II. BAHAN DAN METODE
2.1 Perancangan Percobaan Induk yang digunakan dalam penelitian ini adalah induk ikan nila yang berasal dari 4 populasi ikan nila yang berbeda, yaitu Red NIFI, NIRWANA, BEST, dan Merah lido (endemik Danau Lido). Keseluruhan induk yang digunakan adalah koleksi Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar Bogor. Ikan nila Red NIFI (Gambar 1a) pertama kali masuk ke Indonesia pada awal tahun 1981, diimpor oleh Balai Penelitian Perikanan Air Tawar. Nila merah cepat menyebar ke seluruh pelosok daerah karena penampilannya yang menarik (warna tubuh dan bentuknya). Liao dan Cang (1983) in Hussain et al., (2000) mengungkapkan bahwa ikan nila Red NIFI adalah ikan nila merah mutan yang berasal dari persilangan ikan albino Oreochromis mossambicus dengan Oreochromis niloticus. Hasil restruksi mt-DNA menunjukkan bahwa nila merah merupakan hasil persilangan antara nila putih dengan nila hitam (Nugroho dan Maskur, 2002). Secara genotipe ikan nila merah bersifat heterozigot P1P2 sebagai hasil persilangan ikan nila hitam (P1P1) dengan nila putih homozigot (P2P2) (Rustidja, 1994 in Hanif, 1999). Ikan nila NIRWANA (Gambar 1b) merupakan hasil seleksi famili dengan bahan dasar ikan nila GIFT dan nila GET (Genetically Enhanced Tilapia) dari Philipina. Ikan hasil seleksi memiliki respon seleksi sebesar 12,8% untuk betina dan 30,4% untuk jantan. Pemuliaan ikan nila hitam NIRWANA berlangsung selama tiga tahun (2003-2006) di Balai Pengembangan Benih Ikan (BPBI) Wanayasa, Purwakarta (Judantari, 2007). Ikan nila hitam BEST (Gambar 1c) adalah hasil seleksi nila GIFT 6. Seleksi bobot dilakukan sampai F3, pada keturunan ketiga ini menghasilkan perbaikan respon seleksi sebesar 28,85% (jantan) dan 10,20% (betina). Seleksi dilakukan selama 4 tahun (2004-2008) di BRPAT Bogor (Gustiano, 2008). Ikan nila Merah lido (Gambar 1d) adalah populasi ikan nila yang telah lama dipelihara di Danau Lido. Ikan ini memiliki warna merah pudar dengan
corak hitam disekujur tubuhnya. Persilangan ke empat populasi nila tersebut dilakukan secara resiprok dengan skema persilangan sebagai berikut (Tabel 1).
(a)
(b)
(c)
(d)
Gambar 1. Ikan nila Red NIFI (a), ikan nila NIRWANA (b), ikan nila BEST (c), dan ikan nila Merah lido (d). Tabel 1. Skema persilangan 4 populasi ikan nila secara resiprok. Betina(2)
Populasi
Jantan(1)
R RxR NxR LxR BxR
R N L B
N RxN NxN LxN BxN
L RxL NxL LxL BxL
Keterangan : R (Red NIFI), N (NIRWANA), L (Merah lido), B (BEST). dan 2) populasi kedua (♀), contoh : ♂Bx♀N.
B RxB NxB LxB BxB 1)
Populasi pertama (♂)
2.2 Prosedur Penelitian Kegiatan
penelitian meliputi persiapan wadah untuk pemijahan,
pemeliharaan larva, dan benih.
Pemilihan induk matang gonad, pemijahan
induk, pemeliharaan larva, dan benih. Kemudian dilanjutkan dengan pengamatan fenotipe (pertumbuhan bobot, derajat kelangsungan hidup benih, warna tubuh, dan Truss morphometric) serta pengukuran kualitas air.
4
2.2.1 Persiapan Wadah Pemijahan, Pemeliharaan Larva dan Benih Wadah yang digunakan dalam pemijahan induk ikan nila dan pemeliharaan larva memiliki spesifikasi yang sama yaitu hapa berukuran 2x2x1 m dengan mata jaring 2 mm sebanyak 16 unit
untuk pemijahan induk dan 10 unit untuk
pemeliharaan larva (Gambar 2a). Wadah untuk pemeliharaan benih digunakan waring
dengan ukuran 2x2x1 m dengan mata jaring 4 mm (Gambar
2b).
Sebelum digunakan hapa dan waring dibersihkan dari sisa lumut yang menempel di seluruh permukaan kemudian dibilas hingga bersih dan dipasang pemberat pada setiap sudut dasar wadah. Kode pemijahan dan pemeliharaan masing-masing hasil persilangan dipasang menempel pada hapa dan waring pemeliharaan. Seluruh kode digunakan secara konsisten baik
untuk pengkodean tempat
pemijahan dan pemeliharaan larva serta benih.
(a)
(b)
Gambar 2. Hapa pemijahan induk dan pemeliharaan larva (a), serta waring pemeliharaan benih (b). 2.2.2 Pemilihan Induk Matang Gonad Pemilihan induk matang gonad dilakukan dengan pemeriksaan satu per satu ciri kelamin primernya. Induk betina yang matang gonad ditandai dengan warna merah pada bagian papila, sedangkan pada induk jantan dilakukan pengurutan ringan untuk memastikan ada atau tidaknya sperma. Bobot induk betina yang digunakan berkisar 200-410 g, sedangkan induk jantan yang digunakan 350-600 g. Induk jantan yang digunakan dipilih yang lebih besar dibandingkan dengan betina pasangannya. Induk jantan Red NIFI, NIRWANA, Merah lido, dan BEST diperlukan masing-masing sebanyak 4 ekor, sehingga total dibutuhkan 16 ekor induk jantan matang gonad. Induk betina Red NIFI, NIRWANA, Merah lido, dan
5
BEST diperlukan masing-masing 16 ekor, sehingga total dibutuhkan 64 ekor induk betina matang gonad.
2.2.3 Pemijahan Induk Induk yang telah dipilih untuk dipijahkan, melalui proses pematangan gonad selama kurang lebih selama 2 minggu dengan pemberian pakan berprotein 28,29%, secara ad satiation, dengan frekuensi 2 kali sehari, yaitu pagi dan sore. Pemberian pakan secara teratur diharapkan memenuhi kebutuhan nutrisi dalam proses pemijahan dan pengeraman telur oleh induk betina. Induk-induk yang telah matang gonad selanjutnya dipijahkan dengan perbandingan induk jantan:induk betina adalah 1:4. Proses pemijahan dilakukan secara alami dan terkontrol pada masing-masing hapa dengan skema pemijahan sesuai Tabel 1. Pembuahan pada ikan nila terjadi di luar tubuh, yaitu telur dikeluarkan oleh induk betina dan dalam waktu bersamaan sperma dikeluarkan oleh induk jantan, kemudian induk betina mengerami telur di dalam mulutnya hingga menetas dan kuning telur larva habis.
2.2.4 Pemeliharaan Larva Pemanenan larva dilakukan pada pagi hari saat larva berenang menuju permukaan menggunakan serokan alumunium kemudian dipindahkan ke wadah penampungan secara perlahan. Larva dihitung satu per satu dan dimasukkan ke hapa pemeliharaan larva. Larva dipelihara selama 25 hari dan diberi pakan remah secara ad satiation dengan frekuensi 5 kali sehari, yaitu pagi 1 kali, siang 2 kali dan sore 2 kali. Selama pemeliharaan larva di dalam hapa, hapa dibersihkan secara berkala setiap satu minggu sekali untuk mengurangi penumpukan kotoran dan lumut yang mati di dasar dan keliling hapa.
2.2.5 Pemeliharaan Benih Setelah berumur 25 hari, benih dipanen dari hapa menggunakan serokan alumunium kemudian dilakukan proses grading menggunakan jaring untuk mendapatkan benih yang seragam dengan panjang total rata-rata 3 cm. Seluruh benih dihitung satu per satu dengan sendok plastik. Benih ditebar ke waring dengan padat penebaran 50 ekor/m3 sebanyak 3 ulangan pemeliharaan setiap
6
persilangan resiprok. Benih yang telah di-grading kemudian ditimbang bobot dan diukur panjangnya sebagai titik pengukuran awal pemeliharaan (To) dengan jumlah sampel 30 ekor/waring.
Benih diberi pakan pelet remah dengan FR
(Feeding Rate) 10% dari biomassa, hingga akhir pemeliharaan selama 8 minggu (56 hari). Frekuensi pemberian pakan sebanyak 3 kali sehari, yaitu pagi, siang, dan sore. 2.2.6 Pengamatan Fenotipe Pengamatan fenotipe hibrida hasil persilangan intraspesifik ikan nila dari keempat populasi secara resiprok meliputi laju pertumbuhan harian, derajat kelangsungan hidup, morfometrik (Truss morphometric), dan warna tubuh. Pertumbuhan Bobot Untuk sampling pengukuran pertumbuhan bobot dan panjang dilakukan setiap 2 minggu sekali dengan jumlah sampel 30 ekor/ulangan. Bobot diukur menggunakan timbangan digital dengan ketelitian 0,01 g. Sampling awal (To) dilakukan pada saat penebaran (umur benih 25 hari). Sampling T1 dilakukan pada saat benih berumur 39 hari, T2 berumur 53 hari, T3 berumur 67 hari, dan terakhir T4 berumur 81 hari. Derajat Kelangsungan Hidup Benih Derajat kelangsungan hidup benih dihitung pada akhir perlakuan pemeliharaan (benih berumur 81 hari) untuk setiap persilangan. Pengukuran Truss Morphometric Pengukuran morfometrik dilakukan pada benih yang berumur 84 hari. Setiap benih hasil persilangan diambil secara acak 10 jantan dan 10 betina, kemudian benih tersebut diletakkan di atas kertas yang telah dilapisi plastik bening, kemudian masing-masing titik ditandai menggunakan jarum. Hasil penandaan tersebut kemudian dihubungkan menggunakan pensil dan diukur mengunakan jangka sorong dengan ketelitian 0,01 mm. Metode pengukuran morfologi ikan
adalah metode Truss morphometric mengacu pada cara
pengukuran menurut Brzesky dan Doyle (1988), meliputi pengukuran jarak titiktitik tanda yang dibuat pada kerangka tubuh
(Gambar 3). Penjelasan dari
komponen titik –titik tanda dapat dilihat pada Tabel 2.
7
Gambar 3. Titik Truss morphometric ikan nila (Brzesky dan Doyle, 1988). Tabel 2. Deskripsi 21 karakter morfologis morfometrik yang diukur untuk analisis variabilitas intraspesifik. No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Bidang Truss Kepala
Tengah Tubuh
Tubuh belakang
Pangkal ekor
Kode A1 A2 A3 A4 A5 A6 B1 B3 B4 B5 B6 C1 C3 C4 C5 C6 D1 D3 D4 D5 D6
Deskripsi Jarak Bawah mulut – awal sirip perut Bawah mulut – atas mata Atas mata – awal sirip punggung keras Awal sirip perut – awal sirip punggung keras Awal sirip perut – atas mata Bawah mulut – awal sirip punggung keras Awal sirip perut – awal sirip anal Awal sirip punggung keras – awal sirip punggung lunak Awal sirip punggung lunak– awal sirip anal Awal sirip punggung keras – awal sirip anal Awal sirip punggung lunak – awal sirip perut Awal sirip anal – akhir sirip anal Awal sirip punggung lunak – akhir sirip punggung keras Akhir sirip punggung lunak – akhir sirip anal Awal sirip punggung lunak – akhir sirip anal Akhir sirip punggung lunak – awal sirip anal Akhir sirip anal – awal sirip ekor bawah Akhir sirip punggung lunak – awal sirip ekor atas Awal sirip ekor atas – awal sirip ekor bawah Akhir sirip punggung lunak– awal sirip ekor bawah Awal sirip ekor atas – akhir sirip anal
2.2.7 Pengukuran Kualitas Air Kualitas air yang diukur meliputi DO (Dissolved Oxygen), suhu, pH, kecerahan, Total Amonia Nitrogen (TAN) dan amoniak (NH3). Dissolved Oxygen
8
(DO) diukur menggunakan DO-meter digital (Gambar 4). Suhu dan pH diukur mengunakan alat ukur digital. Total Amonia Nitrogen (TAN) diukur menggunakan spektrofotometer. Amonia dihitung dengan mengambil angka turunan regresi linear dari hasil TAN yang disesuaikan dengan variabel suhu dan pH (Boyd, 1990). Keseluruhan parameter kualitas air tersebut diambil di awal pemeliharaan, di tengah pemeliharaan, dan di akhir pemeliharaan.
Tabel 3. Metode pengukuran kualitas air danau. Parameter Kualitas Air
Satuan
DO Suhu Kecerahan pH TAN Amonia
mg/L °C M mg/L mg/L
Metode Pengukuran
Keterangan
DO meter digital termometer Hg/pemuaian Secchi disk/visual pH meter/potensiometrik Spektofotometer Regresi TAN
in situ in situ in situ in situ ex situ ex situ
(a)
(b)
Gambar 4. DO meter (a) dan pengukuran DO (b). 2.3 Parameter Penelitian Parameter yang diukur dalam penelitian ini adalah keragaan hibrida hasil persilangan intraspesifik 4 populasi ikan nila (Red NIFI, NIRWANA, Merah lido, dan BEST,) secara resiprok yaitu meliputi : jumlah larva, laju pertumbuhan benih, derajat kelangsungan hidup benih, nilai heterosis,
fenotipe (warna &
morfometrik), dan media pemeliharaan di Danau Lido. 2.3.1 Jumlah Larva Jumlah larva hasil persilangan dihitung secara manual satu per satu kemudian diletakkan di hapa pemeliharaan larva. Dalam proses pemijahan
9
terkadang ada 2 sampai 3 induk betina yang menghasilkan larva, sehingga dapat diperoleh rata-rata jumlah larva yang dihasilkan per satuan ekor induk dari masing- masing persilangan. Jumlah larva per satuan induk (ekor/induk) dihitung menggunakan rumus perhitungan sebagai berikut :
Keterangan : x
= jumlah larva per satuan induk (ekor/induk) larva = jumlah larva dalam 1 kali pemijahan (ekor) induk = jumlah induk betina yang memijah
2.3.2 Laju Pertumbuhan Harian Laju pertumbuhan harian (Spesifik Growth Rate /SGR) dalam penelitian ini dihitung menggunakan rumus :
Keterangan :
SGR = laju pertumbuhan harian (%) Wt
= bobot rata-rata ikan pada saat akhir (gram)
Wo
= bobot rata-rata ikan pada saat awal (gram)
t
= lama perlakuan (hari)
2.3.3 Derajat Kelangsungan Hidup Benih Kelangsungan hidup (survival rate/SR) yaitu perbandingan benih yang hidup hingga akhir pemeliharaan terhadap jumlah benih pada awal pemeliharaan dengan menggunakan rumus :
Keterangan : SR = derajat kelangsungan hidup (%) Nt = jumlah benih ikan hidup pada akhir pemeliharaan (ekor) No = jumlah benih ikan pada awal pemeliharaan (ekor)
10
2.3.4 Nilai Heterosis Heterosis (H) adalah penampilan tambahan yang diperlihatkan oleh generasi hibrida di atas penampilan rata-rata kedua induknya. Nilai heterosis dapat dihitung dengan menggunakan rumus :
Keterangan : H
= Nilai heterosis (%)
AB + BA
= Komponen hibrida resiprok
AA atau BB
= Komponen true breeding
2.3.5 Fenotipe Truss Morphometric Analisis Diskriminan Canonical Analisis diskriminan canonical dilakukan untuk mendapatkan pola penyebaran karakter morfologi dengan visualisasi scatter plot dengan persamaan matematis sebagai berikut : Zjk = a + W1X1k+W2X2k+ … + WnXnk Keterangan : Zjk
= Nilai (skor) diskriminan dari responden (obyek) ke–i
a
= Intercept
Xnk
= Variabel independen n untuk objek ke-k
Wn
= Koefisien atau timbangan diskriminan untuk variable independen.
Analisis Nilai Sharing Component Analisis nilai sharing component digunakan untuk mengetahui persentase kekerabatan antar persilangan. Analisis Hierarki Cluster Analisis hierarki cluster dilakukan untuk mendapatkan matriks jarak kemiripan morfometrik dalam bentuk dendogram interpopulasi.
11
2.4 Analisis Data Data derajat kelangsungan hidup benih dan
laju pertumbuhan harian/
Spesific Growth Rate (SGR), yang telah diperoleh kemudian ditabulasi dan dianalisis menggunakan bantuan program Microsoft Excel 2007 dan SPSS 16.0. Jumlah larva dan fenotipe warna diinterpretasikan secara deskriptif. Keragaman intrapopulasi fenotipe hasil persilangan (hibridisasi) intraspesifik menggunakan 4 populasi ikan nila secara resiprok dianalisis menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dan uji F-test pada selang kepercayaan 95%. Jika hasil yang diperoleh berbeda nyata, dilakukan uji Duncan sebagai uji lanjut. Uji statistik dilakukan dengan menggunakan rancangan sebagai berikut: Yij = µ + τi + εij Keterangan: Yij
= data pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j
µ
= nilai tengah data
τi
= pengaruh perlakuan ke-i
εij
= galat percobaan pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j Perbedaan keunggulan induk jantan atau betina pada persilangan resiprok
terhadap keragaan progeni hibrida
dianalisis menggunakan Rancangan Acak
Lengkap Pola Faktorial AxB dengan
dua peubah bebas, dalam klasifikasi
sumber genetik jantan (faktor A) dan sumber genetik betina (faktor B). Model Matematis untuk analisis pola faktorial adalah : Yijk = µ + Ai + Bj + ABij + єijk i = 1, 2, 3,…………,a
j = 1,2,3...........,b dan k =1.2.3,.......u
Keterangan : Yijk
= Pengamatan Faktor A taraf ke-i , Faktor B taraf ke-j dan Ulangan ke-k
µ
= Rataan Umum
Ai
= Pengaruh Faktor A pada taraf ke-i
Bj
= Pengaruh Faktor B pada taraf ke-j
ABij
= Interaksi antara Faktor A dengan Faktor B
cєijk
= Pengaruh galat pada Faktor A taraf ke-i, Faktor B taraf ke-j dan ulangan ke-k
12
Keragaman
fenotipe morfometri dianalisis
menggunakan analisis
diskriminan canonical dan hierarki cluster dengan bantuan software SPSS 16.0.
13
