IMUNOLOGIE REPRODUKCE V TEORII A PRAXI
REPRODUKČNÍ IMUNOLOGIE Z. Ulčová-Gallová1, J. Madar2, K. Nouza2, R. Kinský2, J. Pěknicova3, T. Mardešic4, H. TlaskalováHogenová3, P. Panzner1, O. Cinek5, M. Šnajderová5, K. Křižanovská1, V. Bouše1, D. Sedláček1, Z. Rokyta1 1Plzeň: LF UK a FN 2Praha: UPMD 3ČAV 4Pronatal 5II. LF UK Úvod: Imunologie reprodukce v Plzni soustřeďuje páry s poruchami plodnosti (primární a sekundární sterilitu a infertilitu, pacientky s endometriózou, s preeklampsií, páry s autoimunitním onemocněním, páry opakovaně zařazované do in vitro fertilizačních programů - IVF). Cíl studie: zhodnocení jednotlivých tesů v reprodukční imunologii s ohledem na variabilitu diagnóz. Metodiky: spermmikroaglutinační testy (protilátky proti spermiím v séru, v peritoneální, folikulární tekutině, v ovulačním hlenu, v seminální plazmě), pasivní hemaglutinace (protilátky proti spermiím, antizonální preotilátky), ELISA metody (antizonální protilátky, sedm různých antifosfolipidových protilátek, hladiny sex- hormonů), intraakrozomální proteiny (i-IMF), typizace genů HLA-DQA1-DQB1, –DRB1 a CTLA4 (PCR-SSP). Výsledky: U žen s poruchou plodnosti převažují protilátky proti spermiím v oblasti hrdla děložního, antizonální protilátky v séru a ve folikulární tekutině především u pacientek s opakovanými úplnými IVF cykly, protilátky proti beta2-GPI, proti ph-inositolu a ph-ethanolaminu v IgG u pacientek s opakovanými potraty, u těhotných s preeklampsií, u žen s endometriózou a ze základním autoimunitním onemocněním nalézáme mozaiku vysokých hodnot jednotlivých testů reprodukční imunologie nejen v séru, ale i v peritoneální tekutině. V mikroskopicky zdánlivě normálním spermiogramu nalézáme spermaglutinační protilátky a u některých pacientů i defektní akrozomální reakci. Alela HLA-DQB1*0301 je u pacientek s imunologickou nadstavbou méně častá než u kontrolní skupiny. U některých žen s Dg. infertilitas jsou vyšší hodnoty protilátek proti trofoblastu. Diskuze a závěr: Páry s poruchami plodnosti jsou dnes detailně vyšetřovány vysoce specializovanými imunologickými vyšetřovacimi metodami. Přísně individuální výsledky imunologického vyšetření slouží k doplnění neuroendokrinního obrazu jednotlivce a dávají zatím omezenou možnost terapeutického ovlivnění imunologické tolerance. Sdělení vzniklo s podporou těchto grantů IGA MZ NH / 6409-3, 6451-3, 6463-3 a VZ LF UK 111 4 0000 5.
POVRCHOVÉ PROTEINY SPERMIÍ A SEMENNÉ PLAZMY VE FERTILIZACI V. Jonáková1, P. Maňásková1, P. Jelínková1, P. Balínová2, M. Tichá2 1 2
Ústav molekulární genetiky, AV ČR, Praha 6, ČR Oddělení biochemie PřF UK, Praha 2, ČR
Savčí fertilizace zahrnuje vysoce regulované biochemické interakce: vazbu proteinů semenné plazmy na povrch spermie během ejakulace, interakce povrchových proteinů spermie s epiteliálními buňkami oviduktu, kapacitaci spermie, rozpoznávání gamet, vazbu spermie k vajíčku, penetraci zonou pellucidou vajíčka, a další. Plazmatická membrána (PM) spermie prochází extenzivním remodelováním, když je spermie smíchána s proteiny semenné plazmy během ejakulace. Některé proteiny semenné plazmy i v agregované formě se stávají povrchovými složkami spermie. V tomto procesu jsou obsaženy dva typy interakcí: (i) interakce proteinů s PM spermie, (ii) vzájemné interakce mezi proteiny. Studium druhého typu interakce je předmětem tohoto sdělení. Spermadheziny a další proteiny semenné plazmy se váží jednak mezi sebou a jednak se spermií. Proteiny lokalizované na povrchu spermie se účastní všech zmiňovaných interakcí buď s komponentami oviduktu, zony pellucidy nebo s látkami přítomnými v přirozeném okolí obou gamet. Kančí spermadheziny (AQN, AWN a PSP proteiny) patří k velké rodině vývojově řízených proteinů. DQH povrchový protein spermie se strukturou liší od spermadhesinů a patří do velké rodiny adhezivních proteinů buněk a mezibuněčné hmoty. Zjistili jsme, že proteiny kančí semenné plazmy jsou za fyziologických podmínek přítomné převážně jako agregáty o různé molekulové váze, rozdílného složení a vazebných vlastností. Charakterizovali jsme tyto proteinové agregáty a určili, že agregované formy proteinů semenné plasmy (DQH, AQN, AWN, PSP) spíše než individuální proteiny se účastní vazby na povrch spermie, kapacitace spermie a primární vazby spermie k zoně pellucidě vajíčka. Vzájemné interakce proteinů kančí semenné plazmy jsme sledovali gelovou chromatografií a afinitní chromatografií na imobilizovaných spermadhezinech. Složení proteinů frakce semenné plazmy adsorbované k imobilizovaným spermadhezinům odpovídalo agregovaným formám proteinů semenné plazmy. Vzájemné interakce izolovaných proteinů byly testovány gelovou chromatografií a pomocí specifických protilátek proti spermadhezinům a proti inhibitoru akrosinu asociovaného se spermií (SAAI). Výsledky potvrzují existenci tvorby komplexu mezi spermadheziny AQN a AWN rodiny a DQH proteinu, mezi AQN 1 a inhibitorem akrosinu SAAI a rovněž mezi proteiny tvořícími heterodimer PSP I / PSP II. Ukazuje se, že agregované formy spermadhezinů jsou fyziologicky důležité ve fertilizaci. Tato práce byla podporována Grantovou agenturou České republiky (Granty č. 303/02/0433, 303/02 /P069), Grantem Ministerstva školství České republiky (MSM 113100001).
ÚLOHA INTRA-AKROSOMÁLNÍCH PROTEINŮ v OPLOZENÍ J. Pěknicová1, D. Chládek1, J. Čapková1, G. Geussová1, O. Teplá2 1 2
oddělení biologie a biochemie fertilizace, Ústav molekulární genetiky AV ČR, Praha Laboratoř IVF, Iscare IVF, a.s., Praha
Cíl studie: Využití monoklonálních protilátek (MoAbs) proti intra-akrosomálním proteinům savčích spermií jako nástroje pro studium vybraných proteinů v oplození a možnou aplikaci v asistované reprodukci. Metodika: MoAbs proti intra-akrosomálním proteinům savčích spermií byly použity ke studiu stavu akrosomu u spermií během kapacitace a indukované akrosomální reakci pomocí imunofluorescenčního testu. MoAbs byly použity ke zjištění možné úlohy intra-akrosomálních proteinů při sekundární vazbě spermie/vajíčko v in vitro vazebném testu. MoAbs proti intra-akrosomálním proteinům lidských spermií byly použity ke kvantitativnímu hodnocení množství značených akrosomů spermií u dárců s normálním a
patologickým spermiogramem a k označení spermatid pomocí imunofluorescenčního testu. Výsledky: Během kapacitace a po indukované akrosomální reakce došlo ke kvalitativním změnám v detekci intra-akrosomálních proteinů v akrosomu, byla prokázána úloha vybraných proteinů v sekundární vazbě spermie/vajíčko. Vzorky lidských ejakulátů s patologickým spermiogramem měly výrazně snížené množství intra-akrosomálních proteinů. Vybrané MoAbs byly použity k testování intraakrosomálních proteinů ve spermatidě. Závěr: MoAbs proti intra-akrosomálním proteinům mohou být užity ke studiu úlohy vybraných proteinů v procesu oplození. MoAbs mohou sloužit pro diagnostiku patologie savčích spermií (kvantitativní detekce proteinů) a pro hodnocení fysiologického stavu spermií (stav akrosomu před a po akrosomální reakci). Konečně, monoklonální protilátky proti proteinům lidských spermií mohou pomoci v rozhodování o výběru vhodné metody fertilizace IVF (IUI, standardní IVF, ICSI) již v prvním cyklu asistované reprodukce. Protilátky mohou být též použity pro testování kvality epididymálních spermií (microsurgery sperm aspiration – MESA) a testikulárních spermií (testicular extraction – TESE) určených pro použití v metodě ICSI. MoAbs mohou být použity k odhadu spermiogenese u pacientů s azoospermií. Práce byla podpořena granty č. 204/02/1373 a 303/00/1651 GA ČR, a grantem č. NJ 5851-3 IGA MZ ČR.
IMUNOLOGICKÉ PŘÍČINY OPAKOVANÝCH TĚHO- TENSKÝCH ZTRÁT J. Madar1, A. Chaloupková2, K. Šůla1, J. Pěknicová2, D. Nováková3, K. Nouza1, R. Kinský1 1
Ústav pro péči o matku a dítě, Praha-Podolí Ústav molekulární genetiky AV ČR, Praha-Dejvice 3 3. lékařská fakulta UK, Praha-Vinohrady 2
Úvod: Tolerance mateřské imunity k vyvíjejícímu se zárodku u placentálních savců představuje „imunologický paradox“ a zajímavý model pro studium navození imunologické tolerance. V současné době je známa řada specifických mechanismů, které řídí imunitu na fetomaternálním rozhraní. Při jejich poruše dochází buď k zábraně nidace embrya, nebo k potratům. Cíl studie: V souboru opakovaně potrácejících žen sledovat vybrané imunologické parametry, porovnat je s hodnotami v kontrolních skupinách a definovat možné souvislosti mezi patologickou imunitou a habituálním potrácením. Soubor pacientek: Skupinu opakovaně potrácejících žen tvoří 298 pacientek se třemi a více po sobě následujícími potraty v prvním trimestru těhotenství. Kontrolními skupinami byly jednak ženy dosud netěhotné (nuligravidy, kde příčina sterility páru byla na straně muže, n = 86), jednak plodné ženy, mající v anamnéze posledních dvou let alespoň jedno fyziologické a žádné patologické těhotenství (n = 32). Žádná z žen nebyla v době testů gravidní. Metodika: U pacientek byla sledována intenzita buňkami zprostředkované imunity proti buňkám cytotrofoblastu (BI-T) metodou inhibice migrace leukocytů v přítomnosti antigenu (Dimitrov et al., J. Immunol. Methods 154, 147, 1992). Sérové hladiny antikardiolipinových protilátek třídy IgG a IgM, C3 a C4 složek komplementu, cirkulujících imunokomplexů, imunoglobulinů IgA, IgG a IgM byly určovány standardními metodami Ústředních laboratoří ÚPMD. Výsledky a závěry: Buňkami zprostředkovaná imunita proti trofoblastu byla u opakovaně potrácejících žen výrazně častěji pozitivní a výrazně intenzivnější ve srovnání s oběma kontrolními skupinami, stejně jako úroveň antikardiolipinových protilátek třídy IgG. Hladina cirkulujících imunokomplexů byla u potrácejících žen zvýšena méně výrazně (P < 0,05). Ostatní sledované parametry nebyly signifikantně
odlišné. Uvedené poznatky vedly v indikovaných případech opakovaného potrácení k úspěšnému využití imunomodulační léčby, podávané prekoncepčně a v prvním trimestru gravidity. Studie byla podpořena grantem IGA MZ ČR č. 6463-3.
VÝZNAM FUNKCE ŠTÍTNÉ ŽLÁZY VYŠETŘOVACÍ SCHÉMA A VÝSLEDKY
U
STERILNÍCH
A INFERTILNÍCH
ŽEN
–
D. Nováková1, E. Uhrová2, M. Brandejská2, M. Křenek3, P. Racek3, P. Vlček3, K. Zemanová3 1
Odd. molekulární a buněčné imunologie, CBO Gynekologicko-porodnická klinika 2. LF UK a FN v Motole 3 Oddělení endokrinologie kliniky nukleární medicíny 2. LF UK a FN v Motole 2
Tyreopatie je nejčastější endokrinopatií. Postihuje kolem pěti procent populace. Na změny funkce štítné žlázy reagují i ostatní endokrinní systémy. Velmi často je postihována osa hypotalamus- hypofýzaovarium. Již velmi malé změny tyroidální funkce dokážou ovlivnit všechny etáže této osy. Z klinického hlediska jsou problémem právě preklinické formy tyreopatií, především preklinická hypotyreóza. Příčinou jejího vzniku je nejčastěji chronický zánět štítné žlázy. Na studium vlivu tyreopatie na fertilitu ženy byla zaměřena tříletá studie dvou pracovišť. Kliniky nukleární medicíny a endokrinologie a Centra asistované reprodukce Gynekologicko-porodnické kliniky 2. LF UK a FN v Praze Motole. V průběhu tohoto období bylo vyšetřeno celkem 450 žen s poruchami reprodukce. Pacientky byly podrobeny podrobnému gynekologickému vyšetřování. V rámci vyšetřování štítné žlázy byl u všech pacientek proveden TRH test ve standardní modifikaci, tj., bylo aplikováno 200 mg TRH (TRH Berlin-Chemie). Byly také vyšetřeny protilátky proti tyreoglobulinu (anti-Tgl), mikrosomům štítné žlázy (anti-TPO) a provedeno sonografické vyšetření štítné žlázy. TRH test byl původně používán především ke zjištění reaktivity hypofýzy u preklinické tyreotoxikózy a tomu také odpovídají dosud používaná kritéria jeho hodnocení. Při pátrání po preklinické hypotyreóza se dosud stále používá především vyšetření tyroidálních protilátek. Autoři ve své práci předkládají – na základě zjištěných výsledků – zhodnocení použití všech uvedených metod k verifikaci preklinické hypotyreózy u žen s poruchami fertility.
LABORATORY DIAGNOSTICS OF INFERTILITY IN CONDITIONS OF ASSOCIATED TISSUE BANK OF MEDICAL FACULTY AND UNIVERSITY HOSPITAL OF P. J. ŠAFÁRIK UNIVERSITY IN KOŠICE L. Bobák1, Z. Kladeková1, J. Rosocha1, J. M. Hrivňák2, V. Kraus3 1
Associated tissue bank Clinic of Urology 3 Clinic of Obstetrics and Gynaecology of Medical Faculty and Faculty Hospital of P. J. Šafárik University, Košice, Slovakia 2
Introduction: We can indicate that infertility of couple is biomedical problem, but childless of couple is predominantely sociological problem. In more wide consequences it has character of social and political problem as reason of socioeconomical situation.
Slovak republic also belongs to countries with the population problem. From 1989 is continually decreasing bithrate what results in negative balance of mortality and birthrate. Solution of this problem by diagnostics and therapy mitigate but only by small drop this problem. But at the first place it helps fulfil the dream of childless couples. Methods and results: In 1993 was based laboratory diagnostics of infertility in Slovakia, in the Department of immunology and allegology of University Hospital in Košice. From 1996 the laboratory works in conditions of the Associated tissue bank. Rising spectrum of examinations consists of immunological, biochemical and function tests recomended by WHO laboratory manual. We are in the consciousness of slovak medical community and patients like a sole laboratory with complex program of laboratory diagnostics of infertility. From 1996 to the end of 2001 there were examined 1837 patients and 6962 examinations were completed. Conclusion: Problems with infertility are necessary to solve by cooperation of associated medical specializations and by configuration of solely manual for diagnostic and therapy of infertility which will be incorporated into system of rules of Ministry of Health of Slovak republic.
