Igazságügyi genetika alapjai Molekuláris orvostudomány -
molekuláris bűnjelek genetikai analízise Pádár Zsolt „Nyomok” - Death Valley, CA 2007 / 10 / 11
Igazságügyi genetika … vannak az ÉLET dolgai …
É
K E Y N
… és vannak ROSSZ dolgok az életben …
M K E L E S C
… ezek egy részét mi tesszük …
… másokat velünk tesznek meg … … és vannak, amiről azt állítják, mi tettük meg …
N Ű B
… vannak, az életben NAGYON ROSSZ dolgok is … … amiről azt gondoljuk, csak mással történhet meg …
Genetika Transzmissziós genetika Molekuláris genetika Populáció genetika Ökológiai genetika Kvantitatív genetika Viselkedés genetika Klinikai genetika Citogenetika Mitokondriális genetika Genomika …
forward genetika reverse genetika evolúciógenetika -
molekuláris taxonómia
epigenetika farmakogenetika igazságügyi genetika patogenetika genetikai informatika génsebészet genetic engineering genetikai etika …
Jogtudományok Kriminalisztika Orvostudományok Állatorvostudományok
2008. 11. 1. / 2009. 05. 04.
Az igazságügyi genetika … Genetika és jogtudomány a gyermek tulajdonságai nem csupán a szülői tulajdonságok összegződése „a tudomány csak eljárás, nem maga az igazság”
Alkalmazott tudomány fizikai nyomok és anyagmaradványok vizsgálata molekuláris genetikai technikák objektív alkalmazásával, ezáltal igazolva az adott bűncselekményt illetve az azzal fennálló kapcsolatot eszköz, melynek segítségével a kriminalisztikai hipotézisek megerősíthetők avagy elvethetők
Kölcsönös befolyás az alaptudományokra molekuláris genetikai módszerek alkalmazása, módosítása alaptudományokkal kapcsolatos követelmények módosítása új tudományos adatok szolgáltatása gazdasági, társadalmi fejlődésére, közösségekre és a mindennapok emberére gyakorolt hatások
Szakkérdések … Humán vonatkozások bűncselekmények emberölés, rablás, erőszakos közösülés …
vitatott szülőség leszármazás
rendkívüli halál rendkívüli szívhalál (SCD) arrhythmiás szívhalál szindróma hirtelen csecsemőhalál (SIDS)
tömegszerencsétlenségek áldozatok azonosítása
Szakkérdések … Nem humán vonatkozások állatok kutyák, macskák, vadvilág… állatkínzás, állat támadások, vadorzás …
entomologia halál időpontja, helye
növények és gombák levelek, magvak … pollenek
Mikrobák talajbaktériumok
Genetikai polimorfizmusok analízise Recesszív gén hőmérséklet szenzitív expressziója TYR gén ► tirozináz enzim ► melanin szintézis
Defektív tirozináz ► funkcióvesztés normál testhőmérsékleten
Első lépés - a helyszín … „CSIUniversity ☺”
Vizsgálati komplexitás - „DNA investigation” Azonosítás – identifikáció Eredet meghatározása - honnan származik az eredmény?
Azonosságok megállapítása – közös eredet – individualizáció sejtmagi és mitokondriális DNS
Bármilyen biológiai anyagból és anyagmaradványból történhet Mennyiségi korlátok – vizsgálhatóság, reprodukálhatóság, igazolhatóság Minőségi korlátok – minőségromlás, degradálódás, bomlás, szennyezettség, felülszennyezettség Reakció komplexitás – sztochasztika Genetikai komplexitás - pigmentáció
Követelmények … Az igazságügyi genetikai vizsgálatok nem tudományos kísérletek, hanem tudományos módszerekkel végzett analízisek…
Érzékenység, megbízhatóság, ismételhetőség, ellenőrizhetőség … és vannak, amiről azt állítják, mi tettük meg … Technológia, módszertan Tudományos kritériumok, statisztika Etikai kritériumok
Felelősség Minőségirányítás
A kiindulás … Humán és nonhumán DNS Sejtmagi DNS Autoszómák Repetitive markerek (VNTR, STR) Single nucleotide polymorphisms (SNP)
Ivari kromoszómák Repetitive markerek (VNTR, STR) Single nucleotide polymorphisms (SNP)
Mitokondriális DNS Cytochrome (b) Kontroll régió (HVI, HVII, CR) SNP
Mérföldkövek …
Landsteiner Jeffreys Mullis
PCR
Short Tandem Repeats (STRs) Fluoreszcens festék
AATG
AATG
AATG
7 repetíció 8 repetíció A flanking régiók (ahol a PCR primerek kötnek) konstans, a repetitív régió variabilis a mintákban Homozigota = mindkét allél egyforma hosszú Heterozigota = különböző allélhosszak A primerek pozíciója meghatározza a PCR termék méretét
Elválasztás és detektálás
Jelölt DNA fragmens (PCR termék) Kapilláris vagy gél
Fluoreszcens detektálás Minta detektálás
Méretszeparálás
Ar+ LASER
CCD Panel
(488 nm)
Szín szerinti szeparálás
Detektálási régió Fluoreszcencia
ABI Prism spectrograph
A laboratóriumban …
Short Tandem Repeats (STRs)
13 STR lokusz kromoszómális pozíciója TPOX D3S1358 D8S1179
D5S818 FGA CSF1PO
TH01 VWA
D7S820
AMEL D13S317
D16S539
D18S51
D21S11
AMEL
Személyazonosító vizsgálat-multiplex STR AmpFlSTR® SGM Plus™ kit
Két eltérő személy
amelogenin D19
D3
Allélméret (bp) D8 TH01 VWA D21
D16 D18
D2
FGA
véletlenszerű egyezés esélye: ~1 a 3 milliárdhoz amelogenin D3
Gombostűfejnyi vérfoltból kb. 5 óra elteltével nyert eredmény
D19 D8
VWA TH01
D16 D21 FGA
D18
10 STR és a biológiai nem egyidejű vizsgálata
D2
9 autoszómás lokusz
15 autoszómás lókusz …
… mondjuk, egy szúnyogból ?
Ez itt én vagyok !!!
Növekvő Növekvő jelentőség jelentőség -- Y-kromoszóma Y-kromoszóma … … Y
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/
Human Genome
STR lokuszok DYS19 DYS389I/II DYS390 DYS391 DYS392
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
DYS393 DYS385 YCAII DYS437
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X
Y
DYS438 DYS439
17 Y-kromoszómás lokusz - haplotípus
Beszédes boríték … brutálisan meggyilkolt áldozat… ellentmondó vallomás… egyszerű személyiség… „nem én voltam …” kevés információ, sok kétség …
… boríték a helyszínen … sejtmagi DNS vizsgálat …
Az ujjnyomat…
Az ujjnyomat - eredmények autoszómális Y-STR lókuszok lókuszok
származás
Egy-nukleotid polimorfizmusok (SNP’s) Több millió SNP a genomban kb. 500-1000 bázispáronként pontmutációk génekben és/vagy regulátor régiókban
Fenotípus kapcsolatok pigmentáció, testalkat, …
Leszármazási vonalak (Y-SNP’s) Diagnosztika multifaktoriális poligénes betegségek
SNaPshotTM Multiplex Kit: egy bázis extenzió
Különböző hosszúságú farokkal tervezett primerek
Primer T
T
C
A
C
A
G
Templát
G
Primer extenzió és termináció
A T
A T
G C
T A
G C
T A C G
Elektroforézis
C G
Szín = genotípus Hossz = lókusz
Automatikus analízis
A mitokondriális genom cirkuláris DNS Cambridge Referencia Szekvencia ~ ezer kópia sejtenként nincs hiszton asszociáció magas mutációs ráta D-loop esetében ~ 9000 év alatt 1% oxidáló szabadgyök érzékenység betegségek, öregedés nincs excíziós repair-rendszer nem javítódik, csak szelektálódik palacknyak hatás heteroplazmia rekombináció egy mitokondriumon belül, nukleáris DNS-re jellemző rekombinációs variancia nincs kizárólag anyai öröklődésű öröklődése földrajzilag determinált a nem kódoló szakaszok mutációinak rögzülése és maternális öröklődése lehetőséget ad a populációk geológiai eredet szerinti elkülönítésére
A kontroll régió 16024
16365
73
HV2
HV1 16024
340
Kontroll Régió (D-loop) OH
12S rRNS
cyt b
ND6 ND1
„16 569” bp OL
ND4
Kontroll Régió (CR) – D(isplacement)-loop ~1120 bp replikációs origó hipervariábilis szakaszok
16S rRNS
1/16569
ND5
576
ND2
HV1, HV2 és HV3
alacsony szelekciós nyomás a variációk forrása csak mutáció
Szekvencia-adatbázisok
ND4L
EMPOP
ND3
COI COIII
ATP6
ATP8
COII
Igazságügyi szempontok … A mtDNS egyedi azonosításra kevésbé alkalmas, mint a nuDNS Nem az egyént, hanem az anyai leszármazási haplotípust identifikálja
Ugyanakkor A diverzitás mértéke miatt nagy a valószínűsége annak, hogy két véletlenül kiválasztott személy különböző mtDNS haplotípussal rendelkezik Populációtól függetlenül ez az érték általában 95 % valószínűség fölött van Új minták esetén kb. 2/3 része a mintáknak új haplotípust mutat Csak kevés ún. “közönséges” gyakori haplotípus van, melyek gyakorisága több mint 1% Több ezer haplotípus figyelhető meg, emiatt a haplotípusok relatív gyakorisága alacsony
Terminális (Sanger-féle) szekvenálás dNTP és ddNTP eltérő fragmenshossz jelölt primerek vagy jelölt nukleotidok
dideoxi inhibits !
D-loop szekvencia – anyai leszármazási vonal azonosításának igazságügyi eszköze A vizsgált minták mtDNS szekvenciáját a referenciaként használt CRS-hoz illesztjük (pl. 16071-16140)
A referencia szekvenciától való eltérések pozíciója és nukleotidja megadja az adott minta mtDNS haplotípusát Bizonyíték (Q)
Összehasonlító (R)
16093C 16129A
16093C 16129A
A haplotípusok …
Leszármazás
3 AFRIKAI - 9 EURÓPAI - 7 ÁZSIAI FŐ HAPLOCSOPORT
Eseti alkalmazás 2004 – házaspár eltűnése használati tárgyak, fésű, fogkefe, sapka, pohár
2006 – NN férfi holttest
emberölés
gépkocsiból hajszál-töredék morfológiai hasonlatosság a fésű hajszálaival
2007 – koponya, állkapocs 2008 – összehasonlító minták ♀ gyermek és ♂ testvér
Kié a koponya és a hajszál töredék?
Koponya maradvány
Eredmények fésű csont hajszál gyermek testvér
Eredmények
kizárás
A cytochrome b gén 14747 → 15886 pozíció (1140 bázispár) cytochrome b-c1 komplex kódoló szekvencia: - kisebb mutációs ráta - szinonim mutációk Genetikai drift - fajok közötti szekvenciális különbségek Filogenetikai analízisek
A cytochrome b gén mint a fajazonosítás igazságügyi eszköze
14747 → 15886 pozíció (1140 bázispár) PCR: 358 bp szakasz Átlagos eltérés kb. 15-20%
SNP a cytochrome b génben (Canis f.)
A vélemény … Szakértői válasz – kiértékelés Populáció genetika Reprezentatív populáció
Statisztikai genetika Származás Leszármazás, rokonság
Téves vélemények Technikai okok Kontamináció, inkompatibilitás
Személyi okok Jártasság
Bayes-féle hipotézis tesztelés Vád hipotézise (Hp): Pl.: A helyszínen talált vérnyom XY-tól származott
Védelem ellenhipotézise (Hd): Pl.: A vérnyom az adott népességből véletlenszerűen kiválasztott másik, NN személytől származott
Bayes-formula (valószínűségi tesztelés) Pr(H p I) Pr(H d I)
×
Pr(E H p , I) Pr(E H d , I)
=
Pr(H p E, I)
Pr: valószínűség
Pr(H d E, I)
E: bizonyíték
a posteriori a priori valószínűségi valószínűségi valószínűségi hányados hányados (genetikai bizonyíték) hányados (PoPR) (PrPR)
I: információ H: hipotézis p: ügyész d: ügyvéd
A valószínűségi hányados Ha a biológiai nyom egy személytől származott, és a laboratóriumi hiba kizárt, Pr(E|Hp,I)=1. Pr(E Hp, I)
1 1 = ≈ LR = Pr(E Hd, I) Pr(G c G s , Hd , I) Pr(G c Hd , I) Egyezési valószínűség
Profilgyakoriság
Pr: valószínűség E: bizonyíték G: genetikai profil I: információ H: hipotézis p: ügyész d: ügyvéd c: helyszín s: gyanúsított
A valószínűségi hányados – legegyszerűbb formájában – a genetikai-profil előfordulási gyakoriságának reciprokával egyezik meg.
Köszönöm a figyelmet!
Genetikailag módosított karácsonyfa, Amboy, CA
