TPS, MT, CA 19-9 cytokeratiny, CA 72-4

TPA, CYFRA PSA, fPSA CA 15-3, CEA AFP, beta hCG, TK, NSE

Nádory ovarií

CA 125, CA 72 -4, HE -4

Nádory dělohy Hemoblastozy

SCC, CYFRA TK, beta 2 M, ferritin

TPA, CA 19-9, CYFRA AFP Monototal, CEA TK, TPA

CA 15-3, ChgA, PSA CEA, CA 19-9, CA 125, TPS, MT cytokeratiny

Tab. 3: Pozitivita nádorových markerů u benigních onemocnění Hladiny markerů, které se mění

Klinický stav

Často (více než v 30 %)

Může se měnit (10 – 30 %)

Ne (u méně než 10 %)

Kouření

CEA

Vyšetření per rectum

CEA, PSA

CA 72-4, 125, SCC

CA 15 -3, CA 19-9, cytokeratiny

Těhotenství

hCG, AFP, CA 125, 19-9

CA 15-3, TK, cytokeratiny

CEA, SCC

Perniciozní anemie

TK, feritin

Regenerační procesy spojené rychlým buněčným růstem

TK, TPS

MT

CEA, CA typu, AFP

Bakteriální celková

TK, TPS

TPA, MT

většina NM

Bakteriální lokální

TK, TPS

většina NM souvisí lokalizací

Virová

TK

TPS, MT

Akutní fáze

TK, TPS

MT, TPA, AFP, CA 125, CA 19-9

Infekce

Imunoalteračí onemocnění

Stabilizovaný stav Bez výpotku a ascitu

Srdeční selhání

Výpotek benigní etiologie

S výpotkem a ascitem V pohrudniční dutině

CA 125, AFP, B-2-M CA 125, TPS, TPA, B-2M, MT, CYFRA21.1 CA 125, TPS, TPA, MT, CYFRA

ostatní markery

většina nádorových markerů

TK

Většina NM

CA 19-9, TPS, TPA, MT

TK, CEA, CA 72-4

CA 19-9, CEA, CA 72-4

TK CEA, TK, CA 15-3

CA 125, TPS, TPA

CA 19-9, CA 72-4 MT, CYFRA

CEA, TK, SCC, CA 15-3

Ateroskleróza

TPS

MT, CYFRA

TPA a většina NM

Ledvinné selhání

CEA, Chg A, B-2-M, ferritin, AFP,

CA 15-3, SCC, CA19-9, CYFRA

TK, TPS, TPA, MT

Jaterní selhání

CEA, AFP, CA 125

mucinové NM

TK, cytokeratiny

Akutní

CA 19-9, CA 125, AFP

CA 15-3, CEA,

TK, TPS, TPA, SCC

Chronické

CA 19 -9, AFP, CA 125

CA 15-3, CEA, ChgA

Selhání jater

Chg A, AFP, CA 19-9

CEA, markery CA typu

TK, cytokeratiny

TK, TPS, AFP

Onemocnění jater a žlučových cest

Onemocnění plic Onemocnění prsu

Onemocnění střev

Onemocnění močového ústrojí

V břišní dutině (ascites)

Zánětlivé

CEA, CA - 19-9

Benigní nádor

CEA, CA - 19-9, CYFRA21.1

Benigní nádor

CEA, CA 15-3

TPA, MT, CA 19-9, CA 125

Zánětlivé

CA 19 - 9, CA 72-4, AFP, CEA

TK, TPS, MT, TPA, CYFRA

Autoimunní

TK, TPS,

CA 19 - 9, CA 72-4, AFP, CEA, CYFRA

Benigní nádor

CEA, CA 19 -9, CA 72 - 4

CYFRA

TK, TPS

Zánětlivé

TPA, TPS, CYFRA

TK, CEA

mucinové NM

Benigní nádory

TPA, TPS, CYFRA

onemocnění je důležité nádorové markery stanovovat jednou metodikou v jedné laboratoři. Negativní výsledek ještě neznamená, že nádorové onemocnění není přítomno. Pro kvalitní klinické zhodnocení je nutná úzká spolupráce laboratoře a klinického pracoviště. Pro klinické zhodnocení nádorových markerů se používá Cut off (referenční hladina) – při primární diagnostice je definována jako hladina markeru, pod kterou je 95 % zdravých lidí, event. pacientů s benigním onemocněním, při follow up nádoru nebo monitoraci lečby je definována jako hladina markeru, pod kterou leží 95 % hodnot pacientů v kompletní remisi. V současné době je dopo-

16


většina NM

ručeno stanovovat senzitivitu při 95% specificitě. Je nutné respektovat i skutečnost, že se nádorové markery mohou zvyšovat i u benigních onemocnění (tabulka č.3).

Na otázku položenou v úvodu článku můžeme odpovědět: Správně indikované vyšetření nádorových markerů může přispět především k časnému záchytu

recidivy onemocnění a tím i k rychlejšímu terapeutickému zákroku, který může prodloužit život nemocného. Orgánová specificita při vyšetřování jednoho izolovaného markeru je relativně nízká, proto je nutné vyšetřovat nádorové markery v pravidelných intervalech a v optimální kombinaci. Nejdůležitějším faktorem, který nás může upozornit na časnou recidivu onemocnění, je dynamika vzestupu markerů. Praxe je však přesně opačná, vyšetření jsou indikována naprosto náhodně. To znamená spíše ekonomickou ztrátu, protože výtěžnost těchto nahodilých vyšetření je naprosto nulová. Mnohdy je opomíjeno předoperační stanovení nádorových markerů, které je nezbytným předpokladem využití markerů v úspěšné kontrole terapie. Položíme-li si ještě otázku perspektiv, pak je nepochybně ve vyhledávání nových markerů pomocí nejmodernějších analytických metod (proteomiky, genomiky a dalších) a při volbě terapie využívání znalostí personalizované medicíny. Pro kontrolu léčby používat cílený marker pro cílenou léčbu (VEGF pro antiangiogenní léčbu), dále stanovení cirkulujících nádorových buněk v periferní krvi pro diagnostiku mikrometastáz.

Literatura: 1. Duffy MJ. The urokinase plasminogen activator system: role in malignancy. Curr Pharm Des. 2004;10(1):39-49. Review. 2. Duffy MJ. Evidence for the clinical use of tumour markers Ann Clin Biochem. 2004 Sep;41(Pt 5):370-7. 3. Duffy MJ, Duggan C. The urokinase plasminogen activator system: a rich source of tumour markers for the individualised management of patients with cancer Clin Biochem. 2004 Jul;37(7):541. 4. Fateh Moghadam, A., Stieber, P. Descritption of individual tumor markers. In: Sensible Use of Tumor Markers. Roche, Basel 1993, 33-49. 5. Holubec, L., Jr., Topolčan, O., Pikner, R.: Biologická aktivita u kolorektálního karcinomu. Čas. Lék. Čes. 2002, 141(16), s. 508-512. 6. Kaušitz, J. et al.: Radioimunoanylýza nádorových markerů. Onkológia. Veda, 2003. 7. Votava T, Topolcan O, Holubec L Jr, Cerna Z, Sasek L, Finek J, Kormunda S. Changes of serum thymidine kinase in children with acute leukemia. Anticancer Res. 2007 Jul-Aug;27 (4A):1925-8. 8. Finek J, Holubec L Jr, Topolcan O, Salvet J, Pikner R, Holdenrieder S, Stieber P, Lamerz R, Holubec Sen L, Svobodova S, Visokai V, Helmichova E. Clinical relevance of tumor markers for the control of chemotherapy. Anticancer Res. 2005 May-Jun;25(3A): 1655-8. PROF. MUDR. ONDŘEJ TOPOLČAN, CSC. ODDĚLENÍ NUKLEÁRNÍ MEDICÍNY, ÚSEK IMUNOANALÝZY, FAKULTNÍ NEMOCNICE PLZEŇ, DR. E. BENEŠE 13, 305 99 PLZEŇ E-MAIL: [email protected]


17

Manuální soupravy Immunotech na podzimní vlně dobrých zpráv letošním roce se již stačilo odehrát nemálo významných událostí, namátkou odmítnutí Lisabonské smlouvy v Irsku, nárůst cen ropy do rekordní výše, konání kontroverzních olympijských her v Číně. Zároveň je rok 2008, zejména v České republice, spojen s významnými výročími, při vzpomínce na něž je těžké vyhnout se lehkému mrazení - 1938, 1948, 1868 nebo i 1993 (pro ty, kdo zapomněli - jednalo se o definitivní rozpad Československa). Paralelně s významnými světovými událostmi se samozřejmě dějí i věci, které do běhu světového řádu nijak výrazně nezasahují, byť to nijak nesnižuje jejich význam pro zainteresované jedince. Z ryze subjektivního pohledu pak například narození potomka často naruší „řád věcí“ podstatně více než přírodní či společenská katastrofa odehrávající se někde ve druhé části světa. Na výše zmíněné události lze pohlédnout i z jiného úhlu pohledu, a to z hlediska jejich dopadu. I zde bývá hodnocení velmi subjektivní – můžeme se téměř donekonečna přít o tom, jestli je ten který jev jevem pozitivním nebo negativním, a stejně se názory nepřestanou lišit. V dnešním světě se zdá být tedy prakticky nemožné přijít s informací, která by byla přijímána bezvýhradně kladně. Přesto se domníváme, že pro vás (nebo alespoň pro ty z vás, kteří jste uživateli manuálních imunoanalytických souprav Immunotech) takovou zprávu máme. Ostatně, posuďte sami: Firma Immunotech uvádí na trh tři nové manuální soupravy - vylepšenou RIA soupravu na stanovení protilátek proti tyroidální peroxidáze (Anti-TPO RIA kit, kat. Obr. 1: Klinické ověření soupravy Anti-TPO RIA kit (kat. č. A56719)

č. A56719) a zcela nové soupravy Cytokeratin 19 fragment IRMA kit (kat. č. A56888) a Neo IRT ILMA kit (kat. č. A45781).

Autoprotilátky proti tyroidální peroxidáze Souprava na stanovení anti-TPO prošla již v minulosti některými změnami. Nejdůležitější okamžiky jejího života jsou dva. První nastal v roce 2002, kdy byla nativní TPO používaná v traceru nahrazena rekombinantní peroxidázou, která má výrazně nižší variabilitu mezi jednotlivými šaržemi. Další krok k vyšší kvalitě soupravy právě probíhá. Jeho podstatou je nahrazení polyklonálních protilátek používaných k potažení zkumavek dobře kontrolovanou a pečlivě zvolenou směsí monoklonálních protilátek proti TPO. Vyšší kvalita soupravy se projevuje i ve zřetelnější klinické výpovědní hodnotě. Klinické ověření soupravy bylo provedeno na několika pracovištích v České republice a v zahraničí. Na obrázku č. 1 je uvedeno, u jakého procenta pacientů s různým onemocněním byla nalezena zvýšená hladina autoprotilátek proti štítné žláze.

Cytokeratin 19 fragment

Obr. 2: Porovnání hodnot získaných soupravou Cytokeratin 19 Fragment IRMA kit (kat. č. A56888) s komerčně dostupnou soupravou CYFRA 21-1 IRMA1

Karcinom plic je nejrozšířenějším karcinomem v celosvětovém měřítku, zodpovědným za více než 1,1 milionu úmrtí ročně. V České republice na jeho vrub připadá více než 20 % ze všech úmrtí na rakovinu. Při diagnostice se uplatňuje celá řada tumorových markerů v závislosti na histologickém typu nádoru. K nejčastěji používaným patří, vedle CEA a NSE, stanovení fragmentu cytokeratinu 19 (známého též jako stanovení CYFRA 21-1™) . Nově vyvinutá izotopová souprava společnosti Immunotech již byla úspěšně testována na několika klinických pracovištích a byla též validována pro klinické použití. Na obrázku č. 2 je zobrazeno srovnání s jiným komerčně dostupným stanovením. Obrázek č. 3 znázorňuje způsobilost soupravy rozlišit mezi zdravými jedinci, jedinci s benigním onemocněním a pacienty s nemalobuněčným karcinomem plic v remisi na jedné straně a pacienty s nemalobuněčným karcinomem plic v progresi na straně druhé. Z obrázku č. 3 je tedy zřejmé, že souprava vykazuje vynikající klinickou senzitivitu a specificitu pro nemalobuněčný karcinom plic.

Imunoreaktivní trypsin Od nového roku bude rozšířena nabídka manuálních luminiscenčních souprav pro neonatální screening o stanovení tzv. imunoreaktivního trypsinu. Toto stanovení pomáhá diagnostikovat dědičné onemocnění, které ovlivňuje funkci chloridového kanálu buněk epitelu. Jedná se o cystickou fibrózu, která podle literárních údajů postihuje 1 z 2 500 – 3 500 novorozenců. Nejvíce je ovlivněna funkce dýchacího a trávicího ústrojí. Souprava Neo IRT ILMA prošla klinickou validací v Centru pro screening novorozenců v Bánské Bystrici, během níž bylo testováno 27 974 vzorků od novorozenců. Incidence cystické fibrózy nalezená při této stuidii byla 1:5 595. Výsledek je vzhledem k frekveci výskytu onemocnění ve velmi dobré shodě s publikovanými údaji. O přesném datu, kdy budou soupravy uvedeny na trh, budete včas informováni. Těšíme se na další spolupráci!

Obr. 3: Porovnání hodnot Fragmentu cytokeratinu 19 u zdravých lidí a u pacientů s benigními onemocněními a u pacientů s nemalobuněčným karcinomem plic (stadium III a IV) v remisi a progresi. Hodnota 3,3 ng/mL odpovídá doporučenému cut-off

HELENA KURZWEILOVÁ E-MAIL: [email protected] PATRIK ŠAF E-MAIL: [email protected]

Membránové molekuly na buňkách

Minulost - přítomnost – budoucnost e zjištění biologických příčin neslučivosti tkání při transplantacích výrazně pomohly inbrední kmeny některých laboratorních zvířat, které poskytly vhodné nástroje genetické, biochemické a imunologické analýzy histokompatibilitních systémů determinujících molekuly normálních tkáňových buněk. V historii výzkumu těchto problémů se laboratorní myš stala druhem, jehož H – systémy byly nejlépe prozkoumány zásluhou průkopnických studií P. A. Gorera a později G. D. Snella. Tito vědci položili základy pro pochopení imunologické manifestace genetické podstaty neslučivosti tkání a orgánů, na něž další badatelé svými pokusy navazovali. Pro osud tkáňových transplantátů se ukázal H-2 lokus jako nejvýznamnější, protože alogenní kožní štěpy transplantované mezi H-2 rozdílnými jedinci se zpravidla odhojují do deseti dnů. Místo na chromozomu bylo nejdříve nazváno hlavním histokompatibilitním lokusem a později se ukázalo, že se jedná o extrémně komplexní systém determinující relativně silné Hantigeny, v jehož rámci byla popsána řada různých haplotypů determinujících rozdílnou mozaiku antigenních specificit.

I když se předpokládalo, že poznatky získané výzkumem histokompatibilitních systémů u myší by se mohly využít i u ostatních živočišných druhů, trvalo víc než 10 let, než byl identifikován Daussetem a jeho spolupracovníky hlavní H-systém u člověka. Tento systém byl označen jako HL-A systém a určuje HL-A antigeny, které tvoří pravděpodobně nejheterogennější skupinu antigenů u člověka známých. HL-A systém je nejsilnější H-systém u lidí, kožní štěpy přežívají na HL-A geneticky odlišném příjemci výjimečně 15 dní, většinou se do 12 dnů odhojí. Mnoho poznatků pro transplantační imunologii přinesli i naši odborníci pracující v Ústavu experimentální biologie a genetiky ČSAV, který tehdy řídil prof. MUDr. Milan Hašek. Z tohoto ústavu vyšli skvělí odborníci, kteří významným způsobem posunuli tehdejší stav poznání a zapsali se nesmrtelným písmen do dějin imunogenetiky. Jen namátkově jsou uvedena některá jména, jako J. Klein, P. Skamene, P. a J. Ivanyiové, A. Lengerová, P. Démant, I. Hilgert a mnoho dalších. I autor článku měl možnost vypracovat v tomto ústavu kandidátskou disertační práci na téma Transplantační antigeny (1). Později u dalších živočišných druhů (potkan, opice, prase, pes, králík) byly odkryty hlavní histokompatibilitní systémy (H-1, Rh1-A, P1-A, D1-A, R1-A), které rozšířily dosavadní stav poznání.

Minulost V minulém století se v nejrůznějších oborech (imunologii, hematologii, onkologii, endokrinologii, experimentální medicíně) nahromadilo množství poznatků, jejichž společným jmenovatelem je kritická účast buněčné membrány v různých fyziologických procesech. Pro transplantační strategii bylo objevení individuálně specifických antigenů, které jsou příčinou neslučivosti tkání


19

Tab. 1: Základní informace o mezinárodních setkáních z hlediska vytvoření CD nomenklatury

1

Paříž

1982

Počet MP prokazujících CD znaky 102

2

Boston

1984

126

3

Oxford

1986

236

CD27 – CD45

4

Vídeň

1989

425

CD46 – CDw78

5

Boston

1993

662

CD79 – CD130

6

Kobe

1996

444

CD131 - CD166

7

Harrogate

2000

273

CD167 - CD247

8

Adelaide

2004

Pracovní setkání

Místo konání

Rok

Definované CD znaky * CD1 – CDw15 CD16 – CD26

CD247 – CD350

a orgánů, natolik zásadní, že byly označeny jako histokompatibilitní transplantační antigeny. Byly rozpracovávány jednotlivé metody jejich detekce a zjišťována jejich chemická povaha. Původní představa Billinghama, Brenta a Medawara, že H-antigeny jsou lokalizovány v buněčném jádře (konkrétně v DNA), byla zpochybněna Haškovou a Hrubešovou, které prokázaly, že antigenní aktivita tkáňových homogenátů není citlivá na deoxyribonukleázu. Později se ukázalo, že H-antigeny se nacházejí na buněčné membráně. Tyto poznatky podnítily intenzívní výzkum zaměřený na detekci, a to nejen H-antigenů, ale mnoha dalších membránových molekul. Buněčná membrána se najednou stala středem zájmu a byly vyvíjeny různé metody, které tyto antigeny uvolňovaly z buněčných membrán. Byl přijat model membrány jako tekuté mozaiky, kde je základní nosnou strukturou viskózní dvojvrstva lipidů,

20


v níž jsou lokalizovány různé glykoproteiny mající určitou pohyblivost. Tento model pomohl vysvětlit nejrůznější dynamické jevy včetně indukované redistribuce různých membránových molekul a stabilizace některých membránových komponent jejich uspořádáním v komplexní membránové agregáty. Doslova byla spuštěna lavina objevování a charakterizování nejrůznějších typů molekul u různých druhů. HL-A systém brzy dohnal zpoždění oproti H-2 systému, a tak HLA-A, B, C antigeny byly zařazeny do MHC I. třídy a HLA-DR, DP, DQ do MHC II. třídy. Také byla vyjasněna jejich chemická povaha a funkce. Obrovský rozvoj v analýze antigenních systémů byl v podstatě podmíněn dvěma směry: 1) rozvojem nových detekčních technik a 2) hybridomovou technologií. Pro charakterizaci membránových molekul se z detekčních technik ukázaly jako zásadní dvě hlavní metody, imunofluorescence a průtoková cytometrie. Imunofluorescence dává různé možnosti, a to za využití jednak přímé, jednak nepřímé fluorescence, přičemž se dají ještě použít různé fluorochromy. Průtoková cytometrie se ukázala jako nesmírně užitečná metoda, a to pro celou řadu kvalitativních a kvantitativních stanovení mnoha proteinů. Díky tomu došlo k neuvěřitelnému rozvoji poznatků, které jsou tak rozsáhlé, že již jenom málo lidí je schopno je absorbovat. V druhé polovině minulého století se postupně odkrývaly membránové znaky (antigeny), přítomné na morfologických profilech normálních a patologických buněk převážně leukocytární povahy. Tyto antigeny byly objasňovány z hlediska chemické struktury, genetické determinace, exprese a funkce. Pro toto odkrývání měl přímo zásadní význam objev nositelů Nobelovy ceny G. Köhlera a C. Milsteina, kteří vyvinuli hybridomovou technologii pro přípravu monoklonálních protilátek. Jejich metoda vyústila do biotechnologické přípravy monoklonálních protilátek, používaných pro výrobu výzkumných, diagnostických a farmaceutických prostředků. Před objevem Köhlera a Milsteina bylo známo jen několik málo membránových znaků, které se daly využít k definování membránových odlišností buněk. Tyto znaky byly převážně prokazované rozetovými a cytotoxickými testy. V roce 1980 měl autor možnost pracovat na Royal Free Hospital v Londýně v rámci stipendijního pobytu. Podařilo se mu ve spolupráci s ostatními pracovníky poukázat na to, že stanovení lymfocytů T, které se dříve běžně prokazovaly tzv. E rozetovým testem, lze provést průkazem antigenu monoklonální protilátkou OKT-11 (2). Pro stanovení lymfocytů T to znamenalo, že nepřesné stanovení lze nahradit elegantním průkazem pomocí monoklonální protilátky, což významným způsobem přispělo k definování krevních chorob odvozených z T lymfocytární řady. Toto stanovení bylo ještě umocněno

Obr. 1: Některé membránové antigeny jednotlivých typů v architektuře buněk

zavedením průtokové cytometrie. Samotní průkopníci a zakladatelé cytometrie ani nečekali, jaký dopad bude mít průtoková cytometrie pro klinickou a diagnostickou medicínu. Autor vzpomíná na profesora Herzenberga, který před více než 35 lety představil principy průtokové cytometrie na mezinárodním sympoziu. První informaci o průtokové cytometrii autor poskytl pro československou odbornou veřejnost právě z mezinárodního sympozia, kde prof. Herzenberg předvedl cytometr a nastínil jeho praktické využití (3). Tehdy byla cytometrie na začátku své éry, během několika dalších desetiletí prodělala převážně po technické stránce a za využití počítačových programů obrovské zdokonalení. Autor měl možnost pracovat v roce 1980 na průtokovém cytometru v Londýně, takže si je plně vědom, jaký od té doby cytometry prodělaly neuvěřitelný technický vývoj. K tomu přispěly dvě hlavní oblasti: 1) oblast vhodně značených monoklonálních protilátek, dávající možnost sledovat sedm i více parametrů současně na jedné buňce, 2) rozvoj vhodných počítačových programů, umožňujících záznam a grafické vyhodnocování naměřených parametrů. Cytometrie si tak definitivně získala své místo, protože vedle praktického ovládání průtokového cytometru je nezbytná znalost specificity jednotlivých protilátek, které dávají poměrně širokou volbu pro sledování daného problému. Prvou práci z československých pracovníků na průtokovém cytometru udělal autor na anglickém pracovišti v roce 1980. Jeho práce ve spolupráci se zahraničními autory měla více než 350 citačních ohlasů. Cílem této práce byl průkaz lymfocytů T pomocí monoklonální protilátky detegující membránový antigen (dnes CD2) (2). Průkazem tohoto znaku se podařilo stanovit T lymfocyty a nahradit jejich ne příliš přesné stanovení pomocí E roset. Prvý cytometr v Československu byl na poliklinice na Karlově náměstí v Praze, kde měl autor možnost měřit. Na tento cytometr dohlížel Dr. Petr Hausner, který vycházel vstříc různým spolupracím. Potom přišla vlna, která přinesla velké množství cytometrů různých parametrů, jež byly na různých pracovištích. Jednotliví pracovníci měli i možnost si vzájemně vyměňovat své zkušenosti a poznatky, a to i v rámci cytometrické společnosti. Dnes je již poměrně dobré zastoupení cytometrů na našich klinických i experimentálních pracovištích, což se odráží v lepší kvalitě práce i v počtu původních prací. Díky tomu se rozběhlo také stanovení kmenových hematopoetických buněk a bylo publikováno prvé sdělení o detekci hematopoetických kmenových buněk českými autory (5). Pro transplantační strategii a pro diagnostiku různých chorob vyvstaly nové možnosti, a to především zavedením průtokové cytometrie za použití monoklonálních protilátek. Dřívější metody neumožňovaly odkrývat buněčné subpopulace zastou-

Obr. 2a: Představa proliferace a diferenciace lymfoidních buněk a jejich možné patologické formy

Obr. 2b: Schéma vzniku něktrých malignit v myeloidních řadách

Legenda k obrázkům 2a a 2b (Jednotlivá čísla nad buňkami v obrázcích vystihují stádium, ze kterého vznikají konkrétní krevní choroby) 1. leukémie z kmenových buněk; 2. nediferencovaná leukémie progenitorová nezralá; 3. prekurzorová lymfoidní leukémie nezralá (“null“ ALL); 4. pro B akutní lymfatická leukémie (pro B-ALL); 5. pre-pre B akutní lymfatická leukémie (pre-pre B-ALL); 6. pre B akutní lymfatická leukémie (pre B-ALL); 7. B akutní lymfoblastická leukémie (B-ALL); 8. chronická lymfatická leukémie B typu (B-CLL); 9. B lymfoblastický lymfom, Burkitův lymfom (BL); 10. prolymfocytární leukémie B typu (B-PLL); 11. vlasatobuněčná leukémie B typu (B-HCL); 12. prothymocytární leukémie T typu nezralá (pro T-ALL); 13. thymocytární leukémie T typu (T-ALL); 14. obecná thymocytární leukémie T typu (“common“ T-ALL); 15. lymfoblastický lymfom T typu CD4+, lymfom ze svinutých buněk T; 16. zralá akutní lymfoblastická leukémie T typu CD4+; 17. zralá akutní lymfoblastická leukémie T typu CD8+; 18. lymfoblastický lymfom T typu CD8+, “convoluted“ T buněčný lymfom; 19. lymfomprolymfocytární leukémie T typu CD4+ (T-PLL); 20. Sezary syndrom, Mycosis fungoides, CD4+ (SS, MF); 21. prolymfocytární leukémie T typu CD8+ (T-PLL); 22. prolymfocytární leukémie T typu CD8+ (T-PLL); 23. centroblastický – centrocytární lymfom; 24. centrocytární lymfom B typu; 25. imunocytom, makroglobulinémie, Waldenströmova nemoc; 26. plazmocytom, mnohočetný myelom, (MM), Kahlerova choroba; 27. imunoblastický lymfom T typu CD4+; 28. imunoblastický lymfom T typu CD4+, fenotypová varianta; 29. imunoblastický lymfom T typu CD8+; 30. imunoblastický lymfom T typu CD8+, fenotypová varianta; 31. akutní myeloidní leukémie nezralá (AML-MO); 32. akutní myeloidní leukémie myelomonocytární (AML-M4, AMMoL); 33. akutní myeloidní leukémie, erytroleukémie nezralá (AML-M6, AEL); 34. akutní myeloidní leukémie, erytroleukémie zralá (AML-M6); 35. akutní myeloidní leukémie bazofilní nezralá; 36. akutní myeloidní leukémie bazofilní zralá; 37. akutní myeloidní leukémie megakaryoblastická (AML-M7, AMegL); 38. akutní myeloidní leukémie megakaryocytární (AML-M7); 39. akutní myelomonocytární leukémie (AML-M5, AMoL); 40. akutní monocytární leukémie zralá (AML-M7); 41. histiocytární lymfom; 42. akutní myeloblastická leukémie nezralá, bez maturace (AML-M1); 43. akutní myeloblastická leukémie zralá, s maturací (AML-M2); 44. akutní myeloidní leukémie promyelocytární (AML-M3, APL); 45. chronická myeloidní leukémie (CML); 46. eozinofilní leukémie nezralá; 47. eozinofilní leukémie zralá; 48. leukémie z NK buněk, lymfoproliferativní onemocnění z granulárních lymfocytů

Tab. 2: Přehled hlavních interleukinů, jejich synonym, molekulové hmotnosti a genové lokalizace Interleukiny

Molek. Lokalizace hmotn. D

Synonymum

IL1A

interleukin 1α

TRF, LAF, BAF, MP, EP, LAF, LEM

15-17

2q12-q21

IL1B

interleukin1β

IL1F2

15-17

2q13-q21

IL2

interleukin 2

TCGF, TSF, TMF, TDF, 23 KHF, EDF

4q26-q27

IL3

interleukin 3

CFU-SA, PSF, BPA, E-CSF, HP2, m-CSF

25

5q23-q31

IL4

interleukin 4

BCGF-1, TCGF-2, MCGF 2, BSF-1

20

5q23-q31

IL5

interleukin 5

BCGF-2 (též BCDF), 23 TRF, Eos-CSF

5q23q31

IL6

interleukin 6

BSF-2, IFN-γ 2, PCT-GF, HSF, HPGF

26

7p21-p15

IL7

interleukin 7

LP-1, Lpo, PBGF, THCGF

25

8q12-q13

IL8

interleukin 8

LIP, NAF, MONAP, MDNCF, LAI, TCF

8

4q13-q21

IL9

interleukin 9

P40, MEA, TCGF-3

14

5q31-q35

IL10

interleukin 10

CSIF, BTCGF, IL10a, T GIF

20,5

1q31-q32

IL11

interleukin 11

AIF, meg-CSF

19

19q13.3q13.4

IL12A

interleukin 12α CLMF, NKSF

30

3p12-q13.2

IL12B

interleukin 12β CLMF

30

5q31.1q33.1

IL13

interleukin 13

P600

14,3

5q31

IL14

interleukin 14

HMW-BCGF

60

1p34.3

IL15

interleukin 15

ILT

14

4q31

IL16

interleukin 16

LCF

14

15q26.3

IL17

interleukin 17

CTLA-8, rodina zahrnuje 6 členů (IL17B-IL17F)

17

2q31

IL18

interleukin 18

IGIF, IL1F4, IL1γ

24

11q22.2q22.3

IL19

interleukin 19

IL19, MDA1, ZMDA1

1q32.2

IL20

interleukin 20

ZCYTOR7

1q32

IL21

interleukin 21

Yq11

16

4q26-q27

IL22

interleukin 22

LTIF, IL21, ILTIF, ILD110

23

12q15

IL23

interleukin 23

SGRF

19

12

IL24

interleukin 24

MDA-7, IL-10B, Mob-5, St16

24

1q32

IL25

interleukin 25

IL25

IL26

interleukin 26

AK155

IL27

interleukin 27

IL27

IL28A

interleukin 28α IL28A, IFNL2

19q13.13

IL28B

interleukin 28β IL28B, IFNL3

19q13.13

IL29

interleukin 29

IL29, IFNL1

19q13.13

IL30

interleukin 30

IL27, p28

16p11

22

12q15


pené méně než jedním procentem ve výchozí buněčné suspenzi. Odkrývání membránových molekul přineslo i některé problémy. V literatuře byly popisovány tytéž membránové molekuly pod různými názvy. Snahy o sjednocení názvů vedly k zavedení tzv. CD klasifikačního systému. Tento systém, neboli nomenklatura, se tak postupně vytvářela na základě pracovních zasedání (workshopů) a konferencí nazývaných Leukocyte typing, kterých se již uskutečnilo celkem osm. Tabulka 1 podává základní informace o těchto zasedáních z hlediska definice CD znaků. Prvé setkání bylo v roce 1982 v Paříži, kde byl založen CD klasifikační systém, potom následovalo setkání v Bostonu (1984), Oxfordu (1986), Vídni (1989), znovu v Bostonu (1884), Kobe (1996), Harrogate (2000) a naposledy v Adelaide (2004). V Paříži dostaly antigeny definované monoklonálními protilátkami označení CD (Cluster of Differentiation) s přiřazeným pořadovým číslem. Rozpracovávání inventarizace leukocytárních antigenů naráží i na řadu otázek. Jednou z nich je, jaké spektrum molekul má být do této nomenklatury zahrnuto. Má se jednat hlavně o buněčné znaky čistě leukocytární, popř. rozšířené o molekuly exprimované na krevních elementech (destičkách, erytrocytech) hematopoetického původu, nebo se má systém rozšířit třeba o skupinu úzce příbuzných molekul, vyskytujících se na různých somatických buňkách (hepatocyty, keratinocyty, mozkové buňky apod.). Do jednotlivých workshopů byly zahrnuty sekce týkající se karbohydrátových (lektinových) struktur, erytrocytárních buněk, dendritických buněk, kmenových/progenitorových buněk a také sekce zaměřené na zavedení určitých korelací s buňkami některých živočišných druhů. To je dáno tím, že některé epitopy nejsou specifické pouze pro lidský systém, ale jsou přítomny i na buňkách jiných živočišných druhů. Další otázky se týkají toho, zda karbohydrátové epitopy či antigeny třeba krevních skupin, nebo některé „intracelulární“ diferenciační molekuly, mají být také zahrnuty do této nomenklatury. Po konferenci v Adelaide (Austrálie) končí CD systém číslem CD350, ale CD membránových molekul je o něco více, protože v tabulce znaků jsou zahrnuty jednak skupiny příbuzných molekul (integrinů, selektinů), jednak jejich glykosylované formy. V nomenklatuře CD „leukocytárních“ znaků jsou šířeji zahrnuty i některé molekuly, které se nacházejí na dendritických a endoteliálních buňkách, erytrocytech a krevních destičkách, takže jejich zařazení mezi „čistě“ leukocytární antigeny není zcela přesné. U skupiny antigenů velmi blízce příbuzných molekul je jejich rozlišení ještě vystiženo písmeny (např. CD85a, CD85b, CD85c atd.). U některých znaků jsou jejich glykosylované (sialyzované) formy vyjádřené písmenem -s (např. CD15s,

CD65s) a několik antigenů nese označení -R (např. CD2R, CD44R, CD99R, CD162R, CD236R), což je zkratka pro „restricted“. CD nomenklatura je mezinárodně akceptovaná WHO a IUIS. I když nomenklatura nemá zcela jasné logické uspořádání a původní předpoklad „inventarizovat všechny membránové molekuly lidských leukocytů“ se poněkud zkomplikoval, přesto se tato nomenklatura jeví jako velmi užitečná. Některé názvy molekul (např. CD3, CD4, CD8, CD34) se dokonale vžily, takže jsou běžně mezinárodně používané. Jiné názvy některých adhezívních a destičkových molekul se vyskytují v obojí podobě (tj. původní název a CD označení). Se zahrnutím membránových imunoglobulinů (mIg), receptorů buněk T (TCR a/b, TCR g/d), HLA molekul (HLA-A, B, C a HLA-DR) se do CD nomenklatury již nepočítá, protože označení pro tyto znaky jsou tak zažitá, že měnit je by zřejmě nemělo smysl. K problematice analýzy membránových molekul významnou měrou přispěla i dvě česká pracoviště: 1) Ústav molekulární genetiky AV ČR (prof. Václav Hořejší) a Ústav hematologie a krevní transfúze (Dr. Kristián Koubek a Dr. Petr Stöckbauer), kteří vyvinuli řadu monoklonálních protilátek s imunodiagnostickým dopadem. Výčet membránových znaků lidských leukocytů není ještě zdaleka vyčerpán. Kromě znaků zařazených do CD nomenklatury existují na leukocytech další molekuly, které jsou již popsané, ale doposud nemají CD označení, a také molekuly, které zatím nejsou objevené. Lze předpokládat, že současný stav poznání membránových struktur leukocytů se pohybuje kolem 50 - 60 %. Tento odhad vychází z nálezů rozlišení membránových proteinů lidských leukocytů dvourozměrnou elektroforézou, kde lze nalézt až kolem 1 000 molekul. Samozřejmě pro jednotlivé typy buněk je charakteristické spektrum membránových struktur, které mohou být vyjádřeny v různém zastoupení (v různém počtu kopií) na buňce. Třeba na erytrocytech může být exprimováno 100 - 200 různých molekul, na lymfocytech 200 - 300 a na monocytech snad ještě o něco více. Také počet kopií jedné molekuly na buňku může být různý, např. na erytrocytárním povrchu je CD99 (12E7 protein, E2) vyjádřen kolem 1 000 kopií oproti znaku GLUT1, který je zastoupen v rozmezí 200 000 700 000 kopií. Dále se odhaduje, že na buněčné membráně může být vyjádřeno až 8 - 10 milionů všech molekul. Spektrum jednotlivých molekul vtiskují buňce její funkce, které vyjadřují její komplexnost a také její plastičnost. Obrázek 1 podává představu, jak jsou membránové molekuly v architektuře leukocytárních buněk a krevních destiček utvářeny. Membránové molekuly mohou být asociovány s buněčnou membránou z hlediska čtyř základních lokalizací: 1) transmembránový glykoprotein typu I (COOHNH2), 2) transmembránový glykoprotein typu II (NH2-COOH), 3) několikanásobně procházející

Tab. 3: Interleukinové receptory a jejich genová lokalizace Označení receptorů

Receptory pro růstové faktory

CD označení

Genová lokalizace

IL1R1

Interleukin 1, receptor, typ I

CD121a

2q12

IL1R2

Interleukin 1, receptor, typ II

CD121b

2q12-q22

IL2RA

Interleukin 2, receptor α

CD25

10p15-p14

IL2RB

Interleukin 2, receptor β

CD122

22q13.1

IL3Rα


CD123

Xp22.3; Yp11.3

IL4R

Interleukin 4, receptor

CD124

16p11.2-12.1

IL5Rα


CD125

3p26-p24

IL6R


CD126

1q21

IL7Rα


CD127

5p13

IL8RA


CD128a

2q35

IL8RB


CD128b

2q35

IL9R


IL10R


IL11RA


IL11RB


Xq28 neboYq12 CDw210

11q22-q23.3. 9p13

IL12RB1

Interleukin 12, receptor β1

CD212

19p13.1

IL13R

Interleukin 13, receptor α1

CD213a

X

IL15RA


CD132*

10p15-10p14

IL15RB


CD132*

IL17R


CDw217

2p31

IL18R1

Interleukin 18, receptor 1

2q12

IL20RA


6q23

IL20RB


IL21R


16p11

IL22RA1


1p36.11

IL22RA2


6q24.1-q24.2

IL28RA


1p36.11

Poznámka: * společný řetězec u jednotlivých receptorů

molekula buněčnou membránou, typ III, 4) molekuly intracelulárně i extracelulárně kotvené v membráně pomocí GPI (typ IV). Jednotlivé membránové molekuly se mohou vyskytovat jako monoméry, diméry, triméry, popř. tetraméry. Mimo to mohou být některé molekuly uspořádány do membránových komplexů. Výskyt a počet membránových molekul na povrchu různých buněk je geneticky determinován v přísných stechiometrických poměrech s ohledem na jejich funkci. Membránové antigeny nejen napomáhají charakterizovat jednotlivá diferenciační a proliferační stádia lidských normálních leukocytárních buněk, ale mají zásadní dopad v patogenezi a patofyziologii chorob. V současné době některé diagnosticky významné molekuly výraznou měrou napomáhají v klasifikaci leukémií a lymfomů, což se odrazilo v jejich diferenciální imunodiagnostice. Kvalitativní i kvantitativní zastoupení jednotlivých molekul je relativně konstantní pro jednotlivé typy buněk, což indikuje, že celá architektura buněčné membrány je pod genetickou kontrolou. Fenotypové kopie (počet molekul na buňku) jsou konstantně přepisovány a organizovány do daných stechiometrických poměrů, které byly ve fylogenezi zřejmě utvářeny dle určitých funkčních hledisek. U patologických buněk (leukemických/lymfomových) může být exprese membránových molekul pozměněna, ale přesto zůstává otázka, ke kterému typu normálních buněk je tato exprese vztažena. V CD nomenklatuře jsou zahrnuty i některé molekuly erytrocytů vytvářející krevní skupiny (Kell = CD238,


23

Tab. 4: Přehled vlastností jednotlivých chemokinů Název CXC chemokinu α CXCL1 CXCL2 CXCL3 CXCL4 CXCL5 CXCL6 CXCL7 CXCL8 CXCL9 CXCL10 CXCL11 CXCL12 CXCL13

Jiný název GROα GROβ GROγ PF4 ENA-78 GCP-2 NAP-2 IL8 Mig IP-10 I-TAC SDF-1 BLC/BCA-1

CXCL14

BRAK

Působení na buňky

CXCL15 lungkin CXCL16 C chemokiny γ XCL1 lymfotaktin XCL2 SCM-1β CX3C chemokiny γ CX3CL1 fraktalkin CC chemokiny β CCL1 I-309 CCL2 MCP-1 CCL3 MIP-1α CCL4 MIP-1β CCL5

RANTES

CCL6

MRP-1

CCL7

MCP-3

CCL8 CCL9/10 CCL11 CCL12 CCL13 CCL14 CCL15 CCL16 CCL17 CCL18 CCL19 CCL20 CCL21 CCL22 CCL23 CCL24 CCL25 CCL26 CCL27 CCL28

CCL-2 eotaxin MCP-5 MCP-4 HCC-1 MIP-1δ LEC TARC MIP-4 MIP-3β MIP-3α exodus-2 MDC MPIF-1 eotaxin-2 TECK eotaxin-3 CTACK MEC

24

Vazba na receptory

PMN PMN PMN fibroblasty PMN PMN PMN PMN ak. T (Th1), NK ak. T (Th1), NK ak. T (Th1), NK leukocyty lymfocyty B cAMP aktivované monocyty PMN ak. T

CXCR2 >CXCR1 CXCR2 CXCR2 není známá CXCR2 CXCR1, CXCR2 CXCR1, CXCR2 CXCR1, CXCR2 CXCR3 CXCR3 CXCR3 CXCR4 CXCR5

lymfocyty T lymfocyty T

XCR1 XCR1

Mo, ak. T, NK

CX3CR1

iDC, ak. T, NK Bs, Mo, ak. T, NK, iDC Eo, Mo, ak. T, NK, iDC Mo, ak. T (TH1), NK, iDC Eo, Bs, Mo, ak. T, NK, iDC Mo Eo, Bs, Mo, ak. T, NK, iDC Bs, Mo, ak. T, NK, iDC PMN, ak. T Eo, Bs, ak. T, (Th2), iDC Bs, Mo, ak. T, NK, iDC Eo, Bs, Mo, ak. T, iDC Eo, Mo PMN, Eo, MO Mo, ak. T (Th1) ak. T (Th2) lymfocyty T, iDC lymfocyty T, ak. T, mDC Tm, B, iDC lymfocyty T, ak. T, mDC ak. T (Th2), iDC PMN, Mo, lymfocyty T Eo, Bs, ak. T (Th2), iDC tymocyty, lymfocyty T Eo, Bs, ak. T (Th2), iDC ak. T ak.T

CCR8 CCR2 CCR1, CCR5 CCR5

není známá není známá CXCR6

C CCR1, CCR3, CCR5 CCR1, CCR2, CCR3 CCR1, CCR2, CCR3 CCR2, CCR3, CCR5 CCR1 CCR3 CCR2 CCR1, CCR2, CCR3 CCR1 CCR1, CCR3 CCR1 CCR4 Není známá CCR7 CCR6 CCR7 CCR4 CCR1 CCR3 CCR9 CCR3 CCR3, CCR2, CCR10 CCR10


Band3/Diego = CD233, Rh30CE = CD230CE, Rh39D = CD249D, Rh30D/CE = CD240DCE). Jednotlivé membránové molekuly lokalizované na buněčném povrchu mají určité funkce, pomocí nichž se buňka orientuje v daném mikroprostředí a zprostředkovává svoji odezvu. Tímto způsobem buňka jednak reaguje na prostředí, jednak vyjadřuje svoji individualitu. Buňka má tedy ve svém vybavení velkou škálu receptorů, pomocí nichž má možnost zapojit se do řady interakcí. Zjednodušeně by se dalo říci, že různé funkce jako diferenciace, proliferace, aktivace, migrace, polarizace, apoptóza, „homing“ a některé další jsou vyjádřeny právě pomocí membránově lokalizovaných molekul, které jsou propojeny různými mechanismy s mnoha dalšími systémy.

Přítomnost V současné době dochází k obrovskému nárůstu vědeckých poznatků prakticky ve všech směrech lidského bádání. Tato exploze přináší tolik informací, že není v silách jednoho člověka ji obsáhnout, a to ani v příslušných oborech. Mimořádně se posouvá znalost o elementární povaze a struktuře jednotlivých molekul formulující životní pochody. V molekulách lokalizovaných na buněčných membránách pokročila znalost do té míry, že v současnosti již máme dokonalou představu o jejich chemické struktuře, genetické determinaci, expresi a funkci. Membránové antigeny nejen napomáhají charakterizovat jednotlivá diferenciační a proliferační stádia lidských normálních leukocytárních buněk, ale mají zásadní dopad v patogenezi a patofyziologii celé řady chorob. V současné době některé diagnosticky významné molekuly výraznou měrou napomáhají v klasifikaci leukémií a lymfomů, což se odrazilo v jejich diferenciální imunodiagnostice. Vznik krevních malignit se většinou vysvětluje odvozením jejich patologických forem z normální zdravé krvetvorby, a tak jsou pro představu uvedeny dva zjednodušené obrázky, které podávají možný vznik některých krevních chorob na základě jejich přiřazení k celkové hematopoéze. Jedná se o zjednodušenou představu maligních zvratů odvozených z proliferačních a diferenciačních stádií hematopoézy. Do těchto schémat nejsou zařazeny některé formy bifenotypových (hybridních) forem leukémií a lymfomů. Obrázek 2a schematicky prezentuje lymfopoézu, kde mohou jednotlivá proliferační a diferenciační stadia odrážet jednotlivé krevní malignity. Pro lepší znázornění jsou příslušným krevním buňkám přiřazena čísla, která vysvětlují známé krevní nemoci. Obrázek 2b zobrazuje analogickou situaci v myelopoéze. Samozřejmě se jedná o určité zjednodušení, ale pro pochopení patogeneze a patofyziologie krevních chorob je odvození maligního profilu z normální hematopoézy přímo zásadní.

Je třeba si uvědomit, že jednotlivá stádia jsou pod vlivem různých cytokinů a chemokinů. Tabulka 2 podává nomenklaturu 30 interleukinů, uvádí jejich synonyma, molekulární hmotnost a genovou lokalizaci. Aby jednotlivé interleukiny mohly zprostředkovávat příslušný efekt, musí mít doplňující struktury, což jsou jejich receptory. Tabulka 3 předkládá receptory pro interleukiny a jejich genovou lokalizaci. Přehled vlastností jednotlivých chemokinů poskytují tabulky 4 a 5 podávají přehled cytokinů z hlediska vazby na jejich receptory. Na konečné diferenciaci lymfocytů B a T se však zásadním způsobem podílí především samotný cizorodý antigen, proti němuž se imunitní reakce rozbíhá. Působením antigenu spolu s diferenciačními a růstovými faktory na nezralou buňku B, jež vyjadřuje membránový IgM, dochází k jejímu dělení a diferenciaci na dvě základní buněčné populace: plazmatické buňky, jež produkují protilátku dané specificity, a paměťové buňky, které se reakce neúčastní, ale při novém podání antigenu způsobují časnější a silnější sekundární reakci tím, že se zpětně transformují na buňky plazmatické. Stejně tak mohou být aktivovány i lymfocyty T stimulací antigenem (prezentovaným APC – „Antigen Presenting Cell“ = buňka předkládající antigen) za současného působení IL1, čímž dochází ke vzniku plně diferencovaných cytotoxických lymfocytů nebo pomocných lymfocytů. Obrázek 3 znázorňuje základní schéma T buněčné signalizace pro MHC antigeny třídy I a třídy II za spoluúčasti molekul CD4 a CD8. Obrázek 4 podává schéma B buněčné signalizace, při které se uplatňují BC receptor a několik dalších koreceptorů. Na obrázcích jsou vyznačeny i aktivační motivy u jednotlivých imunoreceptorů. Některé molekuly jsou na základě své strukturální podobnosti zahrnovány do jednotlivých rodin. Tabulka 6 ukazuje rodinu TNF z hlediska jejich ligandů a receptorů. Základní vlastnosti molekul zahrnutých do receptorové rodiny „Toll-like“ podává tabulka 7. V tabulce 8 je uveden výskyt jednotlivých receptorů „Toll-like“ na různých buňkách, a to ve vztahu k likvidaci patogenů. Velmi dobře jsou prozkoumány účinky některých cytokinů na diferenciaci a aktivaci lymfocytů. Tyto imunoregulační mediátory mají nejen význam při vlastní aktivaci buněk T a B, ale řada z nich působí i jako molekuly, které zprostředkují komunikaci mezi buňkami, jež se přímo účastní imunitní odpovědi. Každá imunitní odpověď je výslednicí složitých proliferačních a zejména diferenciačních procesů, při nichž se tvoří funkční lymfocyty B a T, které jakožto imunokompetentní buňky přispívají svojí činností k produkci protilátek (u buněk B), ke stimulaci imunitní odpovědi (v případě pomocných lymfocytů T) a k cytotoxickému účinku buněk NK a LAK. Do imunitní reakce lze zahrnout i tzv.

Tab. 5: Přehled chemokinových receptorů vázajících příslušné ligandy Receptory

Synonyma

CXCR-1

IL8 RA /IL-8R typu I

CXCL8, CXCL6

CXCR-2

IL8 RB/IL-8R typu II

CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8

CXCR-3

IP-10/MIG R

CXCL9, CXCL10

CXCR-4

LESTR/HUMSTR/fusin

CXCL12

CXCR-5

BLR-1

CXCR-6

Ligandy

CXCL13 CXCL16

CCR-1

MIP-1α/RANTES R

CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL14

CCR-2A

MCP-1Rα

CCL2, CCL7, CCL13

CCR-2B

MCP-1Rβ

CCL2, CCL7, CCL13

CCR-3

CC CKR3, eotaxin R


CCR-4

CC CKR4, K5-5


CCR-5

CC CKR5, ChemR13

CCL3, CCL4, CCL5

CCR-6

CY4, DRY6, CKR-L3, STRL22

CCL17

CCR-7

EBI-1/BRL-2

CCL21

CCR-8

TER-1, CY6, ChemR1, CKR-L1

CCL1, CCL4, CCL17

CCR-9

D6

CCL3, CCL5, CCL17

CCR-10

CCL2, CCL7

XCR-1

GPR-5

XCL1

CX3CR-1

CMKBRL-1, V28

CX3CL1 (FKN, neurotaktin)

DARC

Duffy antigen

CCL2, CCL5, CXCL1, CXCL7, CXCL8

Obr. 3: T běněčná signalizace (přenos signálu pomocí TCR a uplatnění dalších receptorů)

Obr. 6: Intracelulární exprese ZAP-70 a jeho asociace s metabolickými drahami

Obr. 4: B buněčná signalizace (přenos signálu pomocí BCR za účasti dalších koreceptorů)

Obr. 5: Přehled jednotlivých mitogen aktivujících kináz (MAPK) zahrnutých do různých buněčných pochodů (proliferace, diferenciace, migrace, apoptózy)

„T supresorové“ buňky, které jsou svojí funkcí antagonické, neboť jsou schopny do určité míry potlačovat imunitní reakci. Jejich význam (i když není plně objasněn) spočívá zejména v určitém usměrnění a regulaci imunitní odpovědi a v zabránění autoimunitních reakcí. Dva hlavní motivy ITAM a ITIM nabývají zásadního významu u molekul imunoglobulinového a lektinového typu při signalizaci a efektorové funkci buněk NK. Tyto motivy mají v cytoplazmatické části buněk, čímž mohou spouštět aktivaci buněk, včetně produkce cytotoxinů. Buňky NK hrají významnou roli v imunitní regulaci a pomocí Fc receptorů (CD16) způsobují navození ADCC a také induku-

26


jí apoptózu. Při zabíjení cizorodých buněk se mohou uplatňovat mechanismy, ve kterých se účastní perforiny (cytolytické proteiny lokalizované v cytoplazmatických granulech), granzymy (serinové proteázy syntetizované jako pro-pro enzymy v endoplazmatickém retikulu). Buňky NK mají celou řadu receptorů sdružených do několika strukturálně odlišných rodin, které jim umožňují rozpoznání a zabití cílové buňky, a to i bez předchozí senzitizace. Buňky NK mohou být rozlišeny podle své funkce na dvě hlavní populace: 1) regulační buňky NK (CD56 bright, CD16 dim-, CD162 dim – 10% lidské populace), 2) cytotoxické buňky NK (CD56 dim, CD16 bright, CD162 bright – 90% celkové jejich populace). Tyto buňky tak mohou rozpoznat abnormální nádorovou buňku pomocí aktivačních a inhibičních NK receptorů, které vyjadřují jejich jednotlivé subpopulace. Vztah mezi těmito receptory po kontaktu s cílovou buňkou vede k integraci informací vyúsťující k navození tolerance či k zabití buňky. Podle funkčního vymezení mohou být membránové antigeny buněk NK na MHC antigenech závislé a i nezávislé. Do znaků závislých na MHC antigenech jsou zahrnuty receptory ILT/LIR (CD85 a-m), KIR (CD158 a-k,z) rodin a také molekuly CD94, které jsou utvářeny jako homodimery (CD94/CD94) a i jako heterodimery (CD94/CD139). Do znaků na MHC nezávislých antigenech se zařazuje rodina obsahující NKG2A a NKG2D molekuly. Receptory rodiny NCR NKG2D se vyskytují jako homodimer a i jako heterodimer a s příslušným ligandem navozují aktivační signál. Molekuly NCR („natural cytotoxicity receptor“) rodiny, receptory přirozené cytotoxicity zahrnují zatím tři antigeny označované jako NKp30, NKp44 a NKp46. NKp30 a NKp46 jsou zastoupeny na buňkách NK a NKp44 jsou pří-

Obr. 7: Regulace mezi přežitím a apoptózou

Tab. 6: Přehled jednotlivých rodin TNF proteinů a jejich označení TNF rodina ligandů

Označení

LTA/TNFSF1

TNF-beta, LT, cytotoxin

TNF/TNFSF2

TNF-alfa, cytotoxin, cachectin

LBT/TNFSF3

TNFC, p33

TNFSF4

OX-40 ligand (OX-40L), gp34 ,TXGP1

TNFSF5

CD40 ligand (CD40L), IMD3, TRAP, gp39, CD154

TNFSF6

FasL, Apol L, APTL, APT1LG1, CD95

TNFSF7

CD70,CD27 ligand, CD27LG (CD27L , CD27LG)

TNFSF8

CD30 ligand (CD30L, CD30 LG)

TNFSF9

4-1BB ligand (4-1BBL), CD137 (CD137L)

TNFSF10

TRAIL, Apo-2 ligand (po2L), TL2

TNFSF11

RANK ligand (RANKL), TRANCE, OPGL, ODF

TNFSF12

TWEAK, DR3LG, APO3 ligand (APO3L)

TNFSF13

APRIL, TALL2

TNFSF13B

BAFF, BLYS, THANK, TALL1, DTL

TNFSF14

LIGHT, Ltg, HVEM-ligand (HVEM- L)

TNFSF15

TL1, VEGI

TNFSF18

AITR ligand (AITRL), TL6, hGITRL ligand (GITRL)

TNF receptorová rodina Označení

Obr. 8: Vztah různých faktorů, které se podílejí na vzniku jednotlivých nádorů

TNFRSF1A

TNF receptor typ I (TNFR1), CD120a

TNFRSF1B

TNF receptor typ II (TNFR2), CD120b

LTBR/TNFRSF3

TNFRSF3, TNFR2-RP, CD18

TNFRSF4

OX40, ACT35, TXGP1L

TNFRSF5

p50, Bp50, CD40 (receptor)

TNFRSF6

FAS, CD95, Apo-1, APT1

TNFRSF6B

DcR3

TNFRSF7

Tp55, S152, CD27

TNFRSF8

Ki-1, D1S166E, CD30

TNFRSF9

4-1BB, CD137, ILA

TNFRSF10A

DR4, Apo2, TRA ILR1

TNFRSF10B

DR5, TRAILR2, KILLER, TRICK2A, TRICKB

TNFRSF10C

DcR1, TRAILR3, LIT, TRID

TNFRSF10D

DcR2, TRUNDD, TRA ILR4

TNFRSF11A

RANK, ODFR

TNFRSF11B

TNFRSF12A

OPG, PRG, OCIF, TR1 DR3, TRAMP, WSL-1, LARD, WSL-LR, DDR3, TRS, APO-3 TWEK receptor, FGF – „inducible“ 14

TNFRSF12L

DR3L

TNFRSF13B

TACI

TNFRSF13C

BAFFR

TNFRSF14

HVEM, ATAR, TR2, LIGHTR, HVEA

NGFR/TNFRSF16

TNFRSF16, NTR

TNFRSF17

BCMA, BCM

TNFRSF18

AITR, GITR

TNFRSF19

TROY, TAJ

TNFRSF19L

FLJ14993, RELT

TNFRSF21

DR6

TNFRSF22

SOBa, Tnfrh2, 28100, 28K06Rik

TNFRSF23

mSOB, Tnfrh1

TNFRSF12

tomny na aktivovaných buňkách NK. Tyto receptory umožňují buňkám NK lyzovat nádorové buňky tzv. přirozenou cytotoxicitou, která může být závislá na NKG2D receptorech.


27

V současné době lze v odborných časopisech nalézt mnoho poznatků týkajících se jednotlivých kináz aktivovaných mitogenem, které se uplatňují v různých buněčných procesech (proliferace, diferenciace, migrace i apoptóza) (viz. obrázek 5). U chronické lymfatické leukémie byl nalezen vztah molekuly označované jako ZAP-70 k vývoji onemocnění. Obrázek 6 znázorňuje vzájemný vztah jednotlivých molekul podílejících se na této signální dráze. Regulace mezi přežitím a apoptózou ukazuje obrázek 7. V literatuře se objevují velmi detailní dráhy, kde jsou vzájemně propojeny a dány do souvislostí různé cesty, což jenom poukazuje na to, že mnoho procesů je vzájemně propojeno, a tak nelze dělat jednostranné závěry.

Budoucnost V minulém století byl úspěšně řešen projekt lidského genomu HUGO – Human Geonome Organisation. Počet genů v genomu člověka byl stanoven na 20 488. Tyto geny mohou vytvořit až 10 milionů genetických polymorfismů, a tak lze do budoucna očekávat, že vedle analýzy vzácných a ojediněle se vyskytujících onemocnění dojde i na stanovení rizika u tzv. komplexních chorob, jako jsou nádorová a kardiovaskulární onemocnění, osteoporózy, trombózy, Parkinsonovy choroby, Huntingtonovy choroby, Alzheimerovy choroby a mnoho dalších. Předpokládá se, že u některých lidí dojde k personalizaci medicíny, což povede k osobní medicíně se zaměřením na vztah genotypu a fenotypu. Určitě dojde k přesnějšímu vyjádření i kvantitativních znaků, tj. sledování hodnot různých extracelulárních i intracelulárních proteinů. Mimo to, toto sledování bude odrážet hodnoty různých rozpustných molekul (cytokinů, chemokinů) a dalších molekul. Z membránových proteinů může být pozornost zaměřena na TGFβ RI, TGFβ RII, BMPs (BMPRI, BMPRI), E-cadherin, GPCR, RTK (receptor tyrosin kinasy), Ras, Integrin, PI3K, ILK, JAK, PTEN, Fas/DR, IL1R, RNFR, Notch, Cleaved Notch, Ptch, Smo. Otázka výzkumu jaderných proteinů, zvláště při analýze nádorového bujení, bude stále velmi aktuální. Pozornost může být zaměřena na hlavní jaderné proteiny při karcinogenezi (Fos, Jun, Myc, Max, Myc Miz-1, Smad2/3, Smad4, E2F, Smad1/5/8, LEF/TCF, β-cadherin, CBP, Tfs, HIF1α, CREB, ZONAB, STAT, FKHR/FOXO, P53, NfκB2, RelB, HDAC, CSL/CBF1, Sin3, NIC, P300, HAT, Gli). Očekává se, že vědci s definitivní platností rozluští příčiny maligního zvratu a najdou způsoby jeho eliminace i způsoby účinné prevence. Obrázek 8 podává zjednodušenou představu o vztahu vzniku jednotlivých nádorů a některých rizikových faktorů. Kombinace uvedených faktorů zvyšuje pravděpodobnost výskytu jednotlivých typů malignit, což přináší komplexnější problémy jejich Obr. 9: Množství a počet buněk uplatňujících se v nádorovém procesu


patogeneze, protože je celá řada nejrůznějších typů jednotlivých malignit a také mnoho různých mechanismů, které tyto malignity vyvolávají. Z tohoto hlediska bude lidstvo stát před velmi zásadní otázkou, zda vůbec budou vhodné nástroje se vypořádat s nekoordinovaným zmnožováním vyúsťujícím do nádorového procesu. I když nás k tomu na jednu stranu samotná buňka svojí plastičností doslova vybízí, na druhou stranu je zde celá řada nejrůznějších mechanizmů, které dávají i alternativní dráhy maligního zvratu, a tak je to vlastně rub a líc jedné mince. Detailnější poznání a směrování buněk do příslušných postižených oblastí může přinést tolik očekávaný efekt. V tomto smyslu programovaná buněčná smrt – apoptóza – figuruje na čelním místě. Např. mitochondriální bcl-2 protein je důležitý inhibitor apoptózy a jeho exprese je zvýšena u maligních buněk, což přímo provokuje k dalšímu výzkumu (např. hledání způsobů, jak navodit apoptotický signál k likvidaci leukemických buněk, blokovat MEK inhibitory nebo využít TRAIL receptorů k indukci buněčné smrti apod.). Do popředí se mohou dostávat i další znaky jako XIAP (inhibitor některých apoptotických proteinů) a XAF-1 (faktor asociovaný s XIAP). Komplexnější pochopení jednotlivých membránových molekul a jejich funkcí je pro patogenezi krevních chorob přímo zásadní, protože je třeba si uvědomit, že dosavadní doporučená schémata nejsou definitivní. To je způsobeno i tím, že jednak stále není znám konečný počet molekul, se kterým by disponovala CD nomenklatura pro imunofenotypizaci leukémií a lymfomů, jednak není známo, které molekuly by mohly mít tolik žádaný efekt. V patologií krevních malignit stále přetrvává náhled, že je dobré testovat molekuly, které jsou pro tyto účely jaksi vžité či zaběhlé, a nemá smysl jít na nové typy molekul, třeba s vyšší výpovědní hodnotou. Lze tedy očekávat, že v budoucnu budou pro imunofenotypizaci krevních chorob podstatné další molekuly, které se v současnosti netestují a nebo jsou testovány na malých diagnostických souborech (CD105, CD117, CD123, CD138, CD154). Dojde tím i k přehodnocení dosavadních schémat v klasifikaci příslušných malignit. Budou pokračovat jednotlivá standardní ustanovení vyšetřovacích metod, protože i ekonomická stránka bude vystupovat do popředí. Mimo to indikace závažnosti jednotlivých vyšetření bude záviset na fundovaných odbornících. Nádorový proces a jeho jednotlivé formy je poměrně složitá záležitost, a tak cílená analýza jednotlivých membránových znaků může být zásadním přínosem v etiopatogenezi a etiopatofyziologii jednotlivých chorob. V interpretaci musí nutně dojít k vyhodnocování těchto sond na základě jejich funkcí. Je nutné si připomenout, že membránové molekuly nejsou vytvořeny pro naše klasifikační účely, ale pro zprostředkovávání jednotlivých funkcí. A právě poznání a pochopení jednotlivých funk-

cí zde bude mít závažnou roli. Oblast defektů v jednotlivých molekulách se dá již v současné době analyzovat. Mimo to lze očekávat i detailní a klinicky ověřený efekt protein tyrozín kinázových inhibitorů v terapii hematologických malignit (např. pro CML), i u dalších nádorů či stavů. Obrázek 9 znázorňuje hmotnost a počet buněk, které se mohou uplatňovat při vzniku nádorových projevů. V některých případech může maligní transformace probíhat velmi rychle. Během 15 dnů může vzniknou maligní proces, který jsme schopni současnými detekčními metodami zachytit. Množství 109-1012 nádorových buněk lze chemoterapií zlikvidovat, zatímco masa nádorových buněk v množství větším než 1012 (přibližně 1kg hmotnosti) je většinou pro organismus letální. Množství nádorových buněk 106-109 jsou zřejmě likvidovány imunologickými mechanismy. V budoucnu bude snaha zlepšit i metody výzkumné práce, a to ve smyslu zavedení dalších výzkumných center pro rozvoj poznání odrážejícího potřeby společnosti a ekonomiky. Nelze nic namítat proti těmto změnám, které by zvýšily výkonnost a efektivnost výzkumu a případně by v něm odstranily některé nedostatky. Tato centra špičkového výzkumu by se měla opírat již o stávající výzkumné organizace, které budou získávat významnou finanční podporu ze státního rozpočtu. Z mnoha kvalitních článků publikovaných v lékařských časopisech mohou vyplynout závažné poznatky využitelné pro zlepšení kvality lidského života. To se odráží do prodloužení průměrného věku života lidí a přináší to zmírnění průběhu patogenéze a patofyziologie řady onemocnění. Je to i důsledek vývoje kvalitních diagnostických přístrojů a různých metod, které jsou schopné poskytnout velice dobré zázemí k objasnění nejrůznějších poruch, a to až na molekulární úrovni. V budoucnu tak nebude problém detailněji analyzovat životní funkce a souvislosti s příčinami jejich patologických poruch. Vyvstanou zcela jiné problémy, před které lidstvo bude postaveno.

Tab. 7: Výskyt jednotlivých receptorů Toll-like na buňkách a jejich vztah k likvidaci patogenů Název Exprese na buňkách TLR1

Patogen

lymfocyty B a T, dendritické buňky, makrofágy, granulocyty houby lymfocyty B a T, dendritické buňky, makrofágy, granulocyty bakterie lymfocyty B a T, dendritické buňky, makrofágy, granulocyty viry

TLR2

dendritické buňky, makrofágy, granulocyty

houby


bakterie


viry

TLR3

houby bakterie lymfocyty T, dendritické buňky, makrofágy

viry

TLR4

houby lymfocyty B a T, dendritické buňky, makrofágy, granulocyty bakterie lymfocyty B a T, dendritické buňky, makrofágy

TLR5

viry houby


bakterie viry

TLR6

lymfocyty B, dendritické buňky, makrofágy

houby


bakterie


viry

TLR7

houby bakterie lymfocyty B, dendritické buňky, makrofágy

viry

TLR8

houby bakterie dendritické buňky, makrofágy

viry

TLR9

TLR10

houby lymfocyty B, dendritické buňky, makrofágy

bakterie


viry


houby


bakterie


viry

Poznámka. Antigeny Toll-like receptorové rodiny nejsou zahrnuty do CD nomenklatury. Každá molekula můře být zastoupena na různých leukocytárních buňkách a každá reaguje na různé skupiny pro organismus nežádoucích patogenů. TLR1 se také nachází na buňkách NK a na PMK, TLR6 na buňkách sleziny a plic, TLR7, TLR8 je u buněk sleziny, lymfatických uzlin, tonzil, placenty, plic a TLR9, TLR10 jsou na buňkách sleziny, lymfatické uzliny a tonzil.

Tab. 8: Základní vlastnosti molekul zahrnutých do Toll-like receptorové rodiny

Literatura 1. Koubek K. Transplantační antigeny. Kandidátská práce, 1- 198, 1974 2. Verbi W.,Greaves M.,Schneider C.,Koubek K.,et al. Eur.J.Immunol.12,81-86, 1982 3. Koubek K. ICRO mezinárodní symposium, Imunol. Zprav. V/1, 33-35, 1974 4. Koubek K. a spol. First Central Europan FACS/ CAS- USERS°, Zakopane, 23-25.May 1993 5. Koubek K. Vnitřní Lék, 54(4), 273-280, 2008 RNDR. KRISTIÁN KOUBEK, DRSC. KLINICKÝ ÚSEK, ÚSTAV HEMATOLOGIE A KREVNÍ TRANSFÚZE, U NEMOCNICE 2, 128 20 PRAHA 2 E-MAIL: [email protected]

TLR1

4p14

Mol. Základní chemické vlastnosti hmotnost a výskyt receptoru (v kDa) 84 heterodimér s TLR2, TLR4

TLR2

4q32

84

heterodimér s TLR1, TLR6

TLR3

4q35

97

homodimér

TLR4

9q32-33

90

homodimér, heterodimér s TLR5

TLR5

1q33

91

homodimér, heterodimér s TLR4

TLR6

4p14

91

heterodimér s TLR2

TLR7

Xp22

121

intracelulární výskyt

TLR8

Xp22

120

intracelulární výskyt

TLR9

3p21

116

homodimér

TLR10

neznámá

95

heterodimér s TLR2

Název Chromozomální receptoru lokalizace


29

Stanovení protilátek proti gliadinu má v souboru vyšetřovaných signálních znaků pro celiakii stále nezastupitelný význam.

Nové EIA soupravy pro diagnostiku celiakie ritská společnost Binding Site uvádí naším prostřednictvím na trh nové soupravy z výrobní řady BINDAZYMETM na enzymoimunoanalytické stanovení protilátek třídy IgG a IgA proti gliadinu (proti modifikovaným gliadinovým peptidům – MGP). Tyto vysoce citlivé a specifické soupravy velmi vhodně doplňují současnou řadu laboratorních diagnostických prostředků pro celiakii. Jsou určeny jako pomůcka při stanovení diagnózy a pro sledování účinnosti léčby a průběhu choroby. Celiakie je zánětlivé onemocnění tenkého střeva způsobené u predisponovaných osob nesnášenlivostí pšeničného lepku nebo příbuzných proteinů žita a ječmene. V tenkém střevě dochází ke štěpení lepku na gliadinové peptidy a k deaminaci těchto peptidů cestou substituce glutaminových zbytků kyselinou glutamovou za účasti tkáňové transglutaminázy (tTG). Tyto modifikované gliadinové peptidy hrají klíčovou úlohu v patogenezi celiakie, posilují imunogennost gliadinu a podněcují k navození imunitní odpovědi. Při celiakii dochází v imunitním systému k předkládání antigenů deaminovaných peptidů, výsledkem je imunitní reakce proti gliadinu a později i proti autoKód výrobku antigenům, provázená produkcí protilátek třídy IgA a IgG, při níž dochází k silné místní MK135 zánětlivé reakci vedoucí k poškození střevMK136 ních klků a tím ke snížení schopnosti vstřeMK137 bávat živiny.

30


Stanovení protilátek proti tkáňové transglutamináze, především ve třídě IgA, (spolu se stanovením protilátek proti endomysiu) je obecně uznáváno jako nejcitlivější a nespecifičtější test používaný při stanovení diagózy celiakie. Přesto u určité části nemocných (u velmi malých dětí a starších pacientů s nízkým stupněm dystrofie střevních klků) nemusí být protilátky anti-tTG zjištěny. Stanovení protilátek proti gliadinu má v souboru vyšetřovaných signálních znaků pro celiakii stále nezastupitelný význam: pro odhalení choroby v časném stádiu, pro sledování účinnosti bezlepkové diety a její dodržování pacientem a pro sledování aktivity nemoci. Protilátky proti gliadinu ve třídě IgG jsou považovány za citlivější znak v porovnání s protilátkymi ve třídě IgA, které jsou naopak specifičtější. Doporučení stanovovat protilátky proti gliadinu jak v IgG tak v IgA se opírá navíc o zjištění, že mezi pacienty s celiakií je výskyt osob s deficitem IgA 10 – 15 x vyšší než v ostatní populaci. Nové soupravy pro stanovení protilátek proti gliadinu mají na pevné fázi navázány modifikované gliadinové peptidy (MGP). Studiemi bylo prokázáno, že v tomto případě se protilátky obsažené v sérech pacientů váží na větší počet antigenních epitopů ve srovnání s vazbou na nemodifikovaný gliadin, tedy že při použití MGP dochází k zesílení imunochemické reakce. Nové EIA soupravy jsou na 96 stanovení, obsahují řadu 5 kalibrátorů, pozitivní a negativní kontrolu a kontrolu s mezní hodnotou (cut-off), lze je používat jak pro semikvantitativní stanovení, tak pro screening. Jsou určeny pro diagnostiku in vitro, mají značku CE. BĚLA ŘÍČAŘOVÁ E-MAIL: [email protected]

Specifikace Human Anti-Gliadin (MGP) IgG EIA Kit Human Anti-Gliadin (MGP) IgA EIA Kit Human Anti-Gliadin (MGP) IgG/IgA EIA combi Kit

ParadigmTM Přístroj PARADIGMTM je prvním multifunkčním detektorem, který může být upgradován nebo jehož konfigurace může být uživatelem změněna v méně než 5 minutách, a to jednoduchou výměnou detekčních kazet. K dispozici je široká škála těchto detekčních výměnných kazet, které lze libovolně doplňovat: kazeta pro měření fluorescenční intenzity „Multimode kazeta“ optimalizovaná pro měření fluorescenční intenzity, time resolved fluorescence a luminiscence ve formátu 96 a 384 jamkových destičkách. kazeta pro měření Time Resolved Fluorescence kazeta pro měření fluorescenční polarizace kazeta pro měření absorbance (libovolné vlnové délky v rozmezí 230 – 1 000 nm) kazeta pro měření luminiscence Další výměnné kazety jsou postupně vyvíjeny.

Časopis Cellular Research Od loňského roku vydává společnost Beckman Coulter pravidelně časopis Cellular Research, který je určen pro pracovníky laboratoří buněčné biologie, uživatele průtokových cytometrů a přístrojů pro analýzu buněk. Páté číslo vydané v květnu je věnováno aplikacím pro průtokové cytometry CyAn ADP a MoFlo XDP. Pokud máte zájem o zasílání tohoto časopisu, pošlete, prosím, svoji adresu na e-mail [email protected]. PAVEL KRUŽÍK E-MAIL: [email protected]

Přístroj PARADIGMTM je možné použít jako samostatně stojící přístroj, který umožňuje analyzovat destičky ve formátu 6 až 1 536 jamkových, nebo je možné ho integrovat s pipetovacími roboty Biomek® Beckman Coulter nebo s novými dispenzory BioRAPTR. Pro snadné ovládání a měření je přístroj dodáván se softwarem, který obsahuje řadu obecně používaných protokolů pro kvalitativní analýzu a pro komerčně dostupné kity. EVA KRÁLOVÁ E-MAIL: [email protected]

Průtokový cytometr CellLab Quanta SC MPL Pracovní skupina Integrated Solution Group vyvinula postup, kterým lze online propojit průtokový cytometr CellLab QUANTA SC MPL s dalšími zařízeními, včetně robotického ramene, které vkládá destičky s tkáňovými kulturami do cytometru pro analýzu. Data z cytometru jsou automaticky získávána pomocí softwaru přístroje a ukládána pro následnou analýzu a interpretaci. Možnost integrovat tento cytometr rozšiřuje jeho použití ve vysokokapacitním testování, walk-away analýzách, včetně počítání absolutních počtů buněk, životnosti, stanovení apoptózy, buněčného cyklu, povrchových znaků nebo exprese fluorescenčních proteinů. Tímto způsobem lze optimalizovat a monitorovat procesy ve vývoji léčiv a ve vývoji dalších aplikací. Průtokový cytometr CellLab QUANTA SC MPL je určen pro výzkumná pracoviště. Přístroj kombinuje měření objemu buněk Coulterovou metodou a fluorescencí na třech fotonásobičích s použitím argonového laseru (488 nm) nebo rtuťové výbojky (excitace při 366, 405 a 435 nm). PAVEL KRUŽÍK E-MAIL: [email protected]


31

Validace a verifikace IVD ýrobci a distributoři diagnostických zdravotnických prostředků in vitro (IVD) zaznamenávají stále s jistou frekvencí požadavky uživatelů IVD na dodání „validačních protokolů či certifikátů„, protokolů o klinických zkouškách, zařazení do tříd podle rizika či jiných pro IVD právně neexistujících dokumentů. Částečně je to způsobeno neznalostí příslušné legislativy, zejména zaměňováním IVD (podle nařízení vlády 453/2004 Sb.) se zdravotnickými prostředky (podle nařízení vlády 336/2004 Sb), svou roli však zřejmě sehrává i příprava laboratoří na akreditaci dle ČSN EN ISO 15189:2007. V tomto textu se budu zabývat pojmy validace a ověření (verifikace) a tím, jakou roli hrají ve vztahu výrobce – uživatel IVD. Podívejme se nejprve, jak znějí definice obou výše uvedených pojmů. Validace je potvrzení prostřednictvím objektivních důkazů, že požadavky na specifické zamýšlené použití nebo specifické aplikace byly splněny. Ověření (verifikace) je potvrzení zkoumáním a poskytnutím objektivního důkazu, že specifikované požadavky jsou splněny. I když je znění obou definic podobné, význam pojmů je podstatně odlišný. Prostřednictvím validace se uživatel ujišťuje, že zařízení, které se chystá používat, odpovídá oněm požadavkům uvedeným v definici. V případě IVD, ať už se jedná o analyzátory nebo reagencie, pozbývá validace uživatelem smysl, neboť účel použití je jednoznačně určen výrobcem. Ten provádí v rámci posuzování shody výrobku s požadavky Směrnice 98/79/ES (NV 453/2004 Sb.) posuzování funkční způsobilosti (performance evaluation) výrobku, což je v jistém smyslu „velmi obsáhlá validace“. Jen tak může vystavit prohlášení o shodě a označit výrobek harmonizovaným symbolem IVD a evropskou značkou shody CE. V případě, že by si laboratoř nakoupila analyzátory a robotická zařízení od různých výrobců a vytvořila by z nich kom-

32


plexní automatizovanou linku, je samozřejmě její povinností tuto linku plně validovat. To platí i pro případ, kdy jsou s analyzátorem používány jiné reagencie, než které doporučuje výrobce. Verifikace je oproti tomu potvrzením toho, že zařízení nebo reagencie dosahují některých parametrů uváděných výrobcem nebo požadovaných předpisy, např. citlivost, specificita, přesnost, správnost, reprodukovatelnost apod. Za ověřování (verifikaci) je plně odpovědný uživatel IVD, tedy nemocnice či laboratoř. Otázka samozřejmě zní, jaký by tato verifikace měla mít rozsah. Poměrně jednoduchá je odpověď v případě verifikace analyzátorů. Zde je většinou nutné obrátit se na autorizovaný servis, který má k dispozici výrobcem schválené postupy a materiály. V případě reagencií takto jednoznačná odpověď bohužel neexistuje. Existuje ovšem řada doporučení, mezi nimi i doporučení ČSKB, jak verifikace provádět. V poslední době jsou často diskutována „verifikační pravidla dle CLIA“, přičemž je uváděna řada nepřesností a nesprávných informací. Tak je například CLIA označována za orgán pro kontrolu kvality a posuzování kompetence laboratoří, uvádí se, že FDA schválené metody „vyžadují podstaně menší rozsah validace v laboratoři, než metody ostatní“ a že „tato zjednodušená validace se považuje za verifikaci“1. To je jisté zmatení pojmů, neboť validace, ať už „zjednodušená“ či „plná“, je něco jiného než verifikace. Takové směšování pojmů nepřispívá k usnadnění komunikace mezi výrobci a uživateli.

Zejména je ovšem nutné zdůraznit, že CLIA není žádný orgán či organizace, se kterou by bylo možné spolupracovat (sic), nýbrž se jedná o federální legislativní opatření (Clinical Laboratory Improvement Amendments) platné na území USA. Tím je řečeno v podstatě vše. Tato velmi obsáhlá regulace stanoví nesmírně podrobně povinnosti klinických laboratoří a validace, verifikace, kalibrace apod. tvoří jejich menší část. Stanoví laboratořím povinnost validovat preanalytickou i postanalytickou fázi, předepisuje kvalifikaci a výcvik laboratorních, popř. dozírajících pracovníků a v podstatě jim předepisuje zavedení a udržování systému managementu kvality. V CLIA, Subpart K – Quality Systems for Nonwaived Testing2 je v odstavci 493.1253 definován rozsah požadované verifikace pro testy podléhající schválení nebo registraci FDA (nonwaived – v podstatě ekvivalent IVD ve smyslu regulace platné v EU). Vyžaduje se verifikace následujících parametrů: přesnost (accuracy)3 shodnost (precision)3 pracovní rozsah (reportable range) vhodnosti referenčního intervalu (normálních hodnot) udaného výrobcem pro populaci, která tvoří klientelu laboratoře (reference intervals) Laboratoř není povinna verifikovat údaje výrobce o interferencích a meze detekce nebo stanovitelnosti, jak je chybně uvedeno v již citované publikaci1. Laboratoř je povinna tyto verifikace provést dříve, než začne předmětný výrobek používat při poskytování zdravotní péče, tedy vydávat výsledky pro konkrétní pacienty. Zajímavé je, že tento na jedné straně přísný předpis stanoví, že pro testy užívané laboratoří před 24. dubnem 2003 nemusí být žádné verifikace prováděny, což naopak vyznívá velmi mírně. Další zajímavostí je, že verifikační požadavky CLIA se vůbec nevztahují na tzv. waived systémy, většinou jednoduché testy, které by nicméně dle regulace platné v EU byly považovány za IVD. Lze jen souhlasit s Friedeckým a Kratochvílou4, že takto liberální přístup k těmto „waived“ testům dozná v USA pravděpodobně změny. Dále je laboratoř povinna verifikovat kalibraci testu (dle odstavce 493.1255), a to minimálně každých 6 měsíců a za použití minimálně tří kontrolních vzorků (kterými mohou být např. reálné pacientské vzorky o známé koncentraci analytu), které musí pokrývat pracovní (měřící) rozsah testu (ve smyslu minimální či nulová hodnota, střední hodnota a hodnota blízká maximu). Při verifikaci kalibrace používá laboratoř kriteria či parametry získané při verifikaci dle odstavce 493.1253. Nabízí se tedy implicitně výklad, že be se měl uživatel při verifikaci kalibrace zaměřit pouze na pracovní rozsah a referenční intervaly.

Kromě pravidelné 6 měsíční verifikace kalibrace je tato předepsána vždy, když: a) dojde k úplné změně šarží reagencií pro určitý test, b) je provedena velká preventivní údržba analyzátoru anebo je vyměněna kritická součástka, c) analýza kontrolních materiálů vykazuje neobvyklý trend nebo jsou jejich hodnoty mimo laboratoří nastavené meze, d) laboratoř si nastaví ve svém systému zabezpečování kvality častější verifikace kalibrace. V případech uvedených v bodech a) – c) nemusí být ovšem verifikace kalibrace provedena, pokud je laboratoř schopna demonstrovat, že změna šarží reagencií či výměna součástky nemá vliv na výkonnost testu(ů) nebo lze-li problémy s analýzou kontrolních materiálů napravit či vysvětlit jinými důvody než je kalibrace. Tyto možnosti jsou ve výše uvedené publikaci4 opomenuty. V České republice neexistuje podobný předpis jako je CLIA. Existuje sice možnost kontroly laboratoře SÚKL; ten se ovšem musí pohybovat v rámci pravomocí, které jsou mu dány českou legislativou. Kromě profesionální odpovědnosti dnes tedy u nás neexistuje síla, která by mohla laboratoře donutit verifikace provádět. Akreditační norma ISO 15189 takovou „silou“ nemůže být, neboť akreditace je jak známo dobrovolný akt. Je zřejmé, že verifikace znamenají pro laboratoř určité náklady. Pokud budou na trhu, a přiznejme si, že laboratorní medicína je dnes podnikání, soutěžit subjekty, které budou akreditovány nebo budou verifikace provádět i bez akreditace, s těmi, které nic takového provádět nebudou, popř. velmi omezí rozsah takovéto činnosti, je jasné, na čí straně bude finanční výhoda. Nemůže být sporu o tom, že určitá forma a rozsah verifikace jsou pro správnou činnost laboratoří nezbytné. Jiná otázka je, jaký by měl být jejich rozsah. CLIA a na něj navazující evaluační protokoly CLSI fungují ve zcela jiném systému financování zdravotnictví, přičemž je třeba mít na zřeteli, že se jedná v první řadě o legislativní akt, nikoli o čistě expertní záležitost, který může být ovlivněn řadou faktorů, které nemají nic společného s odbornými hledisky. To je zřejmé například z výjimky z verifikačních požadavků platné pro testy zavedené před 24. dubnem 2003. Taková výjimka se dá pochopit např. v systému označování značkou CE v EU, ale nenapadá mne žádný rozumný důvod, proč by takové testy nemohly a neměly být verifikovány. Protože se jedná o vynutitelný předpis, nepřichází patrně v úvahu, aby si část laboratoří vylepšovala své ekonomické výsledky tím, že nebude verifikační požadavky plnit. Jedná-li se o všeobecnou povinnost, jsou patrně verifikace nějakým způsobem zohledněny při financování laboratoří. V České republice je však situace, jak již bylo řečeno dříve, zcela odlišná. Vezmeme-li v úvahu, že IVD jsou používány na biochemických, hematologických, imunologických, mikrobiologických a genetických pracovištích, pak je škoda, že se verifikacemi IVD v laboratořích zabývá formou doporučení pouze ČSKB, v jejímž rámci se také většinou odehrává diskuze, někdy i vzrušená, o verifikačních požadavcích. Možná by bylo užitečné, kdyby se diskuze o verifikacích účastnily i ostatní odborné společnosti. Pokud by dospěly ke konsenzu, společnými silami by snad mohli vyvinout tlak na to, aby byla verifikační činnost zohledněna v cenách výkonů. Literatura: 1. B. Friedecký, FONS, 28 – 30, 4/2007 2. http://wwwn.cdc.gov/clia/regs/subpart_k.aspx 3. ČSN ISO 5725 4. B. Friedecký, J. Kratochvíla, FONS, 22 – 24, 3/2007 PETR ŠMÍDL E-MAIL : [email protected]


33

Kongres ISAC v Budapešti

EDMA už má svoje zastúpenie aj na Slovensku uplynulých mesiacoch vzniklo na Slovensku záujmové združenie právnických osôb – Slovenská asociácia výrobcov a dodávateľov diagnostických zdravotníckych pomôcok „in vitro“ SEDMA ako slovenská odnož Asociácie európskych výrobcov diagnostiky in vitro EDMA. Slovensko sa týmto krokom pripája k európskemu štandardu, ktorý v tejto oblasti predstavuje lokálna pobočka celoeurópskej organizácie EDMA. SEDMA združuje 7 renomovaných spoločností z oblasti laboratórnej diagnostiky s celoeurópskou alebo svetovou pôsobnosťou. Zakladajúcimi členmi sa stali spoločnosti: 1. Abbott Laboratories, s.r.o., Praha, ČR 2. Biomedica Slovakia, s.r.o., Bratislava, SR 3. Immunotech, s.r.o., Bratislava, SR 4. Roche Slovensko, s.r.o., Bratislava, SR 5. Siemens Medical Solutions Diagnostics, s.r.o., Bratislava, SR 6. Sysmex Slovakia, s.r.o., Bratislava, SR K týmto zakladajúcim členom sa na 1. valnom zhromaždení asociácie pridala aj spoločnosť Medesa SK, s.r.o., Bratislava, SR. SEDMA ako združenie s otvorenou štruktúrou si kladie za cieľ zastupovať špecifické záujmy svojich členov vo vzťahu k štátnym i profesným orgánom a organizáciám a tak prerokovávať a oboznamovať druhú stranu so špecifickými otázkami týkajúcimi sa postavenia, funkčnosti, aktuálnych problémov a perspektív diagnostiky in vitro na Slovensku. Ambíciou asociácie je prispieť k skvalitňovaniu a zefektívňovaniu diagnostického procesu na Slovensku v súlade s existujúcimi trendmi presadzovaním certifikovaných produktov a riešení najvyššej kvalitatívnej úrovne s adekvátnymi ekonomickými parametrami, prispievať k zvyšovaniu kvality diagnostického procesu presadzovaním katalogizácie výkonov ako prostriedku pre ich adekvátne ohodnotenie, akreditačného procesu diagnostických laboratórií, implementácie najprogresívnejších parametrov do diagnostiky, racionálneho procesu registrácie diagnostických pomôcok in vitro a súčasne sa stať integrálnym článkom legislatívneho procesu, aby sa tak aj výrobcom otvoril priestor na konštruktívne a tvorivé pripomienkovanie pripravovaných zdravotníckych zákonov. Asociácia má miesto pôsobenia v Bratislave. JOZEF SMOLKA E-MAIL: [email protected]

34


květnu tohoto roku proběhl v Budapešti XXIV. kongres International Society for Analytical Cytology. Hlavním tématem akce byla obrazová analýza, průtoková cytometrie, rostoucí význam měření vlastností jednotlivých buněk a vytváření modelů biologických systémů. Hlavním, diamantovým sponzorem byla společnost Beckman Coulter. Největší pozornost návštěvníků firemní expozice poutaly nové akvizice, průtokové cytometry CyAn ADP 9-color a MoFlo XDP, které byly na takovéto akci představeny poprvé. Z dalších přístrojů byly na stánku vystaveny Biomek NX, FC500 MPL, QUANTA SC MPL a FP1000. Výhodná poloha Budapešti umožnila také širokou účast odborníků z České republiky. Řada z nich publikovala výsledky své práce v posterové sekci a ve sborníku kongresu a Doc. Ing. J. Doležel, DrSc. moderoval jednu z paralelních sekcí. PAVEL KRUŽÍK E-MAIL: [email protected]

Vision Centrum v Paříži Uvedení na trh nového kombinovaného systému UniCel® DxC 880i bylo provázeno jeho představením v Beckman Coulter Vision Centru v Paříži. ěkteří z našich zákazníků jak z České Republiky, tak ze Slovenska měli možnost navštívit Vision Centrum v Paříži a setkat se tak s naším novým přírůstkem do rodiny UniCel®. V komorním přednáškovém sále Vision Centra byli přítomní nejprve seznámeni s analyzátorem formou prezentace, kterou uvedl ředitel Ing. Václav Mádr. Produktový specialista Ing. Lukáš Palivec představil unikátní princip řešení kombinovaného systému UniCel® DxC 880i. Následující volná diskuse byla podpořena praktickými zkušenostmi RNDr. Petra Brzáka z Panochovy nemocnice v Turnově, kde byl analyzátor DxC 880i nainstalován začátkem června tohoto roku jako vůbec první ve Střední Evropě.

dubnovém vydání časopisu In Vitro Diagnostika (IVD, vydání 8 – 2008) jsem v článku UniCel koncept – Integrace systémů stručně představil nový produkt rodiny analyzátorů UniCel – alikvotační modul UCTA (UniCel - Closed Tube Aliquotter, z angl. „UniCel – alikvoter z uzavřené zkumavky“), který doplňuje koncepci imunochemických a biochemických analyzátorů Beckman Coulter. Prostřednictvím tohoto modulu lze spojit biochemický a imunochemický analyzátor v integrovaný systém. První laboratoří v České republice, kde byl integrovaný systém nové generace firmy Beckman Coulter nesoucí název UniCel DxC 880i nainstalován, byla laboratoř v Panochově nemocnici v Turnově. Pojďme se tedy podívat na to, jak to vše probíhalo a jaké jsou první dojmy našich zákazníků. Před samotnou instalací bylo nutné provést několik úprav laboratorních prostor. Instalace byla zahájena 19. května a po třech dnech byl systém připravený na rutinní provoz. Dnes je UniCel DxC 880i v chodu déle než jeden měsíc. Na konkrétní věci týkající se instalace,

V předváděcí laboratoři Vision Centra si zákazníci nový systém prohlédli, spustili a vyzkoušeli jeho softwarové možnosti. Kromě UniCel® DxC 880i zde byla příležitost seznámit se s preanalytickou linkou AutoMate 800, s řídícím softwarem Command Central, se starší vývojovou řadou kombinovaného systému i se stand alone analyzátory firmy Beckman Coulter včetně hematologických a výzkumných přístrojů. Den jsme zakončili stylovou večeří na lodi plující po Seině, kdy jsme se kromě vybrané francouzské kuchyně mohli kochat i pohledem na kulturní památky Paříže. JITKA ČERNÁ E-MAIL: [email protected] MARTINA SALÁTOVÁ E-MAIL: [email protected]

Integrovaný systém UniCel DxC 880i – Panochova nemocnice Turnov uvedení do provozu a zkušenosti jsem se zeptal RNDr. Petra Brzáka, primáře Oddělení klinické biochemie a Zdeny Drobníkové, vrchní laborantky. Co Vás vedlo k rozhodnutí vybavit laboratoř integrovaným analytickým systémem? V roce 2007 jsme začali uvažovat o obnově biochemického analyzátoru Synchron CX 7 a více méně ve stejné době se objevila možnost využití integrovaného systému. Z čeho jste měli největší obavy? To je v podstatě několik otázek. Bylo jasné, že budeme muset udělat stavební úpravy bez omezení provozu. Neměli jsme žádné zkušenosti s imunochemickými systémy firmy Beckman Coulter. Integrovaný systém jsou vlastně tři přístroje, to znamená třikrát více problémů na jednom místě. Jaké stavební úpravy bylo nutné provádět? Propojili jsme částečně tři místnosti a přemístili jsme denní místnost zaměstnanců. Ze stavebních důvodů a také po debatě s kolegy, jejichž provoz má sálové uspořádání, jsme nechtěli velký sál.


35

Nebrzdí alikvotační jednotka průchod celého analyzátoru? V našem provozu rozhodně ne. Jak přijaly nový analyzátor laborantky? Jak probíhalo jejich zaškolení? Aktivně, odevzdaně, s mírnou nedůvěrou. To je vždy závislé na jednotlivci a problémech, které každou instalaci provázejí. Zaškolování ještě probíhá. Použili jsme variantu první zaškolení na místě a potom byly laborantky ve dvojicích ve Vašem školícím centru. Další postup je otázka dohody.

Nebyl narušen v průběhu přestavby provoz laboratoře? Byl a nebyl, samozřejmě děvčata pracovala ve velmi stísněných podmínkách na chodbě oddělení a měla k dispozici pouze nouzový denní prostor. Nedostal jsem žádnou stížnost či výtku od klinických pracovišt na nedostatky v provozu v průběhu rekonstrukce. Za tento přístup bych chtěl ještě jednou všem pracovnicím OKBH poděkovat. Bylo pro Vás výhodné, že byl kombinovaný systém instalován na etapy, tzn. biochemie (DxC 800), imunochemie (DxI 800) a následná integrace (U-CTA)? Tuto otázku musím položit i já Vám. Byla instalace v etapách výhodná pro Vás? Z mého pohledu výhodná byla pro všechny, neboť řešení problémů s připojením na LIS a jiných bylo rozděleno na delší časový úsek, a tím méně stresující. Instalaci v jedné etapě také nevidím jako problém. Podobnost všech systému na trhu, vyškolený personál a chuť řešit případné problémy jsou předpokladem, a pak již záleží jen na požadavcích provozu. Jak probíhala samotná instalace? Jak dlouho byly analyzátory mimo provoz? Měli jste nějaké záložní systémy v průběhu odstávky? Jak jste řešili STATIMové vzorky? Řekl bych, že normálně jako každá jiná. Úplná odstávka byla pokud vím 5 hodin. Vzhledem k velikosti našeho provozu jsme připravili starý Synchron CX 7 do pohotovostního režimu pro případ, že by došlo k úplnému kolapsu nových přístrojů. A pro urgentní biochemické vzorky byla připravena sanitka a domluvena výpomoc s kolegy z okolních pracovišť. Ostatní části laboratoře, to je hematologie a krevní sklad, neměly samozřejmě žádné omezení. Umím si představit rozsáhlejší provoz, kde by byla nutná provozní záloha. Jaká byla reakce lékařů na výsledky imunochemických vyšetření? Myslím tím především referenční meze, které jsou přeci jen specifické pro každého výrobce. Projednali jsme vše s předstihem a nebyl, zatím, žádný problém. Ostatně rozdíly v referenčních mezích, které jsme měnily, nebyly až tak závažné. Jaký je hlavní rozdíl mezi samostatnými a integrovanými analyzátory? Myslím tím především z hlediska laboratorního procesu. Na prvním místě úspora práce. Zlepšení průchodnosti urgentních vzorků (kratší TAT). Mírně negativní očekávání, že integrovaný přístroj = více problémů na jednom místě, není provozně významné, protože každá část systému je schopna pracovat jako samostatně stojící analyzátor.

36


V popisu systému UniCel DxC 880i se uvádí vzájemná nezávislost obou analytických modulů. Máte s touto vlastností nějakou zkušenost? Ano, systém pracoval v průběhu instalace a počátečního provozu ve všech variantách. DxC samostatně, DxC a CTA dohromady, DxI samostatně, DxI a DxC samostatně, nezkoušeli jsme DxI a CTA s vypnutím DxC, protože biochemický modul je v nepřetržitém provozu. Jak je to s údržbou celého systému? Řekl bych, že je odpovídající systému, dostatečně zjednodušená a tím proveditelná. Jaké jsou hlavní přednosti tohoto integrovaného systému? Výhody jsem již zmiňoval výše - úspora práce, zlepšení průchodnosti urgentních vzorků (kratší TAT) a další si můžeme říci za rok, až budeme mít více zkušeností. Druhá část otázky je porovnání tohoto systému s jinými, což já mohu těžko posoudit, protože jsem s jiným integrovaným systémem nepracoval. Kde vidíte hlavní rezervy? Co lze zlepšit? Nyní odpovím vyhýbavě, nikoliv proto, že žádné připomínky nejsou nebo že bych se bál, že budou cenzurovány, ale protože je ještě moc brzo. Na rozumné posouzení výhod a nedostatků potřebujeme více času, tak snad až příště. Děkuji Vám za Vaše názory a první zkušenosti s integrovaným systémem UniCel DxC 880i a, jak jste již naznačil v poslední odpovědi, budeme rádi za další poznatky, které vyplynou v průběhu rutinního provozu. LUKÁŠ PALIVEC E-MAIL: [email protected]

# Systém UniCel DxC 880i byl navržen tak, že průchodnost alikvotačního modulu U-CTA (200 vzorků/ hod) je vyšší než průchodnost biochemického modulu UniCel DxC 800 (cca 100 vzorků/hod). Důvodem byla podmínka, aby byl determinujícím faktorem pro celkovou průchodnost integrovaného systému analytický modul (jako je tomu u „stand alone“ analyzátorů), nikoliv alikvotační jednotka. (pozn. autora).

Více flexibility, více bezpecˇnosti, více produktivity - UniCel DxC 880i

PRO VÍCE INFORMACÍ KONTAKTUJTE PRODUKTOVÉ SPECIALISTY: Ing. Miroslav Bischof tel.: 605 200 149 e-mail: [email protected] Ing. Lukáš Palivec tel.: 603 538 361 e-mail: [email protected]

Vaše laboratoř může již dnes splňovat náročné požadavky na výkon, kvalitu a bezpečnost biochemických a imunochemických analýz díky analyzátorům UniCel DxC 800 a DxI 800. Záleží jen na Vašem rozhodnutí, zda ještě zvýšíte produktivitu a zjednodušíte průchod vzorku laboratoří prostřednictvím integrace obou analyzátorů v kombinovaný systém UniCel DxC 880i. Jak na to? Naším řešením je modul CTA (Closed Tube Aliquotting). Prostřednictvím CTA modulu získáte propojení mezi oběma analyzátory, které Vám přinese: jednoduché vkládání vzorků jak pro biochemické, tak imunochemické analýzy, maximální bezpečnost provozu díky odběru alikvotů a vzorků z uzavřených zkumavek, zkrácení doby analýzy díky paralelnímu průběhu biochemických a imunochemických vyšetření, široké spektrum parametrů, schopnost nezávislé funkce biochemického a imunochemického modulu.

INTEGROVANÝ SYSTÉM UNICEL DXC 880i PŘEDSTAVUJE DALŠÍ ZEFEKTIVNĚNÍ A ZVÝŠENÍ BEZPEČNOSTI PRÁCE VE VAŠÍ LABORATOŘI!

www.beckmancoulter.cz www.UniCelDxC880i.cz

XV. Slovensko-česká konferencia o hemostáze a trombóze s medzinárodnou účasťou dňoch 22. - 24.5.2008 sa v Martine konala už XV. SlovenskoČeská konferencia o hemostáze a trombóze s medzinárodnou účasťou, ktorú organizovala Jesseniova lekárska fakulta Univerzity Komenského v Martine, Slovenská spoločnosť pre hemostázu a trombózu, Národné centrum hemostázy a trombózy v Martine a Spolek pro trombózu a hemostázu, Česká republika. Garantom konferencie bolo predsedníctvo v zložení Prof. MUDr. P. Kubisz, DrSc. a Prof. MUDr. J. Malý, DrSc. Podujatie sa konalo pod záštitou ministra zdravotníctva SR, dekana JLF UK, riaditeľa MFN a primátora mesta Martin. Na akcii participovalo okolo 400 účastníkov hlavne zo Slovenska a Českej republiky. V bloku zahraničných prednášok sme si vypočuli prácu Prof. Tripodiho (Milano, Italy), Prof. Michielsa (Antwerp, Belgium), Prof. Morfiniho (Florence, Italy). Na tomto ročníku bola založená tradícia Jesseniovej prednášky, v rámci ktorej prof. Musial (Krakow, Poland) informoval o súčasných poznatkoch a možnostiach prevencie v problematike antifosfolipidového syndrómu Hlavné témy konferencie: nové poznatky o fyziológii a patofyziológii hemostázy hemostáza v kardiológii, gynekológii, pediatrii, neurológii a ďalších odboroch klinickej medicíny hemostáza v onkológii hemostáza v chirurgii hemostáza v intenzívnej medicíne terapeutická angiogenéza a transplantácia kmeňových buniek pri cievnych ochoreniach rekombinantný F VIIa a hemostáza, bypassová terapia vrodené a získané trombofilné stavy vrodené a získané krvácavé stavy aktuálne diagnostické a terapeutické postupy pri poruchách hemostázy transfúzna medicína a hemostáza ošetrovateľská starostlivosť o pacientov v hematológii varia

38


Nosnými témami postgraduálnych prednášok bola problematika trombofílie a hemostázy, nové antitrombotiká. S veľkým záujmom sa stretla spoločná práca hematológov s chirurgami o nových trendoch v liečbe ischémie dolnej končatiny. Táto poukázala na nové možnosti transplantácie kmeňovej bunky v Slovenskej republike, tzv. celulárnu terapiu. V blokoch prihlásených prednášok dominovaly práce z oblasti koagulopatie, trombofílie, antikoagulačnej liečby a nakoniec aj z problematiky hemostázy v iných medicínskych odboroch. Prezentácia Beckman Coulter a Instrumentation Laboratory na podujatí Spoločná prezentácia BC a IL potvrdila celosvetové partnerstvo v oblasti hemostázy aj na tomto podujatí. Záujem účastníkov konferencie na našom stánku sa sústredil na prvú prezentáciu systému ACL TOP od výrobcu Instrumentation Laboratory na Slovensku a ďalšie novinky testov HemosIL. Podrobnejšie informácie nájdete na stránke www.ilww.com. Hlavným príspevkom spoločnosti Instrumentation Laboratory odborného programu konferencie bola prednáška Prof. Tripodiho z University of Milano (Taliansko), State of art lecture: Trombophilia 2008. Viac informácii o konferencii môžete nájsť na stránkach: www. hematology.sk, www.hematology.cz. HELENA BAZOVSKÁ E-MAIL: [email protected]

Uživatelské setkání živatelské setkání Freelite se konalo 13. - 14. 5. 2008 v Telči v příjemném prostředí Vzdělávacího a konferenčního centra „Konvikt svatých Andělů“. Seminář byl tentokrát zaměřen hlavně na technické problémy při stanovení volných lehkých řetězců (které mimochodem není ani lehké, ani není laboratorním pracovníkům „volné“). Problematiku volných lehkých řetězců z nejrůznějších aspektů uvedla svou přednáškou RNDr. Běla Říčařová, CSc. Technicky velmi podrobné a propracované přednášky měli pracovníci firmy Binding Site. Beatrix Thompson upozornila na některá úskalí týkající se atypických vzorků – „nelineárních“ a polymerizovaných, i na to, jak rozpoznat relativní nadbytek antigenu, a uvedla konkrétní doporučení, jak při analýze atypických vzorků postupovat. Dále doporučila některé mezinárodní kontrolní cykly pro stanovení volných lehkých řetězců. John Overton kriticky rozebral stanovení volných lehkých řetězců na konkrétních šesti typech nejčastěji používaných analyzátorů. O další přednášky se podělili účastníci z České republiky a Slovenska. Kromě poslechu přednášek a následné diskuse byl i další čas vyhrazený ke

konzultaci s pracovníky firmy Binding Site. Velký zájem měli účastníci o stánek s knihami, časopisy a separáty týkající se problematiky volných lehkých řetězců. Setkání uživatelů mělo i svůj společenský rozměr: zbyl čas na procházku po nádherném náměstí Zachariáše z Hradce i na společnou prohlídku zámku v Telči. Po oba dva dny bylo krásné slunné počasí, které lákalo na přestávky mezi přednáškami na přilehlou venkovní terasu konferenčního centra. Milou pozorností pořadatelů bylo dodatečné CD se všemi přednáškami a fotografiemi. Freelite v Telči se po všech stránkách opravdu vydařil, těšíme se na příští volné, lehké…. RNDR. IVA OUHRABKOVÁ ODDĚLENÍ KLINICKÉ BIOCHEMIE, KRAJSKÁ NEMOCNICE LIBEREC, HUSOVA 10, 460 01 LIBEREC E-MAIL: [email protected]


39

Laboratórna diagnostika v medicíne 2008 dňoch 12. – 14. 6. 2008 sa uskutočnila v Spišskej Novej Vsi I. zakládajúca slovensko-česká konferencia Laboratórna diagnostika v medicíne 2008. Konferenciu organizovala Slovenská komora iných zdravotníckych pracovníkov v spolupráci so Slovenskou lekárskou komorou, Slovenskou spoločnosťou pre laboratórnu medicínu a s odbornými spoločnosťami na laboratórnu diagnostiku v Slovenskej lekárskej spoločnosti. Akcia sa konala pod záštitou primátora mesta Spišská Nová Ves. Naša spoločnosť Immunotech, a Beckman Coulter Company podporila toto významné podujatie ako generálny sponzor. Cieľom konferencie bolo založenie spoločného fóra všetkých laboratórnych odborov, ktoré dateraz chýbalo nielen na Slovensku, ale aj v Čechách. Odborníci z oboch krajín riešili otázky laboratórnej diagnostiky v blokoch: Vízia moderného klinického laboratória Informačné systémy v zdravotníckych zariadeniach Laboratórna medicína – medicínsky odbor alebo organizačný útvar? Organizácia klinických laboratórií, regulácia, voľný trh, zmluvy so zdravotnými poisťovňami Systém oceňovania výkonov Úloha komôr v zdravotníckom systéme Vymedzenie kompetencií základných laboratórnych odborov Systémy hodnotenia kvality

Konferencia bola ohodnotená podľa zákona NR SR č. 578/2004 Z.z. o poskytovateľoch zdravotnej starostlivosti, zdravotníckych pracovníkoch, stavovských organizáciach v zdravotníctve a o zmene a doplnení niektorých zákonov, a Nariadenia vlády SR č. 322/2006 Z. z. o vzdelávaní zdravotníckych pracovníkov, o sústave špecializačných odborov a o sústave certifikovaných pracovných činnosti 13 kreditmi: 1. deň 3 kredity 2. deň 6 kreditov 3. deň 4 kredity Za aktívnu účasť – prednášku bolo prednášajúcim priznaných 10 kreditov podľa všeobecne platných právnych predpisov. Na konferencii bolo prítomných 191 registrovaných účastníkov zo Slovenska a Čiech. 21 firiem prezentovalo svoju ponuku formou stánkov. Informácie o konferencii boly zverejnené na www stránke www.labmed-snv.sk. Odborníci z oboch krajín sa v závere konferencie dohodli na ďalšej spolupráci aj v nasledujúcom období, aby spoločne riešili problémy laboratórnej diagnostiky a tým aj zdravotníctva v prospech pacienta. Organizátori konferencie výborne zvládli odbornú časť , kde prijali pozvanie s prednáškami špičkoví odborníci zo Slovenska a Čiech, ale tiež spoločenskú časť či už v priestoroch Reduty, alebo uprostred najznámejšieho strediska Slovenského raja – na Čingove. A čo dodať na záver? Spoločnosť Immunotech, a Beckman Coulter Company praje organizátorom ďalších ročníkov tejto akcie veľa úspechov. MÁRIA GAVELOVÁ E-MAIL: [email protected]

Výrobní útvar o celou dobu své existence společnost Immunotech a.s. stavěla svou činnost na třech hlavních pilířích - vývoji, výrobě a prodeji imunodiagnostických prostředků pro humánní medicínu. Výroba manuálních imunodiagnostických souprav je tedy nedílnou součástí společnosti Immunotech od samého začátku. Náplň útvaru výroby lze rozdělit do 2 hlavních aktivit. První je výroba RIA a IRMA souprav, které využívají radioindikátory značené radioaktivním jódem 125I. Druhou aktivitou je výroba neizotopových souprav a to ELISA či LIA souprav, kde se využívá značení křenovou peroxidázou s klasickou kolorimetrickou detekcí či detekcí luminiscenční. Výroba neizotopových souprav reprezentuje dnes pouze asi 5% z celkové výroby společnosti IMMUNOTECH a.s.

Dnes se cca 30 pracovníků podílí na výrobě radioaktivních souprav pro 32 analytů a neradioaktivních souprav pro 18 analytů. V loňském roce bylo vyrobeno přibližně 225 000 souprav (pro 100 stanovení). Největší podíl má výroba souprav pro diagnostiku thyroidální funkce, fertility a onkologických onemocnění. K dalšímu sortimentu patří soupravy pro diagnostiku adrenální funkce, diabetes a kostního metabolismu. Činnost útvaru je plně ve shodě s normou ISO 13485 verze 2003 a s interními dokumenty koncernu Beckman Coulter, což se významně podílí na vysoké kvalitě vyráběných souprav. Počet reklamací zákazníků je také proto minimální. Na základě výborné kvality a vysoké efektivnosti práce našeho výrobního útvaru se vedení koncernu Beckman Coulter rozhodlo konsolidovat veškerou výrobu radioaktivních souprav firmy do Prahy. Dá se očekávat, že v průběhu několika let se portfolio výroby radioaktivních souprav rozšíří o dalších 37 analytů. Podíl naší firmy na celosvětovém trhu manuálních souprav se každým rokem zvyšuje. V současné době patříme k největším výrobcům RIA souprav na světě. Beckman Coulter tak zajišťuje přibližně 25% světové výroby RIA souprav. MIROSLAV KUŠIAK E-MAIL: [email protected]


41

Útvar zabezpečování jakosti a regulatory affairs (ÚZJ) lavním posláním společnosti Immunotech a.s. je neustálé plnění a překonávání očekávání zákazníků. Jedním ze základních předpokladů toho, aby mohlo být naplněno, je shoda s předpisy a legislativními požadavky. Být nejlepší v jakosti je základem pro vedoucí postavení na trhu. Takovým „strážcem“ jakosti výrobků a služeb ve společnosti Immunotech a.s. je Útvar zabezpečování jakosti a regulatory affairs (ÚZJ), který má na starosti zabezpečení shody s požadavky norem ISO 9001:2000, ISO 13845:2003 a dalších externích předpisů. ÚZJ tyto požadavky převádí do srozumitelných interních dokumentů dostupných jak všem pracovníkům společnosti, tak i na vyžádání kompetentním státním orgánům i zákazníkům. ÚZJ rovněž zabezpečuje metrologii společnosti v souladu se zákonem 505/1991Sb. ve znění pozdějších předpisů. ÚZJ pravidelně provádí dle předem stanoveného plánu interní audity a podílí se na auditech dodavatelů celého koncernu Beckman Coulter, aby byly včas odhaleny jakékoliv odchylky od všech stanovených požadavků. V případě takovýchto odchylek kontroluje účinnost provedených nápravných opatření, čímž je zajištěno, že v budoucnu k podobným odchylkám již nebude docházet. Regulatory affairs se zabývá agendou spojenou s legislativními záležitostmi v oblasti zdravotnických prostředků, což jsou zejména Směrnice Rady Evropských společenství 98/79/ES a Rozhodnutí Evropské komise 2002/364/EC, které jsou transponovány do české legislativy nařízením vlády č. 453/2004 Sb. a dále zákon č. 123/2000 Sb. o zdravotnických prostředcích a zákon č. 22/1997 o technických požadavcích na výrobky ve znění pozdějších předpisů. Jedná se zejména o registrace a změny v registraci produktů a komunikaci se zákazníky a kompetentními státními orgány řady zemí, do nichž společnost

42


dodává své výrobky. Velmi důležitou aktivitou útvaru je rovněž poprodejní sledování a vigilance všech produktů společnosti Beckman Coulter na českém trhu tak, aby se předešlo nežádoucím příhodám či riziku jejich vzniku a aby byly správně řízeny případné neshodné produkty. Tato činnost vede k tomu, že na trh jsou uváděny pouze ty produkty, které splňují veškeré na ně kladené požadavky, a dále ke sledování a dohledatelnosti během jejich používání, včetně okamžitého informování zákazníků a kompetentních státních autorit o možných odchylkách od jejich daných specifikací a o řízení a nápravě těchto událostí. ÚZJ je v naší společnosti svěřena rovněž agenda bezpečnosti a ochrana zdraví při práci (BOZP), která se týká jak našich zaměstnanců, tak i uživatelů našich produktů. Jedná se o jednu z priorit společnosti Immunotech a.s. Za tímto účelem je v naší společnosti vypracována jasná koncepce BOZP a probíhají periodické kontroly jejího plnění a zlepšování. Nedílnou součástí BOZP je pro naši společnost i ochrana životního prostředí, které věnujeme nemalou pozornost a úsilí. Ekologičnost a bezpečnost naší produkce je jedním z prvořadých cílů naší společnosti. PETR ŠMÍDL E-MAIL: [email protected]

Slovenská křížovka

Česká křížovka

Křížovka o ceny Baví se na kongresu dva lékaři: „Utekla mi žena, tak si musím sám vařit. Tuhle jsem si dělal míchaná vajíčka, ovšem místo toho jsem uvařil… (Tajenka.).“

Bavia sa na kongrese dvaja lekári: „Ušla mi žena, tak si musím variť sám. Nedávno som si robil praženicu, no miesto nej som uvaril… (Tajnička.).“

Pro 3 vylosované úspěšné luštitele jsou připraveny zajímavé ceny! Tajenky zasílejte e-mailem na adresu: [email protected] do 30. 11. 2008. Do předmětu uveďte „TAJENKA“. Nezapomeňte také, prosím, uvést své konaktní údaje. TAJENKA Z MINULÉHO ČÍSLA: POUŠTĚT DO HOSPODY? Výherci: Tomáš Soukup, Ivana Skřivánková, Liliana Halásová


43

Kde se můžeme setkat (září – prosinec 2008) Konference/seminář s účastí společnosti Immunotech formou stánku 1. - 4. 9. 2008

15. - 16. 9. 2008

27. 11. 2008

60. Jubilejní sjezd Asociací českých a slovenských chemických společností Olomouc

FONS – Pardubice

XVI. Sympózium – Dyslipoproteinémia a ateroskleróza Zvolen

3. – 5. 9. 2008 XIX. Izakovičov memoriál Vysoké Tatry

5. - 9. 9. 2008 XV. Česko-Slovenský hematologický a transfuziologický sjezd spolu s IX. Česko-Slovenskou konferencí laboratorní hematologie Špindlerův Mlýn

16. 9. 2008 Celostátní pracovní konference laborantů ve FN Motol Praha

27. - 28. 11. 2008

19. - 20. 9. 2008

12. Celostátní konference DNA diagnostiky Brno

XVI. Severočeský imunologický seminář Ústí nad Labem

29. 10. - 1. 11. 2008

4. - 8. 10. 2008 Retrovirous Assembly Meeting Praha

XXV. Sjezd českých a slovenských alergologů a klinických imunologů Praha

10. - 11. 12. 2008 14. - 17. 9. 2008

29. - 31. 10. 2008

XXI. Sjezd ČSBMB České Budějovice

XIX. Biologické dny Hradec Králové

Pracovní konference Karlova Studánka

informační magazín číslo

Recommend Documents