Immunszerológia I. Agglutináció, Precipitáció
Immunológiai és Biotechnológiai Intézet PTE-KK
Alapok • Antigén – Antitest • Antigén: vvt, baktérium, latex gyöngy felszínén (µm nagyságú partikulum) • Antitest: főleg IgM, IgA, ritkábban IgG • Direkt – Indirekt • Aktív - Passzív
Miért agglutinál jól az IgM?
Direkt és indirekt agglutináció
Direkt (IgM)
Indirekt (IgG)
Az agglutinációt befolyásoló tényezők • Hőmérséklet • pH • Inkubációs idő • Antigén – antitest arány • Ionerősség
Antigén – Antitest arány
Aktív – Passzív agglutináció • Aktív: a részecske saját felszíni antigén struktúrájával vesz részt a reakcióban pl. vvt – vércsoport meghatározás bakt. sejtfelszíni ag kimutatás
• Passzív: a részecskére tetszőleges haptén (epitóp) köthető – hordozó szerep (latex agglutinációs reakciók)
Az agglutináció élettani szerepe 1.
Az agglutináció élettani szerepe 2.
Agglutináció felhasználása klinikumban • Autoantitestek kimutatása (autoimmun hemolitikus anaemia, rheumathoid arthritis (RA), szisztémás lupus erythematosus (SLE)). • C-reaktív protein (CRP) kimutatása latex agglutinációval. • HCG latex terhességi gyorsteszt • Vércsoport szerológia • Bakteriális antigének kimutatása (pl. Bordetella pertussis, Leptospira sp., Treponema pallidum) • • •
Baktérium agglutináció Indirekt hemagglutináció gátlás Latex agglutináció (pl. Streptococcus hemophilus)
• Vírus antigének kimutatása indirekt hemagglutináció gátlással (pl. Rubeola)
Latex agglutináció 1.
pl. : RF, ASO, HCG, SLE, CRP
Latex agglutináció 2.
Haemagglutináció 1.
Haemagglutináció in vivo
Coombs - teszt AIHA = autoimmun haemolíticus anaemia Direkt Coombs - teszt
Indirekt Coombs - teszt
NZB egér szérumok
Immundiffúzió • Szemi-kvantitatív szérum antigén – antitest vizsgálatra alkalmas módszer. • Mancini módszer: egy antigén tartalmú gél vályújába cseppentett beteg szérum radiálisan szétdiffundál és a vályútól távolodva csökken a szérumban található antitestek koncentrációja. Az antigén – antitest optimális arányának helyén látható immunkomplex formálódik.
Mancini módszer
Ouchterlony módszer • Egy gél két vályújába egy csepp antig anti én és egy csepp szérumot helyezünk el. • Mindkét minta radiálisan a gélbe diffundál. • Precipitációs ívek formálódnak ott, ahol az antigén-antitest arány optimális az immunkomplexek kialakulásához.
Ouchterlony módszer
Elektroforezis (ELFO) • •
A minta komponensei az elektromos térben töltésüknek megfelelően mozdulnak el Az ELFO közege: a) Szilárd (papír, cellulóz-acetát vagy nitrocellulóz membrán) b) Fél-folyékony (agaróz vagy poliakrilamid gél) c) Folyékony (elektrolit)
Elektroforezis (ELFO) •
Szeparáció: a proteinek különböző sebességén alapul, amely függ: a) feszültségtől b) a proteinek méretétől és töltési viszonyaitól c) a közeg ellenállásától
ELFO szérum fehérje analízis • A szérum ELFO-t általában enyhén alaklikus közegben (pH 8.6) végzik. • Ezen a pH-n a legtöbb szérum protein a pozitív elektróda felé mozdul el.
ELFO szérum fehérje analízis • Az albumin a legnagyobb frakció. • α-globulinok (pl. α1 antitripszin, coeruloplazmin, Retinol Binding Protein, akut fázis fehérjék stb.) • β-globulinok (pl. transzferrin, β-2 mikroglobulin stb.) • γ-globulinok (immunglobulinok) Normal szérum elektroforetikus mintázat és denzitometriás diagram.
Poliklonális gammopátia
Alfa-1 antitrypsin hiány
• •
Általában genetikai háttér kimutatható Korai életkorban emfizéma, emfizéma, krónikus pancreatitis, pancreatitis, cirrhosis. cirrhosis.
Immunelektroforézis
Immunelektroforezis
ELFO
iELFO policlonal antibody
IgM κ többlet (cirrhosis)
1:1
1:4
1:8
anti-κ
anti-IgM
1:1
1:2
1:1
1:16 anti-λ
1:4
iELFO poliklonális antitest
ELFO
Monoklonális IgG λ többlet (Myeloma)
1:1 anti-λ
Anti-IgG
1:8
1:32
1:2
1:64
1:1
1:4 anti-κ
1:4
1:8
Poliklonális hipergammaglobulinaemia (RA, chronic inflamm.) ELFO
Norm.
iELFO poliklonális antiestek
1:1
1:2
1:4
1:8
anti-λ
anti-κ
Immunfixáció
Immunfixáció 1. Normál szérum 2. Myeloma multiplex IgG paraproteinnel 3. Waldenström macroglobulinaemia IgM paraproteinnel 4. Myeloma multiplex IgA paraproteinnel
1
2
3
4
Rakéta Immunelfo • Ma már csak monoklonális antitestekkel végzik • Alkalmas koncentráció meghatározásra • A rakéták távolsága az antigén vályúktól arányos a mintában lévő antigén koncentrációval.
2D immunELFO
• polivalens szérum segítségével több antigén vizsgálata • A precipitációs ívek alatti terület arányos a mintában lévő antigén koncentrációjával.
LASER Nefelometria
Turbidimetria
