In vitro testování scaffoldů pro tkáňové inženýrství
Mgr. Jana Horáková 9.12.2015
Proces tkáňového inženýrství 1. Návrh nosiče Seznámení se s problematikou dané tkáně/orgánu Návrh nosiče pro danou aplikaci
2. Příprava a charakterizace nosiče
5. Klinické testy Klinické testy
3. Testování in vitro
Klinická praxe 4. Testování in vivo Testování in vivo
Preklinické testy
Cytotoxicita nosiče Testy adheze a proliferace, migrace Testy buněčné de/diferenciace
Hemokompatibilita nosiče • Implantabilní ZP → testování interakcí materiálu s krví • Ovlivnění hemolýzy, koagulace, interakce s trombocyty
Hemokompatibilita nosiče • ISO 10993-4 Biologické hodnocení zdravotnických prostředků – Výběr zkoušek na interakce s krví 5 kategorií zkoušek: 1. Trombóza (procento okluze, mi, SEM) 2. Koagulace (PTT, koagulační fa) 3. Destičky (počet, agregace, specifické markery) 4. Hematologie (hemolýza, dif) 5. Systém komplementu
Hemokompatibilita nosiče
Hemokompatibilita nosiče
Cytotoxicita • ISO 10993-5 Biologické hodnocení zdravotnických prostředků – Zkouška na cytotoxicitu in vitro 3 kategorie zkoušek: extrakt/přímý styk/nepřímý styk → posouzení poškození buněk morfologickými prostředky → měření poškození buněk → měření růstu buněk → měření specifických aspektů buněčného metabolismu
Cytotoxicita • Positivní kontrola – materiál vyvolávající reprodukovatelnou cytotoxickou odezvu (PUR, fenol) • Slepý vzorek – extrakční činidlo bez vzorku • Negativní kontrola – materiál, který nevyvolává cytotoxickou odezvu (HMWPE) • Extrakční činidlo – kultivační médium se sérem, fyziologický roztok • Podmínky extrakce dle povahy a účelu použití ZP (24 h, 37°C)
Cytotoxicita nosiče II • Kontaktní cytotoxicita – vložení testovaného materiálu do kultivační jamky s buňkami → sledování morfologie buněk v blízkosti zkoumaného materiálu = Zkouška přímým stykem
Nontoxic Cytotoxic
Cytotoxicita nosiče II • Zkouška nepřímým stykem: Zkouška difúzí agarem
Cytotoxicita
• Zkouška na cytotoxicitu příjmem neutrální červeně • Zkouška na cytotoxicitu MTT/XTT
1. den: nasazení buněk do 96-jamkových destiček (1x104 buněk/jamku)→ inkubace 24 hodin 2. den: mikroskopická kontrola buněk, odsátí kultivačního média – přidání extraktů (alespoň 4 koncentrace, positivní, negativní kontroly, médium – slepý vzorek) 3. den: mikroskopická kontrola buněk, odsátí média/extraktů → přidání 50 μl MTT – 2h inkubace → odsátí, přidání 100 μl IPA → měření při 570 a 650 nm Analýza dat: Viabilita (%)= 100 OD570e/OD570b OD570e – střední hodnota změřené absorbance extraktů OD570b – střední hodnota změřené absorbance slepých vzorků
Metabolické testy • MTT, MTS, XTT, WST • Nepřímá kvantifikace buněk → měření jejich metabolické aktivity
Metabolické testy • • • •
MTT MTS – „one step MTT“ XTT WST (Water soluble tetrazolium salts)
Cytotoxicita nosiče
Absorbance
• Výluhy tkáňového nosiče v polárním a nepolárním rozpouštědle → přidání do média při kultivaci buněk • Koncentrační řada výluhů → měření buněčné viability nejčastěji po 24-hodinové inkubaci → stanovení cytotoxické koncentrace 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
Cytotoxicita
Kultivace buněk na testovaném materiálu • Viz praktická cvičení MTI • Nasazení buněk na testovaný materiál → sledování buněčné adheze a proliferace • Doba kultivace, intervaly testování, počet buněk • Statická vs dynamická kultivace • Metody: Metabolické testy Fluorescenční mikroskopie Kvantifikace DNA Elektronová mikroskopie
Statická vs dynamická kultivace
Dynamická kultivace
Bioreaktory
Dynamická kultivace tubulárních vzorků
Fluorescenční mikroskopie • Barvení buněčných struktur: Jádra – PI, DAPI, Hoechst Cytoplasma – fluorescein Specifické barvení – fokální adheze (vinkulin, tallin), specifické buněčné receptory
Fluorescenční mikroskopie • Kvantifikace – počet buněk na ploše (zorné pole/počítací Gundersonovo okénko) po obarvení buněčných jader • Spreading – míra rozprostření buňky na materiálu → vypovídá o buněčné adhezi
LIVE/DEAD assay • Rozlišení živých a mrtvých buněk: mrtvé buňky se barví červeně (PI/ethidium pronikne poškozenou membránou do jádra buňky), živé buňky se barví zeleně (neporušená membrána → PI se nedostane do jádra; calcein)
Elektronová mikroskopie • Kvalitativní (semikvantitativní) hodnocení • Sledování buněčné adheze po nasazení buněk na materiál (v řádu několika hodin) • Proliferace buněk po povrchu scaffoldu během kultivace → vytvoření monolayeru buněk
Testy buněčné migrace
Yarrow et al. BMC Biotechnology 2004 4:21
Testování buněčné diferenciace • Důležité sledování při kultivaci kmenových buněk – ovlivnění jejich diferenciace růstovými faktory, mechanickými signály • Některé buněčné linie dediferencují (chondorcyty) – sledování jejich fenotypu • Využití metod molekulární biologie – detekce syntézy RNA pro dané proteiny (RT PCR), detekce proteinů (ELISA, IFL)
Kvantifikace DNA • Nejpřesnější stanovení počtu buněk • Izolace DNA (lýza buněk, odstranění proteinů, precipitace DNA ethanolem, rozpuštění DNA ve vodě nebo v pufru) – 1. krok při práci s NK • 2 typy izolace: 1. Fenol-chloroformová extrakce: standard, spolehlivé, levné x zdlouhavé, pracné 2. Adsorpční metoda – vazba DNA na silikátovou kolonku
Izolace DNA • pevné tkáně či rostlinné buňky nutno mechanicky rozrušit (homogenizátory) • detergenty lýza buněk a denaturace proteinů (např. Triton X-100) • EDTA, diethylpyrokarbonát (DEPC) aj. potlačení aktivity nukleáz přítomných ve vzorku • odstranění druhé nežádoucí NK v závislosti na izolovaném typu (RNáza A, DNáza I)
Fenol-chloroformová extrakce • lýza buněk • přídavek směsi fenol:chloroform (1:1) → denaturace proteinů a rozpouštění tuků • centrifugace oddělení spodní organické fáze (fenol +chloroform), mezifáze (denaturované proteiny, zbytky buněk) a horní vodné fáze s rozpuštěnými NK
• pro dokonalé odstranění proteinů nutno extrakci opakovat, v závěrečném kroku přidat pouze chloroform (odstranění stopového množství fenolu z vodné fáze) • vysrážení NK z vodné fáze přídavkem chlazeného 100% EtOH, zamražení na -80°C (30 – 60 min.) • centrifugace odstranění supernatantu • odsolení sedimentu (vysrážené NK) pomocí 70% EtOH • vysušení sedimentu • získaná NK se rozpustí v TE pufru (Tris-EDTA, pH 8) nebo deionizované vodě
Adsorpce NK na silikátový povrch • adsorpce NK na silikátový povrch kolony v přítomnosti chaotropních solí (jodid sodný, ionty guanidinu) závisí na koncentraci solí a pH prostředí • uvolnění NK z kolony přídavkem vody nebo pufru s vysokou iontovou silou, který neobsahuje chaotropní soli • této moderní techniky se využívá ve většině dostupných komerčních souprav pro rutinní izolace plazmidů, DNA a RNA
Kvantifikace DNA 1) Spektrofotometrie – konjugované elektrony heterocyklických bází NK specificky absorbují UVzáření v rozmezí 230 až 320 nm s absorpčním maximem při 260 nm • hodnota absorbance při 260 nm se využívá k výpočtu koncentrace NK
Pro správné určení koncentrace NK na základě absorbance při 260 nm je nezbytná čistota vzorku! • posouzení čistoty vzorku na základě poměru absorbancí A260/A280 • pro čistý vzorek NK se výsledné hodnoty poměru nacházejí v rozmezí 1,8 - 2,0
Kvantifikace DNA Spektrofotometrie – absorpce DNA při 260 nm (čistota DNA- poměr 260/280 nm)
- Malá senzitivita - Nulová specifita - Velké množství vzorku
Kvantifikace DNA 2. PicoGreen assay: izolace DNA – spektrofluorimetrické stanovení množství DNA
PCR • Polymerase chain reaction (Polymerázová řetězcová reakce) • Namnožení specifického úseku DNA Analýza genu Genová exprese (RT PCR) Kvantifikace DNA (qPCR) 3 kroky (několikrát opakovány): 1. Denaturace – rozpletení ds DNA → ss DNA 2. Annealing – Nasednutí primerů na specifická místa ss DNA 3. Polymerace – syntéza DNA (termostabilní DNA polymeráza)
PCR - obvykle 20 - 40 x opakování, trvání 2 – 4 hodiny - amplifikace teoreticky geometrickou řadou po 30 opakováních 230 (107 mil.) kopií - účinnost ale pouze cca 80% - v 1.cyklu: vzniká řetězec nespecifické délky (syntéza ukončena při změně teploty) - v dalších cyklech: vznikají řetězce specifické délky, odpovídají vzdálenosti vymezené nasednutím primerů
Termocycler
RT PCR • Sledování exprese genu na úrovni mRNA – přepis do DNA pomocí reverzní transkripce (RT)→ c DNA
Detekce specifických proteinů • Imunofluorescenční/imunohistochemické barvení • Elektroforéza • Western blot
Elektroforéza • Princip: dělení nabitých částic na základě různých elektroforetických pohyblivostí
Princip separace • - pentózofosfátová kostra všech nukleových kyselin nese při neutrálním pH stejně velký záporný náboj fragmenty ve stejnosměrném elektrickém poli migrují ke kladné elektrodě (+) - anodě a rychlost této migrace je závislá výhradně na jejich velikosti.
kratší fragmenty putují rychleji a urazí větší vzdálenost než fragmenty delší • - gel tvoří síťovitou strukturu s póry, brzdí pohyb NK
Horizontální elektroforéza
Nanášení vzorků
Agarózový gel
SDS elektroforéza ELFO na PAGE v přítomnosti SDS (Sodium Dodecyl Sulphate, dodecylsíran sodný) SDS denaturuje proteiny, uděluje jim uniformní záporný náboj
Detekce - elektroforéza
Barvení DNA - ethidium bromid
Western blot 1. Elektroforéza – rozdělení proteinů, např. SDSPAGE 2. blotting – přenos na membránu, např. elektroforeticky 3. detekce (většinou imunodetekce)
Užitečné odkazy • https://www.youtube.com/watch?v=uFu8aie4 QFI • http://byl-jednou-jedenzivot.nikee.net/index.php?video=1 • https://www.youtube.com/watch?v=WFryHxJ uhSI
