informační magazín číslo

informační magazín číslo 5 - 2007

AUTOMATICKÝ ANALYZÁTOR UNICEL® DXC 800 V RUTINNÍM PROVOZU TŘÍLETÁ ZKUŠENOST SE SMĚRNICÍ O IVD MD PRŮTOKOVÝ CYTOMETR CELL LAB QUANTA SC MPL

Akreditace klinických laboratoří v ČR Problematika kvality práce laboratorního komplementu a certifikace a akreditace laboratoří nabývají v poslední době na významu. Položil jsem několik otázek na toto téma našemu přednímu odborníkovi v oblasti laboratorní medicíny, Prof. MUDr. Tomáši Zimovi, DrSc. MBA, přednostovi Ústavu klinické biochemie a laboratorní diagnostiky 1. LF UK a VFN, děkanovi 1. LF UK a předsedovi České společnosti klinické biochemie. Jaké jsou možnosti prokazovat kvalitu laboratoří? Řada laboratoří u nás poskytuje kvalitní laboratorní služby včetně konzultační činnosti pro zdravotníky i pacienty. Kvalita jednotlivých činností koncem 20. a na počátku 21. století se prokazuje posouzením nezávislými experty podle určitých standardů či norem. Ve zdravotnictví obecně se uplatňuje několik přístupů. Jedním z průkazů kvality laboratorního stanovení je úspěšná účast v externím hodnocení kvality. Dále to je systém certifikace dle ISO 9001, akreditace dle ISO 15189 případně 17025, dále je možná akreditace klinických laboratoří popřípadě celých zdravotnických zařízení systémem JCI standardů, akreditace klinických laboratoří dle CPA standardů (používá se především v UK) nebo CAP v klinických laboratořích. Tyto přístupy jsou mezinárodní a srovnatelné na celém světě. K nim přistupují systémy s národní platností jako je audit klinických laboratoří prostřednictvím NASKL nebo akreditace zdravotnických zařízení SAK (Sdružená akreditační komise). Jaký je mezinárodní přístup k akreditaci laboratoří? V zemích EU jsou země, kde je většina laboratoří akreditována (např. skandinávské státy) dle ISO 17025 a které se dle sdělení kolegů ze Švédska zatím nechystají přejít na normu 15189. Jiné země se akreditují dle národních standardů jako například v Holandsku. Ve Velké Británii existují oba způsoby akreditace systémem národního akreditačního orgánu a samostatně stojící organizace pro akreditaci laboratoří, zde však došlo k dohodě o propojení obou systémů. Řada laboratoří je akreditována dle ISO 15189. Jaká je situace u nás? U nás byly nejprve laboratoře akreditovány dle ISO 17025. Byly to laboratoře zdravotnických ústavů, následně referenční laboratoře a některá klinická pracoviště. Od zavedení normy ISO 15189 se klinické laboratoře akreditují podle této normy a počet těchto laboratoří postupně stoupá a v současné době jich je asi 30. Jak může lékař rozpoznat kvalitní laboratoř? Rozlišení laboratoře kvalitní, se kterou by měl lékař či zdravotnické zařízení spolupracovat, od ostatních se může jevit jako obtížné, avšak lze uvést několik základních kritérií. Jedním ze základních kritérií je schopnost laboratoře poskytovat poradenskou a konzultační službu pro lékaře s informacemi nejen o spektru svých vyšetření, ale i o ostatních méně častých analýzách. Lékaři by měla laboratoř poskytnout informaci, které analyty vyšetřuje a které předává do jiných laboratoří k vyšetření. Lékař, pokud spolupracuje s některou laboratoří řadu let, by měl zvážit, zda mu změna laboratoře, která je někdy nabízena, přinese lepší kvalitu. Klíčovým kritériem je také rychlost provedení vyšetření pro pacienta. Moderní analytická technika umožňuje provést většinu laboratorních vyšetření tentýž den, a tak pacient nemusí čekat třeba

2


týden na výsledek. Jedním ze způsobů prokazování kvality práce v laboratoři je postupné zavádění certifikace dle normy ISO 9001 a akreditace dle ISO 15189 nebo 17025. Jsou také akreditovány celá zdravotnická zařízení podle mezinárodních standardů. Jaké myslíte, že jsou základní požadavky na zdravotnické laboratoře? Základní požadavky a kritéria pro laboratoře z hlediska klienta – lékaře, zdravotnického zařízení či pacienta jsou dostupnost a komplexnost služeb, rychlá odezva laboratoře, spolehlivost a správnost výsledků, informovanost a konzultace o prováděných činnostech, ale také analýza stížností a reklamací. Jak pokračujete v zavádění systémů kvality na Vašem Ústavu? Od udělení akreditace dle ISO 17025 v roce 2004 se řada věcí změnila. Při pravidelných dozorových návštěvách jsme postupně rozšiřovali počet akreditovaných metod nejen v klinické biochemii, ale také v sérologii a molekulární biologii. Začali jsme také s implementací požadavků ISO 15189 do dalších laboratoří našeho Ústavu. Na jaře 2007 nás čeká reakreditace. Při stanovení další strategie v oblasti kvality vycházíme z toho, že laboratoře v Ústavu jsou různého zaměření. Naším cílem je implementovat ISO 15189 do laboratoří klinické mikrobiologie a ATB centra, laboratoří klinické imunologie a alergologie a klinicko-biochemické laboratoře v areálu dětské kliniky na Karlově a tím významně rozšířit počet akreditovaných metod v širokém spektru laboratorní medicíny. V závislosti na typu laboratoře budeme zároveň udržovat akreditaci dle ISO 17025, popř. akreditaci podle obou norem souběžně. ŠTĚPÁN TINTĚRA [email protected]

Obsah Automatický analyzátor UniCel® DxC 800 v rutinním provozu

4

Automatický biochemický analyzátor UniCel® DxC 800 je plně automatizovaný, analyzátor pro in vitro stanovení s kapacitou 1440 testů/hod. Zkušenosti z ročního provozu analyzátorů UniCel® DxC800 v biochemickém úseku OKBHI NNH.

Šetřte svůj čas...

8

Nabízíme jednoduché a účelné řešení preanalytické, analytické i postanalytické fáze zpracování vzorků v klinické laboratoři. Analyzátory Beckman Coulter řady UniCel (biochemické a imunochemické analyzátory) používají shodné kompatibilní stojánky na vzorky.

Vidíte do zkumavky?

8

Funkce kontroly kvality a integrity vzorku a polychromatické korekce analyzátorů UniCel® DxC 600/800

Analýzy bez prostojů

9

Předepsaná údržba pro biochemické analyzátory řady UniCel DxC® Beckman Coulter aneb kolik strávíte času údržbou ve vaší laboratoři.

Časopis vydává a distribuuje IMMUNOTECH a.s., Radiová 1, 102 27 Praha 10

Tříletá zkušenost se směrnicí o IVD MD

Časopis připravují

7. prosince 2006 uplynuly tři roky od data, kdy začala být v členských zemích EU a EFTA uplatňována Směrnice 98/79/ES o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro (IVD MD). Stejný stav měl nastat v ČR v den vstupu ČR do EU 1. května 2004.

Mgr. Jiří Moos, CSc. Mgr. Pavel Kružík Mgr. Patrik Šaf RNDr. Helena Kurzweilová RNDr. Běla Říčařová, CSc. Ing. Petr Suchan Mgr. Markéta Krupařová Ing. Roman Šandrik, PhD. Ing. Kateřina Ťuková Ing. Lukáš Palivec, PhD.

Do časopisu přispěli Prof. MUDr. Tomáš Zima, DrSc. MBA, VFN RNDr. Štěpán Tintěra Ing. Ladislava Dubská, Nemocnice Na Homolce Ing. Miroslav Bischof Ing. Petr Šmídl Prof. MUDr. Ondřej Topolčan, CSc., FN Plzeň Mgr. Pavel Kružík MUDr. Tomáš Soukup, LF UK Hradec Králové Mgr. Jiří Moos, CSc. Ing. Roman Vlček RNDr. Helena Kurzweilová Mgr. Hana Machová Mgr. Markéta Krupařová Ing. Petr Suchan - titulní foto

11

Diagnostický a prognostický význam thymidinkinázy (TK) u nádorových onemocnění

12

Průtokový cytometr CELL LAB QUANTA SC MPL

15

Průtokové cytometry QUANTA SC MPL jsou určeny pro výzkumné aplikace. Kombinují měření objemu buněk Coulterovou metodou, rozptylu světla (Side Scatter) a fluorescencí na třech fotonásobičích s použitím více zdrojů světla. Na měření objemu nemá vliv tvar, barva a optické vlastnosti částic.

Stanovení základních biologických charakteristik v laboratoři tkáňových kultur

18

Buňka je základní strukturní a funkční jednotkou živé hmoty – hovoříme o tzv. buněčném principu organizace živých systémů. Každá buňka tak představuje hmotný, konečný, otevřený a hierarchicky uspořádaný systém, který je vysoce adaptivní, schopný autoregulace a autoreprodukce

Immunotech a.s. Beckman Coulter a jeho sponzorská činnost

22

Nina Nováková

Pozvánky na akce

23

Tiskárna

Pozvánka na přehlídku nabídky přístrojů firmy Beckman Coulter, Inspekce rotorů do ultracentrifug a vysokovýkonných centrifug, Seminář DNA analýza IV

Grafická podoba

REPRO servis s. r. o. Starochuchelská 15/195, 159 00 Praha 5

Náklad čísla 1400 výtisků

Kde se můžeme setkat (březen – červen 2007) Konference/seminář s účastí společnosti Immunotech, a.s. formou stánku


3

24

Obr. 1: UniCel® DxC 800, Beckman Coulter

kem tedy může být najednou v analyzátoru 40 vzorků. Ze vzorkového karuselu jsou vzorky pipetovány do MC a CC části dvěma pipetory. Každý z nich je opatřen detektorem sraženin. Ihned po napipetování vzorku jsou sektory vysunuty do prostoru, odkud je lze vyjmout.

MC část (Modular Chemistry)

Automatický analyzátor UniCel® DxC 800 v rutinním provozu Úvod Automatický biochemický analyzátor UniCel® DxC 800 (obr. 1) je plně automatizovaný analyzátor pro in vitro stanovení s kapacitou 1440 testů/hod. Na biochemický úsek OKBHI NNH byl tento analyzátor nainstalován v prosinci 2005, v lednu 2006 následovala instalace druhého, stejného typu analyzátoru. Na analyzátorech se denně zpracovává v rutinním provozu cca 450-500 vzorků sér nebo plasem, cca 100 vzorků močí a asi 10-15 vzorků mozkomíšních moků, dalších 60-80 vzorků se zpracovává v odpolední a noční pohotovostní službě. Obsluhu každého analyzátoru zajišťuje během řádné pracovní doby 1 laborantka.

Popis analyzátoru Analyzátor se skládá z následujících částí: sektor pro manipulaci se vzorky, MC část (Modular Chemistry), CC část (Cartridge Chemistry), reakční karusel, dvojitý reagenční karusel a řídící PC.

Sektor pro manipulaci se vzorky Vzorky jsou do analyzátoru vsunovány ve vzorkových sektorech se čtyřmi pozicemi pro zkumavky, příp. kepíky. Vstupní pás je lineární, má prostor pro 25 stojánků a lze jej napojit na preanalytickou linku. Analyzátor může být vybaven propichovačem uzavřených zkumavek. Samozřejmou výbavou je čtečka čárových kódů pro načítání sektorů, práci s primárními zkumavkami a čtení čárového kódu na pozadí. V sektorech jsou vzorky vsunuty pomocí podavače do vzorkového karuselu. Vzorkový karusel má deset pozic, z toho dvě pro statimové vzorky. Cel-

Obr. 2: MC část (Modular Chemistry)

V této části se provádějí rychlá statimová stanovení analytů na elektrodách nebo fotometricky (obr. 2). MC část umožňuje stanovení Na, K, Cl, Ca (ISE) (obr. 3), glukózy (kyslíkový senzor), albuminu (BCP), celkové bílkoviny (biuret), močoviny (vodivostní elda), fosforu (fosfomolybdátová metoda) a kreatininu (alkalický pikrát). Reagenční roztoky jsou dodávány ve dvoulitrových kanystrech, opatřených čárovým kódem, v kterém je zakódován název, šarže a objem (obr. 4). K měření elektrolytů se vzorek ředí pufrem. Elektrody pro měření draslíku, chloridů a vápníku jsou opatřeny výměnnými špičkami, které se v odpovídajících periodách jednoduchým způsobem vymění a jakákoliv jejich další údržba (broušení, leštění apod.) odpadá. Na základě naší roční zkušenosti lze konstatovat, že životnost jednotlivých membrán je významně delší, než jakou garantuje výrobce. Dalším prvkem, který je v MC části určen k pravidelné obměně, je glukózový senzor. V podmínkách naší laboratoře byla životnost senzoru 8 měsíců. Výsledky měření na MC části jsou k dispozici do 42 sec, pokud je analyzátor v chodu, pokud startuje ze standby, pak jsou výsledky z této části změřeny do 2 minut.

CC část (Cartridge Chemistry) (obr. 5) V této části analyzátoru probíhají fotometrická měření. Reagencie pro tuto část analyzátoru jsou

Obr. 5: CC část (Cartridge Chemistry) Obr. 6: Dvojitý reagenční karusel

Obr. 4: Zásobní roztoky pro MC část

dodávány v reagenčních zásobnících, rozdělených vnitřními přepážkami na tři oddělené prostory. Zásobníky jsou uchovávány v dvojitém reagenčním karuselu s kapacitou 59 pozic (obr. 6). Reagenční karusel je chlazen na 2 – 8 °C. Ve vstupní části karuselu jsou umístěny dvě čtečky čárových kódů, každá z nich je určena pro jedno patro karuselu. Z čárového kódu je, podobně jako u MC roztoků, načten název a šarže reagencií. Počet testů je upřesněn po kontrole hladiny roztoků pomocí senzorů na reagenčních pipetorech. Vzhledem k tomu, že analyzátor je zcela otevřený systém, lze používat i reagencie uživatelské (UDR). Tyto reagencie je třeba zadávat manuálně z klávesnice řídícího PC. Z reagenčního karuselu jsou roztoky pipetovány do kyvet reakčního karuselu pomocí dvou reagenčních jehel. Reakční karusel obsahuje 125 skleněných kyvet s optickou dráhou paprsku 0,5 cm a výškou 30 mm. Po každém přídavku reagencie nebo vzorku do kyvety je obsah

Obr. 3: ISE modul

kyvety promíchán vysokorychlostním zlaceným rotačním míchadlem. Míchadla jsou poté omyta a osušena v příslušné mycí cele. Reagenční jehly mají své mycí stanice umístěny přímo na konci pipetorů a proces mytí probíhá během pohybu jehly. Zdvojené reagenční jehly a časově úsporný způsob mytí umožnily zkrátit takt analyzátoru na 8 sekund. Fotometr se skládá z xenonové pulzní lampy, silikon-diodového pole, monochromátoru a příslušné elektroniky. Jako doplňkový modul lze požadovat také modul NIPIA pro imunochemická stanovení. Promývací stanice kyvet se skládá ze čtyř jehel, zvedacího zařízení a příslušných hadiček. Mycí stanice odsává obsah kyvet po reakci, provádí proplach mycím roztokem a destilovanou vodou a nakonec setření vnitřního povrchu kyvet stírátkem. Pryžové stírátko je třeba pravidelně kontrolovat, při opotřebování je nutná výměna. Na našem pracovišti jej měníme přibližně v intervalu 4 týdnů. Ovládací prvky analyzátoru Analyzátor se ovládá prostřednictvím ovládacích tlačítek (RUN, STOP, PRIORITY), základní provozní funkce jsou řízeny prostřednictvím dotykové obrazovky, lze používat i klávesnici a myš. Software analyzátoru Software je velice logický, přehledný a snadno pochopitelný. Hlavní obslužná obrazovka informuje nejen o aktuálním stavu systému (STANDBY, RUNNING, STOPPED aj.) ale např. i o komunikační aktivitě mezi analyzátorem a LIS. Zobrazuje obsazenost analyzátoru sektory, včetně přehledu vzorků a fáze jejich zpracování. Podrobná informace o požadovaných testech u jednotlivých vzorků se zobrazí po kliknutí na příslušný vzorek. V horní části obrazovky je řada ikon, z kterých vycházejí provozní a progra-

Na základě naší roční zkušenosti lze konstatovat, že životnost jednotlivých membrán je významně delší, než jakou garantuje výrobce.


5

Kontrolní vzorek může být v analyzátoru zpracován po manuálním zadání na sektor/pozici a po výběru testů, nebo automaticky, pokud jsou kontrolní materiály označeny čárovým kódem. movací funkce: programování vzorku, databáze výsledků, přehled reagencií, databáze kontrol, systém setup, údržba, pokyny a nápověda. Programování vzorků - optimálním řešením je zpracovávání primárních zkumavek s čárovým kódem, napojení analyzátoru na LIS a obousměrný přenos dat. Napojení s laboratorním informačním systémem INFOLAB (ing. Paclt a Mgr. Stávek) je zcela bezproblémové. Manuální programování vyžaduje zadání stojánku a pozice, ID vzorku, typ vzorku a výběr požadovaných testů. Je třeba upozornit na to, že posun kurzoru mezi jednotlivými aktivními poli lze realizovat pomocí myši nebo tabelátorem, nelze použít ENTER. Ze stejné obrazovky, ze které se programují vzorky, lze manuálně programovat i provedení kontrol, pokud pro ně nepoužíváme čárové kódy. Software na této obrazovce umožňuje dále zadat: RERUN (opakování měření všech nebo vybraných testů), CLEAR (smazání sektoru, pozice či vzorku), OPTION (např. zadání ručního ředění, umožňuje modifikovat počet opakování vzorku), BATCH (programování vzorků v dávkách), přehled naprogramovaných vzorků aj. Databáze výsledků – umožňuje vyhledat, zobrazit a tisknout pacientské a kontrolní výsledky dle zvoleného kritéria. V paměti systému může být uchováno max. 150 000 výsledků. Po naplnění této kapacity začíná systém chronologicky přepisovat nejstarší výsledky. V této databázi lze také vyvolat k výsledkům odpovídající graf absorbance v závislosti na čase (ABS). To je vhodná pomůcka při odstraňování problémů u dokončených výsledků metod. Systém setup (nastavení systému) – zahrnuje 29 funkcí nastavení systému. Mnohé z nich se nastavují jen jednou, při instalaci systému (např. datum/čas, jazyk, alarm, výběr jednotek u originálních metod, nastavení Obr. 7: Inventura reagencií CC části čárového kódu, komunikace s LIS aj.), nebo se jejich nastavení nemusí vůbec provést (např. zadání hesla, kterým je možno chránit některé funkce analyzátoru). S některými z nich se průběžně pracuje, mění se a doplňují (např. konfigurace nabídky metod, nastavení panelů, vytvoření programu pro uživatelské reagencie, nastavení referenčních/kritických rozsahů u metod aj.). Přehled reagencií (vkládání/ kalibrace) - v této části menu je přehled všech reagencií, které jsou vloženy v analyzátoru. Pro reagencie v MC části jsou v přehledu uvedena v % množství roztoků, která v kanystrech zbývají, dále pak informace o době, po kterou je reagencie v analyzátoru a kalibrační status. Pořa-

6


dí metod v této části přehledu je fixní. Na dalších obrazovkách je přehled zásobníků v CC části, u každého zásobníku je uveden aktuální počet zbývajících testů, exspirace a kalibrační status. Tuto část inventury lze uspořádat podle požadavků uživatele, a to podle pořadí v karuselu, podle počtu zbývajících testů, podle doby exspirace reagencie nebo kalibrace. V naší laboratoři používáme setřídění podle abecedy, neboť využíváme možnosti naplnit do analyzátoru více zásobníků pro jednu metodu a v abecedním seznamu je pak velmi přehledné, kolik testů pro danou metodu máme aktuálně připraveno (obr. 7). Z této obrazovky se také aktivuje vkládání nového zásobníku a kalibrace metod. Velkou výhodou je, že vkládání dalších zásobníků lze provádět za chodu analyzátoru. S MC reagenciemi jsou spojeny i další roztoky: odpěňovací No Foam a koncentrát mycího roztoku Wash Concentrate Buffer II (příp. mazivo pro propichovač uzavřených zkumavek) (obr. 8). Kalibrace: u kalibrátorů na bázi séra je nutné vložení kalibrační diskety. Pro kalibraci reagencie je třeba přiřadit kalibrátoru číslo stojánku/pozici nebo jeho ID. U uživatelských metod musíme pro kalibrátory vyčlenit příslušný počet pozic v sektorech. Kalibrace uživatelských metod, na rozdíl od originálních metod, nelze sdružovat, přestože je použit jeden kalibrátor. Pro kalibraci metod stanovení enzymů dle IFCC je k dispozici Enzyme Validator. Kontrola jakosti – QC menu umožňuje nadefinovat 1-100 kontrolních materiálů názvem

Obr. 9: Grafické znázornění QC

a šarží. Pro každou metodu se zadává cílová hodnota a směrodatná odchylka. Pro jeden kontrolní materiál je možné konfigurovat max. 175 metod. Frekvenci provádění kontrolních měření si určuje uživatel dle vlastního systému řízení kvality zavedeného v laboratoři. Hodnoty měření kontrolních materiálů jsou ukládány v databázi analyzátoru a lze je presentovat v podobě numerického přehledu i v grafické podobě (obr. 9). V sumárním přehledu jsou také uvedeny základní statistické parametry (počet měření, průměr, směrodatná odchylka, variační koeficient). Kontrolní vzorek může být v analyzátoru zpracován po manuálním zadání na sektor/pozici a po výběru testů, nebo automaticky, pokud jsou kontrolní materiály označeny čárovým kódem. Pro zpracování kontrolních vzorků označených čárovým kódem je třeba aktivovat funkci Auto Generation of Control. Při aktivaci této funkce lze také aktivovat funkci Multiple Cartridge. Pokud je tato funkce aktivována, provádí se kontrolní měření ze všech zásobníků, které jsou v daném okamžiku v analyzátoru umístěny. V opačném případě probíhá kontrolní měření u metod, které mají osazeno více zásobníků, jen ze zásobníku, který byl vložen dříve.

Uživatelsky definovaná metoda Analyzátor UniCel® DxC 800 je otevřený systém, v software (system setup) lze definovat až 100 uživatelských metod pro metodiky endpoint, kinetické, metody kalibrovatelné i metody nevyžadující kalibraci. Je třeba nastavit následující parametry: ■ název metody (max. 4 alfanumerické znaky) ■ typ reakce (endpoint, kinetika) ■ jednotky, přesnost, směr reakce, matematický model (lineární, nelineární) ■ primární vlnová délka (výběr z 10 vlnových délek: 340, 380, 410, 470, 520, 560, 600, 650, 670 nebo 700 nm) ■ sekundární vlnová délka (výběr ze stejných vlnových délek) ■ počet kalibrátorů (0-6), hodnoty kalibrátorů, doba platnosti kalibrace ■ reagenční objemy (celkem 200-327 ul) (dávkování reagencií: čas přidání vzorku: 0, primární pipetování reagencie: -180 sec, pipetování druhé reagencie: lze od -180 do 738 sec, reálně jsou reagencie pipetovány v 8 sec intervalech, dávkování třetí reagencie: -172,9 až 738 sec ■ objem vzorku (3-40 ul) ■ časy odečtu pro blank (start:-180 až 1704 s, konec: 180-1720 s) ■ časy odečtu pro reakci (start:1 až 1704 s, konec: 9 až 1720 s) ■ použitelná rozmezí výsledků ■ chybové detekční limity

Údržba V software analyzátoru je instalován elektronický deník údržby. Je to vhodná pomůcka pro sledování toho, jaká údržba má být provedena, kdy je nutné ji provést, a zároveň lze zaznamenat, kým byla údržba provedena. Intervaly prováděné údržby jsou stanovené pro analyzátor, na kterém se zpracuje cca 400 vzorků denně. Údržba je plánována v následujících intervalech: každý týden, měsíc, dva měsíce, tři měsíce, čtyři měsíce, šest měsíců. Velmi se nám osvědčilo skutečně pravidelnou údržbu provádět. Rozhodně poctivé provádění týdenní, měsíční a dvouměsíční údržby je doporučeníhodné. Výměnu špičky u vápníkové a draslíkové elektrody provádíme dle potřeby. Také výměna glukózového senzoru je prováděna ad hoc.

Závěr Na základě zkušeností z ročního provozu analyzátorů Uni®Cel DxC 800 v biochemickém úseku OKBHI NNH můžeme konstatovat, že se jedná o velice vydařený produkt firmy Beckman Coulter, spolehlivé, robustní a výkonné zařízení, které si pro snadnou obsluhovatelnost a programovatelnost získalo oblibu nejen u laborantek, ale i u provozních chemiků v naší laboratoři. Dodávky reagencií od firmy Immunotech a.s. jsou řešeny obratem, také servisní podpora je na výborné úrovni. ING. LADISLAVA DUBSKÁ, OKBHI-NEMOCNICE NA HOMOLCE, ROENTGENOVA 2, 150 30 PRAHA 5, E-MAIL: [email protected], FOTO: VLADIMÍR STUDNIČKA, NNH

Obr. 8: Systémové roztoky


7

Obr. 1

Vidíte do zkumavky? Funkce kontroly kvality a integrity vzorku a polychromatické korekce analyzátorů UniCel® DxC 600/800

Šetřte svůj čas.. abízíme jednoduché a účelné řešení preanalytické, analytické i postanalytické fáze zpracování vzorků v klinické laboratoři. Analyzátory Beckman Coulter řady UniCel® (biochemické a imunochemické analyzátory) používají shodné kompatibilní stojánky na vzorky (obr. 1). Do těchto stojánků lze současně vkládat primární i sekundární zkumavky a různý typ materiálu (sérum, plasma, moč, likvor). Biochemické a imunochemické vzorky se vkládají do stojánků přímo bez třídění. Stojánky se vzorky se následně centrifugují v centrifuze SPINCHRON DLX. Odpadá ruční manipulace se zkumavkami před a po centrifugaci. Vzorky ve stojánku se po centrifugaci přímo vkládají do imunochemického analyzátoru UniCel® DxI 800. Po aspiraci příslušných objemů se stojánky se zkumavkami, které jsou uvolněny z imunochemického analyzátoru, vloží přímo do biochemického analyzátoru UniCel® DxC. Doba zádrže vzorků v jednotlivých analyzátorech je minimální. Imunochemický analyzátor UniCel® DxI 800 uvolní stojánek se 4 zkumavkami do 2 minut, biochemický analyzátor uvolní stojánek po 10 minutách. Biochemický analyzátor UniCel® DxC může být vybaven automatizovaným propichováním uzávěrů (Obr. 2). Odpadá manuální odstranění zátek u statimových i rutinních vzorků. Analyzátory Beckman Coulter lze napojit na řídící SW DataManagement REMISOL 2000, který komunikuje s LIS/NIS jen jedním napojením. Systém umožňuje aktivně sledovat vzorek v reálném čase, vyhodnocovat kontrolní vzorky, provádět autovalidaci výsledků podle analytických a lékařských kritérií a další řadu funkcí. Redukuje se pracnost, šetří se čas a zvyšuje se kvalita vydávaných výsledků a bezpečnost práce. Snižuje se celkový čas TAT. MIROSLAV BISCHOF [email protected]

Obr. 2

8


Každý vzorek při zapnutí této funkce je automaticky analyzován za účelem zjištění hemolýzy, ikterických vzorků a lipémie. V protokolu výsledku jsou zahrnuty numerické hodnoty (indexy) pro relativní koncentrace (rozsahy) uvedených interferencí. Hodnoty jsou automaticky odesílány přímo do LIS či do SW DataManagement REMISOL 2000, kde lze nastavit pravidla pro další analytické či lékařské automatické hodnocení (autovalidaci) výsledků. Hodnoty se tisknou v pacientském protokolu pod oblastí pro speciální výpočty. Funkce Auto Serum Index slouží pro účely posouzení integrity vzorku; hodnoty nemají diagnostický význam. Pro měření se používá reagencie DIL1, která je v analyzátoru a vkládá se jako ostatní reagencie. Analyzátor změří vzorek s reagencií při 5 různých vlnových délkách 340, 410, 470, 600 a 670 nanometrů a vyhodnotí automaticky příslušný index pro hemolýzu (hemoglobin), ikteritu (bilirubin) a lipémii. Vzorky jsou shodné jako pro rutinní stanovení. Doporučuje se čerstvé sérum nebo plasma, které je odděleno co nejdříve od červených krvinek. Doporučený limit je do dvou hodin. Oddělené sérum nebo plasma se nemá skladovat déle než 8 hodin při teplotě +15 °C až +30 °C. Pokud nejsou měření provedena do 8 hodin, sérum nebo plasma se může skladovat při teplotě +2 °C až +8 °C. Pokud nejsou měření provedena do 48 hodin nebo

Funkce kontroly kvality a integrity vzorku umožňuje obsluze pracovat s primárními či sekundárním zkumavkami v plně automatizovaném režimu, bez nutnosti manuální vizuální kontroly.

budou vzorky skladovány déle než 48 hodin, musí být vzorky zamraženy a uchovány při -15°C až 20°C. Zamražené vzorky se mohou po rozmražení analyzovat jen jednou.

Analýzy bez prostojů Předepsaná údržba pro biochemické analyzátory řady UniCel® DxC Beckman Coulter aneb kolik strávíte času údržbou ve vaší laboratoři.

Polychromatické korekce Systém dále provádí automatickou polychromatickou korekci pro eliminaci vlivu analyzátoru, vzorku (př. interference), reagencie, chromoforu. Používá měření absorbance chromoforu při více vlnových délkách.

Shrnutí Funkce kontroly kvality a integrity vzorku umožňuje obsluze pracovat s primárními či sekundárním zkumavkami značenými čárovým kódem/bez kódů v plně automatizovaném režimu, bez nutnosti manuální vizuální kontroly stavu kvality séra či plasmy a zcela eliminovat subjektivní hodnocení obsluhou. Snižují se tím náklady, šetří se čas, neopakují se měření, minimalizuje se možnost vydání výsledků ovlivněných jednotlivými interferencemi. Způsob zpracování vzorků je standardizovaný a poskytuje vždy stejně kvalitní výsledky.

Údržba jakéhokoli biochemického analyzátoru je nezbytná pro zajištění stálé připravenosti systému pro optimální měření a provoz a redukuje tím zároveň i servisní zásahy. Každý výrobce doporučuje optimální postupy údržby a jejich frekvenci tak, aby zajistil nejvyšší kvalitu měření a stálou připravenost systému pro měření. Každá údržba vyžaduje svůj čas a příslušný zásah obsluhy. Četnost údržby dále závisí na vytíženosti systému v čase a počtu zpracovávaných vzorků. Všechny analyzátory Beckman Coulter jsou vyvíjeny pro zjednodušení a minimalizaci údržby a zvyšují produktivitu a automatizaci celého laboratorního procesu zpracování vzorku. Analyzátory Beckman Coulter UniCel® DxC vyžadují minimální údržbu a jejich design byl navržen pro maximální komfort obsluhy. Byl také zohledněn požadavek na minimální čas pro zajištění správné funkce a udržení funkčnosti systémů při plném zatížení v klinickém provozu. Ovládací software je navržen tak, aby automaticky sledoval a vyhodnocoval jednotlivé kroky údržby. Uvádíme specifické frekvence údržby a průměrný čas potřebný pro každou údržbu analyzátorů UniCel® DxC 600 a 800. Frekvence je odvozena od průměrného zpracování 400 vzorků za jeden den. V tabulce je uvedeno množství času, které stráví obsluha při provádění údržby. Všechny uváděné hodnoty jsou v minutách a vteřinách.

MIROSLAV BISCHOF [email protected]

Denní údržba Není požadována.

Týdenní údržba Údržba 1 x za týden

DxC 600

DxC 800

Kontrola reagenčních tras

0:25

0:25

Výměna stírátka kyvet

1:20

1:20

-

3:30

Čištění povrchu dávkovacích jehel

2:20

2:20

Čištění průtokové cely a modulů

1:20

1:20

Čištění dávkovací jehly CC (čas do tisku protokolu)

0:30

0:30

Kontrola chloridové kalibrační hodnoty SPAN

0:40

0:40

Celkový čas údržby 1 x za týden

6:35

10:05

Čištění modulu ALBm a TPm

Systém monitoruje provádění údržby (kdo, kdy, historii) a zobrazuje dobu do další údržby či počet vzorků, které lze analyzovat do další údržby.


9

Měsíční údržba Procedura Čištění měřících modulů (MC) Čištění elektrody BUNm

DxC 600

DxC 800

3:35

3:55

-

6:20

Čištění mixérů

0:30

0:30

Kalibrace lamp modulů a senzorů

0:10

0:10

Celkový čas měsíční údržby

4:15

10:55

DxC 600

DxC 800

6:00

6:00

Údržba každé dva měsíce Procedura Výměna ostří propichovadla zátek (jen s CTS fcí) * Kontrola/výměna vzduchových filtrů

1:30

1:30

Celkový čas procedur každé 2 měsíce

7:30

7:30

* Jen pro analyzátory verze PRO vybavené funkcí propichování uzávěrů zkumavek (Close Tube Sampling).

Periodická údržba Procedura

DxC 600

DxC 800

Výměna injekčního pístu

5:30

5:30

Celkový čas procedur každé tři měsíce

5:30

5:30

Vyčištění reagenčních tras MC modulu

8:00

24:50

Celkový čas procedur každé čtyři měsíce

8:00

24:50

Výměna špičky CALC elektrody

5:30

5:30

Výměna špičky K elektrody

5:30

5:30

Výměna AccuSense™ Glucose Oxygen sensoru

5:10

5:10

16:10

16:10

KAŽDÉ TŘI MĚSÍCE

KAŽDÉ ČTYŘI MĚSÍCE

KAŽDÝCH ŠEST MĚSÍCŮ

Celkový čas procedur každých šest měsíců

Neměníme lampu u fotometru. Garantujeme životnost minimálně 5 let.

Shrnutí Uvedené údaje prokazují reálnou úsporu času nutnou pro údržbu a připravenost analyzátorů řady Unicel® DxC. Výrazně se snížil čas na údržbu a přípravu systému pro provoz a reálný „postkalibrační čas“. Denní údržba se zcela zrušila. Potřebný čas na týdenní údržbu se zredukoval na 6 minut 35 vteřin u analyzátoru DxC® 600 a 10 minut 5 vteřin u analyzátoru DxC® 800. Část údržeb je plně automatizována. Systém monitoruje provádění údržby (kdo, kdy, historii) a zobrazuje dobu do další údržby či počet vzorků, které lze analyzovat do další údržby. Snížily se předvším nároky na zaškolení a připravenost obsluhy. To vše přináší snížení nákladů, snížení prostojů analyzátorů a obsluhy a celkové snížení TAT laboratoře. Nečekáte na výsledky. Měříte, kdy potřebujete. MIROSLAV BISCHOF [email protected]

10


Partner

klinických laboratoˇrí

www.beckman.cz

e skutečnosti k tomu došlo s nepatrným zpožděním 7. července 2004 ve formě nařízení vlády č. 453/2004 Sb. Je nemalou zásluhou tehdejšího předsedy asociace CZEDMA a vedoucího pracovníka Immunotech a.s., že díky jeho expertní spolupráci s legislativním odborem MzČR při tvorbě české transpozice máme k dispozici právní předpis bez závažných omylů, chyb a nejasností. Řada uživatelů IVD MD očekávala, že výrobky označené CE budou, podobně jako Tornádo Lou z Limonádového Joe, „jiné, lepší!“. Byli pak do jisté míry zklamáni, neboť tomu tak na první pohled nebylo. Jaká ovšem byla a je skutečnost? Zůstaneme-li u literární nadsázky, pak tyto výrobky, řečeno Cyranem, „uvnitř tají elegance květ“. Co je tím míněno? Aby mohl výrobce prohlásit výrobek za shodný, musí splnit řadu podmínek daných Směrnicí, jako jsou: ■ aplikace relevantních harmonizovaných norem, ■ vypracování přesně definovaného souboru technické dokumentace, návaznosti na mezinárodně uznávané referenční materiály nebo referenční metody, označování výrobků, ■ poskytování přesně stanovených informací uživateli ■ a jedna z nejdůležitějších podmínek - ověření funkční účinnosti výrobku. V neposlední řadě Směrnice ukládá výrobcům zavést a udržovat systém úplné poprodejní sledovatelnosti výrobků a zavádí dozor nad kvalitou IVD MD a bezpečností jejich používání. V rámci tohoto dozoru je výrobce povinen informovat uživatele, a v řadě případů i státní orgány dozoru v zemích EU a EFTA, o rizicích nežádoucích příhod spojených s použitím určitého IVD MD, o přijatých nápravných opatřeních a o jejich výsledcích. Nejdůležitější změnou kvality v případě shodného IVD MD je však skutečnost, že Směrnice jasně stanoví, že výrobce přebírá plnou odpovědnost za správnou funkci IVD MD, dodržel-li uživatel pokyny výrobce k jeho skladování a použití. Proč je stále třeba, více než tři roky po uvedení Směrnice v život, hovořit o omylech s ní spojených? Jedná se zejména o některé, stále se opakující požadavky uživatelů

Tříletá zkušenost se směrnicí o IVD MD 7. prosince 2006 uplynuly tři roky od data, kdy začala být v členských zemích EU a EFTA uplatňována Směrnice 98/79/ES o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro (IVD MD). Stejný stav měl nastat v ČR v den vstupu ČR do EU 1. května 2004. ohledně dokumentace poskytované výrobci. Velmi často jsou vyžadovány dokumenty, které v rámci platné legislativy vůbec neexistují – certifikát (značky) Nepotvrzení o značce CE, prohlášení o tom, že výrobky splňují předpisy pro použití při poskytování zdravotní péče apod. Žádný takový dokument není Směrnicí ani NV 453 definován. Navíc Směrnice nezná pojem distributor, nýbrž pouze výrobce a jeho oprávněný zástupce v případě, že sídlo výrobce není v jednom ze členských států EU. Pokud tedy není distributor výslovně oprávněn výrobcem jednat jeho jménem v určitých legislativních záležitostech, má jakékoli potvrzení distributora o IVD MD z hlediska našeho právního řádu pro uživatele pochybnou validitu. Z tohoto důvodu je Immunotech a.s. společností Beckman Coulter, Inc. zmocněn jednat v ČR ve smyslu našeho právního řádu jejím jménem. Dalším zdrojem nedorozumění je vyžadování prohlášení o shodě, někdy dokonce v ověřeném překladu. Směrnice i NV 453 stanoví, že posoudil-li výrobce kladně shodu IVD MD s podmínkami Směrnice, je povinen vystavit ES prohlášení o shodě (EC Declaration of Conformity). Prohlášení o shodě je interní dokument výrobce, který není určen k uživatelům. Výrobce je povinen jej předložit pouze státním orgánům dozoru a/ nebo notifikovaným osobám, a to nikoli automaticky, nýbrž pouze na vyžádání v odůvodněných případech. Dále je stanoveno, že se toto prohlášení vystavuje v jednom z úředních jazyků některého členského státu EU. Metodický pokyn SÚKL ZP-19 z 1. října 2004 jasně stanoví, že prohlášení o shodě není dokumentem, který by měl mít poskytovatel zdravotní péče v držení, a dále že dokladem shodnosti výrobku je pro poskytovatele značka shody CE. Dalším občas prezentovaným „mýtem“ je hledání a nalézání vazeb mezi Směrnicí a některými harmonizovanými normami, zejména normou pro akreditaci laboratoří – ISO EN 15189 a normou pro poskytované EHK – ISO EN 14136. Ve skutečnosti zde žádná přímá ani mandatorní vazba neexistuje a ani existovat nemůže. Směrnice je právní předpis, který je prostě pro výrobce závazný a tím pádem jsou pro výrobce závazné všechny harmonizované normy, které jsou na jeho činnost aplikovatelné. Naproti tomu laboratoř, která se neřídí normou ISO EN 15189, může zcela legálně působit v rámci poskytování zdravotní péče. Tím není samo-


11

Je tedy zřejmé, že běžné materiály pro EHK nemohou být používány pro kontrolu kvality IVD MD (zejména správnosti a návaznosti), což také není jejich účel. zřejmě řečeno, že „zákazníci“ a/nebo plátci nemohou dát přednost laboratoři, která je nějakým průkazným způsobem akreditována nebo certifikována. Směrnice se nevztahuje ani na poskytovatele EHK, i když se o EHK zmiňuje v tom smyslu, že výsledky EHK přispívají k poprodejnímu sledování IVD MD, což znamená, že jsou jedním ze zdrojů dat pro výrobce. Rozhodně však není EHK nástrojem či prostředkem dozoru nad kvalitou IVD MD. Tato role je legislativně vymezena pouze příslušným statním orgánům a notifikovaným osobám. Směrnice stanoví, že materiály (vzorky) používané v EHK nejsou IVD MD, z čehož přímo vyplývá, že nemohou být používány pro kontrolu kvality IVD MD. Je to důsledkem toho, že v jiné části Směrnice se uvádí, že materiály pro kontrolu kvality IVD MD musí být rovněž IVD MD a musí mít značku CE. Míní se tím ty materiály pro kontrolu (kontrolní vzorky), které poskytuje uživatelům jako součást soupravy sám výrobce IVD (pak se na ně vztahuje značka CE soupravy) nebo materiály pro kontrolu jakosti daného IVD (nebo určité, přesně specifikované skupiny IVD MD), které jako takové byly vyrobeny a označeny. Výrobce takovýchto materiálů musí v informaci pro uživatele uvést, pro jaké, naprosto konkrétní a jasně specifikované výrobky je takovýto kontrolní materiál určen a ručí za to, že s těmito IVD MD správně funguje. Je tedy zřejmé, že běžné materiály pro EHK nemohou být používány pro kontrolu kvality IVD MD (zejména správnosti a návaznosti), což také není jejich účel. To je možné pouze v těch případech, kdy výrobce takovéhoto kontrolního materiálu deklaruje, pro jaké systémy (IVD MD) je určen, ověří jeho funkční

způsobilost pro tento účel, vystaví ES prohlášení o shodě a označí svůj produkt značkou shody CE. Tento legislativní požadavek není samoúčelný, nýbrž reflektuje požadavek na přiměřenou komutabilitu kalibrátorů a kontrolních materiálů. O co se vlastně jedná? Výrobce IVD MD v je povinen specifikovat, pro jaký typ vzorku je jeho výrobek určen. Zpravidla se jedná o nativní lidské sérum, lidskou plazmu, popř. moč či jinou tělní tekutinu. Je zřejmé, že takovýto požadavek je pro jakékoli kontrolní vzorky používané v širším měřítku velmi obtížně splnitelný, zvláště uvědomíme-li si, že v některých, zejména imunoanalytických systémech, mohou být problematické i „pooly“. A to nehovořím o stabilizaci, lyofilyzaci, mrazení a podobně. V řadě typů stanovení nemusí být, a také patrně není, komutabilita kontrolních materiálů významný problém. Jako příklad je možné uvést řadu základních parametrů z oboru klinické biochemie, neboť se jedná o stanovení jednoduchá (což samozřejmě v žádném případě nesnižuje význam). Opačným příkladem jsou imunochemická stanovení, založená na principu interakce antigenu s jednou nebo dvěma protilátkami. Tato interakce může být významně ovlivněna i malými odchylkami prostředí, ve kterém probíhá a proto je k hodnocení kvality takovýchto výrobků přistupovat kriticky a obezřetně. PETR ŠMÍDL [email protected]

Diagnostický a prognostický význam thymidinkinázy (TK) u nádorových onemocnění Úvod Enzymatická aktivita thymidinkinázy (TK) je nezbytná pro proces zabudování thymidinu do buněčné DNA. De novo je syntéza thymidinfosfátu katalyzována za normální situace pomocí thymidylátsyntetázy, a to z deoxyuridinmonofosfátu za přítomnosti kyseliny listové a vitaminu B12. Fyziologickou funkcí TK v organismu je fosforylace thymidinu, při které dochází k přeměně deoxythymidinu na deoxythymidinmonofosfát, který se v přítomnosti adenozintrifosfátu mění na trifosfátovou formu potřebnou pro syntézu DNA, čímž je umožněna syntéza DNA náhradní (záchrannou) cestou. Proto se zvýšená produkce TK pozoruje u intenzivně se dělících tkání a TK je považována za významný marker buněčné proliferace. Cílem studie bylo ověřit diagnostický a prognostický význam TK u nádorových onemocnění.

Materiál a metodika Thymidinkináza byla měřena pomocí radioreceptorové analýzy (RRA) za užití diagnostické soupravy firmy Immunotech (Praha) (3). Sérové hodnoty TK byly měřeny u 1087 nemocných s nádorovým onemocněním (355 nemoc-

12


ných s hematologickou malignitou, 732 pacientů se solidními tumory). Všechny odběry byly provedeny za standardních podmínek z kubitální žíly v ranních hodinách. Až do laboratorní analýzy byly všechny vzorky skladovány při -20 °C. Sérové hodnoty nádorových markerů byly korelovány s klinickým stavem nemocných. Nemocní s nádory prsu a kolorekta byli systematicky sledováni v průběhu follow up a nádorové markery byly u těchto nemocných odebírány v pravidelných intervalech 3-5 měsíců. Diagnostický význam thymidinkinázy byl retrospektivně vyhodnocen u 68 nemocných s nádorem prsu a u 48 nemocných s kolorektálním karcinomem, u kterých byla v průběhu dispenzarizace zaznamenána progrese onemocnění (lokální recidiva či vzdálené metastázy).

Sérové hodnoty TK a klinické stavy (remise, progrese) byly nezávisle na sobě vyhodnoceny 2 lékaři. Hodnoty TK byly také stanoveny u kontrolní skupiny probandů (100 zdravých kontrol, 100 nemocných s bakteriální infekcí, 100 nemocných s imunoalteračním onemocněním). Statistická analýza (základní deskriptivní statistika, výpočet specificit a senzitivit) byla provedena pomocí statistického softwaru S.A.S, verze 6.2.

Výsledky Tabulka 1 uvádí základní deskriptivní statistiku hodnot kontrolní skupiny. Výsledky jsou shrnuty na obrázcích 1 až 4. Obrázek 1 uvádí senzitivity při 95% specificitě pro hematologické malignity (56 nemocných leukemií, 68 s Hodgkinovým lymfomem, 36 s non-Hodgkinovým lymfomem, 40 s mnohočetným myelomem a 155 s myelodysplastickým syndromem). Obrázek 2 ukazuje stejné parametry pro předoperační hodnoty u solidních nádorů (300 nemocných s nádorem prsu, 300 nemocných s nádorem kolorekta, 97 nemocných s nádorem děložního čípku a 35 nemocných s nemalobuněčným plicním karcinomem-NSCLC). Kromě jednorázového stanovení TK u předoperačních hodnot byly hodnoty TK systematicky sledovány v průběhu follow up. Na obrázku 3 a 4 jsou uvedeny mediány koncentrací TK a senzitivity TK pro predikci progrese 9, 6 a 3 měsíce před klinickou manifestací a v době klinické manifestace progrese, která byla prokázána pomocí vyšetřovacích metod (zobrazovací, endoskopické). Úsečky v grafu vyjadřují minimální a maximální naměřenou koncentraci TK. Obrázek 3 uvádí tyto hodnoty naměřené pro nádory prsu, obrázek 4 pro nádory kolorekta.

Diskuse V naší laboratoři se zabýváme systematickým měřením hodnot thymidinkinázy již od r. 1990

Obr. 1: Senzitivity TK (IU/L) při 95% specificitě u hematologických malignit (n=355)

Tabulka 1: Základní deskriptivní statistika TK (IU/L) u kontrolní skupiny Skupina

N

Medián

Min.-Max.

Zdraví probandi

100

4

1-6

Nemocní s bakteriální infekcí

100

10

4-15

Nemocní s imunoalteračním onemocněním

40

28

2-56

(4). TK je stanovována především u hematologických malignit (5, 6). Problematikou solidních nádorů se v současné době zabývá omezený počet autorů, většina prací s touto tematikou pochází z let 1994-98 (7, 8, 9, 10). Např. Thomas a kol. již popsal význam TK u kolorektálního karcinomu a Robertson a kol. a Kaušitz a kol. popsali korelaci mezi hladinami TK a stadiem onemocnění u karcinomu prsu. Byl také pospán význam stanovení TK v průběhu follow up (7, 8, 9). Později se výzkum zaměřil více na onkofetální a mucinózní nádorové markery a na význam stanovení TK se téměř pozapomnělo (11, 12, 13, 14, 15). Na základě výsledků naší studie můžeme konstatovat, že TK je sekundární diagnostický nádorový marker a primární význam má jen u některých hematologických malignit (4, 5). Na základě našich zkušeností můžeme konstatovat, že hodnoty tohoto markeru korelují se závažností tohoto onemocnění. Zdá se být velmi dobrým diagnostickým a prognostickým nádorovým markerem pro monitoraci průběhu vývoje onemocnění. Pomocí TK je možno predikovat progresi nádorového onemocnění 3 měsíce před klinickou manifestací, v některých případech dokonce 6-9 měsíců před klinickou manifestací relapsu. To se zdá být výhodou i přes nízkou orgánovou specifitu, ale na rozdíl od ostatních nádorových markerů má TK primární význam jako marker buněčné proliferace u nádorových onemocnění (2, 16, 17).

Pomocí thymidinkinázy je možno predikovat progresi nádorového onemocnění 3 měsíce před klinickou manifestací, v některých případech dokonce 6-9 měsíců před klinickou manifestací relapsu.

Obr. 2: Předoperační hodnoty TK (IU/L) a senzitivity při 95% specificitě u pacientů se solidními nádory


13

Obr. 3: Hodnoty TK (IU/L) a senzitivity při 95% specificitě pro predikci progrese 9,6 a 3 měsíce před klinickou manifestací relapsu a v čase klinické manifestace (čas 0) u nemocných s nádorem prsu.

Obr. 4: Hodnoty TK (IU/L) a senzitivity při 95% specificitě pro predikci progrese 9,6 a 3 měsíce před klinickou manifestací relapsu a v čase klinické manifestace (čas 0) u nemocných s nádorem kolorekta.

Závěr Thymidinkináza je sekundárním nádorovým markerem, který je užitečný především pro monitoraci follow up nádorových onemocnění. Elevace hodnot tohoto markeru musí být interpretována vždy při podrobné znalosti klinického stavu nemocného, protože musí být vyloučeny nespecifické elevace sérových hodnot (zánětlivá a imunoalterační onemocnění).

Literatura 1. Chuanjing Wu, Rong-Jiang Yang, Ji Zhou, Shing Bao, Li Zou, Pinggan Zhang, Yongrong Mao, Jianping Wu, Qimin He. Production and characterisation of a novel chicken IgY antipody raised against C-terminal peptide from human thymidine kinase 1. Journal of Immunological Methods, 277, 2003, 157-169. 2. Wu J, Mao Y, He L, Wang N, Wu C, He Q, Skog S. A new cell proliferating marker: cytosolic thymidine kinase as compared to proliferating cell nuclear antigen in patients with colorectal carcinoma.Anticancer Res 20(6C):481520, 2000. 3. Topolcan O, Holubec L Jr, Finek J, Stieber P, Holdenrieder S, Lamerz R, Holubec Sen L, Svobodova S, Visokai V, Lipska L. Changes of thymidine kinase (TK) during adjuvant and palliative chemotherapy. Anticancer Res. 2005 MayJun; 25(3A):1831-3. 4. Lejcko J., Jungerova J., Topolcan O., Koza V.: Thymidine kinase at malignant lymphogranuloma and Non-Hodgkin Lymphoma. Prakt. Lék. (Praha), 72, 1992, č. 5, 171-173. 5. Poley S., Stieber P., Nussler V. et al.: Serum thymidine kinase in nonHodgkin lymphomas with special regard to multiple myeloma. Anticancer Res. 17 (4B) 1997: 3025-9. 6. Christiansen I., Gildlof C., Kalkner K.M. et al: Elevated serum levels of soluble ICAM-1 in non-Hodgkin’s lymphomas correlate with tumour burden, disease activity and other prognostic markers. Br J Haematol. 92 (3) 1996: 639-46. 7. Thomas WM, Robertson JF, McKenna PG, O‘Neill KL, Robinson MH, Hardcastle JD. Serum thymidine kinase in colorectal neoplasia. Eur J Surg Oncol. 1995 Dec; 21(6):632-4. 8. Robertson JF, O‘Neill KL, Thomas MW, McKenna PG, Blamey RW. Thymidine kinase in breast cancer. Br J Cancer. 1990 Oct; 62(4): 663-7. 9. Kausitz J., Kuliffay P., Pecen L. et al.: Correlation of cytosolic concentrations of ER, PS2, Cath-D, TPS, TK and cAMP in primary breast carcinomas. Neoplasma,41, 1994, 331-336 10. Roman S., Christensen I. J., Chinot O. et al.: Prognostic value of cytosolic

14


thymidine kinase activity as a marker of proliferation in breast cancer. Int.J.Cancer, 61, 1995, 7-12 11. Chester SJ, Maimonis P, Vanzuiden P, Finklestein M, Bookout J, Vezeridis MP. A new radioimmunoassay detecting early stages of colon cancer: a comparison with CEA, AFP, and Ca 19-9. Dis Markers. 1991 Sep-Oct; 9 (5) : 265-71. 12. Haglund C, Kuusela P, Roberts P, Jalanko H. Tumour marker CA 125 in patients with digestive tract malignancies. Scand J Clin Lab Invest. 1991 May; 51 (3): 265-270. 13. Kuusela P, Haglund C, Roberts PJ. Comparison of a new tumour marker CA 242 with CA 19-9, CA 50 and carcinoembryonic antigen (CEA) in digestive tract diseases. Br J Cancer. 1991 Apr; 63 (4): 636-40. 14. Kornek G, Depisch D, Temsch EM, Scheithauer W. Comparative analysis of cancer-associated antigen CA-195, CA 19-9 and carcinoembryonic antigen in diagnosis, follow-up and monitoring of response to chemotherapy in patients with gastrointestinal cancer. J Cancer Res Clin Oncol. 1991; 117 (5): 493-6. 15. Ial‘chenko NA, Lagutin VD, Lavik NN, Musin II. [The clinical information value of an immunoenzyme study of the tumor markers CA-19-9, CEA and AFP in cancer of the stomach, pancreas, colon and rectum] Vopr Onkol. 1991; 37(9-10): 921-4. 16. O‘Neill KL, Buckwalter MR, Murray BK. Thymidine kinase: diagnostic and prognostic potential.: Expert Rev Mol Diagn: 1(4): 428-33, 2001. 17. Tanigawa N, Katoh Y, Fujii H, Shimomatsuya T, Aotake T, Yamakawa M. Prediction of prognosis of patients with gastrointestinal cancer based on thymidine uptake. Gan To Kagaku Ryoho. 21 (3): 388-94, 1994. PROF. MUDR. ONDŘEJ TOPOLČAN, CSC., ODDĚLENÍ IMUNOCHEMICKÉ DIAGNOSTIKY, FN PLZEŇ, DR. E. BENEŠE 13, 305 99 PLZEŃ, E-MAIL: [email protected]

olitelně je možno použít argonový laser (488 nm) nebo rtuťovou výbojku (excitace při 366, 405 a 435 nm) . Cytometr QUANTA SC MPL je vybaven podavačem a aspiruje z destiček různých formátů (24, 96 nebo 384 jamek) nebo mikrozkumavek. Minimální aspirovaný objem je 25 μL, maximální 300 μL. Software umožňuje předdefinovat míchání vzorků nebo přidání reagencie přístrojem v objemu 1-250 μL včetně inkubace před aspirací. Aspirační jehla je automaticky omývána před každou další aspirací vzorku. Analyzátor je vhodný pro měření absolutních počtů buněk a stanovení buněčného cyklu, apoptózy, životnosti buněk, měření povrchových a intracelulárních znaků apod. Pro tyto aplikace jsou vyvinuty kompletní laboratorní postupy včetně přípravy vzorků a nastavení přístroje: ■ DNA Cell Cycle Analysis with 4’, 6-Diamidino-2Phenylindole (DAPI) or Propidium Iodide (PI) Nuclear Stains ■ Evaluation of Cellular Viability with Propidium Iodide or 7-Amino-Actinomycin D

Průtokový cytometr CELL LAB QUANTA SC MPL Průtokové cytometry QUANTA SC MPL jsou určeny pro výzkumné aplikace. Kombinují měření objemu buněk Coulterovou metodou, rozptylu světla (Side Scatter) a fluorescencí na třech fotonásobičích s použitím více zdrojů světla. Na měření objemu nemá vliv tvar, barva a optické vlastnosti částic. ■

Evaluation of Apoptosis with Annexin V and Propidium Iodide or 7-AminoActinomycin D ■ Green Fluorescent Protein (GFP) ■ Measurement of Active Caspase-3 in Apoptotic Cells Using Beckman Coulter‘s Cell Lab Quanta™ SC ■ Cell Cycle Analysis with Dual Measurement of Cyclin A2 Expression and DNA Content ■ Determination of P44/42 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) Phosphorylation Using the Beckman Coulter Quanta™ SC Flow Cytometer ■ Fluorescence Concentration Measurement Using the Beckman Coulter Quanta™ SC ■ 3-Color Compensation Using Beckman Coulter‘s Cell Lab Quanta™ SC Flow Cytometr System ■ Enumeration of Mitotic Cells with Dual Measurements of Histone H3 Phosphorylation and DNA Content ■ Cytokine Expression in Serum of Coronary Disease Patients Using the Human Cardiovascular 7Plex FlowCytomix Multiplex Bead Assay Souprava Human FlowCytomix Cardiovascular 7plex Multiplex kit (Obj. číslo BMS711FF) je určena pro stanovení sCD40L, IL-6, IL-8, MCP-1, P-selektinu, t-PA a VCAM-1. Tyto aplikační listy vám na požádání zašleme v pdf formátu (pkruzik@ beckmancoulter.com). Popsané postupy jsou použitelné i na dalších typech průtokových cytometrů. Průtokové cytometry Cell Lab QUANTA SC MPL, QUANTA SC a QUANTA představují ucelenou řadu analyzátorů pro výzkumná pracoviště. Základní verze cytometru QUANTA, která je vhodná pro laboratoře pracující s tkáňovými kulturami, je vybavena dvěma fotonásobiči, laserem 488 nm nebo rtuťovou lampou, popř. oběma světelnými zdroji současně.


15

Beckman Coulter IOTest® iTox3 Tyto reagencie jsou určeny pro stanovení subpopulací lymfocytů periferní krve, kostní dřeně nebo lymfatických uzlin laboratorního potkana v kombinaci IOTest® Anti-Rat CD3-FITC/CD4-PC7/CD8-APC (reagencie pro stanovení subpopulací lymfocytů T) a IOTest® Anti-Rat CD3-FITC/CD45RA-PC7/CD161a-APC (reagencie pro stanovení lymfocytů T, B a buněk NK). IOTest® Anti-Rat CD3-FITC / CD4-PC7 / CD8-APC obj. číslo A32909, 50 testů

CD3

CD4

CD8

klon

1F4

OX-38

OX-8

izotyp

IgM

IgG2a

IgG1

IOTest® Anti-Rat CD3-FITC / CD45RA-PC7 / CD161a-APC obj. číslo A32910, 50 testů

CD3

CD45RA

CD161

klon

1F4

OX-33

10/78

izotyp

IgM

IgG1

IgG1

Obě kombinace konjugovaných monoklonálních protilátek jsou použitelné na průtokových cytometrech FC 500 s dvěma lasery. Při přípravě vzorků se používá metoda bez promývání s využitím lyzačního činidla VersaLyse. Po přidání kalibračních partikulí Flow-COUNT Fluorospheres je možné stanovovat absolutní počty subpopulací lymfocytů. Tato tříbarevná konfigurace (FITC/PC7/APC) výrazně usnadňuje analýzu na průtokovém cytometru bez potřeby nastavování kompenzací. Navíc je možné podle potřeby přidat další monoklonální protilátku značenou PE, např. pro stanovení aktivačních znaků (CD25-PE). Doplňující reagencie Reagencie

Klon

Velikost

Obj.číslo

Anti-Rat CD45-PE, IOTest®

OX-1

50 testů

A36700

150 testů

A07704

VersaLyse Lysing Solution

100 testů

A09777

IOTest3 Fixative Solution

100 testů

A07800

Flow-COUNT Fluorospheres

200 testů

7547053

7-AAD Viability Dye


Pracoviště s vysokou kapacitou mohou využít pro stanovení z plné krve průtokový cytometr FC 500 MPL (Multi Platform Loader). Přístroj v této verzi automaticky aspiruje z mikrozkumavek s objemem 1,4 ml uložených v držáku pro 96 jamkovou destičku. Pro měření vzorků s větším objemem jsou vhodné standardní zkumavky 12 x 75 mm v držáku pro 40 zkumavek.

Automatizovaná příprava vzorků s Beckman Coulter Biomek® NXP Automatizovanou přípravu vzorků je možné zabezpečit pomocí přístroje Biomek® NXP. Tento systém umožňuje automatické pipetování, ředění a dávkování reagencií a vzorků. Biomek® NXP umožňuje pracovat s formátem destiček - 96, 384 a také s běžnými formáty zkumavek. Biomek® NXP lze dále volitelně doplnit dalším příslušenstvím jako například detektorem pro měření absorbance, fluorescence a luminiscence DTX 800/880, dále třepačkou, termostatem a případně skladem vzorků. Využití tak nachází nejen při přípravě vzorků pro průtokovou cytometrii, ale především pro DNA/ RNA purifikaci, pro PCR a sekvenční clean-up a další. Biomek® NXP je optimalizován pro přípravu a purifikaci DNA/RNA reagenciemi Agencourt®.

Nové reagencie pro průtokovou cytometrii CD23-PE, IOTest®, PN A33099 Liquid 2 mL – 20 μL / test Molekula CD23 je přítomna na lymfocytech B a monocytech. Dále je přítomna na širokém spektru lymfocytů T, eozinofilech, krevních destičkách, Langerhansových buňkách a subpopulacích epiteliálních buněk tymu a neutrofilech. CD5-ECD, IOTest®, PN A33096 Liquid 1 mL – 10 μL / test Molekula CD5 je přítomna na povrchu zralých lymfocytů T, na povrchu většiny tymocytů a dále u subpopulace lymfocytů B. Není exprimována na granulocytech, monocytech ani krevních destičkách. CD13-ECD, IOTest®, PN A33097 Liquid 1 mL – 10 μL / test Antigen CD13 je přítomen na buňkách myeloidního původu včetně neutrofilů, eozinofilů, bazofilů a monocytů normální periferní krve. Chybí na lymfocytech T a B, erytrocytech a krevních destičkách. Existuje pět variant molekuly CD13 s odlišnou glykosylací, což vysvětluje odlišné vazebné vlastnosti různých protilátek CD13. CD16-ECD, IOTest®, PN A33098 Liquid 1 mL – 10 μL / test Monoklonální protilátka 3G8 se váže na FcγRIIIA a FcγRIIIB. Schopnost klonu 3G8 specificky vázat CD16 byla testována v rámci 5. konference o lidských leukocytárních diferenciačních antigenech („5th HLDA Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens“), která se konala v Bostonu v USA, v roce 1993.

Regulační lymfocyty T V současné době se věnuje velká pozornost stanovení regulačních lymfocytů T (Tregs). Nejčastěji používaným znakem pro identifikaci této subpopulace CD4+CD25+ lymfocytů T je transkripční faktor FoxP3. Pro stanovení tohoto znaku je nezbytná permeabilizace, která je zdrojem metodických problémů. Řada současných publikací se věnuje membránovému znaku CD127, jehož exprese je snížena na regulačních lymfocytech T ( Liu et al., CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells, JEM, 2006, 203, 7, 1701-1711).

Využití tak nachází nejen pro přípravě vzorků pro průtokovou cytometrii, ale především pro DNA/RNA purifikaci, pro PCR a sekvenční clean-up a další. CD127 je α podjednotka IL-7R. Molekula je asociována s γ řetězcem (CD132), který je společný pro IL-2R, IL-4R, IL-9R, IL-15R, and IL-21R. Nachází se na tymocytech, progenitorech buněk T a B, zralých buňkách T, monocytech a některých dalších lymfoidních a myeloidních buňkách. Stanovení regulačních lymfocytů T v kombinaci CD3+CD4+CD25brightCD12 7dim-to-neg Tregs je možné provést monoklonálními protilátkami s různými fluorochromy: CD3, IOTest, 100 testů, FITC A07746 CD127, IOTest, 100 testů, PE IM1980 CD8, CYTO-STAT, 50 testů,ECD 6604728 CD25, IOTest, 100 testů,PC5 IM2646U CD4, IOTest, 100 testů, PC7 6607101 CD4, CYTO-STAT, 50 testů, ECD 6604727 CD4, IOTest, 100 testů, FITC A07750

CoulterCounter.com V průběhu ledna byly zprovozněny nové webové stránky s názvem CoulterCounter.com. Jsou určeny především uživatelům analyzátorů částic série LS, RapidVue, N5, SA 3100 a MultiSizer3. Stránky obsahují literaturu, vysvětlení principů (Coulterův princip, Miova teorie rozptylu světla apod. ) a popis jednotlivých aplikací pro uvedené přístroje. Pro aplikace v biologii je používán Multisizer3, kterému jsou věnovány články na téma: ■ Real Time Detemination of Cell Volume Changes of Sperm Used for Cryopreservation ■ Determination of Cell Aggregation in Bacteria Cultures for Contact Lens Disinfection Efficacy Testing ■ Beer, Evaluation of Final Product and Filtration Efficiency PAVEL KRUŽÍK [email protected]

Stanovení základních biologických charakteristik v laboratoři tkáňových kultur Soukup T., Rückerová H., Karbanová J., Suchánek J., Kudrnáčová J., Vlček R., Moos J. uňka je základní strukturní a funkční jednotkou živé hmoty – hovoříme o tzv. buněčném principu organizace živých systémů. Každá buňka tak představuje hmotný, konečný, otevřený a hierarchicky uspořádaný systém, který je vysoce adaptivní, schopný autoregulace a autoreprodukce. Jednou ze základních vlastností biologického systému je růst. Růst zahrnuje procesy syntézy jednotlivých stavebních komponent živého systému a odráží procesy transkripce a translace genetické informace a navazuje na ně. U mnohobuněčných organismů je růst vyjádřen též proliferační aktivitou buněk. V průběhu ontogeneze je rychlost růstu proměnlivá a růst navíc souvisí s procesy regeneračními a některými procesy adaptačními. V podmínkách laboratoří buněčných/tkáňových kultur si denně ozřejmujeme základní charakteristiky růstu studiem růstu individuálních buněk a buněčných populací. Růst individuální buňky sledujeme přímo (mikroskopicky) nebo nepřímo (mikrofotograficky či mikrokinematograficky). Růst buněčné populace se obvykle hodnotí pomocí parametrů růstu odvozených od proliferační aktivity buněk sledované buněčné populace. Za podmínek statické kultivace je možné růst populace rozdělit do čtyř fází: 1) Fáze klidová (tzv. lag fáze), 2) Fáze exponenciální, 3) Fáze stacionární a 4) Fáze odumírání. Grafickým vyjádření prvních tří fází je sigmoidální křivka.

„Proč tedy sledovat tzv. základní biologické charakteristiky?“ Protože získáme lepší kontrolu nad celým procesem dlouhodobé kultivace buněk v podmínkách in vitro. Díky této nepopulární „matematice v laboratoři“ jsme schopni kvalitně hodnotit použité laboratorní postupy, kultivační média, separační metody, vhodnost/nevhodnost povrchů kultivačních nádob apod. Můžeme hodnotit celou řadu dalších parametrů

Obr. 1 Lidské mezenchymové kmenové buňky izolované z kostní dřeně (primokultura)

18

ovlivňujících naše in vitro experimenty. Za zcela klíčové, např. pro laboratoře kultivující kmenové buňky, považujeme stanovení počtu populačních zdvojnásobení a času potřebného na toto zdvojnásobení, abychom prokázali neomezený proliferační potenciál těchto buněk. Jaké biologické chcarakteristiky nejčastěji stanovujeme? Jsou to: 1) Počet buněk, 2) Průměr buněk, 3) Distribuce průměrů, 4) Trend velikosti buněk (tzv. size trend), 5) Plating efficiency, CFU, 6) Počet populačních zdvojnásobení (tzv. No. of population doublings), 7) Čas potřebný na zdvojnásobení populace (tzv. doubling time) a 8) Viabilita. Metodické přístupy Pro stanovení výše jmenovaných biologických charakteristik je samozřejmě nutné patřičné vybavení. Do jisté míry vystačíme s mikroskopem a „Bürkerovou komůrkou“. Avšak pro reprodukovatelné, přesné a rychlé stanovení je s výhodou použít některý z analyzátorů buněk a částic (viz. článek v IVD 3/2006 „Analyzátory buněk a částic“). Každý z analyzátorů má však své limity, které budeme demonstrovat dále. V naší laboratoři pracujeme v zásadě se třemi typy buněčných kultur (obrázek 1-4): A) Kultury lidských kmenových buněk rostoucí adherentně, B) Kultury lidských nádorově transformovaných

Obr. 2 Spontánně transformované lidské stromální buňky izolované z lymfatické uzliny (40. pasáž)


Obr. 3 Kmenové buňky zubní pulpy rostoucí ve formě sfér

Obr. 6 Distribuce průměrů čtyř lidských spontánně transformovaných stromálních linií

buněk s různými subpopulacemi, a konečně C) Kultury buněk rostoucí ve formě trojrozměrných útvarů – sfér. Jednotlivé buněčné typy je nutné pro analýzu připravit. Kolonie přisedlé k podkladu musíme enzymaticky rozvolnit (obrázek 5) a resuspendovat na jednotlivé buňky, které můžeme měřit podle použitého přístroje v rozsahu velikostí 270 mikrometrů. Buňky rostoucí ve formě sfér analyzujeme podle potřeby a odhadovaného průměru buďto vcelku, nebo opět enzymaticky rozvolněné. Stanovení počtu, velikosti a distribuce průměrů patří mezi nejzákladnější charakteristiky. Stanovujeme je vždy (jsou základními kvantitativními daty pro výpočet dalších charakteristik), a to za pomocí přístrojů Z2 Coulter a Vi-Cell XR. Na výsledcích analýzy distribuce průměrů transformovaných stromálních buněk lze demonstrovat sílu jednotlivých analytických metod. Pomocí Coulterova impedančního principu jsme schopni přesně analyzovat jednotlivé subpopulace buněčné kultury v rozsahu průměrů 6-28 mikrometrů (obrázek 6). Informace o životnosti jednotlivých subpopulací však chybí. Analýza stejné buněčné populace pomocí trypanové modři a analýzy obrazu přístrojem Vi-Cell XR (obrázek 6a) nám sice nepodá tak přesný pohled na distribuci průměrů, ale doplní tolik potřebný parametr – viabilitu. Víme tedy jaké procento buněk je životaschopných a pro další analýzy a nasazení buněk do nových kultivačních nádob již počítáme pouze s procentem viabilních buněk. U buněk produkujících velké množství extracelulární matrix (např. granulózové buňky z ovariálního folikulu) může při analýze počtu a distribuce průměrů dojít k problému, zejména použití analýzy obrazu je málo vhodné. Toto

Obr. 6a Distribuce průměrů viabilních, spontánně transformovaných stromálních buněk (viabilita 95%)

Obr. 7 Distribuce průměrů granulózových buněk měřená přístrojem Vi-Cell XR.

Obr. 4 Osteoblasty diferencované z kmenových buněk zubní pulpy, sféra vznikla spontánní sedimentací

Obr. 5 Mezenchymové kmenové buňky 10 minut po enzymatickém uvolnění od podkladu


19

Obr. 8 Distribuce průměrů granulózových buněk měřená přístrojem Z2 Coulter.

Obr. 9 Příklad hodnocení trendu velikosti subpopulace lidských kmenových buněk v průběhu prvních 15-ti pasáží.

Obr. 10 Graf demonstrující kumulaci populačních zdvojnásobení u tří kultur lidských kmenových buněk. Kultury MPCs a MPCs/osteoporotic překročily tzv. Hayflickův limit.

Obr. 11 Graf generační doby tří kultur lidských kmenových buněk.

20


Stanovení počtu, velikosti a distribuce průměrů patří mezi nejzákladnější charakteristiky. Stanovujeme je vždy, a to za pomocí přístroju Z2 Coulter a Vi-Cell XR. demonstrujeme na následujících snímcích analýzy granulózových buněk. Jednotlivé buňky jsme byli schopni hodnotit pouze pomocí impedančního principu přístroje Z2 (obrázky 7, 8). Populace v rozsahu průměrů 10-20 mikrometrů zůstala přístroji Vi-Cell skryta. Nutno však podotknout, že analýza buněk menších průměrů než 7 mikrometrů může činit interpretační potíže naopak při použití přístroje Z2 Coulter. Takováto analýza vyžaduje vysoké nároky na čistotu nosného roztoku a kyvet. Za méně kvalitních podmínek pak analýza buněk menších průměrů není přesná a v poolu měřených buněk se nachází množství neživých částic a nečistot. Zajímavou funkcí obou zmiňovaných přístrojů je záznam a hodnocení trendu velikosti buněk (obrázek 9). Tato charakteristika je velmi cenná při hodnocení průměrných dat v průběhu dlouhodobé kultivace. Mezi velmi důležité biologické charakteristiky odvozené od počtu buněk a času, který uplynul od nasazení buněk po jejich sběr jsou – počet populačních zdvojnásobení (total/cumulative population doublings) a čas potřebný na zdvojnásobení populace (doubling time). Počet populačních zdvojnásobení lze vypočítat dle následujícího vzorce: No(PD) = (log Nt – log N0)/0,301 kde No (PD) je počet populačních zdvojnásobení, Nt je počet buněk po enzymatické disociaci/ sběru buněk, N0 je počet nasazených buněk. Výsledné číslo můžeme hodnotit buďto individuálně, nebo kumulovaně v průběhu dlouhodobé kultivace. Regresní analýza individuálních hodnot při každé pasáži vypovídá o trendu proliferačního potenciálu buněčné kultury. Kumulace dat je významná pro zaznamenání překročení tzv. Hayflickova limitu (60 populačních zdvojnásobení), tj. k průkazu neomezeného proliferačního potenciálu (obrázek 10). Čas potřebný na zdvojnásobení populace je veličinou odvozenou od počtu buněk a od doby, která uplynula od nasazení po sběr kultivovaných buněk.

Obr. 12, 12A Výsledky analýzy viability a distribuce průměrů myších neurálních kmenových buněk

G = (t x log2)/(log Nt – log N0) kde G je generační doba – čas potřebný na zdvojnásobení populace, t je čas, který uplynul od doby nasazení buněk po jejich sběr, Nt je počet buněk po enzymatické disociaci/sběru buněk, N0 je počet nasazených buněk. Generační dobu nejčastěji vyjadřujeme graficky pro celou dobu dlouhodobé kultivace (obrázek 11). Závěrem bychom rádi demonstrovali raritní využití přístroje Vi-Cell XR pro analýzu trojrozměrných sfér o velikosti kolem 50 mikrometrů. V experimentu jsme hodnotili nejprve počet a distribuci průměrů viabilních myších neurálních kmenových buněk (obrázky 12, 12a). Tyto po přenesení do kultivačních nádob s neošetřeným, neadhezivním povrchem formovaly sféry různých velikostí. Tyto jsme průběžně analyzovali přístrojem Vi-Cell XR a kvantitativně jsme tak hodnotili schopnost neurálních kmenových buněk tvořit sféry viabilních buněk. Limitem našich měření byla maximální velikost 70 mikrometrů. Měření sfér pomocí Coulterova impedančního principu plánujeme v brzké době. MUDR. TOMÁŠ SOUKUP, ÚSTAV HISTOLOGIE A EMBRYOLOGIE, LF UK HRADEC KRÁLOVÉ,

Obr. 13 Analýza trojrozměrných sfér neurálních kmenových buněk o průměrech 30-60 mikrometrů.

ŠIMKOVA 870, 500 01 HRADEC KRÁLOVÉ E-MAIL: [email protected] ROMAN VLČEK E-MAIL: [email protected] JIŘÍ MOOS E-MAIL: [email protected]

Poděkování: Práce byla podpořena grantovými projekty MSM 0021620820, MŠMT 2006 č. 6354c a grantovým projektem Nadace Tomáše Bati. Poděkování dále patří přednostovi Ústavu histologie a embryologie, LF v Hradci Králové Prof. MUDr. Jaroslavu Mokrému, Ph.D., laborantkám Ústavu histologie a embryologie, LF v Hradci Králové a Jiřímu Moosovi za uvedení do problematiky analýzy buněk a částic.

Vyhlášení vítězů soutěže „Pomozte nám chytit šotka“ V minulém čísle jsme vás poprosili o pomoc, protože se v naší redakci usadil zlomyslný šotek, který zákeřně zaměňoval písmenka ve slovech. Všem, kteří se lovu na šotka zúčastnili, děkujeme. Se svým úlovkem se přihlásili čtyři lovci a lovkyně, kteří dostali zaslouženou odměnu. Jsou to: MUDr. Anežka Fišerová ze III.kliniky infekčních a tropických nemocí Fakultní nemocnice Na Bulovce MUDr. Pavel Jindra z Hematologicko-onkologického oddělení Fakultní nemocnice v Plzni Michaela Valešová z Hematologického oddělení, Klinlab Lenka Nováková OKB Nemocnice Znojmo Všem úspěšným lovcům blahopřejeme! VAŠE REDAKCE


21

Immunotech a.s. Beckman Coulter a jeho sponzorská činnost Společnost Immunotech a.s. patří mezi firmy, které se svým úspěchem alespoň nějakou měrou snaží pomoci těm, kteří jsou určitým způsobem handicapovaní a jejichž startovní čára je omezena nebo vůbec neexistuje. tohoto důvodu již několik let finančně podporujeme projekty zaměřené na integrování lidí se speciálními potřebami do většinové společnosti. Immunotech a.s. byl v letech 2005-2006 hlavním sponzorem projektu Dobromysl.cz, který realizuje občanské sdružení pro integraci lidí s postižením Máme otevřeno?. Dobromysl.cz je internetový portál o lidech a pro lidi se speciálními potřebami. Cílovou skupinou tohoto projektu jsou rodiny lidí s mentálním postižením a lidé z pomáhají-

22


cích profesí (sociální pracovníci, psychologové, speciální pedagogové atd.). Jedná se o poměrně širokou skupinu lidí, protože v České republice je téměř 300 000 lidí s mentálním postižením, kteří potřebují služby sociálních organizací, opatrovníků a kteří mají své rodiny. Portál Dobromysl.cz umožňuje najít aktuální informace z oboru, sdílet informace z této oblasti, seznámit se a informovat o dostupných službách pro mentálně postižené. Jednou z ambicí projektu je prostřednictvím informování o tomto druhu zdravotního postižení zlepšit vztahy mezi většinovou společností a členy minorit. Tematicky projekt pokrývá hlavní oblasti života, jako jsou rodina, vztahy, škola, práce, bydlení, zájmy, zdraví a zaměřuje se přitom především na možnosti začlenění člověka s postižením do běžného života a na jeho přirozené fungování v rámci komunity. Tento portál v současné době měsíčně navštíví přes 11 000 uživatelů.

Jednou z ambicí projektu je prostřednictvím informování o tomto druhu zdravotního postižení zlepšit vztahy mezi většinovou společností a členy minorit. Naše společnosti dále zakoupila 60 kusů diářů na rok 2006, které vydává rovněž občanské sdružení pro lidi s postižením Máme otevřeno?. Tématem diáře pro rok 2006 byly příběhy o zaměstnávání lidí s mentálním postižením a grafickou značkou byl chameleon. Ptáte se proč právě chameleon? Tento ještěr se kromě jiného vyznačuje také tím, že jeho oči se hýbou nezávisle na sobě všemi směry – může se dívat zároveň jedním okem dopředu a druhým dozadu. V našem obvyklém slova smyslu je schopnost chameleona měnit barvy symbolem bezpáteřnosti a proradnosti, naopak na ostrově Madagaskar jej lidé uctívají a říkají: „Dělej to jako chameleon při chůzi – dívej se kupředu a zároveň se ohlížej zpátky.“ Cílem diáře pro rok 2006 bylo, aby svět byl chameleonem v madagaskarském významu, abychom uměli nejen hledět vstříc do budoucnosti, ale abychom se také druhým okem ohlíželi zpátky a pomohli všem těm, kteří nemohou jít tak, jako jdeme my. V roce 2007 se stala společnosti Immunotech a.s. partnerem při realizaci projektu „Sociální automobil“ pro Prahu 10. Tento automobil je zvláštně upravený pro přepravu postižených lidí. Zakoupením reklamní plochy na sociálním vozidle jsme podpořili tvorbu a obnovu vozového parku v ústavech a zařízeních, která svou činnost zaměřují na výchovu, vzdělávání, rehabilitaci a integraci zdravotně či mentálně postižených lidí. I v dalších letech bychom velmi rádi pokračovali ve sponzorování podobných projektů, tj. v pomoci lidem se speciálními potřebami, jejichž integrace do společnosti by bez aktivní podpory okolí nebyla možná. Dovolte, abychom poděkovali i vám – našim zákazníkům, protože bez vás bychom těmto lidem nemohli pomoci. HANA MACHOVÁ [email protected]

Pozvánky na akce IMMUNOMEDICA Vážení přátelé, s blížícím se jarem se blíží také termín mezinárodního zdravotnického veletrhu Pragomedica. V době konání veletrhu, ve dnech 18. a 19. dubna 2007, jsme pro vás připravili přehlídku nabídky přístrojů firmy Beckman Coulter. Tým produktových specialistů a obchodních zástupců vám bude plně k dispozici. Přehlídka se jako již tradičně koná v prostorách firmy Immunotech. Těšíme se na setkání s vámi!

FRIP 2007 Inspekce rotorů do ultracentrifug a vysokovýkonných centrifug proběhne ve dnech 17. – 19. 4. 2007 v Praze, v Brně a v Bratislavě. Zajišťujeme svoz a inspekci rotorů a organizujeme přednášky o novinkách nejen v oblasti centrifugace. Prosíme zájemce, aby se informovali na adrese [email protected].

DNA analýza IV Seminář DNA analýza IV se koná v Praze v Lékařském domě v Praze ve dnech 24. – 25. 5. 2007. Přednášky z minulého ročníku si můžte prohlédnout zde: http://www.immunotech.cz/news/DNAIII/Prezentace.zip. Pokud máte zájem o podrobnější informace, informujte se, prosím, na adrese [email protected].


23

Kde se můžeme setkat (březen – červen 2007) Konference/seminář s účastí společnosti Immunotech formou stánku 21. 3. 2007

16. – 20. 4. 2007

24. - 25. 5. 2007

Setkání pracovníků klinické biochemie a hematologie Plzeňského a Karlovarského kraje Klatovy

FRIP 2007 Praha, Brno, Bratislava

DNA analýza Praha

22. – 24. 4. 2007

1. 6. 2007

Pracovní dny zdravotních laborantů a všeobecných sester pracujících v hematologii a transfuzní službě Špindlerův Mlýn

ES TOOLS Brno

22. 3. 2007 Pracovní den ČSKB – sekce biochemických laborantů Praha

17. – 19. 5. 2007 28. - 31. 3. 2007 V. Martinské imunologické dni Martin

XIV. česko – slovenská konference o hemostáze a trombóze s mezinárodní účastí Hradec Králové

1. - 3. 4. 2007

23. - 25. 5. 2007

28. imunoanalytické dny České Budějovice

XXV. Setkání biochemiků Královéhradeckého, Pardubického a Jihočeského regionu Trutnov

11. - 12. 6. 2007 Seminář Moravskoslezského kraje Žermanice

16. - 19. 6. 2007 XXI. Olomoucké hematologické dny Olomouc

23. – 26. 6. 2007 Česká společnost analytické cytometrie Brno

informační magazín číslo

Recommend Documents