informační magazín číslo

informační magazín číslo 9 - 2008

FINANCOVÁNÍ VÝZKUMU V ČESKU – DŮVOD K RADOSTI NEBO KE SMUTKU? PRIMÁRNÍ IMUNODEFICIENCE V ČESKÉ REPUBLICE ANALÝZA PROLIFERAČNÍHO POTENCIÁLU KMENOVÝCH BUNĚK PERIODONCIA

Financování výzkumu v Česku – důvod k radosti nebo ke smutku? O úvodník pro nové číslo našeho časopisu jsme požádali jednoho z nejvýznamnějších českých vědců – profesora Václava Hořejšího, ředitele Ústavu molekulární genetiky AVČR. Zajímal nás jeho názor na postoj naší společnosti a především naší politické reprezentace k úloze vědy a základního výzkumu a k jejich financování.

asto se setkávám s poněkud zkreslenými představami o tom, jak dobře nebo špatně u nás stát financuje vědu (resp. „výzkum a vývoj” (VaV), jak se říká oficiálně).

Takže nejprve – jak jsme na tom v relativním srovnání s EU? Průměr celkových výdajů na VaV – tedy jak ze státních, tak soukromých (firemních) zdrojů - je v EU kolem 2 % HDP, průměr státních výdajů je cca 0,7 % HDP. V ČR jsou tyto ukazatele cca 1,2 % (celkové) a 0,6 % (státní). Kromě Slovinska jsme na tom ze všech „postkomunistických” zemí v tomto ohledu nejlépe. Zajímavé je také srovnání růstu státních výdajů na VaV v nedávné minulosti: Do poloviny devadesátých let politici prosazovali názor, že stát by měl dát od vědy ruce víceméně pryč - ať ji financuje soukromá sféra, pokud ji potřebuje. Od čelného premiérova poradce R. Holmana jsem v roce 1996 slyšel tezi, že v ekonomice je racionální dělat to, v čem máme komparativní výhodu, v našem případě např. v těžbě dřeva, vápence či štěrku. Podporovat vědu a vysoké technologie, v nichž komparativní výhodu nemáme, proto není racionální rozhodnutí. Václav Klaus nám dokonce při návštěvě v krčském areálu ústavů AV v roce 1997 řekl něco v tom smyslu, že si musíme uvědomit, že vědci už nikdy nebudou mít ve společnosti takovou důležitost jako za komunistů... Byli jsme proto potěšeni, když se od roku 1998 rétorika politiků výrazně změnila a začalo se hlasitě říkat, že věda a výzkum jsou státní prioritou a je třeba je dostat na náležitou úroveň. Ještě důležitější bylo, že nezůstalo u hezkých slov, ale že začaly přicházet i peníze. Růst výdajů na vědu byl v posledních letech nejvyšší ze všech částí státního rozpočtu. Stát letos dává na výzkum nominálně skoro třiapůlkrát více než v roce 1997.

Prof. RNDr. Václav Hořejší, CSc. (nar. 1949) Vystudoval Přírodovědeckou fakultu UK, obor biochemie (1973), od roku 1977 pracuje v Ústavu molekulární genetiky AVČR, od roku 1991 jako vedoucí laboratoře molekulární imunologie, od roku 2005 jako ředitel. Působí také jako profesor imunologie na Přírodovědecké fakultě UK. Jeho oborem je molekulární imunologie, a to především základní výzkum imunoreceptorů a jejich signalizačních mechanismů. Je autorem, resp. spoluautorem přibližně 200 vědeckých publikací a je jedním z nejcitovanějších českých vědců.

2


V roce 1995 vydával stát na VaV cca 0,42 % tehdejšího mnohem nižšího HDP (kolem 7 miliard Kč), letos je to cca 23 miliard. Tento výrazný vzrůst, ke kterému došlo hlavně za posledních cca 8 let, je na řadě pracovišť výrazně patrný – poměrně dost výzkumných pracovišť na universitách a Akademii věd (AV) je celkem dobře vybaveno a platy vědeckých pracovníků jsou už celkem slušné (v průměru kolem dvojnásobku celostátního průměru, u vedoucích vědeckých pracovníků na dobrých ústavech AV a na dobrých fakultách kolem trojnásobku celostátního průměru). Je ovšem pravda, že dlouhodobě zůstává nesplněn závazek státu vydávat na VaV 0,7 % HDP – minulá vláda měla dokonce závazek (a podrobně vypracovaný plán) zvýšení těchto výdajů na 1 % HDP v roce 2010 (což je cíl pro celou EU v rámci tzv. „lisabonské strategie rozvoje”). K tomu bohužel pod novou vládou asi nedojde – plánuje se jen velmi mírný absolutní růst, který bude asi znamenat pokles v relaci k HDP (o kterém se předpokládá, že nadále celkem rychle poroste). POKRAČOVÁNÍ NA STRANĚ 4

Obsah

Časopis vydává a distribuuje IMMUNOTECH a.s., Radiová 1, 102 27 Praha 10 www.beckman.cz

Časopis připravují Mgr. Pavel Kružík Mgr. Patrik Šaf RNDr. Helena Kurzweilová, CSc. RNDr. Běla Říčařová, CSc. Ing. Petr Suchan Mgr. Markéta Krupařová Ing. Kateřina Kožaná Ing. Lukáš Palivec, PhD. Ing. Eva Králová RNDr. Jozef Smolka

Do časopisu přispěli Prof. RNDr. Václav Hořejší, CSc. – Ústav molekulární genetiky AV ČR Prof. MUDr. Jiří Litzman, CSc. – LF MU a FN u sv. Anny Prof. MUDr. Anna Šedivá, CSc. - FN Motol Doc. MUDr. Ilja Stříž, CSc. - IKEM MUDr. Tomáš Soukup - LF UK Hradec Králové Mgr. Pavel Kružík Ing. Roman Vlček Ing. Eva Králová RNDr. Štěpán Tintěra Stephen C. Ishii Ing. Petr Šmídl, CSc. Ing. Josef Kranda Ing. Jan Plicka, CSc. Ing. Mgr. Tereza Tietze Mgr. Markéta Krupařová

Financování výzkumu v Česku – důvod k radosti nebo ke smutku?

2

Obsah

3

Laboratorní vyšetření při nálezu snížené hladiny sérových imunoglobulinů

4

Primární imunodeficience v České republice

7

Existují subpopulace monocytů a makrofágů?

9

Analýza proliferačního potenciálu kmenových buněk periodoncia

11

Průtoková cytometrie

14

Laboratorní automatizace pro zkumavky i mikrotitrační destičky

16

Nový analyzátor částic a molekul velikostí nano a mikro

16

Popište svůj proces

17

Poznatky z návštěvy amerických kolegů u zákazníků firmy Beckamn Coulter v České republice 19 Voice of the Customer Visits in the CR

20

Korelace mezi komerčně dostupnými imunochemickými metodami

21

Uživatelské setkání ve Znojmě (6. – 8. dubna 2008)

23

Exportní útvar

24

Útvar výzkumu a vývoje

25

Inhibin A – CE certifikace pro screening vrozených vývojových vad

26

Solubilní transferinový receptor – nový člen rodiny Beckman Coulter

26

Křížovka o ceny

27

Kde se můžeme setkat (červen – září 2008)

28

Grafická podoba Nina Nováková

Tiskárna REPRO servis s. r. o. Starochuchelská 15/195, 159 00 Praha 5

Konference/seminář s účastí společnosti Immunotech a.s. formou stánku

Náklad čísla 1600 výtisků informační magazín číslo 9 - 2008

3

Nedostatek peněz už není naším hlavním problémem. Tím je efektivita toho, jak se tyto peníze využívají. POKRAČOVÁNÍ ZE STRANY 2

I přes zlepšené financování stále silně pokulhává náš aplikovaný výzkum (počet patentů a licencí a jejich ekonomická efektivita). Také kvalita základního výzkumu posuzovaná podle tzv. scientometrických kriterii (citační indexy) je stále poměrně slabá ve srovnání s vyspělejšími státy. Ačkoli si myslím, že naše věda (resp. VaV) by další zvýšení podpory potřebovala jako sůl (např. na výstavbu nové infrastruktury – podívejte se jen na mnohé zchátralé universitní budovy), přesto se mi zdá, že nedostatek peněz už není naším hlavním problémem. Tím je efektivita toho, jak se tyto peníze využívají. Řekl bych, že snad až 50 % se utrácí špatně, resp. nezřídka se doslova promrhá na špatné projekty a někdy i na jakousi „hru na vědu”. Vláda nyní chystá údajně velkorysou reformu výzkumu a vývoje, která by měla klást důraz na skutečné výsledky. Zdá se však, že je v ní jedno velké nebezpečí – zřejmě se soustředí hlavně na podporu aplikovaného výzkumu s krátkodobou návratností. Myslím, že je to velká chyba. Jsem přesvědčen, že stát by se měl soustředit hlavně na maximální podporu na první pohled „neužitečného“ základního výzkumu, který se týká nejčastěji nějakých nových, pokud možno co nejzáhadnějších jevů bez přímé souvislosti s nějakým praktickým problémem. Hlavním produktem takového teoretického bádání je „pouze“ publikace v odborném časopise a kritériem kvality je to, jak prestižní mezinárodní časopis takovou studii přijme k otištění a jaký pak bude mít ohlas u kolegů v oboru po celém světě. Laikovi se to může zdát marnotratné a může volat po něčem cílenějším a praktičtějším. Je tedy snad základní výzkum jakýmsi luxusem, který slouží jen k tomu, aby se uspokojily záliby podivínů sbírajících vzácné brouky, hledajících bizarní elementární částice nebo objevujících zvláštnosti genů pavouků? Nikoli! Vypadá to sice paradoxně, ale právě tento zdánlivě odtažitý základní výzkum poháněný zvídavostí a ctižádostí vědce se osvědčil jako nejplodnější přístup k odhalování fundamentálních zákonitostí v přírodě, jejichž znalost se pak zprostředkovaně bohatě vyplatí i prakticky. Mnohým ekonomům jistě kdysi připadal jako samoúčelné hraní výzkum genetiky mušek octomilek, bizarních faktorů ovládajících dělení kvasinek či paprsků ze smolince. A přece z toho nakonec vzešly věci, které naprosto změnily náš svět. Určitě tedy platí, že „nejlepší praxí je dobrá teorie“. Z opravdu kvalitního (a toto slovo je třeba třikrát podtrhnout!) základního výzkumu začnou zajímavé aplikace nakonec vypadávat jaksi samy. Náš VaV by podle mého názoru potřeboval důkladný objektivní „audit” a důkladnou reformu – zrušení všeho nekvalitního, zvýšení podpory tomu nejlepšímu a hlavně vytvoření velkorysých příležitostí pro nové výzkumné skupiny vedené mladými lidmi po návratu z úspěšných dlouhodobých pobytů v zahraničí. To by se ovšem o provedení takového náročného úkolu musel někdo „nahoře” velmi intenzivně a kvalitně postarat a příliš toho přitom nepokazit. Ale kdo by se o to měl postarat? Nemáme žádné Ministerstvo pro VaV a kdybychom je měli, obávám se, že by jeho obsazení bylo opět v první řadě otázkou nikoli odbornou, ale stranicko-koaličně-politickou. Takže snad bude nejlepší nechat to postupnému samovolnému vývoji a doufat, že bude nějak samočinně pozitivní... PROF. RNDR. VÁCLAV HOŘEJŠÍ, CSC. LABORATOŘ MOLEKULÁRNÍ IMUNOLOGIE, ÚSTAV MOLEKULÁRNÍ GENETIKY AV ČR VÍDEŇSKÁ 1083, 142 20 PRAHA 4 E-MAIL: [email protected] BĚLA ŘÍČAŘOVÁ E-MAIL: [email protected]

4


Laboratorní vyšetření při nálezu snížené hladiny sérových imunoglobulinů oruchy tvorby imunoglobulinů jsou nejčastější primární imunodeficity v běžné populaci, proto se s nimi setkáváme často jak v klinické, tak laboratornědiagnostické praxi. Kromě primárních humorálních imunodeficitů se setkáváme i se sekundárními hypogamaglobulinémiemi doprovázejícími různá onemocnění nebo jejich léčbu. Poruchy tvorby protilátek se vyskytují jak samostatně, tak v kombinaci s dalšími poruchami imunitního systému. Základní typy onemocnění asociovaných se sníženou produkcí imunoglobulinů Ze skupiny „čistých“ primárních protilátkových imunodeficitů je nejčastější a prakticky nejdůležitější běžný variabilní imunodeficit - CVID (z anglického common variable immunodeficiency). Jedná se o primární hypogamaglobulinémii neznámé etiologie s klinickou manifestací v jakémkoliv věku nemocného. Projevuje se opakovanými a především komplikovanými infekcemi dýchacích cest, kromě toho se mohou objevovat chronické průjmy infekční i neinfekční etiologie nebo různé autoimunitní choroby. Laboratorně nacházíme výrazný pokles hladin IgG a IgA, zatímco hladiny IgM mohou být normální nebo snížené. Pro stanovení diagnózy se nyní považuje za nejdůležitější průkaz porušené specifické protilátkové odpovědi. B-lymfocyty bývají u asi 90 % pacientů přítomny, i když je možno prokázat různé abnormality v zastoupení jednotlivých vývojových subpopulací. Druhým nejčastějším onemocněním doprovázeným výrazným poklesem hladiny sérových protilátek je X- vázaná (Brutonova) agamaglobulinémie. Ta postihuje pouze chlapce, k manifestaci dochází po vymizení transplacentárně přenesených IgG, tj. mezi 6. - 24. měsícem věku, zřídka i později. V klinickém obrazu dominují opakované a komplikované respirační infekce. Laboratorně nacházíme výrazný pokles všech základních tříd imunoglobulinů (IgG, IgA i IgM), při vyšetření lymfocytárních subpopulací nenacházíme v periferní krvi žádné Blymfocyty. Kromě X-vázané agamaglobulinémie,

která je způsobena deficitem enzymu Brutonovy tyrozinkinázy, existuje řada dalších vrozených agamaglobulinémií s obdobným laboratorním i klinickým obrazem (ale postihující obě pohlaví) způsobených jinými poruchami ve vývoji B-lymfocytů. Jedná se o řídce se vyskytující onemocnění, nejčastěji se jedná o deficity různých složek pre-B receptoru (řetězec μ, λ5, Igβ, Igα). Další skupinu primárních poruch tvorby protilátek tvoří selektivní deficity jednotlivých tříd imunoglobulinů (především velmi častý selektivní deficit IgA) nebo podříd IgG (klinicky je nejvýznamnější deficit IgG2). Tzv. přechodná hypogamaglobulinémie kojenců je způsobena pozdním nástupem vlastní tvorby imunoglobulinů kojencem po vymizení transplacentárně přeneseného IgG, laboratorně nacházíme nízké hladiny IgG a IgA, někdy i IgM. V periferní krvi jsou přítomny normální počty B-lymfocytů, stav se postupně, během měsíců nebo i let, upravuje. Jak již bylo výše uvedeno, primární poruchy tvorby protilátek nacházíme u mnoha dalších komplexních forem primárních imunodeficitů. Vzhledem k nutnosti rychlé léčby je nejvýznamnější z nich tzv. těžký kombinovaný imunodeficit (SCID). Jedná se o skupinu onemocnění, která se projevuje časně, ve věku několika měsíců. Manifestací jsou těžké infekce, zejména respiračního, gastrointestinálního nebo kožního systému. Porušena je především funkce a počet T-lymfocytů. Diagnosticky je nejpřínosnější vyšetření periferní krve průtokovou cytometrií, kdy nacházíme nízké počty T-lymfocytárních subpopulací. Ve skupině onemocnění označovaných jako hyper-IgM syndromy nacházíme u pacientů nízké hladiny IgG a IgA, zatímco hladina IgM je normální nebo často i zvýšená. Exaktní diagnostika je založena na průkazu mutovaného genu, což je u nejčastější (X-vázané) formy ligand CD40 molekuly (CD40L, CD154), nebo aktivací – indukovaná cytidindeamináza (AID) u recesivně vázané formy. Variabilní snížení hladiny imunoglobulinů nacházíme i u nemocných s X-vázaným lymfoproliferativním syndromem (Duncanův syndrom), Wiskottovým-Aldrichovým syndromem, Nijmegen breakage syndromem (syndrom Seemanové) a u mnoha dalších primárních imunodeficitů. Snížení hladiny imunoglobulinů různého stupně můžeme nalézt jako sekundární hypogamaglobulinémie při řadě onemocnění nebo jako důsledek léčby. Snížení je obvykle mírnější než u primárních imunodeficitů, přesto může někdy vyvolávat klinické obtíže. Ze sekundárních hypogamaglobulinémií doprovázejících různá onemocnění se setkáváme s poklesem hladin imunoglobulinů zejména při B-lymfomech a při chronické lymfatické leukémii, kdy je příčinou hypogamaglobulinémie porucha tvorby protilátek. Různý stupeň poruchy tvorby imunoglobulinů (ve třídách odlišných od isotypu myelomového imunoglobulinu) nacházíme i u nemocných

s myelomem. S poklesem způsobeným ztrátou imunoglobulinů se setkáváme u nefrotického syndromu (pokles především IgG), případně při exsudativních enteropatiích (jedná se obvykle o pokles všech tří tříd imunoglobulinů). Z léků vyvolává různé stupně poklesu imunoglobulinů zejména dlouhodobá steroidní léčba, podávání sulfasalazinu, solí zlata či některých antiepileptik. Doplňková laboratorní vyšetření při nálezu snížené hladiny imunoglobulinů Pokud prokážeme sníženou hladinu imunoglobulinů, je na prvním místě vždy třeba vyloučit sekundární hypogamaglobulinémie – laboratorně se zejména jedná o průkaz možné proteinurie nebo lymfatické malignity. Mezi důležitá doplňková vyšetření při nálezu hypogamaglobulinémie, zejména při případném rozhodování o nasazení imunoglobulinové léčby, patří stanovení hladiny specifických antibakteriálních protilátek. V našich podmínkách nejčastěji vyšetřujeme protilátky proti pneumokokovému pouzdernému polysacharidu (jako indikátoru odezvy po stimulaci polysacharidovým antigenem) a protilátek proti tetanickému toxoidu (jako ukazateli tvorby protilátek proti bílkovinnému antigenu). Pokud nalezneme nízké hladiny těchto specifických protilátek (ale ne nutně hladiny mimo „referenční meze“!) je možno pacienta přeočkovat 23-valentní pneumokovou vakcínou (Pneumo 23) nebo tetanickým anatoxinem a sledovat vzestup hladiny specifických protilátek. Je možno též vyšetřovat jiné specifické protilátky, například proti pouzdernému polysacharidu Haemophilus influenzae B (HIB), proti difterickému toxinu, případně anamnestické antivirové protilátky. Vyšetření lymfocytárních subpopulací má velký význam při stanovení diagnózy řady primárních imunodeficitů. Nález výrazného poklesu T-lymfocytárních subpopulací u kojenců vždy vzbuzuje podezření především na těžký kombinovaný imunodeficit (SCID). Nepřítomnost B-lymfocytů ve spojení s výraznou hypogamaglobulinémií nejčastěji nacházíme u chlapců s X-vázanou agamaglobulinémií nebo u tzv. Goodova syndromu (hypogamaglobulinémie s tymomem). Naproti tomu pacienti s CVID mívají obvykle B-lymfocyty přítomny, i když asi u 10 % takto postižených nemocných bývá počet B-lymfocytů velmi nízký. Důležité je vyšetření počtu B-lymfocytů v kojeneckém a batolecím věku, neboť toto vyšetření umožňuje odlišit vrozenou (nejčastěji X-vázanou) agamaglobulinémii od přechodné hypogamaglobulinémie kojenců. Pro stanovení diagnózy různých forem primárních hypogamaglobulinémií se stále více využívá možností molekulární genetiky a průkazu mutace genů způsobujících uvedená onemocnění. V naší republice jsou pro diagnostiku primárních humorálních imunodefcitů dostupná vyšetření mutací genů kódujících Brutonovu tyrozinkinázu (následkem mutace je X-vázaná agamaglobulinémie) a CD40L (jejíž mutace způsobující X-vázaný hyper IgM syndrom). Z dalších chorob asociovaných s poruchou tvorby protilátek je prováděna analýza genů pro gama řetězec cytokinových receptorů (X-vázaný SCID), SH2D1A (X-vázaný lymfoproliferativní syndrom = Duncanův syndrom) WASP (Wiskottův-Aldrichův syndrom), NBS1 (Nijmegen breakge syndrome = syndrom Seemanové). Diagnostický algoritmus při nálezu hypogamaglobulinémie je poměrně složitý, vychází nejen z laboratorních nálezů, ale zejména z klinické manifestace pacienta. Velmi zhruba by měl zahrnovat: 1. Vyloučení sekundarity, tzn. vyloučení možnosti, že příčinou je lymfatická malignita, ztráty močí či stolicí nebo porucha tvorby jako sekundární následek léčby.

Vyšetření lymfocytárních subpopulací má velký význam při stanovení diagnózy řady primárních imunodeficitů. informační magazín číslo 9 - 2008

5

2. Je třeba zhodnotit které třídy jsou sníženy: a. Izolovaný pokles hladiny IgA je obvykle možno vysvětlit vrozeným imunodeficitem – selektivním deficitem IgA, ten bývá ve většině případů klinicky němý. U nemocných s výraznými imunodeficitními příznaky (časté a hlavně závažné respirační infekce) je možno doplnit vyšetření hladin podtříd IgG, specifických antibakteriálních protilátek a případně odezvu po specifické antigenní stimulaci vakcínami. U osob s velmi nízkými hladinami IgA (podle našich zkušeností pod 0,07 g/l) je vhodné vyšetřit přítomnost anti-IgA protilátek. Selektivní deficit IgA bývá též asociován s přítomností celiakie a dalších autoimunitních chorob, proto je vhodné provést i screening na nejčastější autoprotilátky. Je samozřejmé, že u těchto pacientů jsou pro diagnostiku celiakie bezcenné testy založené na detekci IgA proti cílovým antigenům (nyní nejčastěji proti tkáňové transglutamináze nebo endomysiu hladkého svalstva). b. Selektivní deficity IgM jsou poměrně řídké, většinou též doplňujeme vyšetření hladiny specifických antibakteriálních protilátek. Pacienti ale obvykle imunodeficitními příznaky netrpí, spíše se setkáváme s přítomností autoimunitních fenoménů. c. Při snížení hladiny IgG nebo kombinovaných poklesech hladin více tříd imunoglobulinů je vhodné doplnit vyšetření hladiny specifických antibakteriálních protilátek, případně doplnit vyšetření odpovědi po specifickém antigenním stimulu po provedeném očkování. Menší výpovědní hodnotu má vyšetření podtříd IgG, neboť samostatný deficit některé třídy IgG bez poruchy tvorby specifických protilátek sám o sobě obvykle nevede k příznakům imunodeficitu. Pokud se setkáváme se symptomatickými deficity, pak se jedná zejména o deficit IgG2, který bývá asociován s poruchou tvorby anti-polysacharidových protilátek. d. Snížení hladin IgE nebo IgD nevede k protilátkovému imunodeficitu, naopak zvýšené hladiny IgE doprovází např. Wiskottův-Aldrichův syndrom. Podobně i nekonstantní zvýšení hladiny IgD bylo popsáno u některých primárních nebo sekundárních imunodeficitů. 3. Vyšetření lymfocytárních subpopulací umožní další směřování diagnózy. Důležitý je průkaz přítomnosti nebo nepřítomnosti B-lymfocytů (vrozené agamaglobulinémie, Goodův sydrom) a průkaz případných T-lymfocytárních abnormalit (kombinované T+B imunodeficity). Průtoková cytometrie je též důležitým pomocníkem v diagnostice lymfatických malignit, zejména chronické lymfatické leukémie, která může být často hypogamaglobulinémií doprovázena. 4. Na základě zhodnocení klinického stavu a výše uvedených laboratorních vyšetření je možno indikovat genetickou analýzu. Snížení hladiny imunoglobulinů třídy IgG (obvykle v kombinaci s poklesem hladiny dalších imunoglobulinových tříd) je indikací k zahájení substituční imunoglobulinové léčby. Při rozhodování o tom, zdali zahájíme tuto finančně velmi náročnou a pro pacienta zatěžující léčbu, je třeba brát v úvahu několik faktorů. Významný je především zdravotní stav pacienta, je vždy velmi diskutabilní zahajovat substituční léčbu u nemocného,

Nejdůležitějším stupněm diagnostiky protilátkových deficiencí je včasné vyhledání nemocných, u nichž je tvorba imunoglobulinů porušena.

6


Prof. MUDr. Jiří Litzman, CSc. (nar. 1958) je přednostou Ústavu klinické imunologie a alergologie Lékařské fakulty Masarykovy univerzity a Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně. Výzkumně se zabývá především diagnostikou a léčbou pacientů s primárními imunodeficity. Ústav klinické imunologie a alergologie v Brně soustřeďuje specializovanou péči o nemocné s imunopatologickými stavy v jihomoravském regionu, dispenzarizuje též řadu nemocných s primárními imunodeficity z dalších moravských krajů. Zajišťuje specializovanou laboratorní diagnostiku alergických, imunodeficitních a autoimunitních chorob, stejně jako imunologické sledování pacientů po transplantacích a v kritickém stavu. Zajišťuje výuku imunologie na Lékařské fakultě Masarykovy univerzity.

u něhož nejsou přítomny příznaky protilátkového imunodeficitu (což jsou především komplikované a opakované respirační infekce). Dalším ukazatelem je hladina sérového IgG. Obvykle se doporučuje zvažovat imunoglobulinovou léčbu u nemocných, u nichž je hladina IgG nižší než 5 g/l (platí pro dospělou populaci). Za téměř absolutní indikaci lze považovat pokles hladiny IgG pod 2 g/l. Třetím faktorem je odpověď po specifickém antigenním stimulu, porucha této odpovědi podporuje rozhodnutí nasadit imunoglobulinovou léčbu. Imunoglobulinovou léčbu nasazujeme vždy u nemocných s prokázanými imunodeficity typu X-vázané agamaglobulinémie, SCID, hyper-IgM syndromů, WiskottovaAldrichova syndromu. Je zřejmé, že diagnostika protilátkových deficiencí by měla mít 2 stupně. Prvním a nejdůležitějším je včasné vyhledání nemocných, u nichž je tvorba imunoglobulinů porušena. Tento úkol by měly splňovat všechny laboratoře s imunologickým zaměřením. Druhý stupeň – bližší určení defektu a rozhodnutí o imunoglobulinové léčbě by měl již náležet do kompetence specializovaného pracoviště, v němž jsou dostupné (přímo nebo nepřímo) výše uvedené specializované testy a jehož pracovníci mají dostatečnou zkušenost v interpretaci těchto testů. PROF. MUDR. JIŘÍ LITZMAN, CSC. ÚSTAV KLINICKÉ IMUNOLOGIE A ALERGOLOGIE, LF MU A FN U SV. ANNY PEKAŘSKÁ 53, 656 91 BRNO E-MAIL: [email protected]

Primární imunodeficience v České republice terapie na přelomu tisíciletí. Pokrok na tomto poli je dobře demonstrován v úvodu k zatím nejlepší monografii na dané téma, v knize Primární imunodeficity, molekulární a genetický přístup, která byla poprvé vydána v roce 1998 a podruhé v roce 2007. V tomto krátkém období se rozsah knihy významně zvětšil, místo původně popisovaných 70 nosologických jednotek je v nové knize popsáno 120 základních nemocí, a ironií osudu nestihly zařazení do knihy největší objevy roku 2007, týkající se dlouho hledané molekulární podstaty hyper IgE syndromu. Kromě zvětšujícího se rozsahu oboru dochází také ke změně jeho struktury a základního dělení primárních imunodeficiencí.

2. Primární imunodeficience – rozdělení na kategorie, historický pohled a nové pojetí

1. Primární imunodeficience – definice a vymezení problematiky Primární imunodeficience jsou onemocnění charakterizovaná kvantitativními nebo kvalitativními deficity buněk nebo dalších komponent imunitního systému. Jsou to nemoci jasně definované, vrozené, z nichž většina již má prokázán genetický podklad, a dá se předpokládat, že u ostatních jednotek dosud geneticky nevysvětlených bude genetická příčina v budoucnu objasněna. Problematika primárních imunodeficiencí je výjimečnou oblastí na poli medicíny, do které se promítá jeden z nejvýznamněji vyjádřených směrů rozvoje moderní lékařské vědy. Celá oblast má relativně jasný začátek, který se shoduje s popisem první jasně definované primární imunodeficience, kterou je Brutonova agamaglobulinémie. Tato nemoc byla popsána v roce 1952, který je v určitých souvislostech považován za vznik oboru klinická imunologie a za počátek éry primárních imunodeficiencí. Je nyní až zvláštní, že v té době nebyly ještě známy lymfocytární populace včetně B lymfocytů, málo bylo známo i o sekreci protilátek a onemocnění tak jasně definované nemohlo být v té relativně nedávné době detailně pochopeno. Za uplynulé období něco málo přes padesát let došlo k nebývalému a stále eskalujícímu pokroku na daném poli. Primární imunodeficience se staly vědeckým oborem, kterému se věnuje řada vynikajících specialistů. Studium těchto nemocí vedlo k řadě objevů a k pochopení funkce imunitního systému. Primární imunodeficience byly též základem převratných léčebných možností, jako je transplantace kostní dřeně, která byla poprvé provedena v roce 1968 právě pro primární imunodeficienci, stejně tak byly první indikací k aplikaci genové

Ze základní definice vyplývá, že se jedná o poruchy složek imunitního systému. V klasické formě jsou primární imunodeficience rozdělovány na poruchy T lymfocytů, B lymfocytů a protilátek, poruchy kombinované, deficience fagocytózy a deficience komplementu. Toto klasické dělení stále platí, nicméně zvláště v posledních letech se začínají objevovat zcela nové formy imunodeficiencí, které nelze lehce a jednoznačně zařadit do daného schématu. Klasické, výše popsané skupiny imunodeficiencí většinou obecně postihují imunitní systém a způsobují větší náchylnost k infekcím, která se s určitými charakteristickými rysy týká širokého spektra infekcí. Nově se však objevují onemocnění, která jsou projevy specifické poruchy imunitní odpovědi na vybrané, specifické patogeny. Takové poruchy byly popsány u mykobakterií, u pneumokokových infekcí a u některých forem infekce herpes simplex. Dá se očekávat, že takové specifické „díry“ v imunitní odpovědi budou objeveny i u dalších patogenů. Kromě nově se objevujících nemocí se zpřesňuje výzkum i u klasických, již popsaných imunodeficiencí. Nalézají se nové aspekty těchto nemocí, nové geny, které způsobují již popsané nemoci, které jsou fenotypicky shodné s nemocí způsobenou původně objeveným genem, nebo naopak nové mutace u genů již známých, které vedou k odlišnému fenotypu onemocnění. Pole primárních imunodeficiencí je tedy v dynamickém pohybu. Dosáhlo nyní takové šíře, že přitáhlo řadu odborníků a vedlo k vytvoření specifické disciplíny. Protože se jedná o vzácná onemocnění, tito odborníci brzy zjistili, že dosáhnout pokroku mohou pouze v případě, že budou úzce spolupracovat, a to hned na mezinárodní úrovni. Jen tak se dá dosáhnout dostatečného počtu pacientů a získat základ pro výzkum v dané oblasti. Organizace péče o pacienty s primárními imunodeficiencemi je tedy globální otázkou, která od počátku přesahuje národní hranice. Struktura organizace výzkumu a klinických aspektů je popsána v následujících odstavcích.

3. Organizace péče o pacienty s primárními imunodeficiencemi Pacienti s primárními imunodeficiencí potřebují komplexní péči, kde je zcela nezbytná účast specialisty, imunologa zaměřeného na danou problematiku. Vzhledem k vzácnému výskytu těchto chorob jsou takoví specialisté soustředěni do větších center, kde potom probíhá komplexní diagnostický a léčebný proces. 3.1. Diagnostika Diagnóza pacienta s primární imunodeficiencí je v některých případech velmi přímočará, ale v některých případech velmi složitá. V každém případě začíná v oblasti pediatrie buď hned v porodnici, nebo při následné pediatrické péči. K racionalizaci tohoto někdy opravdu náročného procesu jsou v současné době vytvořeny velmi účinné pomůcky, z nichž nejvíce používaná jsou diagnostická kritéria primárních


7

imunodeficiencí . Tato kritéria byla vytvořena a jsou používána mezinárodními společnostmi pro imunodeficity, v rámci Evropy hlavně ESID – European Society for Immunodeficiencies. Kritéria mají jednotnou strukturu a podle klinických a laboratorních příznaků umožní rozlišit stavy, kdy je daná diagnóza možná, pravděpodobná nebo jistá. Již při možnosti primární imunodeficience je zvláště v podmínkách České republiky velmi žádoucí vyžádat si vyšetření ve specializovaných ambulancích. V České republice jsou největšími centry fakultní nemocnice v Praze a v Brně. V Praze je centrum ve Fakultní nemocnic v Motole, kde je poskytována péče nejtěžším formám primárních imunodeficiencí díky možnosti transplantace kostní dřeně, která je metodou volby u nejtěžších, se životem neslučitelných imunodeficiencí. Ve Fakultní nemocnici U svaté Anny v Brně má imunologie dlouhou tradici a kromě diskutované diagnostiky a léčby těchto stavů je toto centrum zodpovědné za registr primárních imunodeficiencí. Je jediným pracovištěm v České republice, které poskytuje diagnostiku na molekulárně genetické úrovni v oblasti primárních imunodeficiencí. 3.2. Léčba Léčba primárních imunodeficiencí je velmi komplexní a zasahuje celou škálu léčebných prostředků od stavů, kdy nejsou užívány žádné léky a pacient je pouze sledován, až po nejtěžší případy transplantace kostní dřeně a genovou terapii. Na rozdíl od diagnostických kritérií, která jsou k dispozici pro většinu známých primárních imunodeficiencí, léčebné standardy jsou daleko těžším problémem a nejsou zatím pro všechna onemocnění vytvořena. Základní postupy jsou však známy a v každém případě je vhodné konsultovat odborné pracoviště (viz. odkazy). 3.3.Výhledy do budoucna V České republice je péče o pacienty s primárními imunodeficiencemi na vysoké úrovni. Republika je schopna poskytnout diagnostickou i léčenou péči na vysokém evropském standardu, hlavně díky zmíněným hlavním centrům. Primární imunodeficience jsou jasným příkladem toho, jak kvalita zdravotní péče může ovlivnit život pacientů. Kvalita života, ale i vyhlídky na délku života, přímo souvisí s možnostmi zdravotní péče. V současné chvíli i na poli primárních imunodeficiencí pociťujeme stále více rozpor mezi možnostmi medicíny a možnostmi společnosti hradit tuto péči. Nicméně stále se pohybujeme na špičkové úrovni. Ze škály možností, které jsou k dispozici pro tyto pacienty, pokrývá Česká republika všechny kromě genové terapie. Ta je možná pouze u vybraných nosologických jednotek, v Evropě je rozvíjena ve 4 zemích – Francii, Velké Británii, Itálii a Švýcarsku – a i tam je považována stále ještě za léčbu experimentální a založenou na výzkumu. Do budoucna se dá očekávat posílení současných trendů, udržení standardů péče při prosperující ekonomice země.

4. ESID a PAGID ESID a PAGID jsou mezinárodní společnosti evropské a americké, které jsou zastřešujícími orgány v oblasti primárních imunodeficiencí. Nás se týká hlavně ESID, evropská společnost pro imunodeficience, zmiňovaná již několikrát v předcházejícím textu. ESID byl původně založen jako zájmová skupina lékaři a dalšími odborníky, kteří se věnovali primárním imunodeficiencím. Právě tento fakt podmiňuje jeho skvělou funkčnost, neboť od počátku je organizován tak, aby byl pro své členy a pro celou oblast primárních imunodeficiencí užitečný. Nejlepší orientace v ESID je možná na webových stránkách www.esid.org. ESID poskytuje široké zázemí pro lékaře, další odborníky, pro střední zdravotní personál a pro pacienty. V současné chvíli má pevnou strukturu společnosti, pořádá výroční kongresy a rozvíjí řadu aktivit. Velmi významná je soustavná péče o vzdělání, a to jak specializované, tak vzdělávání široké veřejnosti. ESID organizuje velmi populární letní školy, které jsou skvělou příležitostí k prohloubení znalostí v oboru, ale i k získání evropských i světových kontaktů. Je naší chloubou, že jsme v České republice již v roce 2002 zahájili sérii jarních zasedání, nazývaných ESID Prague Spring Meeting, který se stal ESID podpořenou oficiální platformou pro ESID juniors a slouží zároveň jako bod střetu mezi východem a západem Evropy v oblasti primárních imunodeficiencí. ESID i PAGID vydávají také své publikace. I v České republice jsou k dispozici

8


například brožury pro pacienty vysvětlující celou složitou problematiku primárních imunodeficiencí (viz. kontakty – FN Motol).

5. Stav v České republice Stav péče o primární imunodeficience v České republice je již několikrát zmíněn v odpovídajících odstavcích. Celkově lze říci, že péče o pacienty s primárními imunodeficiencemi má v České republice dlouhou tradici. Pozoruhodnou událostí je i případ obdobný „bubble boy“, kdy tým pod vedením doc. Kasala v Praze již v sedmdesátých letech minulého století zorganizoval porod dítěte pro suspektní případ imunodeficience do speciálního bezmikrobního zařízení, což je dosud obdivuhodný výkon. Historie oboru se od té doby rozvinula a nyní funguje v České republice několik center, kde je poskytována komplexní péče o pacienty s primárními imunodeficiencity. Kromě velkých center v hlavních městech regionů Prahy a Brna jsou významná centra i v Hradci Králové, v Plzni a v Olomouci. Nicméně odborníci schopní zabezpečit péči o pacienty jsou v celé republice. Zvláště je třeba zmínit úlohu pediatrů, neboť osud pacientů jednoznačně závisí na včasnosti diagnózy. Tento parametr se neustále zlepšuje a povědomost pediatrické obce o dané problematice vzrůstá. V současné chvíli nelze přesně říci, kolik pacientů s primárními imunodeficencemi je v České republice. Pacienti jsou registrováni, nicméně nyní je určité přechodné období, kdy celá Evropa přechází z původního registru na novou formu. Nový registr odráží pokrok doby. Oproti původnímu registru, který pouze udával počet pacientů s primárními imunodeficity, je nová databáze funkční a flexibilní platformou, kde se shromažďují komplexní data o pacientovi a jeho onemocnění v celém jeho průběhu. Registr je cenným zdrojem informací o výskytu, diagnostice, léčbě a průběhu těchto vzácných chorob. Registr má také všechny znaky moderní databáze a je plně v souladu s evropskými právními normami. Přechod na takovou databázi je složitý a trvá určitou dobu, což se odráží v ne zcela přesných číslech, která jsou k dispozici v současné chvíli v přechodném období. V původním registru měla Česká republika okolo 600 pacientů s primárními imunodeficity, nyní je toto číslo jistě výrazně vyšší. Počet se zvyšuje taktéž tím, jak se objevují podstaty různých onemocnění, a tak mezi primární imunodeficience spadají i nová, původně neznámá onemocnění nebo onemocnění, u nichž nebyl charakter primární deficience patrný. Jedná se hlavně o poruchy vrozené imunity, například ty, které spadají do chronických zánětlivých stavů, jako jsou periodické horečky a další onemocnění z této skupiny, ale i některé formy autoimunitních onemocnění, jako jsou například autoimunitní polyglandulární syndromy nebo některé formy lymfoproliferativních onemocnění, kde se jedná o primární poruchu regulace imunitního systému na geneticky podmíněném podkladě, což tyto nemoci řadí do definice primárních imunodeficiencí.

6. Užitečné kontakty, odkazy a materiály Centra poskytující komplexní péči o pacienty s primárními imunodeficity jsou soustředěna hlavně ve Fakultních nemocnicích: Praha - FN Motol, VFN, IKEM, FNKV Brno – FN U svaté Anny Hradec Králové Olomouc Plzeň Z dalších center České Budějovice, Liberec, Ostrava, Ústí nad Labem Odkazy na internet: www.esid.org, www.csaki.cz Knihy: Primary Immunodeficiency diseases, a molecular and genetic approach. Second Edition. Ed. H.Ochs,C.I.Smith, J.Puck, Oxford 2007. Imunodeficience. J.Bartůňková, A.Janda, A Šedivá, Grada 2007. Přehledná sdělení: Pan-Hammarström Q, Hammarström L. Antibody deficiency diseases.Eur J Immunol. 2008 Feb;38(2):32733. Fischer A.Human primary immunodeficiency diseases. Immunity. 2007 Dec;27(6):835-45. Maródi L, Notarangelo LD.Immunological and genetic bases of new primary immunodeficiencies. Nat Rev Immunol. 2007 Nov;7(11):851-61. Bustamante J, Boisson-Dupuis S, Jouanguy E, Picard C, Puel A, Abel L, Casanova JL. Novel primary immunodeficiencies revealed by the investigation of paediatric infectious diseases. Curr Opin Immunol. 2008 Feb;20(1):39-48

7. Závěr Primární imunodeficience jsou fascinujícím oborem, který odráží neuvěřitelný pokrok ve znalostech rozvíjejících se hlavně v posledních letech. Tento pokrok se pomalu odráží také v péči o pacienty s těmito poruchami imunitního systému. Péče je komplexní a má jasný nadnárodní charakter. Současný článek se dotýká organizace péče a stavu oboru v České republice, nepokrývá však samu odbornou podstatu této problematiky. Přiložené odkazy, zvláště literární, obsahují většinu informací, které jsou potřeba na poli primárních imunodeficiencí. Osobní kontakty s kolegy a s odborníky v oboru potom zajistí praktickou stránku problematiky. Jedná se o opravdu výjimečné odvětví a lze jenom doufat, že přitáhne mladé vědce a výzkumné pracovníky tak, aby i nadále v České republice byla tato problematika pokryta na evropské a světové úrovni. PROF. MUDR. ANNA ŠEDIVÁ, CSC. ÚSTAV KLINICKÉ IMUNOLOGIE, FN MOTOL, V ÚVALU 84, 150 06 PRAHA 5 E-MAIL: [email protected]

Existují subpopulace monocytů a makrofágů? ononukleární fagocyty představují nejen výkonné efektorové buňky spadající do mechanismů přirozené imunity, ale v případě dendritických buněk rozhodují i o zahájení tzv. adaptivní imunitní odpovědi. V tradičním pojetí se předpokládá, že periferní monocyty pocházející z CD34+ myeloidních progenitorových kmenových buněk vcestují během svého vývoje (nebo ve zvýšené míře při zánětu) do tkání a tam z nich postupně dozrávají buď makrofágy nebo také dendritické buňky. Není sporu o tom, že právě tkáňové makrofágy nemusí být zcela homogenní populací buněk a je zde možné vymezit určité subpopulace lišící se jak fenotypem, tak i funkcí (Gordon and Taylor, 2005). V případě makrofágů je zřejmě rozhodujícím faktorem stupeň maturace a např. u lidských alveolárních makrofágů můžeme v bronchoalveolární laváži současně detekovat jak buňky odpovídající morfologicky zralým tkáňovým makrofágům, tak i monocytům podobné buňky (Striz et al., 1993). Nezralé makrofágy mají stejně jako monocyty vysokou membránovou expresi heterodimerního proteinu S100A8/S100A9 (27E10, MRP8/14, kalprotektin) a rovněž exprese antigenu CD14 je zde vyšší než u zralých makrofágů. Na druhé straně zralé tkáňové makrofágy se vyznačují vysokou expresí antigenu 25F9 a CD68 a HLA-DR (Striz et al., 2001a). Kromě fenotypových změn dochází při přeměně monocytu v makrofág také k úpravě cytokinového a chemokinového profilu, indukci či potlačení tvorby četných enzymů, k regulaci genů spojených s buněčným cyklem a procesem apoptózy. Při studiu diferenciace lidského monocytu v makrofág in vitro byla pomocí analýzy transkripčního profilu prokázána modulace více než osmi set genů (Li et al., 2007). Kromě diferenciace jsou vlastnosti makrofágů ovlivňovány i vlivem mikroprostředí, ať již se jedná o přímé interakce kontaktem s ostatními buňkami (Striz et al., 2001b) nebo o solubilní signály, zejména pak cytokiny uvolňované při imunitních či imunopatologických reakcích. I vlivem cytokinů zřejmě může docházet k polarizaci vývoje makrofágu a v literatuře se dokonce někdy uvádějí jejich subpopulace M1 a M2 odrážející tradiční Th1/Th2 terminologii. Subpopulace M1 odpovídá „klasickému“ aktivovanému makrofágu po stimulaci pomocí IFN gama a vyznačuje se vysokou tvorbou prozánětlivých cytokinů (TNF alfa, IL-1 beta, IL-6) a dále také IL-12 a IL-23. Tyto buňky uvolňují řadu efektorových molekul a uplatní se zvláště u polarizovaných Th1 odpovědí. Oproti tomu subpopulace M2 makrofágů, indukovaná pomocí IL-4 nebo IL-13, se vyznačuje vysokou tvorbou IL-10 a variabilní produkcí prozánětlivých cytokinů a předpokládá se její význam při polarizovaných Th2 odpovědích včetně obrany proti parazitům (Mantovani et al., 2007). Studie posledních let naznačují, že ani prekurzory mikrofágů – periferní monocyty nemusí být jednolitou buněčnou populací. Pro periferní monocyty se zdá být důležité členění dle míry exprese antigenů CD14 (receptor pro LPS) a CD16 (Fc RIII). Zatímco „klasické“ monocyty se silnou membránovou expresí CD14 nevykazují na svém povrchu antigen CD16, existuje také subpopulace monocytů s nižší expresí CD14 a prokazatelným výskytem CD16 (Ziegler-Heitbrock et al., 1991). Tyto dvě subpopulace, CD14+CD16- (většina monocytů) a CD14+CD16+ (cca 15% monocytů) se liší i v dalších membránových znacích. U buněk CD14+CD16+ se setkáme s vyšší expresí HLADR a CD43 (ligand pro E-selektin), pro CD14+CD16- subpopulaci je naopak charakteristická exprese CD62L (L-selektin) a CD163 („scavenger“ receptor) (Komohara et al., 2006). Odlišnosti lze nalézt i v expresi receptorů pro chemokiny (Weber et al., 2000). Zatímco „tradiční“ CD14+CD16- monocyty exprimují zejména CCR2 receptor sloužící pro pro vazbu CCL2/MCP-1, pro subpopulaci CD14+CD16+ je charakteristická spíše exprese CCR5 (receptor pro CCL3/MIP-1alfa a CCL5/RANTES) a CX3CR1 (receptor pro CX3CL1/fraktalkin). Rozdílné jsou i některé funkční vlastnosti. I při srovnatelných hladinách mRNA pro TNF má subpopulace CD14+CD16+ vyšší intracelulární koncentrace tohoto prozánětlivého cytokinu (Belge et al., 2002) a navíc chybějící tvorbu proti-


9

Fenotypové rozdíly mezi subpopulacemi monocytů (CD14+CD16- a CD14+CD16+) CD14+CD16-

CD14+CD16+

HLA-DR

+

++

CD62L

++

-

CD43

++

+++

CD163

++

-

CX3CR1

+

+++

CCR2

++

-

CCR5

+

++

Diferenciace a exprese chemokinových receptorů u monocytárních subpopulací (CD14+CD16- a CD14+CD16+) CD14+CD16CCR2 CX3CR1 CCR5

CD14+CD34+

CD14+CD34-

CX3CR1 CCR5 CD14+CD16+

zánětlivého IL-10. Tyto monocyty mají také vyšší tvorbu IL-12 a oxidu dusnatého. Vysoká exprese HLA-DR u CD14+CD16+ monocytů se odráží i v lepší schopnosti předkládat antigen (Randolph et al., 2008) v případě smíšených lymfocytárních kultur či odpovědi proti CMV. S ohledem na tyto vlastnosti lze považovat subpopulaci CD14+CD16+ za prozánětlivé monocyty. Tomu také odpovídá výrazně zvýšené zastoupení těchto monocytů u pacientů s bakteriální sepsí, tuberkulózou nebo u HIV infekce (Ziegler-Heitbrock, 2007). Ke vzestupu CD14+CD16+ monocytů v periferní krvi však může dojít i při neinfekční etiologii, v případě Crohnovy choroby (Grip et al., 2007), revmatoidní artritidy (Kawanaka et al., 2002), astmatu, sarkoidózy (Okamoto et al., 2003) nebo po transplantaci ledviny (Ulrich et al., 2008). V posledních letech je intenzivně studován také vztah zvýšeného zastoupení CD14+CD16+ monocytů v krvi ve vztahu k ateroskleróze a postižení koronárních tepen (Waldo et al., 2008). I když byla subpopulace CD14+CD16+ monocytů poprvé popsána téměř před dvaceti lety (Passlick et al., 1989), teprve nyní začíná být systematicky studována fyziologická úloha těchto buněk, které mohou hrát klíčovou úlohu v imunitních a imunopatologických reakcích. Literatura: Belge K. U., Dayyani F., Horelt A., Siedlar M., Frankenberger M., Frankenberger B., Espevik T. and Ziegler-Heitbrock L. (2002) The proinflammatory CD14+CD16+DR++ monocytes are a major source of TNF. J Immunol. 168, 3536-42. Gordon S. and Taylor P. R. (2005) Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat Rev Immunol. 5, 953-64. Grip O., Bredberg A., Lindgren S. and Henriksson G. (2007) Increased subpopulations of CD16(+) and CD56(+) blood monocytes in patients with active Crohn‘s disease. Inflamm Bowel Dis. 13, 566-72. Kawanaka N., Yamamura M., Aita T., Morita Y., Okamoto A., Kawashima M., Iwahashi M., Ueno A., Ohmoto Y. and Makino H. (2002) CD14+,CD16+ blood monocytes and joint inflammation in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 46, 2578-86. Komohara Y., Hirahara J., Horikawa T., Kawamura K., Kiyota E., Sakashita N., Araki N. and Takeya M. (2006) AM-3K, an anti-macrophage antibody, recognizes CD163, a molecule associated with an anti-inflammatory macrophage phenotype. J Histochem Cytochem. 54, 763-71. Epub 2006 Mar 3.

10


Li J., Pritchard D. K., Wang X., Park D. R., Bumgarner R. E., Schwartz S. M. and Liles W. C. (2007) cDNA microarray analysis reveals fundamental differences in the expression profiles of primary human monocytes, monocytederived macrophages, and alveolar macrophages. J Leukoc Biol. 81, 328-35. Epub 2006 Oct 17. Mantovani A., Sica A. and Locati M. (2007) New vistas on macrophage differentiation and activation. Eur J Immunol. 37, 14-6. Okamoto H., Mizuno K. and Horio T. (2003) Circulating CD14+ CD16+ monocytes are expanded in sarcoidosis patients. J Dermatol. 30, 503-9. Passlick B., Flieger D. and Ziegler-Heitbrock H. W. (1989) Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood. Blood. 74, 2527-34. Randolph G. J., Jakubzick C. and Qu C. (2008) Antigen presentation by monocytes and monocyte-derived cells. Curr Opin Immunol. 20, 52-60. Epub 2007 Dec 21. Striz I., Pokorna-Sochurkova H., Zheng L., Jaresova M., Guzman J. and Costabel U. (2001a) Calprotectin expression and mononuclear phagocyte subpopulations in peripheral blood and bronchoalveolar lavage. Sarcoidosis Vasc Diffuse Lung Dis 18, 57-63. Striz I., Slavcev A., Kalanin J., Jaresova M. and Rennard S. I. (2001b) Cell-cell contacts with epithelial cells modulate the phenotype of human macrophages. Inflammation 25, 241-6. Striz I., Wang Y. M., Svarcova I., Trnka L., Sorg C. and Costabel U. (1993) The phenotype of alveolar macrophages and its correlation with immune cells in bronchoalveolar lavage. Eur Respir J 6, 1287-94. Ulrich C., Heine G. H., Gerhart M. K., Kohler H. and Girndt M. (2008) Proinflammatory CD14+CD16+ monocytes are associated with subclinical atherosclerosis in renal transplant patients. Am J Transplant. 8, 103-10. Waldo S. W., Li Y., Buono C., Zhao B., Billings E. M., Chang J. and Kruth H. S. (2008) Heterogeneity of Human Macrophages in Culture and in Atherosclerotic Plaques. Am J Pathol 5, 5. Weber C., Belge K. U., von Hundelshausen P., Draude G., Steppich B., Mack M., Frankenberger M., Weber K. S. and Ziegler-Heitbrock H. W. (2000) Differential chemokine receptor expression and function in human monocyte subpopulations. J Leukoc Biol. 67, 699-704. Ziegler-Heitbrock H. W., Strobel M., Fingerle G., Schlunck T., Pforte A., Blumenstein M. and Haas J. G. (1991) Small (CD14+/CD16+) monocytes and regular monocytes in human blood. Pathobiology. 59, 127-30. Ziegler-Heitbrock L. (2007) The CD14+ CD16+ blood monocytes: their role in infection and inflammation. J Leukoc Biol. 81, 584-9. DOC. MUDR. ILJA STŘÍŽ, CSC. PRACOVIŠTĚ KLINICKÉ A TRANSPLANTAČNÍ IMUNOLOGIE, INSTITUT KLINICKÉ A EXPERIMENTÁLNÍ MEDICÍNY VÍDĚŇSKÁ 1958/9, 140 21 PRAHA 4 E-MAIL: [email protected]

Analýza proliferačního potenciálu kmenových buněk periodoncia Soukup T., Víšek B., Suchánek J., Ivančaková R.

ÚVOD Kmenové buňky (KB) jsou elementy vyznačující se charakteristickými vlastnostmi, díky kterým lze tyto buňky nejen identifikovat, ale i izolovat a použít pro výzkumné, případně i klinické aplikace. Jednou z hlavních vlastností, kterou u KB posuzujeme, je jejich proliferační potenciál neboli, obecně, schopnost se dělit. Mezenchymové kmenové buňky (MKB) jsou specifickou skupinou KB. Lze je identifikovat v celé řadě tkání lidského těla, kterými jsou např. zubní pulpa, kostní dřeň, příčně pruhovaná svalovina a další. Obdobná populace byla nalezena taktéž ve tkáni periodoncia (2), přičemž podle současných poznatků takto určená populace PLSC (Periodontal Ligament Stem Cells) skutečně vykazuje fenotyp odpovídající MKB. Toto potvrzují i data získaná zejména fenotypizací PLSC průkazem exprese markerů MKB, dále pak průkazy schopnosti jejich diferenciace v různé typy tkání a v neposlední řadě sledování základních biologických charakteristik, mezi něž patří i proliferační potenciál definovaný v podmínkách in vitro. Tento je možno sledovat různými metodami, přičemž výsledná data slouží jako jeden ze základních parametrů, který danou buněčnou populaci KB charakterizuje. Díky prokázané telomerázové aktivitě MKB obecně platí jejich vysoký stupeň proliferačního potenciálu, který buňkám dovoluje překonat tzv. Hayflickův limit (1, 3, 4), což je počet populačních zdvojení typický pro somatické buňky. Jeho hodnota se pohybuje kolem 60. Překonání této hranice je pak jedním z ukazatelů „kmenového“ charakteru buněčné populace. Další obecnou vlastností MKB je jejich relativně krátký doubling time (čas potřebný na zdvojení populace), což značí vysokou mitotickou aktivitu a tedy větší zastoupení fází S a G2/M buněčného cyklu.

izolovány metodou enzymatické disociace v roztoku kolagenázy a dispázy při 37°C a nasazeny ke kultivaci v adherentních podmínkách. Jako základní kultivační médium sloužilo námi optimalizované médium pro kultivaci MKB (3, 4) - alfa-MEM (Gibco) doplněné o 2% FCS (PAA), ITS suplement (Sigma), antibiotika PNC/STM (Gibco), EGF a PDGF (PeproTech). Pro dosažení optimálních podmínek růstu buněčné populace jsme prováděli pasážování (trypsinEDTA, Gibco) pravidelně při dosažení 70 – 80% konfluence kultivačních nádob. Kultivační médium jsme měnili pravidelně po 2 dnech kultivace. Pro analýzu distribuce průměrů buněk a jejich počtu jsme použili přístroj Z2 Counter, pro určení viability pak Vi-Cell XR (oba od firmy Beckman Coulter). Aplikace určené pro průtokovou cytometrii byly prováděny na přístroji Cell Lab Quanta SC + MPL (Beckman Coulter). Morfologii buněk a konfluenci kultivačních nádob jsme hodnotili pomocí fázově kontrastního mikroskopu (Nikon). DNA analýza byla prováděna paralelně dvěma metodami, v obou případech založenými na detekci fluorescence v průtokovém cytometru. V prvním případě se jedná o značení pomocí interkalačního činidla PI (propidium iodid), druhým způsob je metoda založená na duální detekci cyklinu A2 vs. 7-AAD (vše Beckman Coulter). Proliferační aktivitu v závislosti na redistribuci intracelulárně vázaného fluorochromu jsme sledovali pomocí CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester, Molecular Probes), jehož fluorescenci jsme hodnotili jak fluorescenčním mikroskopem, tak využitím průtokového cytometru. Data získaná z jednotlivých přístrojů byla zpracována vždy softwarově programem pro daný přístroj. Pro zpracování dat půtokové cytometrie jsme kromě standartního software použili programy WinMDI ver. 2.8 a MultiCycle. Souhrné statistické výpočty jsme prováděli v programu MS Excel 2002 a SPSS ver.13.

VÝSLEDKY Při kultivaci PLSC jsme dosud dosáhli 15. pasáže. Během této doby jsme zaznamenali relativně stabilní zastoupení průměrů buněk v závislosti na pasáži (tzv. size trend) – viz obr. 1. Velikost populace oscilovala kolem průměrné hodnoty 16,5 μm (SD 2,19 μm).

Obrázek 1: Distribuce průměrů PLSC kultivovaných v základním médiu (pasáže č. 1-15)

CÍL PRÁCE Hlavním cílem naší práce je analýza proliferačního potenciálu PLSC v podmínkách kultivace in vitro. Dále je cílem porovnání aplikovatelnosti několika metodik, které v našich podmínkách slouží ke studiu proliferačního potenciálu MKB.

MATERIÁL A METODIKA Studovaná populace PLSC byla izolována z periodontální tkáně, která byla do naší laboratoře transportována spolu s třetím molárem, původně určeným pro izolaci KB zubní pulpy. PLSC byly


11

Čas potřebný na zdvojnásobení populace (tzv. doubling time, DT) v průběhu kultivace postupně vzrůstal (obr. 2). Průměrná hodnota DT pro linii PLSC (2.-15. pasáž) byla 45 hodin. Z biologických charakteristik jsme dále sledovali počet populačních zdvojnásobení PPZ (obr. 3). Analýzou kumulace PPZ jsme zatím nepotvrdili překročení tzv. Hayflickova limitu (1). Obrázek 2: Dynamika času potřebného na zdvojnásobení populace v průběhu dlouhodobé kultivace PLSC (2.-15. pasáž)

Obrázek 3: Kumulace populačních zdvojnásobení linie PLSC (2.-15. pasáž). Hayflickův limit dosud nebyl překročen

Analýza nekumulovaných dat PPZ (obr. 4) ukazuje na klesající proliferační potenciál linie PLSC v průběhu dlouhodobé kultivace (průměrná hodnota 2,64 PPZ / pasáž). Tento je však stále o 1/3 vyšší, než u námi sledovaných linií mezenchymových kmenových buněk izolovaných z kostní dřeně. Průměrná viabilita sledované populace byla 95,2%, efektivita nasazení (tzv. plating efficiency v pasáži č. 15) byla 78,2%. Dle výsledků fenotypizace pomocí průtokové cytometrie námi kultivovaná populace PLSC vykazovala vysokou pozitivitu v mezenchymálních znacích CD29, CD44, CD73, CD105 a HLA-1. Střední úroveň pozitivity vykazoval znak CD90. Nízkou expresi jsme zaznamenali u znaků CXCR4, CD235a a HLA-2, negativní expresi vykazovaly CCR7 a CD45 (tabulka 1). DNA analýza prováděná značením PI resp. anti-cyclin A2 vs. 7-AAD prokázala toto stabilní zastoupení jednotlivých fází buněčného cyklu: G0/G1 49,9 %, S 41,9 %, G2/M 8,0 % (obr. 5). Detekce fluorescence CFSE v závisosti na dnech kultivace je zobrazena na obr. 6. Je zde patrný posun maxima intenzity fluorescence značené populace směrem k negativním hodnotám. Obdobnou situaci demonstruje obr. 7, který se rovněž vztahuje k detekci CFSE, avšak zobrazuje posun hlavní značené populace v 3-D zobrazení s přihlédnutím k elektronickému objemu buněk (EV). Obrázek 8 demonstruje CFSE značenou populaci PLSC ve fluorescenčním mikroskopu. Průměrná viabilita buněk po značení CFSE činila v průběhu experimentu 91,9 %. Intenzitu fluorescence v jednotlivých buňkách lze též kvantifikovat pomocí software pro analýzu obrazu (Image-Pro Plus) – viz. obr. 9. Obrázek 5: Zastoupení jednotlivých fází buněčného cyklu, srovnání metod PI vs. Cyclin A2/7AAD

Obrázek 4: Nekumulovaný počet populačních zdvojení. Regresní analýza těchto dat ukazuje na klesající proliferační potenciál linie PLSC

Tabulka 1: Fenotyp kmenových buněk periodontálního ligamenta (Cell Lab Quanta) MARKER

CD29

CD44

CD45

CD73

CD90

CD105

CXCR4

CCR7

EXPRESE (%)

96,5

87,3

8,6

88,1

50,5

96,5

32,6

0,7

20,7

82,0

26,3

EXPRESE (+++)

+++

+++

-

+++

++

+++

+

-

+

+++

+

12


CD235a HLA-1

HLA-2

Obrázek 6, 7: Detekce fluorescence CFSE v závislosti na dnech kultivace a EV populace PLSC

DISKUSE Námi izolovaná buněčná linie PLSC vykazuje vysoký proliferační potenciál in vitro, srovnatelný jak s výsledky kultivace PLSC jiných autorů (2), tak s MKB zubní pulpy a kostní dřeně (3, 4). Během dosavadních 15 pasáží se nám nepodařilo dosáhnout tzv. Hayflickova limitu (1). Uvedenou kumulaci počtu populačních zdvojení (36,9) je však nutno považovat pouze za orientační, neboť skutečný počet polulačních zdvojení od nasazení primokultury po 15. pasáž je vyšší než uvedený údaj. Příčinou je skutečnost, že nelze přesně zaznamenat počáteční množství buněk primokultury a hodnota 36,9 pak postihuje růst buněčné linie od 2. do 15. pasáže. Z našeho mikroskopického pozorování primokultury tedy odhadujeme, že skutečná hodnota kumulace PPZ činí 47 až 50. Analýza buněčného cyklu taktéž prokazuje vysoký proliferační potenciál linie PLSC. Použité metody stanovéní fází buněčného cyklu (PI vs. anti-cyclin A2/7-AAD) jsou přitom z hlediska validity výsledků zastupitelné. Metoda založená na značení pomocí PI je přitom přesnější a časově méně náročná, nicméně pro přesné vyhodnocení je nutný software Multicycle. Značením pomocí anti-cyclin A2/7-AAD pak sice nedosáhneme takové přesnosti výsledků jako v předchozím případě, nicméně metoda je z hlediska práce s daty „flexibilnější“ (gating) a odpadá zde potřeba samostatného analytického software. Metoda sledování proliferačního potenciálu za pomocí fluorochromu CFSE se jeví jako perspektivní pro porovnání dynamiky růstu různých subpopulací buněk. Vzhledem k určité heterogenitě buněčné populace PLSC je takto možné vyjádřit závislost proliferačního potenciálu na velikosti (resp. elektronickém objemu) sledovaných subpopulací. Při použití průtokové cytometrie se pak nabízí možnost současného značení více markery a jejich kvantitativního hodnocení, což by mohlo přispět k pochopení kinetiky růstu subpopulací PLSC v závislosti na jejich fenotypu. Pro linie PLSC takovýto matematický model popisující proliferační potenciál jednotlivých subpopulací dosud nebyl publikován.

Obrázek 8: Buňky značené pomocí CFSE, DAPI, den 1, zvětšení 200x

Obrázek 9: Kvantifikace intenzity fluorescence pomocí programu Image-Pro Plus. Vysoce intenzivní body (žlutě) 21 % označené plochy, středně intenzivní body (červeně) 18 % označené plochy, nízce intenzivní body (zeleně) 43 % označené plochy a konečně plocha jader (modře) 18 % označené plochy.

LITERATURA 1. Ivanovski S, Gronthos S, Shi S, Bartold PM. Stem cells in the periodontal ligament. Oral Diseases 2006;12:358-363. 2. Hayflick L. The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains. Exp. Cell Res.1965: 2323-2328. 3. Soukup T, Mokrý J, Karbanová J, Pytlík R, Suchomel P, Kučerová L. Mesenchymal stem cells isolated from the human bone marrow: cultivation, phenotypic analysis and changes in proliferation kinetics. Acta Medica (Hradec Kralove) 2006;49(1):27-33. 4. Suchánek J, Soukup T, Ivančaková R, Karbanová J, Hubková V, Pytlík R, Kucerová L. Human dental pulp stem cells - isolation and long term cultivation. Acta Medica (Hradec Kralove) 2007;50(3):195-201.

vání dále patří přednostovi Ústavu histologie a embryologie, LF v Hradci Králové Prof. MUDr. Jaroslavu Mokrému, Ph.D., laborantkám Ústavu histologie a embryologie, LF v Hradci Králové a ing. R. Vlčkovi.

PODĚKOVÁNÍ Práce byla podpořena grantovým projektem MSM 0021620820 a projektem Nadace Tomáše Bati. Poděko-

MUDR. TOMÁŠ SOUKUP ÚSTAV HISTOLOGIE A EMBRYOLOGIE, LF UK HRADEC KRÁLOVÉ ŠIMKOVA 870, 500 01 HRADEC KRÁLOVÉ, E-MAIL: [email protected]


13

Průtoková cytometrie růtokové cytometry se v průběhu posledních dvaceti let staly součástí standardního přístrojového vybavení klinických hematologických a imunologických oddělení nemocnic, soukromých laboratoří a ústavů fakultních nemocnic. V naší nabídce je pro diagnostiku in vitro určeno bezmála 300 monoklonálních protilátek, kontrolních materiálů a souprav reagencií. Rozvoj výzkumných aplikací, které nejsou legislativně regulovány jako diagnostika in vitro, předstihl klinické použití jak v technických možnostech přístrojů, tak ve škále dostupných reagencií, monoklonálních protilátek a fluorochromů. Pro výzkumná pracoviště jsou určeny analyzátory Cell Lab QUANTA SC MPL, které pokrývají základní cytometrické aplikace včetně možnosti plné automatizace pro vysokokapacitní provozy. Tyto přístroje se vyznačují snadnou obsluhou a krátkou dobou zaškolení a jsou vhodné pro samostatně pracující odborníky nebo malé pracovní týmy. Pro cytomerická pracoviště v klinické diagnostice a ve výzkumu jsou vhodné cytometry FC500 vybavené jedním nebo dvěma lasery. Pro laboratoře a pracovní týmy, které chtějí plně využít možností průtokové cytometrie, jsou určeny vysokorychlostní analyzátory CyAn a sortery MoFlo. Konfiguraci těchto přístrojů je možné upravovat podle požadavků uživatele pro dosažení optimálních výsledků analýz.

CyAnTM ADP 9 color Stolní průtokový cytometr s třemi lasery a 11 měřenými parametry (FSC, SSC a FL1-FL9). Průtokové cytometry CyAn ADPTM jsou stolní vysokorychlostní analyzátory vybavené dvěma nebo třemi lasery s možností detekce 7 nebo 9 fluorescencí. Tabulka možného použití fluorochromů pro CyAn ADP

Zdroj světla

Parametr Fluorochrom

488 nm

FL1

FITC, GFP, CFSE, AlexaFluor 488*

FL2

PE

FL3

ECD, PE-Alexa Fluor 610, PI, Qot605

FL4

PC5, PerCP, PE-Cy5.5, PerC5-Cy5.5, 7-AAD, QDot655

FL5

PC7, PE-AlexaFluor 750, QDot705*

FL6

Pacific Blue*, Cascade Blue*, DAPI, CFP

FL7

Cascade Yellow*, Pacific Orange*, AmCyan, YFP, QDot565

405 nm

642 nm

FL8

APC

FL9

APC-Cy7, APC-Alexa Fluor 750, APC-Cy5.5, Alexa Fluor 700, QDot800, Alexa Fluor 750

* Ochranné známky jsou vlastnictvím příslušných vlastníků

CyAn ADP 7 color

CyAn ADP 9 color

Počet laserů

2

3

Počet parametrů

9

11

Počet fluorescencí

7

9

488 nm

5

5

642 nm

2

2

405 nm

-

2

14


Přístroje jsou schopny analyzovat buňky rychlostí až 70 000 částic za sekundu. Detekci velmi vzácných populací buněk software Summit umožňuje analýzou souborů až o 100 milionech buněk. CyAn ADPTM 7-color je vybaven dvěma lasery 488 a 642 nm a sedmi detektory pro fluorescence. CyAn ADP 9-color používá navíc 405 nm laser a další dva detektory pro fluorescence. Paprsky laserů jsou vedeny ve třech různých úrovních, což umožňuje prostorové a časové oddělení signálu z jednotlivých excitačních drah. Použití přístroje se rozšiřuje o aplikace používající DAPI pro stanovení buněčného cyklu, CFP-YFP FRET analýzu a Hoechst 33342. Výměnné prvky v optické lavici přístroje umožňují optimalizovat konfiguraci filtrů a dichroických zrcadel pro dosažení optimálních výsledků analýzy. Ovládání přístroje a hodnocení dat zabezpečuje software Summit. Kompenzaci spektrálního překryvu fluorochromů v 9 x 9 kompenzační matici lze provést automaticky nebo manuálně s použitím biexponenciálního zobrazení (funkce VisiCOMP). Konfiguraci těchto přístrojů je možné upravovat podle požadavků uživatele pro dosažení optimálních výsledků analýz. Pro skupiny uživatelů je významný také nelimitovaný počet instalací software Summit. Nedílnou součástí analyzátoru je jednotka SMS (Sheath management system), která je součástí fluidního systému cytometru. Obsahuje zásobníky pro nosnou kapalinu, čisticí roztok a odpad a zajišťuje přibližně 24-hodinový chod přístroje a řadu funkcí, včetně automatického promývání systému. Kombinace vysoké rychlosti analýzy a možnosti hodnotit rozsáhlé soubory činí z cytometrů CyAn ADP ideální nástroj pro analýzy minoritních populací buněk až do frekvence 1/10 000, např. po označení pomocí MHC tetramerů, minimální reziduální choroby, subpopulací kmenových nebo dendritických buněk apod.

MoFloTM XDP MoFloTM XDP je sorter nejvyšší kategorie. Modularita systému, která je zajištěna širokým spektrem laserů, včetně vodou chlazených, a průtokových komor, umožňuje optimalizovat konfiguraci pro sortování a analýzu chromozomů, spermií, bakterií, malých částic a velmi vzácných populací buněk. Přístroj je určen k sortování rychlostí až 70 000 buněk za sekundu a analýze až 100 000 buněk za sekundu. K sortování chromozomů jsou vhodné vodou chlazené argonové lasery o výkonu 300 mW. UV laser (330 – 360 nm) je určen pro excitaci Hoechst 33258, druhý laser (457 nm), který prochází průtokovou komorou a je prostorově oddělen, excituje chromomycin A3. Takto je možné sortovat chromozomy s průtokovou komorou CytoNozzle 70 μm rychlostí 8 000 – 12 000 chromozomů za sekundu. Hospodářsky zajímavou aplikací je sortování spermií. Jedná se o velmi citlivou aplikaci, protože X a Y chromozom domestikovaných zvířat se liší v obsahu DNA průměrně o 3,6 % - 4,2 % (u savců je rozmezí širší, od 2,7 % u gorily až po 4,4 % u žirafy). Základem metody je značení celkové DNA barvivem Hoechst 33342 za podmínek, které minimalizují změny morfologie a motility spermií. Přístroj nabízí řadu dalších funkcí, které zjednodušují obsluhu přístroje. Modul Smart Sampler umožňuje používat více typů zkumavek v objemech 0,5 – 50 mL včetně kontroly

Konfiguraci těchto přístrojů je možné upravovat podle požadavků uživatele pro dosažení optimálních výsledků analýz. teploty ve spojení s vodní lázní v rozpětí -4 až 40°C tak, aby byla zajištěna maximální životnost sortovaných buněk. Vytříděnou populaci buněk může udržovat při konstantní teplotě „Cooling Kit“. IntelliSort automaticky kontroluje a řídí podmínky sortování pomocí kamery a dalšího programového a technického vybavení. Podmínky sortování jsou nejvíce ovlivněny změnami laboratorní teploty, teploty nosné kapaliny a změnami tlaku v přístroji. IntelliSort je při změnách v podmínkách sortování schopen upravit nastavení bez intervence operátora. Funkce 4Way™ Sort zvyšuje produktivitu využití přístroje a šetří uživateli vzácné vzorky sortováním čtyřech populací současně. Pro třídění buněk do standardních destiček se 72 nebo až s 1536 jamkami, na mikroskopická skla nebo do uživatelem zadaných formátů je určena funkce CyCLONE™. Aerosol Evacuation Unit odstraňuje aerosol z prostoru komory pro třídění a zachycuje ho do filtru ULPA. Průtok vzduchu je definovatelný uživatelem a umožňuje výměnu vzduchu 10 – 40 krát za minutu. Sterilní třídění buněk je zabezpečeno vyměnitelnými zásobníky pro nosný roztok a odpad a vyměnitelnými sterilními drahami vedení vzorku. Další informace obsahují informační materiály BR-11391A (MoFlo) a BR-11390A (CyAn), které vám rádi zašleme. PAVEL KRUŽÍK E-MAIL: [email protected]


15

Nový analyzátor částic a molekul velikostí nano a mikro DelsaTM Nano

Laboratorní automatizace pro zkumavky i mikrotitrační destičky tomatizované pipetovací stanice Biomek představují komplexní řešení pro laboratoře, které potřebují pipetovat ve formátu zkumavek nebo destiček. Biomek umožňuje provádění veškerých manipulací s kapalinami od prostého rozpipetování, ředění a distribuce vzorků až po speciální manipulace, jako je izolace a purifikace DNA/RNA, PCR set-up nebo příprava vzorků pro další analýzy. Systém Biomek umožňuje provedení testů na jedné platformě (pracovní ploše pipetovací stanice) včetně pipetování reagencií, inkubace, promývání, odsávání, měření produktů v readeru a samozřejmě vedení a zpracování dat o vzorku. Přístroj umožňuje integrovat do prostoru pracovní plochy readery pro destičky (luminometr, absorbanční reader, fluorometr a další), PCR cycler, inkubátory buněk a další zařízení. Biomek lze také doplnit o čtečky čárových kódů jak pro destičky, tak pro zkumavky. Veškeré operace jsou řízeny prostřednictvím řídícího počítače Biomeku. Pokročilejší a komplexnější pipetování lze jednoduše nastavit a kontrolovat pomocí software SAMI EX. Přijďte si prohlédnout práci na robotickém systému Biomek NXP na vlastní oči.... Pro podrobnosti nás, prosím, kontaktujte. ROMAN VLČEK E-MAIL: [email protected]

16


PARTICLE SIZE ANALYZER DelsaNano je zcela nová generace analyzátorů využívajících fotonové korelační spektroskopie (PCS) a elektroforetický rozptyl světla (ELS), díky kterým lze měřit velikost částic difundujících v kapalině i nabitých molekul pohybujících se v elektrickém poli tzv. Zeta Potenciál. Přístroj DelsaNano umožňuje měřit částice od 6 nanometrů do 7 mikronů a široké rozmezí koncentrací od 0,001 % to 40 %. Přístroj DelsaTM Nano je navržen tak, aby byl schopen měřit zeta potenciál koncetrovaných materiálů a pevných povrchů jako jsou filmy, papír, sklo, keramika, kovy a oxidy kovů. Je ideální pro měření jakýchkoli tekutin včetně léčiv, odpadních vod, barev, inkoustů nebo petrochemikálií. Přístroj je dodáván ve dvou verzích Delsa Nano S, která měří velikost částic, a Delsa Nano C, který navíc měří i zeta potenciál částic v roztoku nebo pevných povrchů. Přístroj může být rozšířen o autotitrační jednotku Delsa Nano AT pro zjištění distribuce velikosti i zeta potenciálu suspendovaných částic v širokém rozmezí koncentrací a pH (pracovní rozsah 1-13) Hlavní výhody stroje: vysoce přesné měření částic v rozsahu od 0,6 nm do 7 μm vysoká citlivost přístroje – umožňuje měřit Vitamin B1 (MW = 267 Daltonů) typický koncentrační rozsah: 0,001 % - 10 % (v závislosti na velikosti částic) autotitrace použitelná pro dynamické měření (pH titrace, teplotní trendy, kinetické studie) EVA KRÁLOVÁ E-MAIL: [email protected]

Popište svůj proces minulém čísle jsem se rozpovídal o nutnosti vnímat veškeré události v laboratoři, které se odehrají se vzorkem či s daty, jež se vzorku (nebo možná správněji pacienta) týkají, jako proces. Lehce jsem nakousl důvody, proč je tak dobré učinit především z pohledu řízení kvality a výkonu laboratoře. V tomto čísle bych si dovolil navázat na toto téma trochu konkrétněji. Bez dalšího polemizování bych vám rád navrhl, abyste si popsali váš proces. Jedním ze způsobů popsání laboratorního procesu je nakreslit si ho. Jako vhodný nástroj pro popis procesu obecně se již kdysi dávno osvědčily vývojové diagramy. Tento nástroj ve spojení s praktickými znalostmi o vašem procesu může vést k jeho přesnému popsání. I tak je dobré mít na paměti některé aspekty, které nám mohou pomoci při vlastním popisu procesu. Jak na nic nezapomenout a čeho se naopak vyvarovat? Důležité je nepodcenit sebemenší krok v procesu a zaznamenat jej (žádný krok v procesu není minoritní). Pokuste se vcítit do kůže toho, kdo daný úkon provádí, a představit si, jaká rozhodnutí musí při realizaci kroku učinit, na základě jakých kriterií se musí rozhodnout a tato rozhodnutí logicky uspořádat v posloupnost a zaznamenat větvení procesu pro jednotlivá rozhodnutí. Představte si zvědavého virtuálního návštěvníka, kterého provázíte laboratoří a který klade řadu dotazů. V této souvislosti je nejlepším návštěvníkem 5-ti leté dítě, které klade dost často všetečné otázky typu „A proč?“. Na konkrétní úkon se zkuste zeptat všemi pádovými otázkami. Při formulaci otázek využijte slov, „kdo“, „co“, „kde“, „kdy“, „jak“ „komu“, „pro koho“ atd. Vymyslete pro každý krok minimálně 5 otázek a odpovězte na ně. Představte si, že jste vzorek (zkumavka), který přijde k vám do laboratoře. Zrovna tak, jako se ptá člověk, který je zpracováván nějakým procesem a ptá se na to, co se s ním děje, proč se děje tohle a ne tamto, pokuste se i vy ptát jménem zkumavky (nebo ještě lépe jménem pacienta). Neklaďte si jenom otázky, na které znáte okamžitou odpověď. Hledejte otázky, které vám s odpovědí tak říkajíc dají zabrat. Otázka je na každý pád způsob, jak hledat a najít. Jak už jsem se v minulém čísle zmínil, laboratorní proces lze dělit na jednotlivé části podle etapy

zpracování vzorku, vstupu dat, jejich zpracování a nakonec i výsledků, jejich validace, archivace dat i materiálů a následně i likvidace. Proces z pohledu druhu zpracovávané informace lze rozdělit na dva základní vývojové diagramy: Tok materiálu Tok dat Laboratorní proces lze z pohledu stavu zpracovávané informace rozdělit do tří základních fází: Preanalytická fáze Analytická fáze Postanalytická fáze Zabývejme se nyní konkrétně preanalytickou fází a naformulujme otázky, na které se pokuste odpovědět. Níže uvádím několik konkrétních otázek jako příklad. Doplňte svoje vlastní otázky podle již výše uvedených doporučení. Někdy jsem do závorky za otázku uvedl příklad, v jakém vztahu je otázka s realitou v laboratoři. Jak přichází materiál do laboratoře? (donáškou?, svozem?, potrubní poštou?, je odebrán na místě?, ...) Jak je materiál označen? (popisek na zkumavce, jméno, datum narození) Jak přicházejí do laboratoře informace o požadovaných vyšetřeních? (papírová žádanka, elektronická žádanka) Co víme o vlastním průběhu cesty vzorku do laboratoře? (máme údaje o době odběru, o možných zdrženích vzorku na cestě, o podmínkách, při kterých je dopravován) Z jaké největší vzdálenosti se dostávají vzorky do laboratoře? Má záznam o předání materiálu na příjmu v laboratoři časový údaj? (čekají vzorky v kelímku před dveřmi laboratoře nebo na okénku příjmu?) Jsou předávány vzorky z ruky do ruky, a to nejen statimové? Jak jsou rozlišeny STAT vzorky od rutinních? Jak je kontrolována kvalita vzorků na vstupu do laboratoře? (fyzická kontrola vzorku, ...) Jsou vzorky na příjmu tříděny? Podle kterých kriterií jsou vzorky tříděny? (typ odběrové zkumavky, druh žádanky, dle původu vzorku) Jsou vzorky na příjmu značeny jiným štítkem, než se kterým přijdou do laboratoře? Přijdou požadavky na vyšetření jednoho pacienta v několika zkumavkách? Rozlišujete jednotlivé zkumavky od jednoho pacienta? Kdy je generován štítek pro označení vzorku? (je předtištěn dopředu, je generován just in time) Jakou formu má štítek? (pouze čárový kód, případně s číslem vzorku, čárový kód s textem, ...) Jaké údaje nese štítek? Používáte více typů žádanek podle druhu vyšetření? (žádanka na hematologická vyšetření, žádanka na biochemická vyšetření, žádanka na imunologická vyšetření, bakteriologie, sérologie) Jak jsou tříděny zkumavky podle dalšího způsobu zpracování? (krevní obraz, biochemie, koagulace, imunochemická vyšetření, imunologie atd., podle systémů ve vaší laboratoři a podle jednotlivých vyšetření, podle typu materiálu – moč, plná krev, vyšetření ze séra, plazmy atd.)


17

Jak jsou dopraveny vzorky na centrifugaci? Kdo a podle jakých kriterií rozhoduje o centrifugaci jednotlivých vzorků? (čekají vzorky na centrifugaci, vytíženost centrifug, zádrž vzorků v této etapě jejich přípravy) Provádíte odvíčkování zkumavek? (u všech zkumavek, jenom u alikvotovaných zkumavek, ...) Pro která vyšetření vytváříte alikvoty? (elfo, nefelometrická vyšetření, …) Kdy jsou tyto alikvoty vytvářeny? (po vyšetření základních parametrů z primární zkumavky, po centrifugaci, před vložením primární zkumavky do systémů pro rutinní vyšetření) Provádíte veškerá vyšetření denně? (méně frekventní vyšetření prováděná manuálně, ELISA testy, ...) Která vyšetření střádáte a jak často je provádíte? Které kriterium používáte pro rozhodování, kdy se jaké nepravidelně prováděné vyšetření uskuteční? (počet nastřádaných požadavků, pevně stanovený termín, nezávisle na počtu požadavků) Jistě budete schopni naformulovat celou řadu dalších otázek, na které budete hledat odpovědi ve vašem laboratorním procesu. Pro úplnost uvádím také pár otázek, které bychom mohli použít pro analytickou fázi a postanalytickou fázi a validaci výsledků. Jak se dostane vzorek k analyzátoru? (donáškou personálem pro příjem vzorků, pracovníkem, který provádí centrifugaci, pracovníkem, který provedl alikvotaci, vyžádáním obsluhou analyzátoru, docházkou obsluhy analyzátoru, ...) Kdo provádí vklad vzorků do jednotlivých analyzátorů? (obsluha každého analyzátoru zvlášť, obsluha více analytických systémů, osoba odpovědná za tok vzorků laboratoří) Lze vzorky do analyzátoru vkládat za provozu analyzátoru? (ano, ne, jen při přerušení analýzy s čekací dobou ....sec, min) Jak je zajištěno, že analyzátory disponují všemi reagenciemi potřebnými pro jednotlivá vyšetření? (doplnění na začátku pracovního dne, doplňování v průběhu dne dle potřeby) Jak je zajištěno, že analyzátor disponuje veškerým spotřebním materiálem potřebným pro jeho plynulý chod?

18


(dodávka vody, promývací roztoky, reakční kyvety, substráty, kontrolní materiály, referenční roztoky atd., doplnění na začátku pracovního dne, doplňování v průběhu dne dle potřeby) Jak jsou doplňovány reagencie do jednotlivých analytických systémů? Jak je doplňován spotřební materiál do jednotlivých analytických systémů? Jak je obsluha jednotlivých analytických systémů upozorňována na nutnost doplnit reagencie nebo spotřební materiál do jednotlivých analytických systémů? Jak je sledován postup vzorku laboratoří? Jak je sledována kompletnost provedených vyšetření u jednotlivých vzorků? Jak je sledována kompletnost provedených vyšetření u pacientů? Kdo vidí průběžné výsledky požadovaných vyšetření? Jak jsou validovány výsledky jednotlivých vyšetření? Jak jsou validovány výsledky vyšetření jednotlivých pacientů? Jak jsou doručeny výsledky lékaři, který vyšetření požadoval? Jak je zajištěna zpětná vazba od lékaře na doručené výsledky? Výše uvedený seznam otázek není zdaleka kompletní a vyčerpávající. Tyto otázky by vás měly především inspirovat k vašim vlastním formulacím. Při kladení a formulaci jednotlivých otázek se je snažte logicky řadit tak, jak připadají do úvahy ve vašem konkrétním případě. Toto pořadí otázek a následných odpovědí vám pomůže při vlastním popisu laboratorního procesu formou vývojového diagramu. Na závěr dnešní kapitoly na téma laboratorní proces na základě popisu jednotlivých kroků (otázek a odpovědí) zaznamenejte formou symbolů používaných ve vývojových diagramech (viz. přiložená legenda symbolů) jednotlivé kroky, které propojte šipkami ve smyslu toku vzorků, případně toku dat. Několik rad na závěr: Poté, co nakreslíte preanalytickou fázi vašeho laboratorního procesu, toto schéma odložte. Vraťte se k tomuto záznamu po týdnu a pokuste se pochopit to, co jste nakreslili. Ukažte svůj popis jednotlivých činností a rozhodovacích kroků personálu, který je skutečně provádí, a zkonzultujte s ním popsanou činnost. Nenechte se odradit prvními neúspěchy, zdánlivou komplikovaností procesu a nemožností ho jednoduše popsat. Snažte se popis procesu dotáhnout do konce.

Legenda základních symbolů vývojových diagramů: Proces (jednotlivý krok v procesu)

Rozhodovací krok

Proces (alternativní krok)

Data

Dokument

Dynamická spojnice

Pro popis základní kostry laboratorního procesu vám pro začátek vystačí základní symboly pro jednotlivý krok procesu, symbol pro rozhodovací krok a dynamická spojnice pro spojení jednotlivých kroků ve smyslu toku materiálu a dat. Několik slov na závěr. Laboratorní proces a jeho mapování, popis a hledání souvislosti mezi jednotlivými kroky se vám může stát i zábavou. Není to jen otravná činnost, kterou se připravujete na akreditaci vaší laboratoře, nebo činnost, jejímž cílem je hledání možných zlepšení procesu či hledání úspor. Je to činnost objevitelská, která vám nachystá celou řadu překvapení, zajímavých zjištění a objevů. Popíšete jevy, jež jste v podvědomí tušili, ale nyní budete schopni je přesně definovat, uspořádat a dále s nimi vědomě pracovat. Zrovna tak, jako botanici, kteří se stále snaží popsat a systematizovat jednotlivé druhy flóry, kteří se snaží nalézt jejich společné, ale i rozdílné znaky, zrovna tak, jako geografové, kteří znova a znova mapují kontinenty a území již dávno známá, ale až nyní skutečně poznaná, tak i vy budete při mapování a popisu laboratorního procesu prožívat vzrušení z objevitelské činnosti. Doufám, že téma laboratorního procesu a skromný návod, jak jej popsat, je pro vás tématem zajímavým. Na tento článek chceme navázat i v dalších číslech našeho časopisu. Rádi bychom dali v rámci tohoto tématu prostor i vám. Pokud se s námi chcete podělit o vaše připomínky, postřehy, poznámky, ale i zkušenosti, zašlete nám je e-mailem na adresu [email protected] a do předmětu zprávy uveďte heslo „IVD - laboratorní proces“. Děkujeme za vaše podnětné připomínky a nápady. ŠTĚPÁN TINTĚRA E-MAIL: [email protected]

Poznatky z návštěvy amerických kolegů u zákazníků firmy Beckamn Coulter v České republice Praha, 25. - 28. února 2008 – Dva pracovníci společnosti Beckman Coulter z obchodního centra pro chemii v Kalifornii navštívili Českou republiku. Jsou to představitelé nastupující generace v týmu, který vyvíjí reagencie. Cílem jejich návštěvy bylo seznámit se s rutinní prací našich biochemických a imunochemických laboratoří a s problémy, které někdy vyvstávají při každodenním provozu. Na všech navštívených pracovištích měli možnost hovořit jak s techniky, tak s klíčovými pracovníky laboratoří i s jejich vedoucími. Získané informace pak použije vývojový tým při konstrukci nových laboratorních přístrojů. Naši kolegové z Kalifornie navštívili laboratoře ve Fakultní nemocnici Motol, v Nemocnici Na Homolce, ve Fakultní nemocnici Olomouc a v Nemocnici Znojmo. Každá laboratoř jim poskytla svoji vizi laboratorního provozu do budoucna. „Organizace navštívených laboratoří na nás udělala velmi dobrý dojem” řekla Donna Huss, Group Manager výroby reagencií Beckman Coulter, Carlsbad. “Beckman Coulter chce lépe porozumět potřebám všech zákazníků a naše návštěva v České republice byla v tomto směru velmi úspěšná. Na všech pracovištích jsme se mohli otevřeně bavit o potřebách i potížích s postupy i samotnými analyzátory. Zapů-


19

sobilo na mne, s jakou zodpovědností se každý pracovník snaží co nejlépe vyhovět potřebám pacientů i lékařů.” „Naše návštěvy a rozhovory byly velmi cenné,” řekl Stephen Ishii, Marketing Manager z centra pro obchod s reagenciemi. „Mohli jsme tak lépe porozumět tomu, jakým úkolům a problémům je nutné v České republice při laboratorním testování čelit. Všechny tyto informace zahrneme do našich zkušeností získaných po celém světě. Sehrají tak důležitou roli při konstrukci nové generace přístrojů, které, jak doufáme, uspokojí potřeby laboratoří po celém světě.” STEPHEN C. ISHII BECKMAN COULTER INC. BREA E-MAIL: [email protected]

Voice of the Customer Visits in the CR Prague, Czech Republic, February 25 - 28, 2008 – Two members from the Beckman Coulter Chemistry Business Center in California, recently visited the Czech Republic as representatives of the next generation chemistry development team. The purpose of their visit was to observe and understand the problems that laboratories in the Czech Republic encounter in performing biochemistry/immunochemistry testing on day-to-day basis. Interview sessions with key operators, directors and technical supervisors were conducted at each visit. This information will help the development team as they design the next chemistry/immunochemistry instrument. The hospital laboratories visited included University Hospital Motol, Hospital Na Homolce, University Hospital Olomouc and Hospital Znojmo. Each laboratory gave a different perspective on laboratory operations for the visitors from California to observe. “We were very impressed with the overall organization of the laboratories we visited” said Donna Huss, Group Manager from the Beckman Coulter Carlsbad Reagent Manufacturing Site. “Beckman Coulter wants to better understand their customer’s needs on a world-wide basis and our visit to

20


Czech Republic was very successful because all the customers were willing to openly share their likes and dislikes about their processes and analyzers. I was impressed with the pride and commitment that each person demonstrated in providing the best service to the patients and physicians.” “Our visits and interviews were invaluable,” said Stephen Ishii, Marketing Manager from the Chemistry Business Center. “We were able to obtain a better understanding of the challenges and problems that are faced in performing chemistry testing in the Czech Republic. We will take this information and combine it with interviews conducted in other countries world wide. This information will be very important to ensure we design our next generation instrument that will satisfy a world wide market need.” STEPHEN C. ISHII BECKMAN COULTER INC. BREA E-MAIL: [email protected]

odborné literatuře bývá čas od času poukazováno na skutečnost, že některé rutinní imunochemické metody pro stanovení určitého analytu mezi sebou špatně korelují. V tomto textu se nechci zabývat metodologií či reprezentativností jednotlivých studií. Pokusím se však poukázat na některé důvody, proč k tomuto jevu dochází. Nebudu se samozřejmě zabývat případy, kdy určitá metoda špatně koreluje s jinými proto, že vykazuje nedostatky ve standardizaci a/nebo návaznosti. To je samozřejmě chyba výrobce. V minulém čísle našeho časopisu jsem se zabýval problematikou návaznosti metodik na stanovení troponinu I v lidském séru či plazmě. Domnívám se, že troponin I je vhodný příklad, jehož pomocí lze problémy s korelací rutinních metod dobře demonstrovat. Existuje pro to několik důvodů : 1. Jedná se o velmi frekventované stanovení – je tedy k dispozici dostatek dat. 2. Jedná se o organickou makromolekulu (cca 24 kDa), která je do určité míry variabilní (fosforylace, defosforylace, oxidace, redukce, proteolýza, enzymatická modifikace) a která se navíc vyskytuje ve vzorcích buď volně nebo v binárních komplexech s troponiny C nebo T a v ternárním komplexu s troponiny C a T. 3. V době uvedení většiny rutinních metodik na trh nebyly k dispozici vyšší prvky řetězce metrologické návaznosti, tj. primární kalibrátor, sekundární referenční metoda, sekundární kalibrátor (sekundární referenční materiál). Z bodů 2 a 3 vyplývá, že a) drtivá většina výrobců zvolila jako základní formát sendvičovou metodu se dvěma protilátkami cílenými proti dvěma různým epitopům troponinu I, b) musela nalézt takový systém, kdy není diskriminována molekula troponinu I, ať už je přítomna volně nebo vázána v komplexu, c) kdy je na minimum redukován vliv variabilního složení molekuly analytu na výsledek stanovení, d) nalézt vhodný způsob zabezpečení návaznosti a e) hlavně zabezpečit korelaci získaných výsledků s velkým množstvím klinicky charakterizovaných reálných vzorků. Je nicméně skutečností, že jednotlivé komerčně dostupné metody mezi sebou korelují velmi špatně, na čemž nic nezměnilo zavedení referenčního materiálu SRM 2921. Příčin může být několik. Neexistuje spolehlivá sekundární referenční metoda (vlastně neexistuje žádná), kterou by bylo možné stanovit skutečnou koncentraci troponinu I v reálných vzorcích biologického původu, jak je

Korelace mezi komerčně dostupnými imunochemickými metodami to možné pro analyty-hapteny, jako jsou například steroidní nebo některé tyreoidální hormony. I kdyby taková metoda k dispozici byla, byla by patrně založena na kombinaci extrakčních, chromatografických a hmotnostně spektrometrických postupů a nezaručovala by, že všechny takto stanovené molekuly troponinu I budou imunochemicky aktivní. Představme si experiment, kdy bude rekombinantně připraven troponin I, který bude označen v některých zbytcích aminokyselin radioaktivními izotopy 3H nebo 14C. Takovýto „vnitřní standard“ bude přidán k reálnému vzorku lidského séra a po době dostatečné pro ustavení rovnováhy pak tento vzorek bude podroben stejným izolačním procesům, které byly použity při izolaci čistého troponinu I. Vyčištěný produkt pak bude dále charakterizován pomocí HPLC v kombinaci s hmotnostní spektrometrií, popř. sekvenční analýzou aminokyselin. Za předpokladu, že se žádná molekula troponinu I během izolace nerozpadla na menší části, získali bychom poměrně přesnou hodnotu koncentrace analytu v původním vzorku. Dokonce by bylo do jisté míry možné díky radioaktivnímu značení sledovat i to, zda a do jaké míry dochází během procesu izolace k destrukci molekul troponinu I. Je zřejmé, že by se jednalo o náročný proces, ať už z důvodu potřebného množství vzorku, časovou náročnost, náklady na přípravu radioaktivně značeného troponinu I, apod. Hlavní je ale to, že neexistuje záruka, že jsou všechny molekuly takto získaného analytu imunoreaktivní. Každý, kdo má zkušenosti s izolací čistého proteinu – antigenu z biologického materiálu, zaznamenal většinou ztráty imunoreaktivity produktu ve srovnání s výchozím materiálem, které nelze připsat na vrub pouze ztrátám určitého množství antigenu v průběhu izolačních kroků.


21

Pokusme se definovat, jaké nároky by taková referenční imunochemická metoda měla splňovat. To je zásadní rozdíl proti antigenům typu steroidních hormonů, kdy je analyt možné přirovnat k běžné chemikálii, která během izolačních operací neztrácí nic ze své schopnosti interakce s příslušnou protilátkou. Otázkou je i to, zda jsou obecně všechny molekuly troponinu uvolněné ze srdečního svalu a nacházející se v séru či plazmě vždy skutečně imunoreaktivní a jak jsou imunoreaktivní v konkrétním reálném rutinním systému. Je nicméně zřejmé, že bez sérových sekundárních referenčních materiálů nedojde ke zlepšení korelace mezi jednotlivými komerčně dostupnými metodami. V minulém článku jsem se stručně zmínil o volání po „vyšší imunochemické metodě“, která by vyplnila „metrologickou mezeru“ mezi SRM 2921 a doposud neexistujícími sekundárními materiály. Pokusme se definovat, jaké nároky by taková referenční imunochemická metoda měla splňovat: i) musela by využívat protilátky cílené na epitopy umístěné v nevariabilních úsecích molekuly, ii) musela by poskytovat identické odezvy pro troponin I jak volný, tak vázaný v komplexech, iii) nesměla by být ovlivněna změnami struktury molekuly troponinu I, iv) SRM 2921 by se v ní musel chovat zaměnitelně, tj. poskytovat stejnou odezvu pro identickou koncentraci analytu jako v reálných vzorcích, v) protože by se jednalo o imunochemickou assay, musela by být výjimečně stabilní ve smyslu reprodukovatelnosti mezi jednotlivými šaržemi (stability a reprodukovatelnost přípravy protilátek, značení, atd.), vi) musela by být validována pomocí velkého množství klinicky dobře charakterizovaných indiciálních vzorků. Každý, kdo má zkušenosti s vývojem a výrobou imunochemických diagnostických zdravotnických prostředků, si dokáže představit, jak obtížný by to byl úkol, už jen z pohledu času a nákladů. Navíc, uvážíme-li, jaké prostředky byly v uplynulých letech jistě vynaloženy skutečně velkými hráči na trhu IVD na vývoj či zlepšování tak důležitého výrobku, jakým jsou prostředky pro stanovení troponinu I, ať již z hlediska klinického významu, tak s ohledem na velikost trhu, není vůbec jisté, že se podaří vyvinout imunochemické stanovení, které bude splňovat nároky kladené na sekundární referenční metodu. Řada komerčně dostupných metod totiž již dnes garantuje ekvimolární rozeznávání troponinu I, tedy kvantitativně stejnou odezvu na molekulu tohoto analytu, ať je vázán v komplexu nebo se ve vzorku vyskytuje volně. Dále někteří výrobci uvádějí, že použité protilátky jsou zaměřeny proti epitopům nacházejícím se ve stabilnější oblasti molekuly mezi polohou 30 a 110 v sekvenci aminokyselinových zbytků, která méně podléhá degradacím a změnám molekuly tak, aby byl výsledek stanovení ovlivněn co nejméně. Nabízí se ovšem jiná možnost, která byla, je a jistě i nadále bude využívána. Je jí jakési neformální, nicméně do značné míry obecně uznávané, postavení některé komerčně dostupné metody coby „zlatého standardu“, „obecné reference“, apod. Jedná se velmi často o případ, kdy to byl výrobce takovéto metody, kdo uvedl konkrétní parametr na trh, poté co vykonal podstatný díl výzkumné a validační práce a investoval nemalé úsilí do vybudování důvěry odborné veřejnosti k novému parametru. Příkladem budiž souprava pro stanovení PSA společnosti Hybritech, která svého času získala jako jediná certifikaci FDA pro využití ve screeningu karcinomu prostaty. Předcházelo tomu ovšem, kromě jiného, ověřování na mnoha tisících klinicky bezpečně charakterizovaných vzorků ve spolupráci s renomovanými urologickými pracovišti. Nebylo

22


proto divu, že většina ostatních výrobců uváděla ve prospěch svých výrobků dobrou korelaci se systémem Hybritech. U troponinu I takto uznávaná metodika patrně v současné době neexistuje, nicméně musím konstatovat, a to ne bez určité hrdosti, že řada registrací IVD pro stanovení troponinu I u FDA uvádí jako metodu, s níž výrobek koreluje, soupravu Access AccuTnI společnosti Beckman Coulter. Tím nemá být samozřejmě řečeno, že je postavení AccuTnI stejné jako tomu bylo v případě PSA Hybritech. Nicméně by výběr některé spolehlivé a všeobecně uznávané metody mohl být jistým krokem ke zlepšení mezimetodové reprodukovatelnosti. Obávám se však, že by narazil na řadu obtíží vyplývajících z obav konkurenčních výrobců a rovněž z toho, že by výrobce takovéto „referenční“ metody musel patrně zpřístupnit některé informace, které považuje za důvěrné. Z těchto důvodů tudy asi cesta nepovede. Nezbývá tedy než vyčkat, čím nás výbor AACC pro standardizaci troponinu I překvapí. Chtěl bych poznamenat, že s obtížemi se standardizací a tím pádem i s reprodukovatelností podobnými těm, které byly diskutovány v tomto textu, se setkáváme u řady jiných analytů-proteinů. Typickým příkladem je třeba CA 19-9. V takovýchto případech by výrobci měli v návodech k použití upozornit uživatele, že výsledky nejsou přenosné mezi jednotlivými metodami. Uživatelům pak lze doporučit, aby i v případě, kdy návod takovéto upozornění neobsahuje a zároveň neuvádí návaznost na vyšší referenční materiál či metodu, přistupovali k porovnávání výsledků získaných různými metodami s rezervou. Závěrem bych chtěl říci, že obdobné problémy nebo omezení nelze vyloučit u řady dalších metod určených pro stanovení analytů-proteinů imunochemickými metodami. Nikdy nelze např. zcela vyloučit proteolýzu a pokud vznikne fragment molekuly, kde je přítomen cílový epitop (v případě kompetitivního uspořádání), či oba epitopy (v případě sendvičového uspořádání), jeho kvantitativní odezva bude s velkou pravděpodobností jiná než u intaktní molekuly. Některé analyty (typicky rakovinné markery) jsou variabilní už ze své podstaty, např. CEA, neboť jsou produkovány buňkami, které mají proti normálním buňkám pozměněnou genetickou informaci. Tyto a některé další „nedostatky“ imunochemických metod jsou však podle mého názoru bohatě vyváženy jejich klady – dostupnost, selektivita, citlivost, výkonnost, atd. Navíc není v současné době k dispozici, např. na rozdíl od steroidních hormonů, alternativní způsob jejich stanovení. Je však třeba posuzovat jimi získané výsledky se znalostí všech výše uvedených omezení. PETR ŠMÍDL E-MAIL: [email protected]

Uživatelské setkání ve Znojmě (6. – 8. dubna 2008) radiční společné setkání uživatelů biochemických a imunochemických systémů Beckman Coulter jsme tentokrát zorganizovali v prostorách znojemského hotelu Prestige. Našimi hlavními tématy bylo uvedení na trh nového kombinovaného systému UniCel DxC 880i a automatizace laboratorních procesů. O své znalosti se s námi podělila naše kolegyně Antje Piening z Eurocentra našeho koncernu ve švýcarském Nyonu. Přednášky uživatelů byly věnovány kazuistikám a využití jednotlivých parametrů v diagnostice. Vzrušená diskuse následovala po přednáškách věnovaných legislativě, externímu hodnocení kvality, validacím a verifikacím v klinické laboratoři. Pro zájemce jsme zpestřili program přednáškami z imunologie a průtokové cytometrie. Velkým lákadlem byla prohlídka provozu Oddělení klinické biochemie v Nemocnici Znojmo. Touto cestou bychom chtěli ještě jednou poděkovat panu primáři MUDr.

Ivo Lerchovi a pracovníkům oddělení za trpělivost a čas, který všem návštěvníkům věnovali. Večery s hudbou, tancem a ochutnávkou vína jsme strávili v příjemných prostorách hotelového sklípku. Jako nejlepší znalci vína se projevili paní Oľga Brcková a Květa Tauchmanová, pan Petr Brzák a naše kolegyně Marika Gavelová. Organizaci těchto konferencí a seminářů a jejich odborné úrovni věnujeme velkou pozornost. Toto setkání bylo první z akcí, které jsme připravili v tomto roce pro uživatele našich systémů. V květnu proběhl v Telči technický seminář na téma FreeLiteTM. Na červen jsme připravili dvoudenní konferenci, která bude věnována genetice, analýze nukleových kyselin a buněčné analýze. Na podzim plánujeme setkání uživatelů produktů The Binding Site, tentokrát zaměřené na endokrinopatie, komplement a imunodeficience. Na konferenci uživatelů hematologických analyzátorů Beckman Coulter nám i letos přislíbil účast Dr. Ramon L. Simon. Všechny tyto akce jsou součástí odborného vzdělávání a jsou ohodnoceny příslušným počtem kreditů. PAVEL KRUŽÍK E-MAIL: [email protected]


23

Exportní útvar ývoz výrobků Immunotechu a.s. má dlouhou tradici. Před vznikem společnosti se uskutečňoval jako vývoz výrobků ÚVVVR do zemí východního bloku. Po r. 1990 byly dodávky přerušeny z důvodu rozpadu RVHP a především vzhledem k přechodu z plateb převoditelným rublem na volně směnitelné měny. Znamenalo to hledání nových partnerů a uzavírání nových kontraktů ve zcela liberálním obchodním prostředí. Lze konstatovat, že v průběhu několika let se podařilo dodávky nejen obnovit, ale výrobky Immunotechu se staly ve svém tržním segmemntu majoritními na trzích celé východní Evropy. V roce 2005 byla činnost exportního oddělení společnosti Immunotech Praha rozšířena o odpovědnost za vývoz manuálních imunodiagnistik i do ostatních zemí. Tato činnost byla převedena ze sesterské společnosti Immunotech S.A. Marseille. Náplň práce se tím podstatně rozšířila a rozsah naší působnosti sahá od Japonska až po např. Kubu. Našim úkolem je v jednotlivých zemích nacházet partnery – distributory, kteří následně zajišťují uvádění našich výrobků na lokální trh. S partnery kromě jiného projednáváme podmínky dodávek, obchodní strategii, cenovou politiku. Tu je nutné stanovovat s přihlédnutím ke kupní síle obyvatel, respektive k cenovým limitům na stanovení, proplácených místními pojišťovnami nebo státním rozpočtem, a samozřejmě také k činnosti konkurence. Nemalým

24


problémem je registrace výrobků na jednotlivých teritoriích. V těchto situacích si teprve uvědomujeme výhodu CE značky pro země EU. Manuální imunodiagnostické soupravy jsou dodávány do 60 zemí celého světa. Největšími z nich jsou země Středního Východu, Jižní Korea, Rusko, Francie, Německo, Řecko, Indie, Pákistán, Itálie. Do těchto zemí bylo v roce 2007 odesláno více než 200 tisíc souprav. V roce 2005 se stala součástí společnosti Beckman Coulter dříve konkurenční společnost Diagnostic System Laboratories. Tímto spojením se Beckman Coulter stal světovým lídrem v oblasti RIA. Spojením protfolií a distribučních sítí obou společností vzniká možnost dalšího rozšíření našich aktivit, především do oblasti Latinské Ameriky, ale i do ostatních zemí. V roce 2007 se v porovnání s předcházejícím rokem podařilo zvýšit prodeje manuálních imunodiagnostických souprav o více než 15%. V tomto trendu chceme pokračovat i v následujících letech a jsme přesvědčeni, že portfolio, kvalita i zájem o naše výrobky dává záruky tohoto cíle dosáhnout. JOSEF KRANDA E-MAIL: [email protected]

o celou dobu své dosavadní existence společnost Immunotech a.s. stavěla svou činnost na třech hlavních pilířích - vývoji, výrobě a prodeji imunodiagnostických prostředků pro humánní medicínu. To platilo a platí i nadále, neboť útvar vývoje diagnostických souprav je nedílnou součástí společnosti Immunotech od samého počátku. Náplň útvaru je možné rozdělit do tří aktivit. První tvoří vývoj nových souprav doplňujících stávající sortiment dle produktových řad. Dále je to vývoj nových verzí již existujících souprav. Třetí aktivitou je snaha o vývoj soupravy na stanovení zcela nového analytu, tedy analytu, který se na trhu dosud nevyskytuje. Od roku 1992 bylo vyvinuto 52 imunodiagnostických souprav, převážná část (37) ve formátu radioaktivních (RIA, IRMA) menší část pak ve formátu ELISA s klasickou kolorimetrickou detekcí či detekcí luminiscenční. Součástí útvaru je rovněž laboratoř přípravy protilátek. V této laboratoři jsou připravovány polyklonální i monoklonální protilátky, a to v průběhu řešení vývojového projektu a následně pak také pro

Útvar výzkumu a vývoje potřeby výroby nového produktu. V případě monoklonálních protilátek je využívána jak metoda in vivo, tak metoda in vitro. Činnost útvaru je plně ve shodě s normou ISO 13485 2003 a interními dokumenty koncernu Beckman Coulter pro vývoj IVD. Pro přípravu protilátek jsou využívána laboratorní zvířata, jejichž chov a zacházení s nimi se řídí vyhláškou 207/2004 Sb. o ochraně, chovu a využití pokusných zvířat a dále dle zákona 246/1992 Sb. na ochranu zvířat proti týrání. V některých oblastech činnosti je nezbytná spolupráce s externími organizacemi. Jde především o oblast klinických validací nových výrobků, kde spolupracujeme s předními klinickými pracovišti. V posledních letech intenzivně spolupracujeme s firmou Generi-Biotech. Jedná se o problematiku vývoje rekombinantních proteinů použitelných pro přípravu protilátek a pro konstrukci imunodiagnostických souprav. V souvislosti s rozhodnutím vedení koncernu centralizovat výrobu všech manuálních radioaktivních souprav do Prahy dochází k rozšíření aktivit útvaru výzkumu a vývoje. Díky tomuto rozšíření bude možné zajistit nutnou podporu pro narůstající výrobu a řešení problémů souvisejících s převodem souprav z jiných lokalit do Prahy. V některých případech souvisí převod do Prahy také s přepracováním soupravy tak, aby vyhovovala zvyšujícím se nárokům našich zákazníků. JAN PLICKA E-MAIL: [email protected]


25

Inhibin A – CE certifikace pro screening vrozených vývojových vad V loňském roce jsme Vám představili novinku v reprodukčním panelu firmy Beckman Coulter pro stanovení na analyzátorech řady Access a DxI – Inhibin A. V současné době tato souprava získala CE certifikát pro screening vrozených vývojových vad. Je tedy možno používat soupravu zejména při stanovení rizika trisomíí 21 (Downův syndrom) v rámci kombinovaného screeningu ve druhém trimestru těhotenství.

Údaje pro objednání: PN

Název

A36097

Access Inhibin A 2x50 tests

A36098

Access Inhibin A Calibrators (7x2,5 ml)

A36100

Access Inhibin A QC (3 hladiny, 2x2,5 ml) TEREZA TIETZE E-MAIL: [email protected]

Solubilní transferinový receptor – nový člen rodiny Beckman Coulter V letošním roce se opět rozrostla skupina imunochemických stanovení anemií, tentokrát o stanovení solubilního transferinového receptoru (sTfR). Toto stanovení umožňuje především odlišit anemii způsobenou nedostatkem železa od jiných typů anemií. Firma Beckman Coulter teď nabízí jako jediná na imunochemických analyzátorech řady Access a DxI kompletní panel pro stanovení anemií, který ideálně Údaje pro objednání: PN

Název

A32493

Access sTfR 2x50 tests

A32494

Access sTfR Calibrators (1x4 ml; 5x 2,5 ml)

doplňuje výsledky získané hematologickými analyzátory: Ferritin Vitamin B12 Folát Folát v červených krvinkách (RBC folát) Erytropoetin Protilátky proti vnitřnímu faktoru (IfAb) Solubilní transferinový receptor TEREZA TIETZE E-MAIL: [email protected]

Pozvánka na akci DNA Analýza V. (4.- 5. června 2008) Místo konání akce: hotel Novotel Kateřinská ulice, Praha 2 1. den - genetika a analýza nukleových kyselin 2. den - buněčná analýza Přihlášky, prosím, posílejte na e-mail: [email protected]

26


Slovenská křížovka

Česká křížovka

Křížovka o ceny Máte testy na stanovení výše hladiny cholesterolu, iontů, enzymů a všeho možného, ale už někdo vymyslel test na to, jestli mě má nastávající bude po svatbě… (Tajenka.)

Máte testy na stanovenie výšky hladiny cholesterolu, iónov, enzýmov a všetkého možného, ale vymyslel už niekto test na to, či ma moja nastávajúca bude po svadbe… (Tajnička.)

Pro 3 vylosované úspěšné luštitele jsou připraveny zajímavé ceny! Tajenky zasílejte e-mailem na adresu: [email protected] do 31. 7. 2008. Do předmětu uveďte „TAJENKA“. Nezapomeňte také, prosím, uvést své konaktní údaje. TAJENKA Z MINULÉHO ČÍSLA: TŘICET KORUN, PANE DOKTORE! Výherci: Jana Doupovcová, Anna Moravčíková, Zdenka Ulčová-Gallová.


27

Kde se můžeme setkat (červen – září 2008) Konference/seminář s účastí společnosti Immunotech formou stánku 1. – 3. 6. 2008

12. - 14. 6. 2008

VIII. Zjazd SSKB Bratislava

Laboratórna diagnostika v medicíně 2008 Spišská Nová Ves

Slovenskou konferencí laboratorní hematologie Špindlerův Mlýn

1. – 3. 6. 2008

18. - 20. 6. 2008

10. 9. 2008

BIOLAB Brno

XXVI. Mezikrajské dny klinické biochemie Tábor/Sezimovo Ústí

Severočeský imunologický seminář Ústí nad Labem

4. - 5. 6. 2008

1. - 4. 9. 2008

14. - 16. 9. 2008

DNA analýza Praha

60. jubilejní sjezd Asociací českých a slovenských chemických společností Olomouc

FONS Pardubice

14. - 17. 9. 2008

9. - 10. 6. 2008 Seminář Moravskoslezského kraje Žermanice

5. - 9. 9. 2008 XV. Česko-Slovenský hematologický a transfuziologický sjezd spolu s IX. Česko-

XXI. Sjezd ČSBMB České Budějovice

informační magazín číslo

Recommend Documents