II. BAHAN DAN METODE 2. 1 Perancangan Percobaan Rumput laut yang digunakan pada penelitian ini yaitu rumput laut K. alvarezii dengan kondisi baik (tidak terdapat tanda-tanda pemutihan jaringan) yang berasal dari Kepulauan Natuna, Kepulauan Riau. Penelitian ini dimulai dengan persiapan eksplan thalus rumput laut. Persiapan eksplan meliputi persiapan media kultur semi steril. Media yang digunakan adalah media CW. Persiapan lainnya dalam persiapan eksplan adalah transportasi eksplan dari tempat asal dan pembersihan eksplan untuk dikultur pada kondisi semi steril. Setelah dilakukan persiapan eksplan, dilakukan sterilisasi eksplan menggunakan media CW dengan penambahan antibiotik. Sterilisasi eksplan meliputi persiapan media steril, inisiasi eksplan, dan uji kontaminasi eksplan. Proses selanjutnya pada penelitian ini adalah induksi kalus. Induksi kalus meliputi kegiatan pembuatan media perlakuan untuk induksi kalus, penanaman eksplan, dan pengamatan induksi kalus. Media perlakuan yang digunakan adalah media CW dan PES padat dengan penambahan zat pengatur tumbuh dari golongan auksin yaitu Indol Acetic Acid (IAA) dan Napthalen Acetic Acid (NAA), serta dari golongan sitokinin yaitu Benzyl Amino Purine (BAP). Jenis ZPT dikombinasikan sesuai rancangan percobaan pada penelitian ini. Perlakuan dengan penambahan ZPT IAA dan BAP dibuat menjadi 9 perlakuan di tiap-tiap media dasar. Sementara itu perlakuan dengan penambahan ZPT NAA dan BAP dibuat menjadi 6 perlakuan di tiap-tiap media dasar, akan tetapi perlakuan dengan tanpa penambahan NAA menggunakan data yang sama dengan kelompok perlakuan penambahan ZPT IAA dan BAP sehingga jumlah perlakuan menjadi 9 perlakuan. Setiap perlakuan dibuat sebanyak 10 ulangan.
2. 2 Prosedur Penelitian 2. 2. 1 Persiapan Eksplan 2. 2. 1. 1 Persiapan Wadah dan Media Kultur Wadah yang digunakan yaitu toples. Langkah awal yaitu toples dicuci dan disterilisasi dengan menggunakan autoklaf selama 15 menit.
Selanjutnya dibuat stok air laut saring untuk campuran dalam pembuatan media kultur semi steril dengan cara air laut disaring menggunakan internal filter akuarium AA-1200L. Air laut yang sudah disaring tersebut kemudian disaring kembali menggunakan plankton net sebanyak dua kali. Setelah itu dilanjutkan dengan pembuatan larutan stok media untuk kultur semi steril. Pembuatan dilakukan dengan cara larutan stok A dipanaskan hingga mendidih kemudian ditambahkan 1 mℓlarutan stok B ke dalam larutan stok A dan diaduk menggunakan magnetic stirrer sampai homogen. Komposisi media CW terdapat pada Lampiran 1. Langkah selanjutnya adalah pembuatan media untuk kultur semi steril. Media CW dalam toples ditentukan sebanyak 4 liter. Langkah pertama dalam pembuatan media CW untuk kultur semi steril yaitu disiapkan terlebih dulu labu ukur ukuran 2 ℓyang telah diisi dengan air laut saring sebanyak 1 ℓ. Selanjutnya ditambahkan 8 mℓstok larutan CW (2 mℓ /ℓ) dan 4 mℓstok larutan thyamine (1 mℓ /ℓ) sambil diaduk dengan magnetic stirrer kemudian ditambahkan air laut saring hingga volume mencapai 2 ℓ . Setelah diaduk secara merata, media dimasukkan ke dalam toples kaca dan ditambahkan lagi air laut saring sebanyak 2 ℓke dalam toples kaca hingga volume mencapai 4 ℓ. Setelah selesai membuat media, toples kaca ditutup dengan menggunakan plastik tahan panas dan diikat dengan karet kemudian disterilisasi dengan autoklaf selama 1 jam pada suhu 1210C atau tekanan 0,1 Mpa. Satu hari setelah disterilisasi, pada media CW ditambahkan 1 mℓstok larutan vitamin B12 steril. Hal ini dilakukan dalam laminar air flow. 2. 2. 1. 2 Persiapan Eksplan untuk Kultur Semi Steril K. alvarezii ditransportasikan dari Kepulauan Natuna, Kepulauan Riau, Indonesia menuju Laboratorium Service SEAMEO BIOTROP Tajur, Jawa Barat, Indonesia. Rumput laut dimasukkan ke dalam wadah transportasi yaitu box kardus dimana rumput laut dibalut dengan koran basah. Waktu transportasi disesuaikan dengan persiapan media kultur. Selanjutnya, thalus rumput laut yang sehat dan bersih dipotong sekitar 10 cm menggunakan pisau lalu dibersihkan dengan air laut steril (Gambar 1). Untuk aklimatisasi pada kondisi laboratorium, eksplan yang telah dipotong kemudian
5
dikultur pada kondisi semi steril dalam media CW yang sebelumnya sudah dipersiapkan dan diberikan aerasi serta ditutup dengan plastik wrap code PW-45.
Gambar 1. Stok air laut steril. Rumput laut dipelihara sampai dapat bertahan hidup dengan stabil dalam ruangan AC dan diberikan fluktuasi penyinaran cahaya gelap : terang = 12:12 jam dengan intensitas ± 1500 lux (Suryati dan Mulyaningrum 2009) (Gambar 2). Selama aklimatisasi, media diganti satu minggu sekali.
Gambar 2. Kultur cair semi steril (aklimatisasi eksplan). 2. 2. 2 Sterilisasi Eksplan Thalus 2. 2. 2. 1 Persiapan Media Sterilisasi Media CW sebanyak 970 mℓyang sudah disterilisasi dengan autoklaf ditambahkan larutan antibiotik mix (penicillin G, streptomycin sulphate, kanamycin, nystatin, neomycin) sebanyak 30 mℓdan vitamin B12 0,2 mℓdi dalam laminar air flow. Pembuatan larutan antibiotik mix (Suryati dan Mulyaningrum 2009) yaitu dengan cara mencampurkan penicillin G 1 g, streptomycin sulphate 2 g, kanamycin 1 g, nystatin 25 mg dan neomycin 200 mg
6
ke dalam 100 mℓaquades yang kemudian disterilisasi dengan syringe filter 0,22 μm. Setelah pembuatan media steril selesai, media steril dibagi ke dalam 10 botol dengan volume masing-masing 100 mℓ . 2. 2. 2. 2 Inisiasi Eksplan Eksplan yang digunakan adalah rumput laut yang telah diaklimatisasikan pada kultur semi steril selama 1 minggu dan 5 minggu. Rumput laut dipotong sepanjang 5 cm dengan menggunakan pisau scalpel steril kemudian dibersihkan dengan air laut steril sebanyak dua kali. Selanjutnya rumput laut yang telah dibersihkan, dicuci dan direndam air laut steril ditambah sabun tween sebanyak 5 tetes per 100 mℓselama 10 menit, kemudian dibilas dengan menggunakan air laut steril kembali sebanyak dua kali. Proses selanjutnya adalah perendaman eksplan rumput laut ke dalam larutan betadine 0,5% (0.5 mℓper 100 mℓair laut) selama 2 menit dan setelah itu dibilas kembali sebanyak dua kali dengan air laut steril. Eksplan kemudian dimasukkan ke media CW + antibiotik mix sebanyak 12-14 eksplan per botol kultur kemudian dishaker selama 60 jam dengan penyinaran lampu TL 1500 lux dengan perbandingan penyinaran terang gelap 12 : 12 jam. Setelah 60 jam dishaker, eksplan dibilas dengan air laut steril kemudian ditanam di media CW padat (media CW dengan penambahan bacto agar 8 g/ℓ). Eksplan yang ditanam disimpan di ruang kultur pada suhu ruangan 220C dan pencahayaan lampu 1500 lux dengan perbandingan pencahayaan terang gelap 12 : 12 jam. Pada 2 minggu setelah tanam, diamati jumlah eksplan yang terkontaminasi dan kondisi fisik eksplan.
2. 2. 3 Induksi Kalus 2. 2. 3. 1 Persiapan Media Induksi Kalus Rancangan percobaan dilakukan untuk mendapatkan media yang optimal untuk induksi kalus. Induksi kalus dilakukan pada dua jenis media dasar yaitu CW dan PES. Komposisi media PES terdapat di Lampiran 2. Media dasar CW dibuat sebanyak 1 liter. Pembuatan media CW dilakukan dengan cara stok larutan CW dimasukkan sebanyak 2 mℓdan stok thyamine 1 mℓke dalam labu ukur berukuran 1 ℓkemudian ditambahkan air laut saring sampai 1 ℓ. Sementara itu, banyaknya media PES yang dibuat adalah 1 liter. Pembuatan media PES yaitu
7
dengan cara larutan stok PES steril sebanyak 20 mℓdimasukkan ke dalam 980 mℓ air laut yang sudah disterilisasi dengan autoklaf. Penambahan stok PES steril tersebut dilakukan dalam laminar air flow. Pada masing-masing media tersebut ditambahkan dua kombinasi ZPT yaitu BAP + IAA dan BAP + NAA. Konsentrasi BAP yang digunakan adalah 0; 0,5; 1 mg/ℓ . Konsentrasi IAA yang digunakan adalah 0; 2,5; 5 mg/ℓ , sedangkan NAA pada konsentrasi 0; 0,5; 1 mg/ℓ(Tabel 1 dan Tabel 2). Tabel 1. Perancangan media perlakuan dengan penambahan ZPT IAA dan BAP Media Dasar
CW
PES
IAA
BAP (mg/ℓ )
(mg/ℓ )
0
0,5
1
0
1
6
11
2,5
2
7
12
5
3
8
13
0
16
21
26
2,5
17
22
27
5
18
23
28
Keterangan : Angka yang dicetak miring merupakan penomoran pada media perlakuan di botol
Tabel 2. Perancangan media perlakuan dengan penambahan ZPT NAA dan BAP Media Dasar
CW
PES
NAA
BAP (mg/ℓ )
(mg/ℓ )
0
0,5
1
0
1
6
11
0,5
4
9
14
1
5
10
15
0 0,5
16
21
26
19
24
29
1
20
25
30
Keterangan : Angka yang dicetak miring merupakan penomoran pada media perlakuan di botol
Setiap media perlakuan ditambahkan bacto agar 8 g/ℓ kemudian dipanaskan hingga larut. Setelah larut, media perlakuan disterilisasi di autoklaf selama 30 menit pada suhu 121 0C atau tekanan 0,1 Mpa. Setelah disterilisasi dan suhu media sudah menjadi hangat, tiap-tiap media perlakuan ditambahkan 0,1 mℓ vitamin B12 di dalam laminar dan diaduk menggunakan magnetic stirrer. Selanjutnya media perlakuan dituang ke dalam botol perlakuan steril (botol chicken).
8
2. 2. 3. 2 Penanaman Eksplan dan Pengamatan Eksplan rumput laut K. alvarezii yang tidak terkontaminasi pada 2 minggu setelah sterilisasi dipindahkan (subkultur) ke media perlakuan. Eksplan yang steril dikeringkan dengan menggunakan tissu steril kemudian dipotong menjadi panjang 4-5 mm dan dikeringkan kembali menggunakan tissu steril untuk menghilangkan cairan dan lendir yang keluar pada saat pemotongan. Eksplan kemudian ditanam di media perlakuan untuk induksi kalus (1 eksplan per botol).
2. 3 Parameter Penelitian dan Analisis Data Parameter yang diukur pada penelitian ini adalah hubungan umur pemeliharaan eksplan pada kondisi semi steril terhadap tingkat kontaminasi, tingkat persentase kalus yang terinduksi dan respon pertumbuhan kalus. 2. 3. 1 Sterilisasi Eksplan Thalus Rumput Laut Kontaminasi merupakan salah satu hal yang harus dihindari dari kegiatan kulur jaringan. Untuk menunjang keberhasilan kultur jaringan, eksplan yang ditanam harus steril dan tidak terkontaminasi. Eksplan yang dipelihara pada kultur semi steril selama 1 minggu dan 5 minggu diuji hubungannya terhadap jumlah eksplan yang terkontaminasi dan tidak terkontaminasi. Hal ini bertujuan untuk mengetahui apakah ada hubungan lama pemeliharaan dalam kultur semi steril terhadap kontaminasi eksplan. Untuk mengetahui hubungan antara lama pemeliharaan dalam kultur semi steril dan kontaminasi eksplan, maka dilakukan penghitungan eksplan yang terkontaminasi dan tidak terkontaminasi. Perhitungan dilakukan pada tiap-tiap umur pemeliharaan (1 minggu dan 5 minggu). Data hubungan umur eksplan dalam kultur semi steril terhadap tingkat kontaminasi eksplan dianalisis statistik dengan menggunakan uji independensi (chi-square test). Langkah-langkah uji independensi yang telah dirumuskan Daniel (1990) adalah sebagai berikut: 1. Merumuskan H0 dan H1 H0 : Umur eksplan dalam pemeliharaan kultur semi steril dan kontaminasi eksplan adalah independent (tidak ada hubungan)
9
H1 : Umur eksplan dalam pemeliharaan kultur semi steril dan kontaminasi eksplan tidak independent (ada hubungan) 2. Menentukan taraf nyata dan derajat kebebasan serta menentukan daerah kritisnya (α= 0,05; derajat bebas (v) = (kolom – 1) (baris – 1)) Menentukan statistik uji yang cocok χ2 = Eij = (total baris i) x (total kolom j) : total pengamatan 3. Menghitung statistik uji 4. Menarik Kesimpulan 2 Jika χ hitung > χ2 tabel (α,v) : tolak Ho 2 Jika χ hitung < χ2 tabel (α,v) : gagal tolak Ho
Keterangan : O : frekuensi obeservasi E : frekuensi harapan i : baris ke-i j : kolom ke-j
2. 3. 2 Persentase Eksplan Membentuk Kalus Persentase eksplan membentuk kalus pada tiap-tiap perlakuan dihitung dengan membandingkan jumlah eksplan yang membentuk kalus pada minggu ke6 setelah tanam dengan jumlah eksplan keseluruhan yang ditanam pada tiap-tiap media perlakuan. Untuk menghitung persentase eksplan membentuk kalus digunakan rumus matematika sebagai berikut: % eksplan membentuk kalus =
x 100%.
Data tingkat persentase kalus yang terinduksi dianalisis secara deskriptif dan perhitungan persentase menggunakan MS.Excel 2007.
2. 3. 3 Pertumbuhan Kalus Pada minggu ke-6 setelah tanam dilakukan pengamatan pertumbuhan kalus. Pengamatan respon pertumbuhan kalus dilakukan dengan cara pemberian nilai (skor). Kalus yang terbentuk terbagi menjadi 6 nilai pertumbuhan, yaitu: 0 : eksplan tidak bereaksi atau mati
10
1 : pembentukan kalus sangat rendah 2 : pembentukan kalus rendah 3 : pembentukan kalus sedang 4 : pembentukan kalus tinggi 5 : pembentukan kalus sangat tinggi Data yang diperoleh kemudian diolah untuk mendapatkan media yang optimal untuk pertumbuhan kalus. Data respon tumbuh kalus dianalisis statistik dengan menggunakan uji statistik non-parametrik Kruskal-Wallis dengan menggunakan perangkat lunak SPSS 16.0. Analisis data dengan menggunakan uji Kruskal-Wallis mengikuti langkahlangkah yang telah dirumuskan dan telah ada dalam perangkat lunak SPSS 16.0 sebagai berikut (Steel and Torrie 1980 dalam Aprilliana 2010): 1. Merumuskan H0 dan H1 2. Perangkingan (Pemberian Skor) 3. Membuat tabel rangking 4. Menghitung jumlah T(t-1)(t+1) 5. Menghitung faktor koreksi atau pembagi Pembagi = 16. Menghitung H H=
12 n(n+1)
∑Ri2 ni
- 3(n+1)
Menghitung H’ H’ = Melihat X2 tabel dengan α: 0,05 db (v) = k-1 Jika x 2 hitung > tabel = tolak Ho = uji lanjut Dunn Jika x 2 hitung < tabel = gagal tolak Ho Keterangan : T
: (t-1)(t+1)
Ni
: banyaknya pengamatan dalam perlakuan
Ri 2
: Jumlah rangking dalam perlakuan ke-i
T
: banyaknya pengamatan seri dalam kelompok
H’
: H terkoreksi
11
Jika hasil analisis data pada uji Kruskal-Wallis menunjukkan adanya pengaruh yang nyata maka dilanjutkan dengan uji Dunn yang bertujuan untuk mengetahui perlakuan mana saja yang memberikan pengaruh berbeda nyata terhadap pertumbuhan kalus. Uji dilakukan dengan menghitung mengikuti rumus sebagai berikut (Daniel 1990): >
>Zα
jika
maka terdapat perbedaan yang nyata
k(k-1)
jika
maka tidak terdapat perbedaan yang nyata
k(k-1)
Keterangan : Ri : rata-rata ranking perlakuan ke-i Rj : rata-rata ranking perlakuan ke-j N : Banyaknya ulangan k
: Banyaknya perlakuan
12
